CN104487591A - 预测前列腺癌预后之分子标记、方法及套组 - Google Patents

Abstract

本发明系提供一种预测已检测罹患前列腺癌之人类病患之临床预后之方法，系包括：由该人类病患所得之包含前列腺癌细胞之生物性样本中，检测由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群组之一种或多种标记基因之表现量；以及，藉由该标记基因之表现量与参考值之比较，预测临床预后之可能性。本发明亦提供一种分子标记之组合及包含该组合之套组。

Description

预测前列腺癌预后之分子标记、方法及套组

技术领域

本发明系关于前列腺癌之新颖分子标记，以及包括该等分子标记之用于检测前列腺癌之方法及套组。

先前技术

前列腺癌为男性主要致死癌症。针对早期、局部性之前列腺癌，进行根治性前列腺切除术(radical prostatectomy)有机会可根除此疾病，然而，具有初始局部病症之约15-30％之病患会在5-10年内复发，造成很差的治疗结果(Bill-Axelson et al.,2005；Pound et al.,1999)。前列腺癌病患之预后(prognosis)之进一步之改善，可依据对病理分子机制更深入的了解而进行，可以人类前列腺癌临床变化之更佳预测为基础，进行疾病复发率及合理治疗计划之改善。

如同大多数腺癌，前列腺上皮之恶性转形系与一般腺体结构之逐步性及多样性丧失相关。因此，人类前列腺癌常展现于腺体分化作用中显著的肿瘤内基因异质性(heterogeneity)，为一种广泛用于前列腺癌之病理学分类(例如格里森分级系统(Gleason grading system，参考文献Gleason,1992))之因子。大量的临床研究已建立了腺体分化作用程度，以作为前列腺癌临床变化之决定因子。尤其是，低分化、高格里森评分之肿瘤，系具有高肿瘤复发及低预后之可能性(Albertsen et al.,1995；Stamey et al.,1999)。然而，此种以表型为基础之分类系统仅针对适度的预后症状，无法将具有类似组织病理学特征之前列腺癌进行风险分级。组织结构之评估无法对可见性肿瘤变异提供功能性或机制性之观察指标。因此，亟需能应用于前列腺癌之临床结果预测，且能增加正确性，能指示途径(pathway-informed)，并以分子学为基础之检测分析。

近来，高处理能力之基因解析技术有利于发现包括前列腺癌之人类恶性肿瘤之分子特征(Glinsky et al.,2004；Henshall et al.,2003；Singh et al.,2002；Stratford et al.,2010；van't Veer et al.,2002；van de Vijver et al.,2002)。该等基因标记之预后应用系说明肿瘤之固有分子特征可作为其临床表现之重要决定因子(Ramaswamy et al.,2003)。举例言之，Dhanasekaran等人藉由比较前列腺癌检体与相邻之正常前列腺之基因表现图谱，鉴定出前列腺癌之协同表现基因群(Dhanasekaran et al.,2001)，该等基因之其中两个，包含hepsin(HPN)及pim-1(PIM1)，显示与临床结果测量相关。类似地，Varambally等人藉由比较转移性前列腺癌及局部性前列腺癌之基因表现图谱，鉴定出55个上游基因及480个下游基因(Varambally et al.,2002)。针对排名前位之基因，它们系Zeste蛋白同系物2(Zeste homolog 2，EZH2)之经实验证实之强化子，Zeste蛋白为一种促转移基因，且为前列腺癌之预后标记。Singh等人研究21位接受根治性前列腺切除术之前列腺癌患者之肿瘤基因表现图谱，并建立了5-基因模块，可预测术后疾病复发之风险，正确率达90％(参考文献：Singh et al.,2002)。此模块系基于少量肿瘤样本而建立，且其表现并未于独立病患群中进行验证。以相同的21个前列腺癌样本组为基础，Glinsky等人藉由比较前列腺癌复发与未复发病患之肿瘤之基因表现图谱，鉴定出三基因组(参考文献：Glinsky et al.,2004)。该等基因印记能够区分前列腺癌在临床表现上为易复发或非复发，正确率为86-95％。Gary等人则以少量之肿瘤样本：4个来自前列腺癌复发之病患及5个来自未复发之肿瘤，鉴定出33个基因，其在前述两组前列腺癌中有区别性的表现(美国专利公开号US 2010/0196902A1)，但此组前列腺癌之基因印记亦来自少量样本数及缺乏独立验证。

除了分子标记建构外，基因工具亦可用于肿瘤次型之分子性定义、或用于区分初级/转移性之前列腺癌。例如，人类前列腺癌组织之转录图谱已证实三种不同之肿瘤次型之存在，其与肿瘤分级与阶段相关(参考文献：Lapointe et al.,2004)。LaTulippe等人鉴定出超过3000个基因，于初级与转移性前列腺癌中具有区别性之表现(参考文献：LaTulippe et al.,2002)。由格里森级数代表之肿瘤分化之基因表现图谱亦被描述。例如，29个显微切割之前列腺肿瘤之基因表现图谱，展示了一种86基因模块，其能够区分低级数至高级数之前列腺癌(参考文献：True et al.,2006)。应留意，上述分子图谱系以临床前列腺肿瘤检体所建立，可能只能反映已形成之肿瘤之特征，而无法提供该等肿瘤变异型之病理学机制。因此，以知识为基础之方法可提供定出更多合理标记或分类系统之机会，此有利于临床决定进行及疗效进展。该等方法已被用于数种实性肿瘤中，以建立肿瘤前驱细胞、基质活化或组织分化相关基因图谱之预后应用(Chang et al.,2004；Fournieret al.,2006；Liu et al.,2007；Sotiriou et al.,2006)。

近来，主要的肿瘤发生模式认为，组织分化与肿瘤进程共享类似的基因调控作用及分子途径。与腺体上皮分化过程相关之分子改变可能难以于活体内进行研究。然而，生理学相关之三维器官培养模式已被应用于乳腺泡(正常乳房上皮之基本结构单位)之结构性及功能性分化过程之再现(Debnath and Brugge,2005；Lee et al.,2007)。类似模式已成功再现前列腺、胰及肺之上皮之型态发生过程及分化过程(Gutierrez-Barrera et al.,2007；Mondrinos et al.,2006；Webber et al.,1997)。利用此建构性模式之比较性基因表现分析系展示出基因表现图谱及标记基因之鉴定，其显示了与乳癌预后之明显关连性(Fournier et al.,2006；Kenny et al.,2007)。相同模式是否可被应用于其它腺癌类型(如前列腺癌)仍然不清楚。

因此，用于预测前列腺癌临床结果(如复发率)之分子标记，且具有改良之正确率及临床应用性者，仍有其需求。

发明内容

本发明系提供一种预测已检测得前列腺癌之人类病患之临床预后(clinical prognosis)之方法，包括：由该人类病患所得之包含前列腺癌细胞之生物性样本中，检测由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群组之一种或多种标记基因(marker gene)之表现量；以及，藉由该标记基因之表现量与参考值之比较，预测临床预后之可能性(likehood)。该生物性样本系以抽吸术(aspiration)、活检(biopsy)、或手术切除术(surgical resection)取得。

本发明亦提供一种用于预测前列腺癌之临床预后之分子标记组合，系包括ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2中之至少二者。

本发明亦提供一种用于预测前列腺癌之临床预后之套组，系包括一种检测选自由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2所成群组之一种或多种标记基因之表现量之工具。

图式简单说明

第1图显示以三维培养模式之前列腺上皮细胞之结构性组织，其中，第1A图上列显示于三维重建基底膜胶培养之RWPE-1细胞团(培养48小时所形成)及腺泡(培养6天所形成)之共焦影像，而下列显示于三维重建基底膜胶培养之前列腺癌LNCaP细胞团(培养48小时所形成)及球状物(培养6天所形成)之共焦影像。该等结构系以底部胞外基质受体α6-整合素(红色)及顶部标记GM130(绿色)进行免疫染色。细胞核以Hoechst 33342(蓝色)进行复染色。比例尺为20μm。第1B图显示RWPE-1细胞或LNCaP细胞所形成之极化构造之比例，系于荧光显微镜下以目测计数定量。数据以平均数±SEM表示，n＝3.***,P<0.001。

第2图显示与前列腺腺泡分化相关基因之功能分析，其中，第2A图显示与前列腺分化相关基因之功能分析，该等高功能性基因类型之分类系依据基因本体学生物性程序，如方框所示，并以横截面区域表示包含于各分类之基因之数量；与各分类相关之基因系以圆形框所示，且，比较前列腺腺泡及细胞团中的表现量，红色表示增加，绿色则表示减少。第2B图显示于RWPE-1腺泡或恶性LNCaP球状物与细胞团相较，与上皮分化、或前列腺之荷尔蒙或分泌功能相关之基因转录体表现量之倍数变化，其系以定量实时PCR分析进行测量。数据以平均数±SEM表示，n＝3.*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

第3图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较BWH组之21位前列腺癌病患之未复发之存活率将该等病患区分为两群：高与低r_acini。P值系以对数等级检定计算。

第4图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较Lapointe组之29位前列腺癌病患之未复发之存活率，依r_acini将该等病患分群。P值系以对数等级检定计算。

第5图显示所选择之12-基因组，系以BWH组之21位前列腺癌病患之疾病复发风险预测之一致性指数(C-指数)为基础。于R语言统计编程(cran.r-project.org)中使用「survcomp」包装进行C-指数统计分析。

第6图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较BWH组之21位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据表列12个分子标记之转录体表现量计算复发级分(方程式1)，并以据此所得之预测复发风险为基础，将该等病患区分为两群。P值系以对数等级检定计算。

第7图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较Lapointe组之29位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据表列12个分子标记之表现图谱计算复发级分(方程式1)，并以据此将该等病患区分为两群。P值系以对数等级检定计算。

第8图显示BWH组之21位前列腺癌病患之未复发之存活率，系依据表列之代表性分子标记表现量为基础，将该等病患分群。各基因标记之阀值系以最大尤登指数决定。P值系以对数等级检定计算。

第9图显示CFMC组之前列腺癌组织之PDCD4(i,ii)、KLF6(iii,iv)、及ABCG1(v,vi)之免疫染色(400×倍率)。所显示为具有各标记之高染色强度(i、iii、v)或低染色强度(ii、iv、vi)之肿瘤。

第10图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较CFMC组之61位前列腺癌病患之未复发之存活率，依据PDCD4、ABCG1或KLF6之染色强度分群。该染色图谱系以组织学评分(H-评分)定量。各基因标记之阀值系以最大尤登指数决定。P值系以对数等级检定计算。

第11图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较CFMC组之61位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据PDCD4、ABCG1及KLF6之染色强度(以H-评分定量)计算之复发评分(方程式1)，将该等病患分为两群。P值系以对数等级检定计算。

第12图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较BWH组之21位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据PDCD4、ABCG1及KLF6之转录体表现量(以抗体杂合强度表示)计算之复发评分(方程式1)，将该等病患分为两群。P值系以对数等级检定计算。

第13图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较CFMC组之61位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据PDCD4及ABCG1之染色强度(以H-评分定量)计算之复发评分(方程式1)，将该等病患分为两群。P值系以对数等级检定计算。

第14图显示卡普兰-梅耶存活曲线，系比较BWH组之21位前列腺癌病患之未复发之存活率。依据PDCD4及ABCG1之转录体表现量(以探针杂合强度表示)计算之复发评分(方程式1)，将该等病患分为两群。P值系以对数等级检定计算。

实施方式

定义

于此处，「前列腺癌」意指衍生自前列腺上皮细胞之哺乳类恶性癌症，特别是指腺癌。本发明所指前列腺癌系包含转移性及非转移性癌症。

术语「分化作用」意指于发育期间，一器官或组织在结构或功能上发生广泛性或特异性的改变。分化作用的概念于本技术领域中为习知，无须多加详述。例如，前列腺之分化，意指腺状结构之形成及/或正常前列腺之荷尔蒙或分泌功能之取得之过程。

于此处，术语「临床预后」意指患有前列腺癌之病患之结果，包括肿瘤复发之可能性、存活、疾病进程(disease progression)、及治疗反应。手术后(如前列腺切除术)之前列腺癌复发率暗示了更具侵袭性之癌症；更短的宿主(如前列腺癌患者)存活期；肿瘤之尺寸、体积、或数量增加之可能性提高；及/或治疗失败之可能性提高。

于此处，术语「预测临床预后」意指提供一前列腺癌之可信进程或结果之预测，包括预测转移、多重抗药性、无疾病存活期、整体存活率、复发率等。该方法亦可用于设计适当之癌症治疗之疗法，例如，藉由指示该癌症是否仍为早期阶段、或是否该癌症进展至侵袭性疗法亦无效之阶段。

于此处，术语「复发」意指于初期治疗或后续治疗后，前列腺癌又重新发生。典型之治疗包括任何形式之手术(如根治性前列腺切除术)、任何形式之放射线治疗、任何形式之化疗或生物性疗法、任何形式之荷尔蒙疗法。于部分实例中，前列腺癌复发系由上升的前列腺专一性抗原(PSA)量(如，至少0.4ng/ml之PSA、或两个连续之PSA值为0.2mg/ml并升高)(Stephenson et al.,2006)；及/或由罹患前列腺癌之患者所得之任何生物性样本中鉴定出前列腺癌细胞所表示。

于此处，术语「疾病进程」意指一种状况，尽管进行治疗，其中一种或多种前列腺癌指标(如血清之PSA量、可测得之肿瘤尺寸或体积、或新病灶)显示该疾病正在进展中。

该等术语「分子标记」、「基因标记」、「癌症相关抗原」、「肿瘤专一性(特异性)标记」、「肿瘤标记」、「标记」、或「生物标记」意义相通，意指一分子或一基因(典型为蛋白质或核酸，如RNA)，与非癌细胞或其它种癌细胞相较，该分子或该基因系可区别性表现于该种癌细胞中、表现于该癌细胞之表面、或由该癌细胞所分泌；以及，其系有用于癌症诊断，以提供一预后，及优先订出癌症之药剂。通常，与非癌症细胞或其它种癌细胞相较，一癌症相关抗原系于该癌细胞中过度表现或表现过低之一分子，例如，与非癌症细胞相较为1倍之过度表现量、2倍之过度表现量、3倍之过度表现量、或更多倍；或，例如，与非癌症细胞相较为20％、30％、40％、50％或更低者。通常，一癌症相关抗原为在该癌细胞中不适当地合成之分子，例如，与非癌症细胞所表现之分子相较，为包含缺失、新增或突变之分子。通常，一癌症相关抗原为仅表现于癌细胞之细胞表面，且不被正常细胞所合成或表现。例示性细胞表面肿瘤标记包含：前列腺癌之前列腺专一性抗原(PSA)、乳癌之c-erbB-2蛋白质及人类上皮生长因子受体(HER)蛋白质、及多种癌症(包含乳癌、卵巢癌及大肠癌)之醣类黏蛋白。通常，一癌症相关抗原并非该癌细胞表面之主要表现者。

于本发明中，术语「区别性表现」或「区别性调控」通常意指，与至少一种其它样本相较，于样本中，一蛋白质或核酸过度表现(增量调控)或表现过低(减量调控)。

于此处所载之「ABCG1」、「PDCD4」、「KLF6」及其它分子标记，包括记载于图表者，意指核酸(如基因、前驱mRNA、mRNA)及多肽、多型变异体、对偶基因、突变型、及物种间同源体，其系：(1)与由一参考核酸所编码之多肽或此处所述之胺基酸序列，具有胺基酸序列相同度大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％；较佳为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高之胺基酸序列相同度之胺基酸序列；较佳系涵盖超过至少约25、50、100、200、500、1000或更多个胺基酸之区域；(2)专一性键结至抗体(如多株抗体)，该抗体可拮抗包括一参考胺基酸序列、其免疫原性片段、及其保留性修饰之变异体之免疫原；(3)于可信赖杂合条件下，与编码参考胺基酸序列之核酸、及其保留性修饰之变异体产生专一性杂合；(4)与一参考核酸序列相较，具有核苷酸序列相同度大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％；较佳为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高之核苷酸序列相同度之核苷酸序列；较佳系涵盖超过至少约10、15、20、25、50、100、200、500、1000或更多个核苷酸之区域。典型地，聚核苷酸或多肽序列系来自哺乳类，并非用以限制，系包含灵长类(如人类)、啮齿类(如大鼠、小鼠、仓鼠)、牛、猪、马、羊、或其它哺乳动物。本发明之核酸及蛋白质包含自然产生的分子及重组分子。该等抗原之截短型及选择性剪接型包含于此定义中。

熟习本技术领域之通常知识者可理解，此处所描述之标记可单独使用或与其它标记组合使用于任何应用中，例如诊断或多重抗药性癌症之预后。

「生物性样本」系包含组织切片(如活检样本及抽吸术样本)及为组织学目的所采之冷冻切片。该等切片包含前列腺癌组织、血液及血液馏份或产品(如血清、血浆、血小板、红血球细胞等)、唾液、组织、经培养之细胞(如初代培养、培植体、及转形细胞)、粪便、尿液等。

「活检」意指移除一组织样本以进行诊断评估或预后评估之过程，以及意指该组织检体本身。于本技术领域中已知之任何活检技术均可应用于本发明之诊断及预后方法。所应用之活检技术系依进行评估之组织类型(如乳房等)、肿瘤尺寸及类型、及其它因素而定。具代表性之活检技术包含，但不限于，切除性切片、切开性切片、针头活检、外科手术切片、及骨髓活检。「切除性切片」意指移除整个肿瘤及小部分边缘之围绕该肿瘤之正常组织。「切开性切片」意指以一楔形状移除部分组织，包含肿瘤之横切直径。以内视镜或荧光镜进行之诊断或预后可要求「核心针头活检」或「细针头抽吸活检」，通常自标的组织内取得细胞之悬浮物。

「核酸」意指脱氧核醣核酸或核醣核酸，及其聚合物，无论是单股或多股形式，及其互补物。该术语涵盖包含已知核苷酸类似物或经修饰之骨架残基或连锁之核酸，可为合成、自然发生及非自然发生者，其具有与参考核酸类似的键结性质，并以与参考核酸类似的方式代谢。该类似物之实例包含，但非用以限制，硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、对掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核醣核酸、肽-核酸(PNAs)。

于此处，该等术语「多肽」、「胜肽」及「蛋白质」之意思互通，意指胺基酸残基之聚合物。该等术语应用于胺基酸聚合物，其可为天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物，其中一个或多个胺基酸残基可为合成之化学仿真物(对应于天然胺基酸)。

该术语「胺基酸」意指天然胺基酸及合成天然胺基酸，以及胺基酸类似物及胺基酸仿真物，其功能模式系与天然胺基酸类似。天然胺基酸系由基因密码子所编码者、及随后经修饰(如羟基脯胺酸、γ-羧基谷胺酸、及O-磷酸丝胺酸)之胺基酸。

「抗体」意指一多肽，包括一来自免疫球基因或其片段之骨架区域，其可专一性键结并辨识一抗原。该辨识之免疫球基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε、μ保留区段基因，及极大数量之免疫球变异区段基因。轻炼之分类为κ或λ。重炼之分类为γ、μ、α、δ、或ε，依序分别定义为免疫球蛋白分类为IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。典型地，抗体之抗原键结区段为对于键结专一性及亲和性最重要之处。

例示性分子标记：

ATP-键结卡匣(cassette)，次族G，成员1(ABCG1)

人类ATP-键结卡匣，次族G，成员1(ABCG1)基因(NCBI Entrez Gene9619)位于编号21之染色体上，基因地图位置21q22.3，可编码一复数穿膜蛋白，其主要座落于内质网(ER)及高基氏体之膜上。已鉴定出六种选择性剪接变异型。例示性ABCG1序列为公开，例如由基因库GenBank(如编号：NM_004915.3、NM_016818.2、NM_207174.1、NM_997510、NM_207628.1、及NM_207629.1(mRNAs)及NP_004906.3、NP_058198.2、NP_997057.1、NP_997510.1、NP_997511.1、及NP_997512.1(蛋白质))或UniProtKB(如P45844)。

计划性细胞死亡4(PDCD4)

人类计划性细胞死亡4(PDCD4)基因(NCBI Entrez Gene 27250)位于编号10之染色体上，基因地图位置10q24，可编码一核-质间穿梭蛋白。已鉴定出三种选择性剪接变异型。例示性PDCD4序列为公开，例如由基因库GenBank(如编码：NM_001199492.1、NM_014456.4、及NM_145341.3(mRNAs)、及NP_001186421.1、NP_055271.2、及NP_663314.1(蛋白质))或UniProtKB(如Q53EL6)。

类库氏因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)

人类类库氏因子6(KLF6)基因(NCBI Entrez Gene 1316)位于编号10之染色体上，基因地图位置10q15，可编码一核蛋白质。已鉴定出三种选择性剪接变异型。例示性KLF6序列为公开，例如由基因库GenBank(如编码：NM_001160124.1、NM_001160125.1、及NM_001300.5(mRNAs)、及NP_001153596.1、NP_001153597.1、及NP_001291.3(蛋白质))或UniProtKB(如Q99612)。

于本发明中，该分子标记包括该等标记基因：ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、DSC2或前述之任意组合，系用以预测前列腺癌之临床预后。亦提供以前述分子标记为基础之方法与套组。

作为分子标记，该等标记基因ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC可单独使用或组合使用。该分子标记包含基因、RNA转录产物、及表现产物(如蛋白质)，可为野生型、截短型、或经选择性剪接型。

于一实施例中，以前述标记基因之至少两者为组合为较佳，例如该等标记基因中的3、4、5、6、7、8、9、10、11、或全部12个。于一较佳实施例中，该分子标记为12-基因模块，使用所有该标记基因进行预测。于另一较佳实施例中，该分子标记为3-基因模块或2-基因模块，其中，该标记基因系选自ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群组。尤其是，该分子标记为ABCG1、PDCD4、及KLF6之组合；或ABCG1及PDCD4之组合。

该标记基因之表现量可以该标记基因之RNA转录产物、或其表现产物、或两者之组合为基础而决定。于一实施例中，测定该标记基因之表现量之手段系包括核酸探针、适配体(aptamer)、抗体、或前述之任意组合，其能够专一性辨识该标记基因之RNA转录产物或表现产物(如蛋白质)。更具体而言，该标记基因之RNA转录产物之表现量可藉由聚合酶连锁反应(PCR)、北方墨点试验、RNA酶保护试验、微数组试验、RNA原位杂合反应等方法检测；而该标记基因之表现产物(如蛋白质或多肽)之表现量可藉由免疫转渍试验、免疫组织化学法、二维蛋白质电泳、质谱分析试验、组织学染色等方法检测。前述检测手段可单独或组合使用。

该生物性样本系如前述所定义，可以抽吸术、活检、或手术切除术取得。该生物性样本可为新鲜、冷冻、或经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)之前列腺肿瘤检体。

于一实施例中，核酸结合分子例如探针、寡核苷酸、寡核苷酸数组、及引子可用于该试验中，以测定病患样本中之标记基因之差异性RNA表现，例如RT-PCR、qPCR、及核酸微数组。

于另一实施例中，蛋白质表现量之检测系包括使用该基因标记专一性之抗体，及对于经固定(如福尔马林固定)及/或经蜡包埋(如石蜡包埋)之前列腺肿瘤组织之免疫组织化学染色。该免疫组织化学法可以手动或自动操作方式进行。

于另一实施例中，抗体或核酸探针可应用于固定于显微镜玻片上之病患样本。所得抗体染色或原位杂合图谱，可使用本技术领域已知之不同光学显微镜检或荧光显微镜检之任一进行者显像。

于另一实施例中，该蛋白质或核酸分析可藉由例如高效液相色层分析(HPLC)单独使用、或与质谱仪(例如MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、tandemMS等)组合使用而达成。

于一实施例中，该临床预后包括疾病进程之可能性、临床预后、复发率、死亡率等。该疾病进程系包括前列腺癌之分类、前列腺癌细胞之分化程度之测定等。

于另一实施例中，该临床预后可为：一时间间距，介于疾病检测日期或手术日期至疾病复发或转移日期；一时间间距，介于疾病检测日期或手术日期至病患死亡日期；前列腺癌之可测量肿瘤病灶(lesion)之数量、尺寸、体积之至少一项之变化；或前述之任意组合。肿瘤病灶之变化之测定，可于诊断或手术之前、或期间之不同时间点、或之后，藉由目测、放射学及/或病理学检验该前列腺癌而进行。

于本发明中，该参考值系作为该预测之基准线，其可以一前列腺癌病患族群中，经常态化之该标记基因之表现量为基准而决定。典型地，该参考值可为一参考阀值，其系代表一大数量之前列腺癌病患或前列腺癌组织中之该标记基因之多肽或聚核苷酸，以组织样本或活检或其它生物性样本(如细胞、血清、或血液)进行量测，且该等患者之临床预后资料为可获得。所述参考阀值系藉由定义量而决定，其中，与表现量低于参考阀值者相比，当该患者之肿瘤之标记表现量高于参考阀值时，系被预测为具有较高或较低程度之分化作用、或临床预后或疾病进程之较低风险。本发明之多肽或聚核苷酸之量与该参考范围之差异(不论是高或低)暗示了该患者具有较高或较低程度之肿瘤分化作用或临床预后或疾病进程之较低风险，此系与表现量低于该参考阀值者相比所得。

为了比较该标记基因之表现量及该参考值，可采用包括下列之统计方法，但并非用以限制，级别区分可使用非监督式分类法(例如：k平均法(k-means)、阶层式丛集法、主成分分析法、非负矩阵分解法、或多维尺度法)(Hastie et al.,2009)、监督式分类法(例如：判别分析、支持向量机、或k-最近邻法)、或半监督式分类法；或结果预测(例如：无复发存活期、疾病进程、或整体存活期)可使用Cox回归模型(Kalbfleisch and Prentice,2002)、加速失效时间模型、贝氏存活模型(Bayesian survival model)、或存活资料之平滑分析(Wand,2003)。

于一实施例中，与该参考值相较，该标记基因表现量增加系表示阳性临床预后之可能性提高，例如前列腺癌未复发之长期存活率。于另一实施例中，该标记基因表现量增加可表示阳性临床预后之可能性降低，例如前列腺癌之复发率。

于本发明中，该套组包括检测该分子标记表现量之工具，例如，一探针或一抗体。该套组可进一步包括对照组，例如可专一性键结至持家基因(housekeeping gene)或蛋白质之探针或抗体(例如，β-肌动蛋白、GAPDH、RPL13A、微管蛋白等)。

于一较佳实施例中，该套组可包含至少一核酸探针，其对ABCG1转录子、PDCD4转录子、或KLF6转录子具专一性；至少一对引子，可专一性扩增ABCG1、PDCD4、或KLF6；及/或至少一抗体，其对ABCG1蛋白质、PDCD4蛋白质、或KLF6蛋白质具专一性。该套组可进一步包含一核酸探针、引子、及/或一抗体，系对持家基因/转录子/蛋白质具专一性。

于一实施例中，该初级检测工具(如探针、引子、或抗体)可直接标记有荧光团、发色团、或能产生可测定产物之酵素(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、及其它本技术领域习知者)，或可应用次级检测工具，例如二次抗体或非抗体之不完全抗原(hapten)键结分子(如抗生物素蛋白或卵白素)。可将一可测定基团直接标记于该二次检测工具。于其它例子中，该二次或更高次之抗体可与不完全抗原(如生物素、DNP、或FITC)连接，该不完全抗原可藉由同源之不完全抗原键结分子(如链亲和素(streptavidin)辣根过氧化物酶、链亲和素碱性磷酸酶、或链亲和素QDotTM)检测得。于其它实施例中，该套组可进一步包括一呈色剂，系用于协助以酵素标记之初级、二次、或更高次检测工具，该酵素可以藉由该等呈色剂显色。

于一实施例中，该套组可进一步包括一阳性及/或阴性对照组样本，例如，包含或未包含该标记基因之转录产物之mRNA样本、包含或未包含该标记基因编码之蛋白质或区段蛋白质之蛋白质溶解物(lysate)、及/或已知可表现或未表现该标记基因之细胞株或组织。

于部分实施例中，该套组可进一步包括一载体，例如箱、袋子、药水瓶、管子、小包、塑料盒、包材、或其它容器。该套组之成分可以单剂为单位封装，且该单位可具有分隔而容置该套组之一个或多个成分；或，该套组可包含一或多个容器，以容置例如一种或多种待测生物性样本。于部分实施例中，该套组可进一步包括缓冲液及其它试剂，其可用于该预测方法之实施。

本发明之分子标记之组合可应用于微数组，如核酸数组或蛋白质数组。该微数组系包括一固态表面(如玻片)，于其上固定该专一性键结物(如cDNA探针、mRNA探针、或抗体)。于该数组上，该专一性键结物系位于一可寻址编排模式(如：网格)中。该专一性键结物系与存在于样本中之同源标的物产生交互作用。在所有固定物中之标的键结模式系提供了基因表现之图谱。

于一实施例中，该微数组系由对该等标记基因之至少两种之专一性键结物所构成，例如，由ABCG1、PDCD4、及KLF6专一性核酸探针或抗体所构成之微数组。该微数组可进一步包含对一种或多种持家基因或其基因产物(如mRNA、cDNA、或蛋白质)专一性之核酸探针或抗体。

该核酸探针或抗体所形成之数组可直接连结于一撑体上，或藉由作为间隔物或连结物之寡核苷酸或其它分子而接附至该撑体。该固态撑体可为玻璃玻片或以有机聚合物形成者。于本发明中，可应用不同的数组模式。例如，寡核苷酸条带之线性数组、不连续细胞之二维模式等。

以下藉由实施例详述本发明，除非另有指明，否则该等实施例系仅用于说明，并非意欲限制本发明。熟习本领域之技艺者可理解，在不悖离后附申请专利范围所界定之范畴下针对本发明所进行之各种变化或修改系落入本发明之一部分。

实施例

实施例1：鉴定与前列腺腺泡分化作用相关之基因表现图谱

前列腺之腺泡分化过程系藉由于生理学相关三维(3D)培养模式中培养前列腺上皮RWPE-1细胞(Bello et al.,1997)而再现，如参考文献(Weaver etal.,1997)所述。RWPE-1细胞为不死化前列腺上皮细胞，衍生自人类前列腺腺泡，已知可维持正常的细胞发生特征及功能特征(Bello et al.,1997)。将RWPE-1细胞植入3D重建基底膜胶(Matrigel,BD Biosciences)之厚层中并于此生长。该培养物系培养于添加牛脑下垂体萃取物、10ng/ml上皮生长因子、及抗生素(均购自Invitrogen)之Keratinocyte-SFM培养基(Sigma-Aldrich)中(Bello et al.,1997；Liu et al.,1998)。

如第1图所示，当于前述条件下培养短期间(48小时)，RWPE-1细胞形成小型细胞团，缺乏细胞极化作用或组织建构。接着延长于3D培养之时间(10-12天)，此等细胞有显著比例(平均93.1％)产生表型组织化，形成圆形、类腺泡结构，可联想到正常前列腺或低度PCA。共焦影像分析确认了该等结构系由具有顶部-底部极化作用之单层细胞所构成，如底部表面标记α6-整合素(红色)及顶部标记GM130(绿色)所指示，其环绕一中空的中央内腔(第1A图)。检验3D结构，显示高于93.1％之RWPE-1细胞形成极化之腺泡，而仅有非常少数的前列腺癌LNCaP细胞能够形成极化构造(第1B图)。

为了详细分析关于此种前列腺腺泡分化过程相关之基因表现之改变，以早期细胞培养形成之RWPE-1细胞团及晚期形成之腺泡进行整体基因表现图谱实验。简言之，使用TRIZOL(Invitrogen)抽取全RNA样本，接着以RNeasy迷你套组及DNase(Qiagen)处理进行纯化。进行三重复实验。以Affymetrix人类基因体U133A 2.0Plus基因芯片平台(购自Affymetrix)，根据操作手册进行基因表现分析。以基因芯片操作软件(GeneChip Operatingsoftware，购自Affymetrix)处理杂合强度数据，并以Affymetrix P/A/M flags为基础，筛选过滤基因，保留于至少一种培养条件中之重复样本之至少三个中表现之基因。为了在比较组别中选出区别性表现之基因，采用低于0.025之伪发现率。

表1提供了411个特定基因(以447Affymetrix探针组表现)之详细列表，系鉴定为在RWPE-1细胞之腺泡分化期间之区别性表现基因。该等基因系藉由微数组实验，以其表现量于RWPE-1细胞团与腺泡之间有显著差异，所鉴定出。依据各探针在RWPE-1腺泡与RWPE-1细胞团间之平均杂合强度之比例，将该等基因系以递减排序。

表1、于RWPE-1腺泡(A)及细胞团(C)中具区别性表现之411个基因(以447Affymetrix探针组表现)

于第2图中，基因本体功能群分析显示，于此411个基因组中，于前列腺腺泡分化期间为增量调控之该等基因，实质上多为关于上皮及外胚分化作用与上皮结构之维持(第2A图)，包含细胞角蛋白KRT15、KRT16及KRT4、角质细胞膜蛋白质SPRR1B及SPRR1A、层黏蛋白-5次单元LAMB3、缝隙连接蛋白质GJB6及GJB3、紧密连接蛋白质CLDN8、及分化相关转录因子KLF4及FOXQ1，以及，与前列腺之荷尔蒙与分泌功能相关之因子，包含类固醇与黄体激素代谢(HSD11B2,DHRS9)、黏蛋白或硫酸乙酰肝素生成(MUC1,HS3ST1)、亚精胺/精胺代谢(SAT1)、及生殖腺蛋白质(FST)(第2B图)。此等发现系强力支持本组织器官化模型，可作为获得前列腺结构及功能分化过程之特定分子讯号之确切途径。

实施例2

本实施例证实，带有分化之前列腺腺泡之411个基因表现图谱之前列腺癌系与较佳临床预后具关连性。

为了证实前列腺腺泡分化相关之分子图谱是否带有人类前列腺癌之重要预后信息，本实施例审视了已公开之以21位罹患局部性前列腺癌并接受根治性前列腺切除术之患者之基因表现微数组数据组(该等患者之切除术系于布莱根妇女医院(Boston,MA)进行，以下简称BWH组)(Singh et al.,2002)。以该411个腺泡分化相关基因之表现为基础，藉由计算皮尔森相关系数(r_acini)而测定该患者肿瘤与前列腺腺泡之间之相似程度。

于第3图中，依r_acini将病患区分为两次群，临界值系以最大尤登指数决定(Pepe,2003)。将具有较高r_acini之肿瘤定为「腺泡状」肿瘤，且，藉由卡普兰-梅耶分析(对数等级检定P＝0.009)发现，与具有较低相关值之病患相较，患有此类型肿瘤之病患具有显著较低之复发之风险。于具有腺泡状PCA之病患中，完全未复发之3年存活率预估为92.1％，而于较低r_acini群组中则为58.3％。

如表2所示，于一多变量Cox比例风险分析中，发现肿瘤之r_acini是复发之唯一显著预测者(风险比例＝0.173(0.041-0.725),P＝0.016)。

表2、藉由腺泡及临床及病理学标准，于该BWH组中以多变量Cox比例风险模块预测复发

表2

为评估前列腺腺泡之表现图谱对于前列腺癌之风险分级可多精确，此处以来自接受根治性前列腺切除术并后续追踪达5年之29位前列腺癌病患之独立肿瘤转录体数据组(Lapointe et al.,2004，以下简称Lapointe组)重复上述分析。

第4图显示，于此验证组(对数等级检定P＝0.032)中，具有较高r_acini之患者(即腺泡状肿瘤)表现较具有较低r_acini者佳；于具有较高r_acini组之病患中，完全未复发之18个月存活率预估为80％，而于较低关联值组中则为0％。

如表3所示，多变量Cox回归分析确认了r_acini系于前列腺癌中提供独立的预后信息，而于此组中格里森评分仅能提供轻微预后。

表3、藉由r_acini及临床及病理学标准，于Lapointe组中以多变量Cox回归模块预测复发

实施例3

本实施例系鉴定以前列腺腺泡分化相关之分子图谱为基础之前列腺癌之12-基因预后模块。

已确认于前列腺癌中，前列腺腺泡相关之表现图谱之预后值，此处意图完善此图谱、并定出较高临床应用性之较少基因数之组。为此，将该411个腺泡相关基因与该BWH数据组(Singh et al.,2002)进行比对，并以Cox模块为基础设定「复发级分」以预测根治性前列腺切除术后之肿瘤复发之发生率。本实施例采用前述监督式方法并进行调整(Wang et al.,2005)。简言之，对于每个基因，采用单变量Cox之回归分析以测量基因表现量(以log₂规格)与该BWH组之PCA患者之完全未复发之存活长度之间的关连性。本实施例建立了该组病患之1000个引导样本，并对各样本进行Cox之回归分析。接着，藉由计算该1000个引导样本之P-值中数及Cox系数中数，分别决定各基因之预估P-值及预估标准化Cox回归系数。为确保本模块之一致性，选择了于前列腺腺泡分化期间表现量改变之基因，且该等改变系与复发风险预期为阳性(于细胞团中增量调控之基因)或阴性(于前列腺腺泡中增量调控之基因)，如同以预估标准化Cox回归系数决定者。接着将所选基因依据预估P-值排列分级，以顶端前三个基因为起始组，自该递减排列之列表顶端开始每次重复添加一个或多个基因，藉此产生复数个基因组。接着，计算「复发级分」(方程式1)以测量针对一基因组之病患手术后复发之风险：

其中，k为探针组中的探针数量，b_i为第i个探针之标准化Cox回归系数，且x_i为第i个探针之log₂表现量。

针对各所选探针组，一致性指数(C-指数，C-index)系用于评估存活分析之预测正确性(Pencina and D'Agostino,2004)。于R语言统计编程(cran.r-project.org)中使用「survcomp」包装进行C-指数统计分析。选出达到最大预测正确性且包含最少数目基因之基因组，作为最适化之预后预测者。如第5图所示，由此方法选出一组之12个基因，如C-指数所评估，其预后预测之表现可达高峰。

表4显示所选择之12个基因之鉴定。

表4、12-基因印记之基因描述

第6图显示，以复发级分(方程式1)为基础，此12-基因印记之表现图谱可以藉由卡普兰-梅耶分析于该BWH组中(对数等级检定P＝0.0005)相当有效率地进行疾病复发之风险分级。

第7图显示，以该12-基因模块为基础而计算之复发级分亦可将该Lapointe et al.组之病患区分为于复发风险上具有显著差异之两群(对数等级检定P＝0.0455)。

如表5所示，多变量Cox回归分析系证实此12-基因模块可提供强力且独立之前列腺癌预后信息(风险比例＝42.304,P＝0.004)。

表5、藉由该12-基因模块及临床-病理学标准，于该BWH组中以多变量Cox回归模块预测复发

表6显示，该12-基因模块系显著增加了包含临床及病理变因之组合式临床模块之预后准确性(C-指数：由0.620至0.847)，且更优于先前报导之数种前列腺癌之预后基因印记(Glinsky et al.,2004；Singh et al.,2002)。

表6、于该BWH组中对不同预后预测模块之预测正确性(以C-指数评估)

^＊该5-基因印记包含染色颗粒素A(CHGA)、血小板衍生之生长因子受体β(PDGFRB)、同源框C6(HOXC6)、三磷酸肌醇受体3(IPTR3)、及唾液酸转移酶-1(ST3GAL1)。

该5-基因印记包含非铭印普瑞德-威氏/安裘曼氏症候群区域蛋白质2(NIPA2)或HGC5466、无翅型MMTV整合点家族，成员5A(WNT5A)、含DENN/MADD区域4B(DENND4B)或KIAA0476、肌醇1,4,5-三磷酸受体第1型(ITPR1)及转录因子2(TCF2)。

实施例4

本实施例详述表4所列之特定标记之预后值。

第8图显示表4中之12分子标记之大部分均可独立将该BWH群之前列腺癌病患分级成两群，具有明显不同之根治性前列腺切除术后复发风险。例外的是ANXA11及DSC2，仅提供轻微的预后(对数等级检定P>0.1)。另外一个例外为BANF1，所以该等标记系于前列腺腺泡中增量调控(相对于在细胞团中)(表4)，并相关于较低之疾病复发风险，显示它们作为组织分化及肿瘤抑制物之潜在角色。反之，BANF1之转录增加程度，在前列腺腺泡会被减量调控，故其为复发风险正相关者。

若可并入惯常病理学检验中，癌症生物标记可更具临床应用性。为了检测该12-基因模块之基因之预后相关性是否可于人类前列腺癌材料中于蛋白质及组织层级中观察到，测定包含PDCD4、ABCG1、及KLF6之三个选定标记之组织表现，系以来自接受根治性前列腺切除术并后续追踪达11年之61位早期前列腺癌患者之独立群组，以肿瘤组织之免疫组织化学染色进行(奇美医学中心，台湾，台南；简称CFMC组)。该等选定标记之专一性及病理学验证过之抗体为商业可购得，包含抗-ABCG1抗体(品系EP1366Y)、抗-PDCD4抗体(品系EPR3431)、及抗-KLF6抗体(均购自Epitomics,Burlingame,CA)。简言之，取得于奇美医学中心接受根治性前列腺切除术之61位患者之福尔马林固定、石蜡包埋之人类前列腺癌组织及相关临床数据，并依人体试验委员会所核准之计划(该CFMC组)进行实验。PCA之生化性复发系定义为前列腺专一性抗原(PSA)为至少0.4ng/ml、或两个连续的PSA值为0.2mg/ml且为升高(Stephenson et al.,2006)。将组织切片去石蜡、水合、浸泡于pH 6.0之柠檬酸延缓冲液中，以于微波中将抗原位恢复。内生性过氧化物酶活性系以3％过氧化氢酶骤冷15分钟，接着将玻片以10％一般马血清培养以阻断非专一性免疫反应。接着施用抗体并以DAKO EnVision套组(DAKO)检测。所有免疫组织化学(IHC)染色均由相同病理学专家评估，且该染色型态系以组织学评分(H-评分)量化(Budwit-Novotny et al.,1986)。

第9图显示于PCA组织中，PDCD4(i、ii)、KLF6(iii、iv)、及ABCG1(v、vi)之代表性之免疫染色(400×放大倍率)。所用抗体包含抗-ABCG1抗体(品系EP1366Y)、抗-PDCD4抗体(品系EPR3431)、及抗-KLF6抗体(均购自Epitomics,Burlingame,CA)。所显示为具有各标记之高染色强度(i、iii、v)或低染色强度(ii、iv、vi)之肿瘤。

如第10图所示，以H-评分评估之PDCD4染色强度显示了与卡普兰-梅耶分析(对数等级检定P<0.001)进行之手术后生化性复发风险之强烈的负相关性。类似地，亦发现，与较低染色强度者相较，KLF6或ABCG1之肿瘤染色强度系与明显较长之无复发存活期相关(对数等级检定分别为P<0.001)。

如表7所示，多变量Cox回归分析证实，PCDC4、ABCG1、或KLF6系强力预后信息，且独立于临床标准及格里森评分。

表7、藉由PCDC4、KLF6、或ABCG1之染色强度及临床-病理学标准，于该CFMC组中以多变量Cox回归模块预测复发

实施例5

本实施例系详述以PDCD4、ABCG1、及KLF6表现量为基础之前列腺癌之3-基因预后模块。

于实施例4中，该前列腺癌之12-基因模块中之三个基因标记，包含PDCD4、ABCG1、及KLF6，可藉由前列腺肿瘤组织之免疫组织化学染色检验。该等标记之个别染色强度显示了与手术后生化性复发风险之强烈的负相关性(第10图)。同理，PDCD4、ABCG1、或KLF6之mRNA表现量显示了与手术后疾病复发风险之强烈的负相关性(第8图)。因此，进行是否可使用PDCD4、ABCG1、及KLF6之表现量以建立前列腺癌之3-基因预后模块。对此，以染色强度为基础而计算复发级分(方程式1)，如H-评分所量化之该CFMC组之PDCD4、ABCG1、及KLF6。依据该复发级分及以最大尤登指数决定之临界值(Pepe,2003)，病患可被区分成两次群，具有手术后生化性复发之高风险或低风险。

如第11图所示，基于该复发级分，PDCD4、ABCG1、及KLF6之染色强度可以于该CFMC组中，藉由卡普兰-梅耶分析而有效地进行疾病复发之风险分级(风险比例＝30.2，对数等级检定P<0.0001)。显然，在低风险群之病患中，并无于整体追踪期间复发疾病者。反之，高风险群之病患之存活期中数为4.833个月。

如表8所示，多变量Cox回归分析证实，该3-基因模块系提供最强力之前列腺癌预后信息，其独立于临床标准及格里森评分(风险比例＝22.591,P＝0.004)。

表8、藉由3-基因模块及临床-病理学标准，于该CFMC组中以多变量Cox回归模块预测复发

表9显示，依据C-指数数值(Pencina and D'Agostino,2004)，该3-基因模块之预测正确性可达0.951，显然优于藉由C-统计之预测正确性为0.695之组合式临床模块(包含年龄、肿瘤阶段、血清PSA、及格里森评分)(P＝0.001)。

表9、于该CFMC组中，3-基因模块及临床-病理学标准之预测正确性(以C-指数评估)

证实该前列腺癌之3-基因预后模块之较佳表现后，接着测试其对于BWH组之表现。于此数据组，使用PDCD4、ABCG1、及KLF6之转录表现量以计算该复发级分，并将该等病患分成两次群，具有手术后复发之高风险或低风险，且以最大尤登指数决定之临界值。

第12图显示，基于该复发级分(方程式1)，PDCD4、ABCG1、及KLF6之转录程度可以于该BWH组中，藉由卡普兰-梅耶分析而有效地进行疾病复发风险之分级(风险比例＝12.0，对数等级检定P＝0.0005)。

如表10所示，多变量Cox回归分析证实，该3-基因模块系提供最强力且独立之前列腺癌预后信息，其手术后疾病复发率之风险比例达59.551(P＝0.006)。

表10、藉由3-基因模块及临床-病理学标准，于该BWH组中以多变量Cox回归模块预测复发

表11显示，依据C-指数，该3-基因模块于该BWH组之预测正确性可达0.939(P<0.001)，显然可增进组合式临床模块(包含年龄、肿瘤阶段、血清PSA、及格里森评分)之预测正确性(P＝0.002)，组合式临床模块本身并不具备明显的预后数值(C-指数＝0.617,P＝0.113)。

表11、于该BWH组中，3-基因模块及临床-病理学标准之预测正确性(以C-指数评估)

实施例6

本实施例系详述以PDCD4及ABCG1表现量为基础之前列腺癌之2-基因预后模块。

已验证PDCD4及ABCG1之表现量可被用于建立有效之前列腺癌之2-基因预后模块。以染色强度为基础而计算复发级分(方程式1)，如H-评分所量化之该CFMC组之PDCD4及ABCG1。以最大尤登指数决定之临界值。依据该复发级分及以最大尤登指数决定之临界值，病患可被区分成两次群，具有手术后生化性复发之高风险或低风险。

第13图显示，基于该复发级分，PDCD4及ABCG1之染色强度可以于该CFMC组中，藉由卡普兰-梅耶分析而有效地进行疾病复发风险之分级(风险比例＝15.6，对数等级检定P＝0.009)。

如表12所示，多变量Cox回归分析证实，该2-基因模块系提供最强力之前列腺癌预后信息，其独立于临床标准及格里森评分(风险比例＝16.25，P＝0.002)。

表12、藉由2-基因模块及临床-病理学标准，于该CFMC组中以多变量Cox回归模块预测复发

表13显示，依据C-指数数值，该2-基因模块之预测正确性可达0.915，很显然地优于组合式临床模块(包含年龄、肿瘤阶段、血清PSA、及格里森评分)(P＝0.012)。

表13、于该CFMC组中，2-基因模块及临床-病理学标准之预测正确性(以C-指数评估)

接着测试具有21位患者之BWH组中，该2-基因预后模块之表现。于此数据组中，使用PDCD4及ABCG1之转录表现量以计算复发级分，并将病患分为两次群：手术后复发高风险或低风险者。

第14图显示，基于该复发级分，PDCD4及ABCG1之转录表现量可以于该BWH组中，藉由卡普兰-梅耶分析而有效地进行疾病复发风险之分级(风险比例＝6.8，对数等级检定P＝0.009)。

如表15所示，多变量Cox回归分析证实，该2-基因模块系提供最强力且独立之前列腺癌预后信息，其手术后疾病复发率之风险比例达139.963(P＝0.048)。

表14、藉由2-基因模块及临床-病理学标准，于该BWH组中以多变量Cox回归模块预测复发

表15显示，依据C-指数，该2-基因模块于该BWH组之预测正确性可达0.875(P<0.001)，显然可增进组合式临床模块(包含年龄、肿瘤阶段、血清PSA、及格里森评分)之预测正确性(P＝0.022)。

表15、于该BWH组中，2-基因模块及临床-病理学标准之预测正确性(以C-指数评估)

如表16所示，比较上述12-基因模块、3-基因模块及2-基因模块对于该BWH组病患之前列腺癌临床预后之预测正确性。很显然地，该3-基因模块与该12-基因模块表现一样好(分别为C-指数0.939、P<0.001)。虽然2-基因模块表现略微逊色于12-基因或3-基因模块(C-指数＝0.875，P<0.001)，但C-指数上的差异并不具有统计显著性(P＝0.134)。

表16、12-基因模块、3-基因模块及2-基因模块对BWH组之预测正确性

N.A.：未采用

进一步比较3-基因模块及2-基因模块对该CFMC组病患之预后预测之表现。如表17所示，3-基因模块表现较2-基因模块稍佳，尽管并无统计上之显著差异性(P＝0.195)。

表17、3-基因模块及2-基因模块对CFMC组之预测正确性

N.A.：未采用

实施例7

本实施例系详述以实施例3所示之12-基因预后模块为基础，对于前列腺癌病患之预测复发率之计算及预期无复发存活。

如实施例3所述，可量测一前列腺癌病患之手术后复发率以所选基因组计算复发级分针对已知复发级分之病患，该病患于时间点t之复发风险率可藉由Cox回归评估，且该风险率可以h(t)＝h₀(t)exp(bx)表示，其中x为复发级分之值，b为回归系数，及h₀(t)为风险基准函数。于时间点t之预测之复发率可依下列方程式评估：

F(t)＝1-S₀(t)^exp(bx)  (方程式1)

其中，为无复发基准函数。该等计算可以商业可购得软件(如SPSS软件(IBM)等)进行。又，复发时间中数可由F(t)＝1-S₀(t)^exp(bx)(方程式1)，设定F(t)＝0.5而解决。

举例而言，对于BWH组之病患之复发级分，可依该标的之12基因标记之转录表现程度为基准，以下列方程式计算：

$\begin{array}{c}x=10.028+(-1.636\mathrm{ABCG}1-1.74\mathrm{ANXA}11+1.811\mathrm{BANF}1\\ -1.345\mathrm{BTD}-0.711\mathrm{DSC}2-1.844\mathrm{DUSP}2-1.419\mathrm{IRS}1\\ -1.000\mathrm{KLF}4-2.601\mathrm{KLF}6-2.185\mathrm{PDCD}4\\ -2.028\mathrm{ST}6\mathrm{GALNAC}2-1.488\mathrm{ZNF}185)/12\end{array}$    (方程式2)

预估Cox回归为h(t)＝h₀(t)exp(1.490x)。复发函数可由下列表示：

F(t)01-S₀(t)^exp(1.490x)  (方程式3)

所预估之S₀(t)之值系显示于表18。

表18、以12-基因模块所计算之复发级分为基准，依Cox回归预估之该BWH组病患之疾病复发基准率

故，依列于表中之该病患之12基因标记转录表现量，可依F(t)01-S₀(t)^exp(bx)   (方程式1)、 $\begin{array}{c}x=10.028+(-1.636\mathrm{ABCG}1-1.74\mathrm{ANXA}11+1.811\mathrm{BANF}1\\ -1.345\mathrm{BTD}-0.711\mathrm{DSC}2-1.844\mathrm{DUSP}2-1.419\mathrm{IRS}1\\ -1.000\mathrm{KLF}4-2.601\mathrm{KLF}6-2.185\mathrm{PDCD}4\\ -2.028\mathrm{ST}6\mathrm{GALNAC}2-1.488\mathrm{ZNF}185)/12\end{array}$ (方程式2)、及表12而预测该病患之复发率及预期之完全未复发之存活率。表19显示选自BWH组之4位病患之预测结果。

表19、以12-基因模块预测之选自BWH组病患之3年复发率及无复发存活率

＊转录表现量，以Affymetrix U95Av2数组(Affymetrix)测量，并以探针杂合强度表现。该数据系由http://www-genome.wi.mit.edu/MPR/prostate(Singh et al.,2002)下载。

实施例8

本实施例系详述以实施例5所示之3-基因预后模块为基础，对于前列腺癌病患之预测复发率之计算及预期无复发存活。

实施例7之相同原理亦可应用于如实施例5所示之3-基因模块，以预测CFMC组病患之复发率及预期无复发存活率。依据

可依下列方程式，以H-评分表示之于该病患肿瘤中PDCD4、ABCG1、及KLF6之染色强度为基础，计算CFMC组病患之复发级分：

x＝7.112+(-2.771ABCG1-2.814KLF6-3.442PDCD4)/3   (方程式5)。

预估Cox回归为h(t)＝h₀(t)exp(1.235x)。复发函数可由下列表示：

F(t)＝1-S₀(t)^exp(1.235x)   (方程式6).

所预估之S₀(t)之值系显示于表20。

表20、以3-基因模块所计算之复发级分为基准，依Cox回归预估之该CFMC组病患之疾病复发基准率

因此，对于ABCG1、PDCD4及ABCG1之染色强度为已知之CFMC组之任何病患，所预测之3年复发率、5年复发率及预期无复发存活率可依x＝7.112+(-2.771ABCG1-2.814KLF6-3.442PDCD4)/3  (方程式5)、F(t)＝1-S₀(t)^exp(1.235x)  (方程式6)、及表20计算。表21显示选自CFMC组之4位病患之预测结果。

表21、以3-基因模块预测之选自CFMC组病患之3年复发率、5年复发率、及无复发存活率

以相同原理，可以ABCG1、PDCD4、及KLF6之转录表现量为基础，依下列方程式计算复发级分：x＝16.682+(-1.636ABCG1-2.601KLF6-2.185PDCD4)/3)  (方程式7)。

预估Cox回归为h(t)＝h₀(t)exp(0.672x)，且复发函数可依F(t)＝1-S₀(t)^exp(0.672x)  (方程式8)而计算。

所预估之S₀(t)之值系显示于表22。

表22、以3-基因模块所计算之复发级分为基准，依Cox回归预估之该BWH组病患之疾病复发基准率

表23显示选自BWH组之4位病患之预测之3年复发率及无复发存活率。

表23、以3-基因模块预测之选自BWH组病患之3年复发率及无复发存活率

依据上述结果，本发明系提供预测前列腺癌之临床预后之分子标记之组合。与已知模式相较，本发明系显示更佳的正确性，且更适于临床应用。

Claims (19)

1.一种预测已检测得前列腺癌之人类病患之临床预后之方法，系包括：

由该人类病患所得之包含前列腺癌细胞之生物性样本中，检测由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4及DSC2所成群组之一种或多种标记基因之表现量；以及

藉由该标记基因之表现量与参考值之比较，预测临床预后之可能性。

2.如权利要求1之方法，其中，该临床预后系选自疾病进程之可能性、临床预后、复发率、死亡率、或前述任意之组合。

3.如权利要求1之方法，其中，该临床预后系包括：一时间间距，系介于疾病检测或手术之日期至疾病复发或转移之日期；一时间间距，系介于疾病检测或手术之日期至病患死亡之日期；前列腺癌之可测量肿瘤病灶之数量、尺寸、体积之至少一项之变化；或前述之任意组合。

4.如权利要求2之方法，其中，该疾病进程系包括前列腺癌之分类、前列腺癌细胞分化程度之测定、或其组合。

5.如权利要求1之方法，其中，该标记基因系选自由ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群组之一种或多种。

6.如权利要求1之方法，其中，该标记基因为ABCG1及PDCD4之组合。

7.如权利要求1之方法，其中，该标记基因之表现量系以该标记基因之RNA转译子或该标记基因之表现产物为基础而测定。

8.如权利要求1之方法，其中，该标记基因之表现量系藉由聚合酶连锁反应(PCR)、北方墨点试验、RNA酶保护试验、微数组试验、RNA原位杂合反应、免疫转渍试验、免疫组织化学法、二维蛋白质电泳、质谱分析试验、或前述之任意组合。

9.如权利要求1之方法，其中，该生物性样本系以抽吸术、活检、或手术切除术取得。

10.如权利要求1之方法，其中，该参考值系以一前列腺癌病患族群中，经常态化之该标记基因之表现量为基准而决定。

11.如权利要求1之方法，其中，当该标记基因之表现量增加，表示阳性临床预后之可能性为增加或减少。

12.如权利要求10之方法，其中，该阳性临床预后系包括无前列腺癌复发之长期存活率、或前列腺癌病患之长期整体存活率。

13.一种用于预测前列腺癌之临床预后之分子标记组合，系包括ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2中之至少二者。

14.如权利要求13之分子标记组合，其中，该至少二个分子标记系选自由ABCG1、PDCD4、及KLF6所成群组。

15.如权利要求13之分子标记组合，其中，该临床预后该临床预后系包括疾病进程、临床预后、复发率、死亡率、或前述任意之组合。

16.如权利要求15之分子标记组合，其中，该疾病进程系包括前列腺癌之分类、前列腺癌细胞分化程度之测定、或其组合。

17.一种用于预测前列腺癌之临床预后之套组，系包括一种检测选自由ABCG1、PDCD4、KLF6、ST6、BTD、BANF1、IRS1、ZNF185、ANXA11、DUSP2、KLF4、及DSC2所成群组之一种或多种标记基因之表现量之工具。

18.如权利要求17之套组，其中，该标记基因之表现量系以该标记基因之RNA转译子或该标记基因之表现产物为基础而测定。

19.如权利要求17之套组，其中，该工具系包括核酸探针、适配体、抗体、或前述之任意组合。