CN101880715B

CN101880715B - 一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒

Info

Publication number: CN101880715B
Application number: CN 201010204931
Authority: CN
Inventors: 周俭; 樊嘉; 胡捷; 王征; 代智; 肖永胜
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2030-06-22
Also published as: CN101880715A

Abstract

本发明提供了一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以血浆循环DNA中两个SNP rs894151和rs12438080为检测位点，以rs894151和rs12438080上游序列和下游序列作为扩增引物，用荧光探针作为基因分型探针。本发明可在术前评估肝癌患者行肝移植术后的复发风险。并且本发明以外周血为检测样本具有快捷、准确、简单、易于推广应用等特点。可用于临床肝癌肝移植患者的筛选，指导肝癌肝移植术后的辅助治疗，降低高危患者术后复发率，从而改善肝癌肝移植的预后，有效利用有限的供肝。该试剂盒对于超出米兰标准患者预后的判断具有重要的临床意义。

Description

一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是全球最常见的恶性肿瘤之一，由于我国乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染率较高，因此肝癌的发病率居高不下。肝移植能彻底切除肿瘤并修复肝功能，已成为肝癌的根治性治疗手段之一。但移植术后肿瘤的复发转移仍是影响肝移植疗效的最主要因素。对移植术后肿瘤复发转移的准确预测将有助于积极的个体化防治措施的开展。同时由于供肝的短缺，预后的准确预测对于合理分配有限的供肝具有重要现实意义。

影响肝癌肝移植预后因素的研究，目前主要集中于肿瘤大小、数目、肿瘤分化、血管侵犯、甲胎蛋白(AFP)水平等方面，但上述临床病理指标仍难以准确预测肝癌肝移植术后的复发转移。最近，少量相关的研究发现了可用于肝癌肝移植术后复发预测的分子标记。但这些研究多采用肿瘤组织作为研究材料，而组织学肿瘤标志物存在标本采集、无法连续检测和随访追踪等诸多限制，不利于实际临床应用。本发明前期研究发现在肝癌病人的血浆循环DNA可检测到与复发密切相关的杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)。基于芯片的高通量SNP(单核苷酸多态性)分析使全基因组范围的遗传分析成为可能。本发明在我院前期研究的基础上，利用高通量SNP芯片、时间飞行质谱的方法，寻找血浆循环DNA分子遗传学变异(主要是SNP)在肝癌肝移植患者术后转移复发预测中的价值，并制成检测试剂盒，为现有肝癌肝移植适应证的进一步完善提供简便、有效的检测指标。

发明内容

本发明的目的是构建一种能够方便运用于临床、快速有效地在术前预测肝癌肝移植患者术后复发潜能的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒，其特征在于，用PCR扩增和荧光探针检测rs894151和rs12438080两个SNP位点的基因型，用这两个位点的基因型结合肿瘤大小、数目来预测肝癌肝移植术后复发的风险，包括PCR扩增引物以及用于基因分型的荧光检测探针；

其中，PCR扩增引物为：

rs894151位点：

上游序列5’AGAAACACTGAGTCTGCAGG3’；

下游序列5’GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3’；

rs12438080位点：

上游序列5’GATGACTCATAGCTTCCCTG3’；

下游序列5’CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3’；

用于基因分型的荧光检测探针为：

rs894151-TA：AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA；

rs894151-TG：TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG；

rs894151-TR：-P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；

rs12438080-TA：TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA；

rs12438080-TC：TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC；

rs12438080-TR：-P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。

本发明的原理如下：如图1所示，为获得rs894151和rs12438080两个SNP位点的分析流程图。通过SNP芯片在30例FFPE肿瘤组织中筛查复发相关位点，然后用飞行质谱法在这些芯片病例的循环DNA中对筛选出的复发相关位点进行SNP分型，找出同时在血浆循环DNA中出现的复发位点。在另两组独立的病例血浆循环DNA中进行验证。

首先本发明使用Affimetrix公司的最新的SNP6.0芯片筛查肝癌肝移植患者肿瘤组织(复发组及未复发组各15例)间的遗传学差异，发现了1272个差异SNP位点(P＜0.001)。其中30个差异最显著的SNP位点P值小于0.001。聚类分析发现30个差异最显著的SNP位点能清楚地将患者分为两群，两群的无复发生存率及总体生存率均有显著差异。如图2和图3所示，用30个P值最小的差异位点可清楚地将所有的患者分为两群(高危复发组及低危复发组)。生存分析发现两群的总体生存时间(图2)及无复发生存时间(图3)存在显著差异(P＜0.001)。在以上病人的术前循环DNA中用飞行质谱法检测这30个SNP位点，共成功检测到28个位点，发现肿瘤组织DNA和循环DNA中的符合率大于98％。本发明在另外102例独立病例(测试集)的循环DNA中进一步验证这28个SNP位点与复发的关系，发现rs894151和rs12438080两个位点与复发显著相关。其中rs894151位点的G等位基因和rs12438080的C等位基因与复发呈正相关。本发明将等位基因G和C定义为危险等位基因。两个SNP位点共四个基因座。rs894151位点可能的基因型为AA、AG和GG，rs12438080位点可能的基因型为AA、AC和CC。本发明将两个位点均为AA基因型的患者定义为复发低危组；其余患者(即两个位点任一基因座出现危险等位基因的患者)分为复发高危组。生存分析发现这两个位点的联合指标是肝癌肝移植术后复发的独立预后指标(P＝0.030)，如表1所示：

表1：多因素分析临床病理因素与OS和RFS的关系(102例测试集病例)

该结果得到第三组独立病例(47例验证集)的验证。如表2所示：

表2：多因素分析临床病理因素与RFS的关系(验证组47例病例)

符合米兰标准的患者均为早期肝癌，而我国大多数患者就诊时已进入晚期从而失去移植机会。本发明在超过米兰标准的患者中检测血浆循环DNA SNP联合指标，发现超出米兰标准的患者若rs894151和rs12438080位点基因型均为AA其术后复发转移的概率仅为30％(6/20)。图4为米兰标准分层后SNP联合指标的预测结果图，两个SNP位点的联合指标在超出米兰标准病例中的预测价值。

本发明进一步用循环DNA中两个SNP(rs894151和rs12438080)的联合指标以及米兰标准中采用的肿瘤大小、个数共三个因子建立肝癌肝移植的预后模型。微血管侵犯虽然也是复发的独立预后因素，但该指标在术前无法获得，因此不纳入预后模型中。将SNP联合指标、肿瘤大小和肿瘤个数分别置入COX风险比例模型中，计算每个因子与复发关联，每个因子产生一个系数。患者的复发风险为三个指标分别与其系数相乘后的累加。即：患者复发风险＝2.008×SNP联合指标+1.381×肿瘤大小+0.859×肿瘤数目。当患者两个位点基因型均为AA时“SNP联合指标”＝0；否则“SNP联合指标”＝1；当患者肿瘤直径≤5cm时“肿瘤大小”＝0；大于5cm时“肿瘤大小”＝1；，当患者肿瘤仅一枚时“肿瘤数目”＝0；多枚时“肿瘤数目”＝1。用模型计算每个患者的复发风险并用不含SNP指标的模型作为参照，ROC曲线分析两种模型复发风险的预后价值发现，用含有SNP指标的模型AUC面积为0.810，而用传统的肿瘤大小、数目的模型AUC面积仅为0.705，如图5所示，为复发风险的ROC曲线分析图，两者具有显著差异(P＜0.001)。含有SNP指标的模型可达到较高预测效能。

为简化模型，本发明进一步用复发风险值的中位数2.240作为复发的预测阈值将所有患者分为两群：复发风险＞2.240为高危组，该组患者两年内复发的概率为70.4％(50/71)；复发风险≤2.240为低危组，该组患者两年内复发的概率为17.9％(14/78)。同样用ROC曲线分析其预测效能。如图6所示，为用复发风险中位数分组后的ROC曲线分析图，用复发风险的中位数2.240作为复发的预测阈值进行ROC分析。其预测复发的AUC面积为0.767，敏感度为78.1％，特异度为75.3％。

本发明的优点是：

1、能够方便运用于临床、快速有效地在术前预测肝癌肝移植患者术后复发潜能。

2、检测外周血分子指标为非侵入性检查，创伤小，患者更易接受。

3、遗传学变异反映了肿瘤的生物学行为，结合肿瘤大小、数目等临床病理指标能更好的预测肿瘤术后复发，而目前国际上所有的肝癌肝移植标准均未含术前肝癌生物学特性指标。

4、血浆循环DNA可在术前获取样本，术前即能完成患者复发潜能评估，有利于移植病人的选择、供肝的合理分配。

5、外周血获取方便，可在术前术后对患者进行连续动态监测。有利于高复发风险的移植患者选择合理有效的干预治疗，延长总体生存时间。

6、肿瘤具有异质性，同一个肿瘤不同的取材点可能得到不同亚群的肿瘤细胞。循环DNA可以起源于肿瘤内部任何一个亚克隆的群体，因此能比组织学取材的肿瘤更全面地反映肿瘤细胞的遗传学改变。

附图说明

图1为获得rs894151和rs12438080两个SNP位点的分析流程图；

图2为总体生存曲线图；

图3为无复发生存曲线图；

图4为米兰标准分层后SNP联合指标的预测结果图；

图5为复发风险的ROC曲线分析图；

图6为用复发风险中位数分组后的ROC曲线分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例

一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒，以血浆循环DNA中两个SNP rs894151和rs12438080为检测位点，包括PCR扩增引物以及用于基因分型的荧光检测探针；

其中，PCR扩增引物为：

rs894151位点：

上游序列5’AGAAACACTGAGTCTGCAGG3’；

下游序列5’GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3’；

rs12438080位点：

上游序列5’GATGACTCATAGCTTCCCTG3’；

下游序列5’CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3’；

用于基因分型的荧光检测探针为：

rs894151-TA：AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA；

rs894151-TG：TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG；

rs894151-TR：-P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；

rs12438080-TA：TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA；

rs12438080-TC：TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC；

rs12438080-TR：-P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。

使用试剂盒进行肝癌肝移植术后复发预测的具体步骤如下：

1、血浆获取：肝癌患者肝移植术前，清晨空腹取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，以820g离心10分钟后将上清血浆部分吸至洁净离心管，再用16000g离心10分钟完全去除血细胞成分后置于干燥洁净冻存管中。

2、循环DNA抽提：血浆循环DNA的抽提采用

DNA Blood MiniKit(Qiagen公司，德国，cat：51106)试剂盒的操作步骤进行。具体操作步骤如下：

(1)将试剂盒中所有试剂和buffers升温至室温。

(2)将水浴箱调至56℃。

(3)如果Buffer AL或Buffer ATL含有沉淀，将其置于70℃水域中。

(4)加20μl蛋白酶K至1.5mlEP管底。

(5)加入200μl血浆至EP管内混匀。

(6)加入200μlAL至EP管内，涡旋混匀15秒。

(7)置入水域箱中56℃孵化10分钟。

(8)短暂离心，去除管盖内和管壁内侧的液珠。

(9)打开管盖，加入200μl无水乙醇，涡旋混匀。

(10)将EP管置于90℃水浴箱中放置1小时。

(11)短暂离心，去除管盖内和管壁内侧的液珠。

(12)将所有液体转移至QIAamp MinElute column，6000g离心1分钟，弃收集管。将QIAamp MinElute column置入另一洁净收集管中。

(13)在QIAamp MinElute column中加入500μl AW1，6000g离心1分钟，弃收集管。将QIAamp MinElute column置入另一洁净收集管中。

(14)在QIAamp MinElute column中加入500μl AW2，6000g离心1分钟，弃收集管。将QIAamp MinElute column置入另一洁净收集管中。

(15)将QIAamp MinElute column空柱最高转速离心3分钟。

(16)将QIAamp MinElute column置入一洁净1.5mlEP管中。加入100μl BufferAE至膜中央。室温孵育1分钟。

(17)将QIAamp MinElute column全速离心1分钟收集EP管中的DNA溶解。

(18)抽提好的DNA用Nanodrop测浓度后凝胶电泳进行质量鉴定。

3、rs894151和rs12438080位点基因分型：

SNP分型服务采用连接酶特异检测技术，对需检测SNP位点设计特异性探针，在连接酶的作用下，当特异性的寡核苷酸探针与互补靶序列DNA完全配对时连接反应顺利进行，若寡核苷酸探针与其不完全配对，则连接反应不能进行。最后通过测序仪检测，得到分型结果。步骤如下：

(1)、PCR扩增：

PCR仪为ABI 9600；

扩增体系：上一步抽提的DNA 1ul(调整浓度至20ng/ul)，10＊buffer(Tris-Cl10mmol/L，PH 8.3～8.8)1.5ul，MgCl₂溶液(1.5mmol/L)1.5ul，四种dNTP(总量为10mM)0.3ul，本发明试剂盒中的四种PCR扩增引物，每种10pmol/ul，0.25ul，Taq酶(5u/ul)0.25ul，加H₂O补至15ul。其中，引物由上海生工合成，taq酶(货号201223)，dNTP都由凯捷公司提供。

扩增条件：

(2)、连接反应：

反应体系：PCR扩增产物3ul、10*Taq DNA ligase buffer(20mMTris-HCl(pH 7.6)1ul、Taq DNAligase(40U/ul)0.125ul、本发明试剂盒中的6种探针，每种10pmol/ul，0.01ul，加H₂O补至10ul。探针由上海捷瑞合成，TaqDNA ligase由NEB公司提供(货号：#M0208S)。

连接条件：

(3)、在ABI 377型测序仪上进行电泳检测：取1ul连接产物，加2ul上样，95℃变性3min，立即冰水浴。

4、肝癌肝移植患者的复发风险预测值计算采用如下公式：患者复发风险＝2.008×SNP联合指标+1.381×肿瘤大小+0.859×肿瘤数目。当患者两个位点基因型均为AA时“SNP联合指标”＝0；否则“SNP联合指标”＝1；当患者肿瘤直径≤5cm时“肿瘤大小”＝0；大于5cm时“肿瘤大小”＝1；，当患者肿瘤仅一枚时“肿瘤数目”＝0；多枚时“肿瘤数目”＝1。肿瘤大小及数目资料来源于患者术前CT或MRI或彩超，由两种及两种以上影像学确认。风险大于2.240为高复发风险，不适宜行肝移植术，小于等于2.240则为低复发风险，适合行肝移植术。

序列表

<110>复旦大学附属中山医院

<120>一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒

<160>10

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>1

agaaacactg agtctgcagg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>2

gcctctttcc ttcatctgtc 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>3

gatgactcat agcttccctg 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>4

cttgccgaga gtttaacagg 20

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>5

aactgtgaat aataaatgcc acgca 25

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>6

tttaactgtg aataataaat gccacgcg 28

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>7

ttttgctctc atcaaagcag ttatcacaa 29

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人类(Homo sapieus)

<400>8

tttttttgct ctcatcaaag cagttatcac ac 32

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<223>n为荧光染料FAM

<400>9

caaagctctt cactgtgtta agtaan 36

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<223>n为荧光染料FAM

<400>10

cagtaagtat ggtaaaaata aaaataatn 39

Claims

1.一种肝癌肝移植术后复发预测试剂盒，其特征在于，以血浆循环DNA两个SNP rs894151和rs12438080为检测位点，包括PCR扩增引物以及用于基因分型的荧光检测探针；

其中，PCR扩增引物为：

rs894151位点：

上游序列5’AGAAACACTGAGTCTGCAGG3’；

下游序列5’GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3’；

rs12438080位点：

上游序列5’GATGACTCATAGCTTCCCTG3’；

下游序列5’CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3’；

用于基因分型的荧光检测探针为：

rs894151-TA：AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA；

rs894151-TG：TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG；

rs894151-TR：-P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；

rs12438080-TA：TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA；

rs12438080-TC：TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC；

rs12438080-TR：-P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。