CN105722998A

CN105722998A - 预测乳腺癌复发

Info

Publication number: CN105722998A
Application number: CN201480061817.8A
Authority: CN
Inventors: 凯瑟琳·A·施纳贝尔; 丹尼斯·C·斯格罗伊; 张毅; 布罗克·施罗德; 马克·G·埃兰德
Original assignee: bio Theranostics Inc
Current assignee: bio Theranostics Inc
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2016-06-29
Also published as: ES2829912T3; IL276505B; EP3044335A4; IL244554A0; MX2021002014A; EP3044335A1; US20150203921A1; BR112016005225B1; MX2016002938A; WO2015038682A1; CA2923606A1; IL244554B; US20220186317A1; EP3044335B1; IL276505A; BR112016005225A2; JP2016536004A

Abstract

提供了确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法。还提供了确定对受乳腺癌困扰的受试者的治疗的反应的方法。另外还提供了治疗受乳腺癌困扰的受试者的方法。

Description

预测乳腺癌复发

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年9月11日提交的美国临时申请No.61/876,757的权益，并且在此通过参引方式将其全部引入本文。

技术领域

本公开内容涉及具有乳腺癌复发临床相关性的基因表达图谱或者模式的鉴定和使用。特别是，本公开内容提供了用于确定使用抗乳腺癌疗法例如辅药它莫昔芬或者芳香化酶抑制剂进行的初始治疗后癌症复发的可能性的分析。

背景技术

雌性激素受体阳性乳腺癌是一种具有长期复发风险的疾病。在5年的辅药它莫昔芬后，患者被诊断具有疾病复发和死亡的持续风险至少15年。来自辅药芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑、它莫昔芬的单独的关键性预先试验或者与组合(ATAC)试验以及乳腺国际组织(BIG)1-98研究(Cuzick等，2010)的长期追踪显示，在初始治疗后每年有约2％的连续复发比例，且在辅药内分泌疗法5年后超过所有复发的一半。这些发现强调了对扩展辅药疗法以及能够指导治疗决策过程的生物标记物的需要。

在过去10年所研究的用于估测雌性激素阳性乳腺癌的复发风险的多基因表达签名主要依赖于增殖相关基因表达的定量测量。这些多基因签名包括21-基因复发打分(OncotypeDX；GenomicHealth,RedwoodCity,CA,USA)是远处复发的强的预测因子，但是它们的预后能力在估测从诊断开始超过5年的风险减弱(Sgroi等，2012)。相反，后期复发的预测因子没有得到很好的表征，并且不同的机制可能与前期和后期复发相关联。需要生物标记物来鉴定采用仅5年的内分泌疗法就已经得到充分治疗的患者，并且反过来鉴定后期复发风险增加的可能需要扩展的辅药内分泌或者其他疗法的那些患者。

以前的工作发展并且确认了乳腺癌指数(BCI)分析法，该分析法由两个独立发展的基因表达生物标记物集组成：分子等级指数(MGI)和HOXB13/IL17BR。MGI，一种涵盖肿瘤等级和增殖的五基因预测因子，在患有雌性激素阳性乳腺癌的患者中具有高度的预后能力。HOXB13/IL17BR是独立发展的肿瘤等级或增殖，对前期和后期远处复发具有预后能力，并且在患有前期雌性激素阳性乳腺癌的患者中具有对扩展的辅药芳香化酶抑制剂的益处具有预测能力。所述BCI和21-基因复发打分分析法这两者都通过定量实时PCR测量基因表达，不过它们在其所检测的基因上存在差异。IHC4是测量如下四种信息最丰富的免疫组织化学生物标记物的蛋白表达的另一种预后模型：雌性激素受体、孕酮受体、HER2和Ki-67(Cusick等，2011)，它们当中没有一个是由BCI分析法中的基因所编码。BCI还没有在患有雌性激素阴性或者三重阴性乳腺癌的患者中用来估测过。参见美国专利7,930,105和7,504,214，美国专利公报2011/0136680和2013/0281502以及PCT专利公报WO/2012/079059。

因此，用于针对患有雌性激素阳性乳腺癌的患者的后期复发以改善扩展辅药内分泌疗法的生物标记物显然是需要的。本发明满足了这种需要。

发明内容

本公开内容部分地基于如下发现：(a)在BCI分析中可以有效地利用两类别方案(高度风险、低度风险)以避免现有技术中中度风险分类的不确定性；(b)对于复发风险，线性BCI模型(BCI-L)比立方体模型(BCI-C)具有优越的预后能力；以及(c)上述发现能够更简单且更精确地应用BCI来提供能够用于选择治疗选项的预后信息例如癌症复发以及预测信息如对某些疗法的反应。

本文提供了确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法。所述方法包括：(a)确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的多个基因的mRNA表达水平；以及(b)根据在诊断乳腺癌疾病时所述多个基因的所述mRNA表达水平的分析，对所述受试者是否具有低度的或者高度的癌症复发风险进行分类。在该方法中，所述多个基因的分析提供了在接受约5年的辅药疗法后的癌症复发风险，所述癌症复发风险在比较具有超过5年的结果或者其代表性样品的回溯性(retrospective)ER+乳腺癌患者数据集时在低度风险组中为小于约5％。在很多实施方式中，所述受试者已经接受约5年的辅药疗法并且在该疗法后是没有疾病的。

因此，在一些实施方式中，本发明涉及确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法。所述方法包括：

确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的HoxB13、IL17BR、Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表达水平；

对所述表达水平进行求和，从而形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较高的BCI值与较高的癌症复发风险相关联，而较低的BCI值与较低的癌症复发风险相关联；以及

根据BCI值，将样品分类为指示在所述患者中具有低度的或者高度的癌症复发风险而没有中度风险类别。

在其他一些实施方式中，本发明涉及确定对受乳腺癌困扰的受试者的治疗的反应的方法。所述方法包括：

对所述表达水平进行求和，从而形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行五年以下的初始治疗后对使用芳香化酶、靶向疗法或者内分泌疗法进行的额外治疗的反应相关联；以及

根据BCI值，将样品分类为指示具有所述反应或者缺乏所述反应。

另外，本发明还涉及治疗受乳腺癌困扰的受试者的方法。所述方法包括：

对所述表达水平进行求和，从而形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与(a)使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行五年以下的初始治疗后对使用芳香化酶、靶向疗法或者内分泌疗法进行的额外治疗的反应和(b)较低的远处复发风险相关联；以及

根据针对该受试者的BCI值确定结果，治疗该受试者。

附图说明

图1是针对本文所述的统一标准(consort)的ATACCONSORT图。

图2是显示基于针对所有ER+N0患者中的总共10年远处复发的BCI-C和BCI-L的预定风险组的效能的图。图A-BCI-C；图B-BCI-L。

图3是显示作为ER+N0患者中的连续BCI-线性指数的因变量的总共10年远处复发风险的图。

图4A和4B是显示基于针对所有ER+N0HER2阴性患者中的总共10年远处复发的BCI-C和BCI-L模型的预定风险组的效能的图。图A)BCI-C；图4B)BCI-L。

图5A和5B是显示针对ER+N0患者中的前期和后期远处复发的BCI预定风险组的效能的图。5A)前期0至5年远处复发；5B)后期5至10年远处复发。群体PI是指预定低度的和中度的风险组而P2是指前期复发风险组。P3是指预定的低度风险组，而P4是指针对后期复发的中度和高度风险组。

图6A和6B是显示作为ER+N0患者中的连续BCI指数的因变量的前期和后期远处复发风险的图。6A)前期0至5年远处复发风险；6B)后期5至10年远处复发风险。竖直线条描绘了低度、中度(中间)和高度预定BCI风险组之间的边界。

图7是显示针对ER+N0HER2阴性患者的前期和后期远处复发的BCI预定风险组的效能的图。图A–前期(0至5年)远处复发；B)后期(5至10年)远处复发风险。

图8是显示作为ER+N0HER2阴性患者中的BCI指数的因变量的前期(0至5年)和后期(5至10年)远处复发风险的图。图A–前期远处复发风险；图B–后期远处复发风险。

图9是显示针对NR+N0患者(组合的两臂和独立的阿那曲唑(ANA)和它莫昔芬(TAM)臂)中的总共10年远处复发的IHC4的事后分析确定类别风险组和BCI和RS的预定风险组的效能的图。图A–组合的两臂；图B–组合的两臂中的RS；图C–组合的两臂中的IHC4；图D–单独的阿那曲唑臂的BCI；图E–单独的阿那曲唑臂的RS；图F–单独的阿那曲唑臂的IHC4；图G–单独的它莫昔芬臂的BCI；图H–单独的它莫昔芬臂的RS；图I-单独的它莫昔芬臂的IHC4。

图10是显示针对ER+结节阳性患者中的总共10年的远处复发的预定风险组的效能的图。

具体实施方式

本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”拟指也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。另外，“或者”的使用拟指包括“和/或”，除非上下文另有明确说明。

定义

基因表达“模式”或者“图谱”或者“签名”是指两个或者多个临床结果、癌症结果、癌症复发和/或存活结果之间的一种或者多种基因的相对表达，其与区分所述结果的能力相关联。在一些情况中，所述结果是乳腺癌的结果。

“基因”是编码离散产物(不管性质上是RNA还是蛋白)的多核苷酸。应当理解的是，多于一种多核苷酸可以能够编码离散的产物。该术语包括编码相同产物及其根据染色体定位和正常有丝分裂过程中重组的能力为功能相关(包括功能的获得、失去或调节)的基因的等位基因和多态性。

术语“相关联”或“相关”或者其等同措辞是指通过使用本文所述的方法鉴定的一个或者多个基因的表达和细胞的生理学状态(排除一种或者多种其他状态)之间的相关性。基因可以以较高水平或者较低水平表达，但是仍然与一种或者多种癌症状态或者结果相关联。

“多核苷酸”是具有任意长度的核苷酸(不管是核糖核苷酸还是多氧核糖核苷酸)的聚合物形式。这个术语仅指分子的初级结构。因此，这个术语包括双链和单链DNA和RNA。它还包括已知类型的改变形式，包括本领域已知的标签、甲基化、“帽”、使用类似物对一种或者多种天然存在的核苷酸进行的取代、和核苷酸内部的修饰例如无电荷连接(例如硫代磷酸、二硫代磷酸等)以及多核苷酸的无修饰形式。

术语“扩增”以广泛的含义使用，是指形成扩增产物可以通过采用DNA或者RNA聚合酶以酶法例如使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)实现。本文使用的“扩增”一般是指生成所需序列尤其是样品的那些的多个拷贝的过程。“多个拷贝”是指至少两个拷贝。“拷贝”不一定是指与模板序列的互补或者等同的完美序列。

对应是指核酸分子与另一个核酸分子共有实质量的序列同一性。实质量是指至少95％、一般至少98％以及更一般为至少99％，并且序列同一性使用如Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)(使用公开的缺省设定，即参数w＝4，t＝17)中所述的BLAST算法确定。用于扩增mRNA的方法通常在本领域中是已知的，并且包括逆转录PCR(RT-PCR)以及美国专利6,794,141中描述的那些方法。可以使用的另一种方法是定量PCR(或者Q-PCR)。作为选择，RNA可以通过本领域已知的方法直接标记为对应的cDNA。

“微阵列”是形成在固体支持物例如但不限于玻璃、塑料或者合成膜上的优选具有离散区域(各个具有所限定的面积)的线性或者二维阵列。微阵列上的离散区域的密度通过拟在单个固相支持物的表面上进行检测的固定多核苷酸的总数来确定，优选为至少约50/cm²、更优选为至少约100/cm²、甚至更优选为至少约500/cm²，但是优选为小于约1,000/cm²。优选的是所述阵列包含总共为至少约500、约1000、约1500、约2000、约2500、或者约3000的固定多核苷酸。本文使用的DNA微阵列是布置在芯片或者其他表面上用于杂交来自样品的扩增或者克隆的多核苷酸的低聚核苷酸或多核苷酸的阵列。由于阵列中的每一个特定的引物组的位置是已知的，因此样品多核苷酸的身份可以根据它们与微阵列中的特定位置的结合来确定。

因为所公开内容依赖于对过表达或者低表达的基因的鉴定，所以所公开内容的一个实施方式涉及通过样品细胞的mRNA或者其扩增本或克隆本与对于特定的基因序列而言是唯一的多核苷酸的杂交来确定表达。优选的这种类型的多核苷酸包含基因序列的在其他基因序列中没有发现的至少约20、至少约22、至少约24、至少约26、至少约28、至少约30、或者至少约32个连续的碱基对。在前个句子中使用的术语“约”是指所述数值增加1或者减去1。甚至更优选的是一个基因序列的在其他基因序列中没有发现的至少或约50、至少或约100、至少或约150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、或者至少或约400个碱基对。在前个句子中使用的术语“约”是指所述数值增加或者减少10％。这些多核苷酸还指能够与本文所述的基因的序列或者其独特部分杂交的多核苷酸探针。优选的是，所述序列是由所述基因编码的mRNA的那些序列，与这些mRNA对应的cDNA和/或这些序列的扩增本。在所公开内容的一些优选的实施方式中，所述多核苷酸探针被固定在定位该探针的阵列、其他装置或者单个点上。

在所公开内容的另一个实施方式中，所公开的序列的所有或者一部分可以通过诸如聚合酶链式反应(PCR)或者其变化方式例如但不限于定量PCR(Q-PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)和实时PCR(可选为实时RT-PCR)等方法进行扩增和检测。这些方法将利用能够与所公开的序列的部分互补的一个或者两个引物，其中所述引物被用来引导核酸的合成。新合成的核酸可选地进行标记并且可以被直接检测或者通过所公开内容的多核苷酸的杂交进行检测。新合成的核酸可以与所公开内容的多核苷酸(包含序列)在允许它们杂交的条件下接触。

作为选择并且在所公开内容的另一个实施方式中，基因表达可以使用对细胞样品中的个体基因产物(蛋白质)的一个或者多个表位具有特异性的一种或者多种抗体分析该样品中的感兴趣的表达蛋白来确定。这些抗体优选被标记以允许它们在结合至基因产物之后容易地进行检测。

术语“标签”是指能够生成指示所标记的分子的存在的可检测信号的组合物。适当的标签包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分以及类似的标记等。因此，标记是能够通过光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学法、光学法或者化学法检测的任意组合物。

术语“支持物”是指常规支持物例如珠子、颗粒、浸量尺、纤维、过滤器、膜和硅烷或者硅酸盐支持物例如载玻片等。

本文使用的“癌症组织样品”或者“癌症细胞样品”是指从受相应癌症困扰的个体分离的含细胞的组织样品。所述样品可以来自通过外科手术例如活检法取下的材料。这样的样品是基础分离物(不同于培养的细胞)并且可以通过本领域认识到的任意适当方式收集。在一些实施方式中，“样品”可以通过非介入性方法包括但不限于磨蚀(abrasion)或者细针抽吸来收集。

“乳腺组织样品”或“乳腺细胞样品”是指从被怀疑受乳腺癌困扰或者存在患上乳腺癌风险的个体分离的乳腺组织或者流体的样品。这样的样品是基础分离物(不同于培养的细胞)并且可以通过任意非介入式方法进行收集，所述非介入式方法包括但不限于导管灌洗法、细针抽吸法、针式活检法、以及在美国专利No.6,328,709中描述的装置和方法、或者本领域认识的任意其他合适的方法。作为选择，“样品”可以通过介入式方法包括但不限于外科手术活检法进行收集。

“表达”和“基因表达”包括核酸材料的转录和/或翻译。当然，该术语还可以限于指(如果有这样指明的话)仅限于核酸的转录。

本文使用的术语“包含”及其类似的术语以它们非封闭式的意思使用；即，等同于术语“包括”及其对应的类似的术语。

“允许”事件发生的条件或者“适合”于诸如杂交、链延伸此类的事件发生的“条件”或者“适当”的条件是不妨碍这些事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或引导所述事件的发生。这些条件，如本领域已知的以及本文所述的，取决于例如核苷酸序列的性质、温度和缓冲条件。这些条件还取决于所希望发生的事件，例如杂交、切割、链延伸或转录。

本文使用的术语序列“突变”是指与对照序列相比本文所公开的感兴趣的基因的序列中所出现的任意序列改变。序列突变包括序列中由诸如取代、缺失或插入之类的机制造成的单个核苷酸变化或者多于一个核苷酸的改变。单核苷酸多态性(SNP)也是本文所使用的一个突变。因为本公开内容基于基因表达的相对水平，所以本文所公开的基因的非编码区的突变在所公开内容的实施中也进行分析。

“检测”包括任意检测方式，包括基因表达以及其中的变化的直接和间接检测。例如，“检测到较少的”产物可以直接观测或者间接观测，并且该术语指示任意的降低(包括可检测信号的缺乏)。类似的，“检测到较多的”产物是指任意增加，不管是直接观测还是间接观测。

所公开的序列的被评价的两个条件之间的表达差异(例如高度或低度的复发风险)基于所述两个条件之间的表达变化百分比或者倍数而在如下术语中定义。两个条件之间的差异可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、或者200％。

作为选择，从一个条件到另一个条件的倍数增加或降低可以为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、或10。

除非另有说明，否则本文使用的所有的技术和科学术语具有本公开内容所属的技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明部分地基于下文将进一步讨论的若干发现。第一个发现是两个类别方案(高度风险、低度风险)可以有效地被用在BCI分析中以避免现有技术中中度风险类别的不确定性。参见例如下文的实施例2。第二个发现是线性BCI模型(BCI-L)对复发风险具有比立方体模型(BCI-C)优越的预后能力。这些发现允许更简单并且更精确地使用BCI来提供预后信息例如癌症复发以及预测信息例如对某些疗法的反应，这些信息可以用于选择疗法选项。因此，BCI可以鉴定具有复发风险低于5％的低度风险组，涵盖超过60％的乳腺癌患者(实施例2)。这使得经历过初始疗法的超过60％的患者放弃扩展治疗而几乎没有复发风险。

作为通过分析本文所公开的表达模式来确定预后和/或癌症复发的方法，本文提供了这些优点。因此，在先前可能使用主观解释来确定癌症患者的预后和/或治疗的情况中，这个公开内容提供了客观的基因表达模式，该基因表达模式可以单独使用或者结合主观标准使用以提供更加精确的患者结果的评价，包括癌症的复发和存活。

因此，在一些实施方式中，提供了确定受乳腺癌困扰的受试者的癌症复发风险的方法。所述方法包括：(a)确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的多个基因的mRNA表达水平；以及根据在诊断乳腺癌疾病时所述多个基因的所述mRNA表达水平的分析，对所述受试者是否具有低度的或者高度的癌症复发风险进行分类。在这个方法中，所述多个基因的分析提供了在接受约5年的辅药疗法后的癌症复发风险，所述癌症复发风险在比较带有超过5年的结果或者其代表性样品的回溯性ER+乳腺癌患者数据集时在低度风险组中为小于约5％。在很多实施方式中，所述受试者已经接受约5年的辅药疗法并且在该疗法后是没有疾病的。

这些方法可以只使用低度和高度的风险分类实施。在一些替代性的实施方式中，也分类有中度风险类别。

在一些实施方式中，所述低度风险组包含超过50％的数据集。在其他一些实施方式中，所述低度风险组包含超过55％的数据集。在另外一些实施方式中，所述低度风险组包含超过60％的数据集。

这些方法可以评价任意一段时间例如5年或者更短、大于5年、第10年、大于10年等的复发风险。另外，这些方法可以评价远处复发和/或局部复发的风险。

对于这些方法，可以使用任意多个基因，前提是当分析它们的表达水平时，它们能够鉴定具有小于5％的复发风险的低度风险组。在一些实施方式中，所述多个基因中的一个基因是HoxB13。在其他一些实施方式中，所述多个基因中的一个基因是IL17BR。在另外一些实施方式中，确定HoxB13/IL17BR(H：I)的表达水平的比例。

在另外一些实施方式中，所述多个基因包括MGI基因Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2中的1、2、3、4个或者所有5个。在一些实施方式中，确定Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平。在这些实施方式中的一些实施方式中，还确定HoxB13/IL17BR(H：I)的表达水平的比例。在这些实施方式中的各个方面，对Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平进行求和并且应用系数来获得MGI指数，并且将H：I和MGI作为连续变量组合成BCI值。

在使用BCI的情况下，可以使用本领域已知的任意方式计算所述BCI。在一些实施方式中，通过评价个体癌症复发风险作为连续BCI变量的一部分来计算BCI，其中复发风险与所述BCI变量成线性关系地增加。

本发明还涉及确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法。所述方法包括：

对所述表达水平进行求和以形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较高的BCI值与较高的癌症复发风险相关联，并且较低的BCI值与较低的癌症复发风险相关联；以及

根据BCI值，将所述样品分类为指示在所述受试者中的癌症复发具有低度风险或高度风险，且没有中度风险类别。

所述公开内容的一些所述方法基于受试者的乳腺癌细胞中的作为BCI的一部分的某些基因的表达水平，包括HoxB13的表达水平。在一些实施方式中，使用HoxB13表达和IL17BR表达的双基因的比例(或者HoxB13：IL17BR比)(美国专利申请公报2005/0239079、2005/0239083、和2006/0154267)。在乳腺癌指数的一些替代性的实施方式中，可以使用HoxB13表达和CHDH表达的双基因的比例。

所述HoxB13：IL17BR(H：I)的比例是根据能够预测临床结果的超越标准预后因子的新型生物标记物的研究而得以发现的。将患上癌症复发的患者与就肿瘤阶段和等级而言没有患上癌症复发的那些患者相匹配。发现简单的H：I比适合于预测接受辅药它莫昔芬疗法的雌性激素受体阳性(ER+)乳腺癌的患者中的癌症复发。随后的研究(Ma等，2006；Goetz等，2006；Jerevall等，2007；Jansen等，2007)进一步表明这个比例例如通过作为肿瘤进展的指示物不仅具有预后作用，而且还在回溯性和随机临床试验中具有预测它莫昔芬益处(即，它莫昔芬反应/耐受性)的作用。

所述BCI包括一种或者多种另外的基因的表达与HoxB13/IL17BR的表达的组合。所述组合可以和如下另外公开的基因中的任意的一个、两个、三个、四个或者所有五个组合。所公开内容的这些另外的基因编码Bub1B("通过苯并咪唑Iβ而解除对出芽的抑制(buddinguninhibitedbybenzimidazolesIbeta))或者p21蛋白激活激酶6(PAK6)；CENPA(着丝粒蛋白A，亚型a)；NEK2(NIMA相关激酶2或"从未在有丝分裂基因"，一种相关激酶2)；RACGAP1(RacGTP酶激活蛋白1)；和RRM2(核糖核苷酸还原酶M2)。这五个基因单独使用在本文中是指分子等级指数(MGI)。在下文的实施例2和美国专利公报2011/0136680中讨论了计算MGI的方法。在一些实施方式中，MGI通过使用用于每个基因表达水平的系数对Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平进行求和来计算。所述系数通过本领域已知的任意方法进行确定。在各种实施方式中，所述系数根据主分量分析进行确定。

所述公开内容的多个方面包括结合上述五种基因中的一个或者多个的表达水平针对HoxB13表达以及ILI7BR表达的使用所描述的组合物和方法，以研究、提供预后信息和/或提供临床反应的预测作用。

上述5个MGI基因在细胞循环中具有作用并且据报道峰值表达如下：

这些基因的身份细节请参见PCT专利公报WO/2012/079059。

因此，所述公开内容部分地基于基因表达水平能够用来提供受试者的预后和预测决定的发现。所有所发现的七种基因的使用称为乳腺癌指数(BCI)。

如在实施例中所展示的那样，BCI通过将在内分泌疗法、靶向疗法或者使用芳香化酶抑制剂治疗的从初期到五年的过程中具有中度风险的受试者分为低度风险或者高度风险而提供了乳腺癌患者复发风险的优越分层。因此BCI比其他同代基因表达标签优越，因为每个时间段鉴定两种而不是三种不同风险组(通过针对前期复发将中度和低度风险一起分组并且针对后期复发将中度和高度风险一起分组)允许消除了能够占多达40％的雌性激素受体阳性乳腺癌患者的中度风险类别。在一些情况中，将BCI应用于后期疾病复发的情况中，因为它可以得到一种能够鉴定出可能避免扩展辅药内分泌疗法及其副作用的患者的方法。

临床病理学因子如结节状态和肿瘤尺寸与较高度风险的后期复发相关联；但是，本文所公开的结果是一种细化，允许进行后期复发的个性化评价，并且提供在预后效能中超出临床病理学因子的具有统计学显著性的改善。换句话说，所述公开内容的所述方法可以在没有使用或者可选地结合使用临床病理学因子如结节状体和肿瘤尺寸的情况下实施。其他基于基因表达的分析(EndoPredict和PAM50)具有超出临床病理学因子的预后能力。这些研究进一步证实针对后期疾病复发风险的评价的基于分子的分析的临床使用。

为了在实施本公开内容中确定基因的表达水平，可以使用本领域中任意已知的方法。在一些实施方式中，使用基于与本文所公开和鉴定的基因杂交的mRNA的表达的检测。这容易通过本领域中已知或者认为等效的任意mRNA检测或者扩增+检测方法进行，这些方法包括但不限于逆转录PCR、在美国专利6,794,141中公开的方法以及用于检测RNA稳定化或者去稳定序列的存在或不存在的方法。在各种实施方式中，mRNA被转化为cDNA。

区分能力是由对相关的各个基因的表达进行的鉴定提供，而不是由用于确定实际表达水平的分析的形式提供。分析可以使用本文所公开的被鉴定的个体基因的任意鉴定特征，只要该分析反映(不管是定量地还是定性地)该基因在“转录体”(基因组中基因被转录的部分)或者“蛋白体”(基因组中被表达基因的被翻译部分)中的表达。鉴定特征包括但不限于用于编码(DNA)或者表达(RNA)的独特的核酸序列，所述基因或者表位对被得到基因编码的蛋白具有特异性或者具有活性。需要的只是该基因的身份，这对区分癌症结果和在表达分析中使用的适当的含细胞样品而言是必要的。类似地，含细胞样品的性质不受限制，因为在所公开的方法中可以使用新鲜的组织、新冷冻的组织以及固定的组织，如福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)组织。

还可以使用基于表达的对蛋白水平或活性的存在、升高或降低的检测。所述检测可以采用用于蛋白检测的本领域已知并且认为合适的基于免疫组织化学的方法、基于血液的方法(特别是对于分泌蛋白)、基于抗体(包括抗该蛋白的自体抗体)的方法、基于脱落细胞(来自癌症)的方法、基于质谱的方法、基于图像(包括使用标记配体)的方法。基于抗体和图像的方法另外可用于通过使用以非介入式程序(例如导管灌洗法或细针抽吸法)获得的细胞确定癌症后的肿瘤的定位，其中，癌细胞来源是未知的。可以使用标记的抗体或配体来定位患者中的癌症。

使用基于核酸的分析来确定表达的一个实施方式是通过将本文鉴定的基因的一个或者多个序列固定在固体支持物上，所述固体支持物包括但不限于固体基底如本领域已知的阵列或珠子或者基于珠子的技术。作为选择，还可以使用本领域已知的基于溶液的表达分析法。

被固定的基因可以是对于该基因来说是独特的或者特异的多核苷酸形式，使得所述多核苷酸将能够与和该基因对应的DNA或RNA杂交。这些多核苷酸可以是该基因的全长形式，或者该基因的短序列形式(直至比本领域已知的全长序列短一个核苷酸，例如，通过从该序列的5'或3'末端缺失)，其可选地受到最小的破坏(通过失配或插入非互补碱基对)，使得不影响与和该基因对应的DNA或RNA杂交。在一些情况中，使用的多核苷酸来自于该基因的3'末端，例如从该基因或者表达序列的多腺苷化信号或者多腺苷化位点的约350、约300、约250、约200、约150、约100、或约50个核苷酸范围内。

本领域技术人员完全能够针对这些基因的每一个基因比对任意两个或者多个已知表达序列以鉴定身份或保守变化的区域作为在与其他基因的比较中唯一鉴定这些基因中的每一个基因的区域。而且，本领域技术人员完全能够针对这些基因中的每一个基因比对任意两个或者多个已知表达序列，以鉴定对所述表达序列的一个或者多个而言是独特的区域作为相对于至少一个其他表达序列唯一地鉴定一个已知的表达序列的区域。作为一个非限制性示例，独特区域可以为一个已知基因的表达序列的一个变体，使得该区域可以被用来鉴定所述变体的表达。

相同基因的序列也已经从其他动物物种中得到鉴定和表征。因此，本领域的技术人员清楚地了解到如何相对于其他动物基因鉴定所公开的基因。本领域技术人员还可以可选地比较来自不同动物来源的所公开的基因的已知序列以鉴定相对于其他基因而言对这些基因来说是独特的保守区域和序列。

还可以使用相对于所公开的基因的序列而言包含突变的多核苷酸，只要突变的存在仍然能够杂交以产生可检测的信号。被固定的基因可以被用来确定从样品受试者的结果是未知的或者用于确定已经分配给所述样品受试者的结果的样品癌症或乳腺、细胞制得的核酸样品的状态。没有限制所公开的内容的意思，这种细胞可以来自患有ER+乳腺癌的患者。被固定的多核苷酸只需要足以在适当的条件下特异地与来自该样品的对应核酸分子杂交。

如本领域技术人员将理解的那样，上述提及的一些对应序列包括对所公开的序列的独特性没有贡献的3'polyA(或互补链上的polyT)链。所述公开内容因此可以使用缺少3'polyA(或者polyT)链的序列实施。所公开序列的独特性是指该序列的仅在所公开基因的核酸中发现的部分或者整体，包括在该基因的3'非翻译部分发现的独特序列。用于实践所述公开内容的优选的独特序列是对三组中的每一个的保守序列有贡献的那些序列，使得独特序列将被用来检测各种个体的表达，而不是对存在于一些个体中的多核苷酸具有独特性。作为选择，可以使用对个体或者亚群具有独特性的序列。优选的独特序列优选具有所述公开内容的本文所讨论的多核苷酸的长度。

还可以使用用于鉴定提高的RNA稳定性(导致观察到表达提高)或者降低的RNA稳定性(导致观察到表达降低)的方法。这些方法包括检测提高或者降低含有该基因的序列的mRNA的稳定性的序列。

这些方法还包括检测提高的mRNA降解。在所述公开内容的一些实施方式中，使用具有存在于上述公开的序列的3'非翻译区和/或非编码区中的序列的多核苷酸来检测癌症、或者乳腺、细胞中的基因序列的表达水平。这些多核苷酸可以可选地含有见于上述所公开的序列的编码区的3'部分的序列。

含有来自编码区和3'非编码区的序列的组合的多核苷酸具有连续布置的序列而没有插入异源序列。

作为选择，所述公开内容可以采用具有存在于癌症、乳腺或细胞中的基因序列的5'非翻译区和/或非编码区的序列的多核苷酸来实施，以检测它们的表达水平。这些多核苷酸可以可选地含有见于编码区的5'部分的序列。含有来自编码区和5'非编码区的序列的组合的多核苷酸优选具有连续布置的序列而没有插入异源序列。所述公开内容还可以使用存在于所公开的基因序列的编码区的序列来实施。

非限制性多核苷酸含有来自3'或5'非翻译区和/或非编码区的至少约20、至少约22、至少约24、至少约26、至少约28、至少约30、至少约32、至少约34、至少约36、至少约38、至少约40、至少约42、至少约44、或至少约46个连续核苷酸的序列。在前一句中使用的术语“约”是指所述数值增加1或者减去1。甚至更优选的是含有至少或约50、至少或约100、至少约或150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、或至少或约400个连续核苷酸的的序列的多核苷酸。前一句中使用的术语“约”是指所述数值增加10％或者降低10％。

来自见于所述公开内容的多核苷酸中的上述编码区的3'或5'末端的序列具有与上述那些相同的长度，不同之处在于它们将天然地受到编码区的长度的限制。编码区的3'末端可以包含不超过所述编码区的3'半部的序列。相反，编码区的5'末端可以包含长达所述编码区的5'半部的序列。当然，上述序列或者编码区以及含有它们的多核苷酸可以以其整体使用。

含有来自3'非翻译区和/或非编码区以及所述编码区的相关联的3'末端的序列的多核苷酸可以为至少或约100、至少约或150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、或至少或约400个连续的核苷酸。优选的是，所使用的多核苷酸来自该基因的3'末端，例如从所述基因或表达序列的多腺苷化信号或多腺苷化位点开始在350、约300、约250、约200、约150、约100、或约50个核苷酸之内。相对于所公开的基因的序列含有突变的多核苷酸也可以使用，只要突变的存在仍然允许杂交以产生可检测的信号。

在所述公开内容的另一个实施方式中，可以使用含有从上述所公开的序列的5'和/或3'末端缺失的核苷酸的多核苷酸。所述缺失优选为从5'和/或3'末端缺失1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-125、125-150、150-175、或175-200个核苷酸，不过所述缺失的程度自然受到所述序列的长度的限制，并且需要能够使用所述多核苷酸来检测表达水平。

所述公开内容的来自上述所公开的序列的3'末端的其他多核苷酸包括用于定量PCR的引物和可选的探针的那些多核苷酸。在一些实施方式中，所述引物和探针是从基因或者表达序列的多腺苷化信号或多腺苷化位点扩增少于约350、少于约300、少于约250、少于约200、少于约150、少于约100、或少于约50个核苷酸的那些。

在所述公开内容的另外一些其他实施方式中，可以使用含有上述所公开的序列的部分包括3'末端的多核苷酸。这种多核苷酸将含有从所公开的序列的3'末端开始的至少或约50、至少或约100、至少约或150、至少或约200、至少或约250、至少或约300、至少或约350、或至少或约400个连续核苷酸。

所述公开内容还包括用于检测乳腺癌细胞中的基因表达的多核苷酸。这些多核苷酸包含由见于上述基因的序列以及天然不见到与该序列组合的异源序列的组合组成的较短的多核苷酸。非限定性示例包括来自克隆载体或者存在于用于制备本文所述的标记探针或引物的限制片段的短序列。

所需的表达水平可能是针对所使用的基因通过本文所述的方法鉴定的水平。另外，所述分析可以包括可选地用于PCR(聚合酶连锁反应)或其他分析方法从样品制备RNA，如本文所述。PCR方法可选地为RT-PCR(逆转录-PCR)或定量PCR，如实时RT-PCR。作为选择，所述分析可以通过使用阵列例如微阵列、通过新一代测序法、或通过本领域已知的任意其他方法进行。可选的是，癌症细胞的样品可以切取自从上述受试者取下或获得的组织。如本文所述，可以使用各种类型的样品，包括作为一个非限定性示例的福尔马林固定-石蜡包埋(FFPE)样品。并且如本文所述，所述方法可以包括分析或确定本文所公开的样品中的H：I比(HoxB13和IL17BR的表达水平的比例)。

以非限定性示例为例，可以分析并使用MGI的所有五个基因来检测与MGI的“高度风险”的值相对应的表达水平(其高于临界值)、或检测与MGI的“低度风险”的值相对应的表达水平(其等于或低于临界值)，如本文所公开的那样。在一些情况中，MGI临界阈值可以是0(零)，例如使用1的标准偏差将表达水平的测量结果标准化为0(零)的情况中。在一些替代性的实施方式中，临界值可以为等于或约0.05、等于或约0.10、等于或约0.15、等于或约0.20、等于或约0.25、等于或约-0.05、等于或约-0.10、等于或约-0.15、等于或约-0.20、等于或约-0.25、等于或约-0.30、等于或约-0.35、等于或约-0.40、等于或约-0.45、等于或约-0.50、等于或约-0.55、等于或约-0.60、等于或约-0.65、等于或约-0.70、等于或约-0.75、等于或约-0.80、等于或约-0.85、等于或约-0.90、等于或约-0.95、等于或约-1.0、等于或约-1.1、等于或约-1.2、等于或约-1.3、等于或约-1.4、等于或约-1.5、等于或约-1.6、等于或约-1.7、等于或约-1.8、等于或约-1.9、等于或约-2.0或者更低。关于H：I比，其测定可以根据在Ma等(2004)和Ma等(2006)中所述进行。例如，0.06的值可以被用来确定样品具有“高度风险”(>0.06)还是“低度风险”(0.06)的H：I比。

因此，所有五个基因使用作为MGI的一个非限定性示例的0(零)的阈值或临界值，所公开的方法针对一个给定的样品提供了两种可能的分析结果：与大于0(零)的值对应的“高度风险MGI”和与0(零)的值对应的“低度风险MGI”。“高度风险MGI”指示“高度风险”癌症包括乳腺癌，这类似于本领域已知的方法和标准所定义的等级III肿瘤的情况。“低度风险MGI”指示“低度风险”癌症包括乳腺癌，这类似于本领域已知的方法和标准所定义的等级I肿瘤的情况。

用于确定中度风险的癌症复发的阈值或临界值可以为本文公开的那些，或者处在其约2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或者更多之内。

作为一个非限定性示例，癌症细胞可以是来自用于诊断受试者中的癌症的手术前组织样品或活检样品打开一个样品。对于患有原位导管癌(DCIS)的这种受试者，目前用于除去DCIS的护理标准是手术，且乳腺保留手术优于根治性乳房切除术。这一般会跟着术后放射性治疗，可选地采用内分泌疗法，例如使用它莫昔芬、选择性雌性激素受体调节物(SERM)、选择性雌性激素受体调低调节物(SERD)、芳香化酶抑制剂(AI)如来曲唑进行的治疗、靶向疗法如抗-mTOR治疗(如采用)或抗-HER2治疗(如采用)和/或使用本领域已知的任意化合物进行的化学疗法。

当然，基因表达的检测和BCI的确定可以在如本文所述的任意适当的含细胞样品中进行。在所述公开内容中使用的细胞的非限定性示例包括新鲜分离自所述受试者的那些细胞、分离后冷冻的那些细胞以及固定和/或包埋(例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE))的那些细胞。在大多数实施方式中，所述细胞是乳腺细胞，例如乳腺癌细胞。

如本文所述公开的那样，BCI被用来确定受乳腺癌困扰的患者中的癌症复发风险。后期复发的非限定性示例包括使用芳香化酶抑制剂进行的治疗、靶向疗法或内分泌疗法例如它莫昔芬后5年的情况，但是还包括治疗4年后、3年后、2年后或更少的时间的情况。类似的，可以在上述时间段之后使用BCI来预测对抗芳香化酶治疗如阿那曲唑或来曲唑治疗、靶向疗法或抗雌性激素治疗的反应。

在一些实施方式中，本文所公开的方法可以有利地用在来自所述受试者的含有乳腺癌细胞的样品，例如DCIS样品，不过本文所述的方法可以使用任意类型的乳腺癌，包括任意非侵润性或侵润性乳腺癌，如侵润性导管癌、侵润性小叶癌、炎性乳腺癌、男性乳腺癌、转移性乳腺癌、复发性乳腺癌、乳头状癌、三阴性乳腺癌、乳头偑吉特病、乳腺癌、髓样癌、管状癌、粘液癌、化生性癌、腺样囊性癌、乳腺叶状肿瘤和血管肉瘤。

如在下文实施例2中所讨论的那样，使用BCI的复发风险可以被分类为低度风险和高度风险，没有中度风险类别，并且没有失去精确度。在这种方案中，中度分类，如所述的那样，例如在美国专利公报2013/0281502(参见例如其中的表2)中所述的那样，当复发风险在5年或更短(例如4、3、2或1年)被分类时可以和低度风险组一起分组，当复发风险在超过5年或更长(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多年)被分类时可以和高度风险组一起分组。

当BCI被标定在1至10(例如参见图3、6和8)时，中度组在5至6.5的BCI分之间。如上文所讨论的那样，当BCI被标定在1至10的范围并且5年或更短的复发风险被分类时，可以将中度组加入到低度风险组。低度(+中度)风险和高度风险组之间的临界值因此为中度组遇到高度风险组的情况，即，约6.5，例如5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.33、7.4或7.5、或者其间任意的值。应当理解的是，在这些情况下的临界值可以在5.5至7.5之间，这取决于多少年复发风险被确定出来(年数越少，允许的临界点越高)以及手术者在宣布患者具有低度或高度复发风险的保守程度(即指数为低度复发风险的复发百分比)。对于任意特定的年数和所期望的风险水平，本领域技术人员能够确定合适的BCI分数而无需过度的实验。

类似的，当BCI被标定在1至10的范围并且多于5年的复发风险被分类时，中度组可以加入到高度风险组，使得所述低度风险组和高度(+中度)组之间的临界值成为中度组遇到低度风险组的点，即约5，例如4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、或6.0、或者其间的任意值。

上文的具体方案显示，对于乳腺癌诊断和/或手术介入后使用它莫昔芬、靶向疗法或芳香化酶抑制剂进行的先期(初始)治疗中的任一种之后具有低度风险的患者，BCI试验可以提供没有进一步系统性治疗的选项。例如，初始辅药疗法后具有高度复发风险的患者(具有高的HOXBI3/TL17BR的患者)受益于从扩展激素治疗转到芳香化酶抑制剂来曲唑。这些患者将显示出高的H：I比或BCI分数。但是，5年的初始芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法后具有高复发风险的患者可能受益于或者可能不受益于扩展辅药激素治疗或实际上为任意系统性治疗。这些患者可能还是用于实验治疗途径的候选者。但是，本公开内容提供BCI作为有助于更合适地对那些患者进行分诊的方法。

在一些实施方式中，所计算的BCI指示，在5年或更少的初始疗程的过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法如它莫昔芬进行治疗，受试者具有低度的远处复发风险，因为所计算的BCI指示低度风险或中度风险。所述受试者因此可以使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行初始5年疗程的治疗而具有低度复发风险。在所述初始疗程之后，并且如果所计算的BCI为中度风险的话，指示是如果不使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行另外的5年时间的治疗的话，所述受试者具有高度的癌症复发风险。

在其他一些实施方式中，所计算的BCI指示，在5年或更短的初始疗程过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法如它莫昔芬进行治疗，所述受试者具有高度的远处复发风险，因为所计算的BCI具有高度风险或中度风险。所述受试者因此可以使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行治疗且具有减弱的成功预期。在一些情况中，所述受试者可以在初始疗程期间使用额外的疗法例如作为非限定性示例的化学疗法或放射性疗法进行进一步的治疗。

本公开内容包括所述受试者如所预期的那样受益于在初始的抗芳香化酶、靶向疗法或内分泌疗法例如5年以下时间的过程中无复发存活之后的额外治疗的鉴定。

因此，所述公开内容包括确定BCI作为初始的抗芳香化酶治疗、靶向疗法或内分泌疗法如辅药它莫昔芬治疗之后受试者中的癌症复发的可能性增加的指示。所述方法因此可以包括将所述受试者鉴定为可能或者不可能发生局部或者远处癌症复发。作为非限定性示例，可以在长达5年或者更长的随后一段时间的过程中在没有扩展的初始治疗后的治疗的情况下确定复发的可能性。

本发明还提供用于通过作为计算作为BCI(作为连续变量)的一部分而进行或者与计算BCI相关地进行个体风险评价而确定乳腺癌受试者中的癌症复发风险。如本文所公开的那样，乳腺癌样品群中的BCI的确定指示BCI是将受乳腺癌困扰的受试者的癌症复发风险相关联的连续变量。因此，复发风险随BCI值的增加而呈线性关系地增加。在一些实施方式中，将作为连续变量的BCI值的范围与针对个体乳腺癌样品确定的BCI值进行比较以将癌症复发风险评价为低度风险、中度风险或高度风险。

如本文公开的额外的或者随后的疗程的治疗或疗法可以在第一线(初始)疗法之后的任意时间进行，例如之后立即进行、在终止第一线疗法之后3个月内进行、在终止第一线疗法后6个月内进行、在终止第一线疗法后12个月内进行、在终止第一线疗法后18个月内进行、或在终止第一线疗法后24个月(或者更长的时间)内进行。

鉴定高度或者低度复发风险的预后能力提供了可能有助于确定治疗过程的信息。例如，当BCI指示，在5年或者更短的初始疗程的过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法如它莫昔芬进行治疗，受试者(例如患者)具有高度的远处复发风险，那么这种治疗将被忌用并且可以开始其他疗法例如化学疗法。

相反，如果BCI指示，在5年或者更短的初始疗程的过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法如它莫昔芬进行治疗，受试者具有低度的远处复发风险，则可以指示采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行治疗。

另外，如果BCI指示，如果在另外的5年时间的过程中不使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法如它莫昔芬进行治疗，受试者具有高度的远处复发风险，可以指示采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法、内分泌疗法或另一种辅药疗法进行治疗。

在其他一些实施方式中，所述受试者被鉴定为经历过使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法不超过5年疗程的治疗而没有癌症复发。那么，该受试者根据所述受试者的肿瘤的BCI值被分类为在终止治疗后具有或者不具有高度的癌症远处复发风险。如果该受试者具有高度的复发风险，那么该受试者使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行另外的疗程。

如所知道的那样，高的HOXB13/IL17BR指数不仅具有预后作用，而且还预测辅药内分泌疗法的益处的作用。参见例如美国专利7,504,214和PCT专利公报WO/2012/079059。如在实施例2中讨论的那样，BCI-C预测反应的能力可能被HOXB13/IL17BR的双重预后和内分泌疗法预测性能所击败。相反，BCI-L只包含MGI和HOXB13/TL17BR的附加功能并且在临床结果代表乳腺癌的自然经历的未治疗组的乳腺癌受试者中发展而来。在实施例2中报道的结果表明，BCI-L避免了HOXB13/IL17BR的内分泌疗法预测性能的任意失败效果，结果，BCI-L是HOXB13/IL17BR和MGI的组合的优选的预后版本。

在第二方面，所述公开内容提供了鉴定对治疗例如在使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法5年以下的初始治疗之后采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行另外的治疗的反应的方法。在一些实施方式中，所述另外的治疗在初始疗程之后进行5年或者更长的时间。

因此，在又一些实施方式中，本发明涉及确定对受乳腺癌困扰的受试者的扩展治疗的必要性的方法。所述方法包括：

对所述表达水平进行求和以形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与不需要在使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法5年或更短时间之后使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行任何进一步的额外治疗相关联；

根据BCI值将所述样品分类为指示需要或者不需要额外的治疗。

可以结合BCI辨别复发风险和对治疗的反应的能力来提供治疗选项。

因此，本发明还涉及治疗受乳腺癌困扰的受试者的方法。所述方法包括：

确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的HoxB13、IL17BR、Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的mRNA表达水平；以及

对所述表达水平进行求和以形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与(a)使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行五年以下的初始治疗后对使用芳香化酶、靶向疗法或者内分泌疗法进行的额外治疗的反应和(b)低度的远处复发风险相关联；以及

根据针对所述受试者的BCI值测定结果，治疗所述受试者。

在一些实施方式中，BCI分析指示，在5年或更短的初始疗程的过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行治疗，在受试者中具有高度的远处复发风险。这样的受试者可以使用化学疗法进行治疗。

在其他一些实施方式中，BCI分析指示，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行治疗5年或更短的时间，在受试者中具有低度的远处复发风险。这样的受试者可以使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法治疗初始的5年疗程，然后不必进行扩展疗法。

在另外一些实施方式中，BCI分析指示，在另外的5年时间的过程中，如果不使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行治疗，受试者具有高度的远处复发风险。这样的受试者可以使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法或者另外辅药疗法进行治疗。上述方法中的任意方法都可以用于确定停经前和停经后女性的临床反应的预后因子或预测因子。停经后女性可以被限定为大于或者等于50岁的那些女性，而停经前女性可以被限定为小于50岁的那些女性。在一些方面，那些女性已经经历过使用抗芳香化酶、靶向疗法或内分泌疗法进行的治疗并且在那段时间期间还保持没有癌症。

在又一个实施方式中，所述公开内容通过分析来自单细胞或同源细胞群的全部或者几乎全部的基因表达来鉴定基因表达模式，所述单细胞或同源细胞群已经切离自或者分离自或纯化自污染细胞(此外可能采用简易活检)。因为大量基因的表达在来自不同患者的细胞之间以及来自相同患者样品的细胞之间波动，所以基因表达的水平可能对应于表达在一个或者多个患者的细胞中相对恒定的一个或者多个“对照”或“归一化”基因。

这种方法的一个有利之处是污染的非癌症细胞(例如浸润性淋巴细胞或者其他免疫系统细胞)没有存在，从而可能影响用于鉴定患者的癌症复发和/或存活结果的鉴定基因或基因表达的随后分析。存在其中含有很多细胞类型的活检被用来分析基因表达图谱的这种污染。

虽然本公开内容主要在人类癌症例如乳腺癌的背景中进行描述，但是其可以在任意动物的癌症的背景中实施。用于应用本公开内容的优选动物是哺乳动物，尤其是对农业用途具有重要作用的动物(例如但不限于：牛、羊、马和其他“农畜”)、癌症的动物模型和用于人类伴侣的动物(例如但不限于狗和猫)。

所述公开内容所提供的方法还可以部分地或者全部进行自动化。

试剂盒

本公开内容的方法中使用的材料理想地适合于根据已知的程序制造试剂盒。因此，所述公开内容提供了包含用于检测用于对肿瘤进行分级或者确定肿瘤结果的所公开的基因的表达的试剂的试剂盒。这些试剂盒可选地包含所述试剂以及鉴定描述或标记或与它们在本公开内容的方法中使用相关的说明书)。这种试剂盒包含容器，每个容器带有所述方法中使用的各种试剂中的一种或者多种(通常为浓缩的形式)，包括例如预制微阵列、缓冲剂、适当的核苷三磷酸(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及本公开内容的一种或者多种引物复合物(例如适当长度的poly(T)或连接至具有与RNA聚合酶反应的活性的启动子的随机引物)。一般还包括一套说明书。

优选的实施方式将在下文实施例中描述。处在本文权利要求书的范围内的其他实施方式对于考虑了如本文所公开的本发明的说明或实施的本领域技术人员而言是清楚的。说明部分和实施例拟仅仅认为是例示性的，本发明的范围和精神由实施例之后的权利要求书示出。

实施例1

研究设计和患者

对于前瞻性比较研究，从在2002年启动的TransATAC项目获得组织样品，从而从来自ATAC试验单疗法组的患有雌性激素受体阳性乳腺癌的绝经后患者建立福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的原发肿瘤块(block)的组织库，以帮助转录研究(Paik等、2004；Dowsett等，2010)。除了根据局部测试已知为雌性激素受体和孕酮受体阴性的那些患者和随机分配到ATAC试验的联合治疗组的那些患者之外，对于已经计算21-基因复发分数和IHC4的所有患者都要求建档肿瘤块。该研究得到伦敦东南部研究伦理委员会(South-EastLondonResearchEthicsCommittee)和马萨诸塞州综合医院机构复核委员会(MassachusettsGeneralHospitalInstitutionalReviewBoard)的批准。患者已经提供了她们的组织将被用于进一步试验的书面同意书。

程序

之前进行的研究中，RNA从来自UK患者(其样品占总数量的79％)的TransATAC组织库的FFPE块中提取，以计算和测试21-基因复发分数(Paik等、2004)。随后，进行用于雌性激素受体、孕酮受体、HER2、ki-67和肿瘤等级评价的免疫组织化学分析，并且使用来自组织被用于计算所述21-基因复发分数的相同患者(可以从她们获得足够的额外组织)的组织样品计算IHC4和临床治疗分数(使用肿瘤尺寸和等级、淋巴结状态、年龄、和治疗的经典变量的预后模型)。

在这个研究中，使用在之前研究中使用的具有足够余留RNA的相同匹配的样品来进行BCI分析。测试基因，分析引物和探针序列，并且按照之前的报道(美国专利7,930,105和7,504,214、美国专利公报2011/0136680和2013/0281502、以及PCT专利公报WO/2012/079059)执行RT-PCR程序以计算HOXB13/IL17BR和MGI。测试了预定的BCI模型。该模型是基于变量的立体和线性组合的立体(BCT-C)和线性(BCI-L)。

BCI分数与最终的分数(0-10)成线性增减。将各组鉴定为低度风险、中度风险和高度风险，且每个模型具有预定的临界点：BCI-C低度风险(<5.0点)、BCI-C中度风险(5.0至6.4)、以及BCI-C高度风险(>6.4)；以及BCI-L低度风险(<5.0825点)、BCI-L中度风险(5.0825至6.5025)、以及BCI-L高度风险(>6.5025)。按照之前的报道(Paik等，2004)鉴定21-基因基因复发分数风险组。使用分别与TransATAC群(cohort)中的10年远处复发率为10％和20％的两个临界点建立三个IHC4风险组(即，<10％、≥10％至20％、和>20％)。所述IHC4临界值未经过独立地证实。

远处复发前瞻性地被定义为原发端点，其指在远处器官的所有复发，排除对侧疾病、局部和同侧复发和其他次级原发癌。还包括在作为远处复发时的事件的局部复发之后发生的远处复发。排除在远处复发前已经死亡的患者。所有的复发、乳腺癌死亡和总体存活(从任意病因到死亡的时间)被定义为第二端点。初步分析人群是患有雌性激素受体阳性、N0乳腺癌的患者，但是二次分析人群包括患有雌性激素受体阳性、N0、HER2阴性的乳腺癌患者和患有雌性激素受体阳性、结节阳性乳腺癌的那些患者。初步研究目标是前瞻性地定义为针对患有雌性激素受体阳性、N0乳腺癌的患者中的远处复发的BCI-C模型的总体(0至10年)预后能力的评价。二次研究的目标是为了评价BCI-L模型及其部分HOXB13/IL17BR和MGI对于总体(0至10年)、前期(0至5年)和后期(5至10年)远处复发的预后能力，以及为了比较BCI-L的能力和所述复发分数和IHC4的能力。

统计分析

统计分析计划在研究启动前得到ATAC和LATIE(长期阿那曲唑与它莫昔芬治疗效果(Long-termAnastrozoleversusTamoxifenTreatmentEffects))试验的指导委员会的批准。通过诊断后5年跟踪检查所有患者来评价前期远处复发。在保持没有远处复发至少5年的患者亚组中评价后期远处复发，从而评价基因签名在其前期复发预后作用之后保持的预后作用是否消除。使用基于Cox比例危险回归模型(Coxproportionalhazardsregressionmodel)的似然比检验来检验基于临床治疗分数的和降低比例危险模型和全比例危险模型包括BCI、21-基因复发分数或IHC4之间的显著性差异。由似然比χ²(LR-Δχ2)值(其通过与临床治疗分数比较度量由tile基因签名增加至比例危险模型的信息的量)的变化对预测作用的改进进行定量。由于IHC4是在TransATAC样品亚组中形成的，因此如前所述将样品分开以针对潜在溢量(potentialoverfilling)进行调节。使用Kaplan-Meier存活分析来对BCI的三个预定风险组中患有远处复发的患者比例进行图形表示，并且采用对数秩检验法来检验曲线的质量。

根据针对总体(0至10年)、前期(0至5年)和后期(5至10年)远处复发的Cox比例危险模型以BCI作为因变量将远处复发风险计算为线性协变量。为了比较21-基因复发分数和IHC4，通过比较生物标记物的连续分数的第75个百分点与第25个百分点和来自Cox比例危险模型的相关95％CI来估算分位数危险比例(HR)。将双侧p值小于0.05视为具有统计学显著性。因为复发分数已经在TransATAC中研究过，并且IHC4在这些患者亚组中建立，因此预定作为连续分数的IHC4和21-基因复发分数，并且不进行任意多重检验调节。使用STATA12.1版本进行统计分析。

实施例2

患者和样品

针对915个女性(其中的665个具有雌性激素受体阳性、N0乳腺癌)计算采用21-基因复发分数、IHC4和BCI的值(参见图1)。在表2中列出这665个患者的临床特征并与参加ATAC试验但不是TransATAC的一部分的患有雌性激素受体阳性、N0乳腺癌的561个UK患者的特征进行比较。在这两个组中没有显著性差异，只是与TransATYAC患者相比，非TransATAC群具有显著较多的分化很好的肿瘤和较少的中度分化的肿瘤，以及显著较少的后期远处复发。

表1患者人口统计学和临床特征

*这些是来自ATAC试验的没有肿瘤块进行翻译研究的英国患者。

#比较在N0TransATAC与N0非TransATAC群之间进行，t检验用于年龄和BMI，基于正态逼近的比例检验用于远处复发，其他所有的使用费雪精确检验。

缩略词：ER，雌性激素受体；N0，结节阴性；HER2阴性，人类表皮生长因子受体2阴性；BMI，身体质量指数；UK，英国

在BCI和TransATAC群中的N0女性中，在乳房切除术后有106个复发，包括72个远处复发和7个局部复发。在BCI和TransATAC群中的中位数追踪为9.97年(IQR8.5至10)。

H/I和MGI的计算

通常，并且对于MGI来说，优选将所公开的基因的表达水平组合形成用作临床结果的强的预后因子和预测因子的单一指数。所述指数是所用基因的表达水平的总和并且使用根据主分量分析确定的系数来将多余一个公开基因的情况组合成单个指数。所述系数由因素如每个基因表达水平在整个代表性数据集中的标准方差和每个样品中的每个基因的表达值来确定。代表性数据集是基于本文所公开的对照基因的平均表达值的质量控制。

换言之，将使来自例如微阵列、新一代测序技术或RT-PCR的五个基因的归一化表达水平标准化至横跨每个数据集的样品的平均值0和标准偏差1，然后通过使用第一组分量通过PCA组合成单一指数/样品。每个数据集中的初级表达数据的标准化对于解释不同平台(微阵列、测序和rtPCR)和样品类型(冷冻和FFPE)是必要的。因此，并且在对参数进行换算后，生成定义所述指数的用于表达值的总和的公式。然后可以根据整个数据集的基因的表达水平的平均值、标准误差和标准偏差(采用置信区间)对换算参数的精确性进行检验。因此，指数的公式的生成取决于数据集、对照基因和MGI的基因。

按照以前(Ma等，2006)所述计算HOXB13：IL17BR比作为HOXB13和IL17BR之间的标准化表达水平的差异。用于对表2群进行标准化的HOXB13和IL17BR的平均值和标准偏差可以来自于从雌性激素受体阳性、淋巴结阴性乳腺癌患者的基于独立群体的群的190份FFPE组织切片的分析。

对于MGI，在对数值(每个基因和每个样品重复2次)进行求均计算之前排除明显异常的原始CT值。然后通过四个对照基因(ACTB、HMBS、SDHA、和UBC)的平均CT值对每个基因的平均原始CT值进行归一化。将归一化的表达水平(CT)与预定临界值例如0进行比较，其中高MGI大于临界值，而低MGI小于临界值。

乳腺癌指数(BCI)

BCI通过将作为连续变量的H：I和MGI组合来建立。这两个变量的线性关系通过拟合Cox比例危险回归模型和限制三次样条(restrictedcubisplines)进行检查，并且H：I显示出显著非线性。采用赤池信息准则(Akaikeinformationcriterion)使用H：I的多项式函数来逼近所述限制模型。然后将从最终的Cox回归模型得到的预测因子重新换算成0至10的范围，这称为BCI。

将BCI进一步分为3个水平：低度风险、中度风险和高度风险，如本文所述。

H/I临界点：在该研究中使用用于HOXB13：IL17BR比的0.06的临界点(之前定义以将使用辅药它莫昔芬治疗的患者分成低度和高度复发风险)。

在665个雌性激素受体阳性、N0患者中，BCI-C模型的Kaplan-Meier分析显示在预定类别BCI-C风险组中在10年时间的绝对远处复发存在显著差异(p<0.001)，并且在针对肿瘤尺寸和等级、年龄以及治疗的效果进行调节之后，低度风险组和其他风险组之间的HR存在差异(如通过临床治疗分数所确定的那样；参见图2)。作为连续变量(而不是作为带有限定的临界值的亚组)进行分析的BCI-C与针对临床治疗分数进行调节时的远处复发的总体(0至10年)风险没有显著相关(分位数HR1.39；LR-Δχ²＝3.70；p＝0.054)。

在相同的患者群中的BCI-L的评价显示，当针对临床治疗分数进行调节时，与BCI-C相比，这个版本与远处复发的总体风险的相关性要强得多(分位数2.30；LR-Δχ²＝22.69；p<0.0001；表2)。

表2

HR＝危险比例，LR-Δχ²＝基于似然性比例统计的χ²值的变化。BCI＝乳腺癌指数分析。N0＝结节阴性，IHC4＝四个免疫组织化学标记物(雌性激素受体、孕酮受体、HER2和Ki-67)。*HR在每个生物标记物的连续分数的IQR之间计算；使用样品划分来计算IHC4的χ²和HR。

Kaplan-Meier曲线显示，在根据预定的BCI-L风险组的绝对远处复发比例中有明显的差异(p<0.001；图2B)。总体10年的远处复发风险随BCI-L的增加而线性地增加(图3)。

在具有597个患者的HER2阴性、N0亚组中，BCI-C和BCI-L均与远处复发的总体风险显著地相关(BCI-C分位数HR1.65，LR-Δχ²＝6.61，p＝0.0001；BCI-L分位数HR2.49，LR-Δχ²＝21.9，p<0.0001；表2)。BCI的两个版本的预定组的Kaplan-Meier曲线都显示，在绝对远处复发中存在明显的差异(图4A–BCI-C；4B–BCI-L)。

BCI-L与BCI-C的预后能力的比较显示，不像BCI-C，BCI-L作为连续和类别变量是复发风险的显著预测因子，并且在针对临床治疗分数进行调节后，HR在BCI-L和BCI-C的高度风险和低度风险之间分别为2.19与4.86。下文的讨论使用线性模型(本文称作BCI)。

基于BCI的组

当针对临床治疗分数进行调节时，BCI与前期(0至5年)远处复发风险显著相关(表3)。Kaplan-Meier曲线(图5A)显示5年时绝对远处复发存在差异。虽然三个风险组是预定的，但是来自预定的Kaplan-Meier分析的结果显示，低度风险患者和中度风险患者具有类似的远处复发比例并且构成明显不同于高度风险患者组的一个组。

事后的Kaplan-Meier分析(post-hocKaplan-Meieranalysis)显示，在BCI低度风险组和中度风险组之间5年时的远处复发几乎没有差异，这两个组包含665个患者(PI)中的556个(84％)，且5年的远处复发比例的总和为2至6％(表3)。

表3.在ER+N0患者的临床相关亚组的前期和后期远处复发的绝对风险。

前期复发(0-5年)

包含665个患者中的109个(16％)患者的BCI高度风险组(P2)具有18.1％的5年远处复发率。当针对临床治疗分数进行调节时，P1和P2之间的HR为4.61。

对于后期(5至10年)复发，当针对临床治疗分数进行调节时，BCI与远处复发风险显著地相关(表2)。Kaplan-Meier曲线显示，BCI低度风险组、中度风险组和高度风险组的5至10年的绝对远处复发率有差异(图5B)。来自预定的Kaplan-Meier分析的结果显示，中度风险和高度风险患者具有高度相似的复发率，构成明显不同于低度风险患者的一个群。另外的事后Kaplan-Meier分析(表3)显示，BCI低度风险组(P3)对于5至10年具有3.5％的远处复发率，显著不同于组合的BCI中度风险和高度风险组(P4)的13.4％的比例。针对临床治疗分数进行调节，P3和P4之间的HR为2.94。远处复发风险随前期和后期复发两者的BCI值的增加而线性地增加(图6A和6B)。

HER2状态

因为雌性激素受体阳性、HER2阳性乳腺癌的自然历史不同于雌性激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌，进行亚组分析以评价在整个N0雌性激素受体阳性TransATAC群中的BCI的预后能力是否因包括HER2阳性患者亚组而受到影响。在HER2阴性N0亚组的597个患者(占总试验研究组的90％)中，BCI与前期远处复发风险和后期远处复发风险显著相关(表2)，并且根据BCI风险组，绝对远处复发存在明显的差异(图7)。对于前期和后期复发两者而言，远处复发风险随BCI值的增加而增加(图8)。

芳香化酶抑制剂和内分泌疗法

所有患者(并且独立地根据治疗组(阿那曲唑和它莫昔芬))的21-基因复发分数和IHC4风险组的总体(1至10年)远处复发的Kaplan-Meier曲线显示在图9中。对于所有患者的组合(即，或者接受阿那曲唑或者接受它莫昔芬的那些患者)，BCI低度风险组在与21-基因复发分数低度风险组(6.5％)和IHC4低度风险组(6.2％)相比时在10年中具有最低比例(4.8％)的远处复发，而BCI高度风险组在与21-基因复发分数高度风险组(27.1％)和IHC4高度风险组(21.8％，图9)相比时具有最高比例(29.0％)的远处复发。

另外，如在图9D至9F所示的那样，BCI在高度和低度风险阿那曲唑组之间将远处复发风险分类要比21-基因和IHC4系统要好得多，因为BCI在其高度风险组中具有最高的复发％(21.6％对13.5％和15.6％)，并且在其低度风险组中还具有最低的复发％(4.8％对9.4％和8.0％)。

与其他评价体系的比较

使用似然性比例LR-Δχ²值的变化来提供BCI与IHC4和21个基因复发分数的直接面对面比较(directhead-to-headcomparison)。每个生物标记物的相对预后能力随远处复发时间框架而变化(表2)。对于早期复发，BCI、IHC4和21-基因复发分数在单变量和多变量分析两者中对远处复发全都具有预后作用(表2)。在所有的N0患者中，IHC4在对临床治疗分数进行调节后比复发分数和BCI更具有预后作用。但是，在N0HER2阴性患者中，BCI和IHC4在对临床治疗分数进行调节后具有类似的预后能力，两者都好于21-基因复发分数(表2)。在后期复发的多变量分析中，只有BCI在所有的N0和N0HER2阴性患者中保持强大的预后作用，但是IHC4和21-基因复发分数在任一群体中都不具有预后作用(表2)。将所有的复发、乳腺癌死亡以及总体存活视为端点，看到了类似的结果(表4)。

表4.BCI、RS(21-基因复发分数)和IHC4在所有激素受体阳性N0患者和N0HER2亚组中的二次前期和后期疾病事件的比较预后效能。

*HR是在每个生物标记物的连续分数的内部分位数之间进行计算

缩略词：BCI，乳腺癌指数；RS，OncotypeDX复发分数；IHC4，四个免疫组织化学标记物(雌性激素受体、孕酮受体、人类表皮生长因子2和Ki-67；HR，危险比例；LR-Δχ²，基于似然性比例统计的χ²值；CTS，临床治疗分数；N0，结节阴性；HER2-，表皮生长因子受体阴性。

结节阳性乳腺癌

虽然这些实施例的初步分析集中在N0患者上，但是结节阳性患者的分析显示，BCI对这些患者的远处复发同样具有预后作用(对数秩p＝0.0045；图10)。而且，比较分析显示，BCI、IHC4和21-基因复发分数在这个患者群体中具有高度类似的预后能力，不过不如在N0亚组中所见到的强大。

表5.BCI、RS、IHC4在激素受体阳性、结节阳性患者中的0至10年远处复发的比较预后效能。

表5显示了相对于癌症复发的多变量分析。

如以上所述显示的那样，BCI对5年的它莫昔芬治疗之后的ER+患者中的后期癌症复发具有预后作用。HoxB13表达对5年的它莫昔芬治疗之后ER+患者中的后期癌症复发也具有预后作用。

参考文献

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PCT专利公报WO/2012/079059.

从上文可以看出本发明的若干目的得以实现，其他益处得以获得。

由于在上述方法和组合物中可以进行各种改变而没有脱离本发明的范围，因此包含在上文说明中和显示在附图中的所有内容拟将解释为是例示性的而不是限制性的意思。

在本说明书中引用的所有参考文献在此通过参引方式引入。本文的文献的讨论拟仅对作者所做声明的总结而不是承认任意参考文献构成现有技术。而且，它们的引用并非对有关公开内容的研究的指示。申请人保留挑战所引用文献的准确性和恰当性的权利。

Claims

1.一种确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法，所述方法包括：

确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的多个基因的mRNA表达水平；以及

根据在诊断乳腺癌疾病时所述多个基因的所述mRNA表达水平的分析，对所述受试者是否具有低度的或者高度的癌症复发风险进行分类；

其中，所述多个基因的分析提供了在接受约5年的辅药疗法后癌症复发风险，所述癌症复发风险在比较带有超过5年的结果或者其代表性样品的回溯性ER+乳腺癌患者数据集时在低度风险组中为小于约5％，并且

其中，所述受试者已经接受约5年的辅药疗法并且在该治疗后是没有疾病的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，还分类有中度风险类别。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述低度风险组包括超过50％的ER+患者。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述低度风险组包括超过55％的ER+患者。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述低度风险组包括超过60％的ER+患者。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，确定5年后的复发风险。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，确定远处复发风险。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，确定局部复发风险。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述多个基因中的一个基因是HoxB13。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述多个基因中的一个基因是IL17BR。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，确定HoxB13/IL17BR的表达水平的比例。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述多个基因中的一个基因是Bub1B。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述多个基因中的至少一个基因选自CENPA、NEK2、RACGAP1和RRM2。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，确定Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，还确定HoxB13/IL17BR(H：I)的表达水平的比例。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，对Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平进行求和，并使用一个系数以获得MGI指数，并且将H：I和MGI作为连续变量组合为BCI值。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，通过将个体癌症复发风险作为连续BCI变量的一部分进行评估而对所述BCI进行计算，其中，复发风险随所述BCI变量呈线性关系地增加。

19.一种确定受乳腺癌困扰的受试者中的癌症复发风险的方法，所述方法包括：

确定来自所述受试者的ER+乳腺癌细胞的样品中的HoxB13、IL17BR、Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1和RRM2的mRNA表达水平；

根据BCI值将所述样品分类为指示所述受试者中的癌症复发的低度风险或高度风险，且没有中度风险类别。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，通过如下方式对所述表达水平进行求和：

-计算HoxB13/IL17BR(“H：I”)的表达水平的比例；

-使用系数对Bub1B、CENPA、NEK2、RACGAP1、和RRM2的表达水平进行求和以获得MGI指数；以及

-将H：I和MGI作为连续变量进行组合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述系数由主分量分析确定。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是乳管原位癌(DCIS)，并且所述癌症复发包括局部复发。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述复发是后期复发(初始治疗后超过5年)。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，在5年或5年以下的初始疗程的过程中，如果采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，所述指示是在所述受试者中具有高度的远处复发风险，并且进一步包括使用化学疗法治疗所述受试者。

25.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，在5年或5年以下的初始疗程的过程中，如果采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，所述指示是在所述受试者中具有低度的远处复发风险，并且进一步包括使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法治疗所述受试者。

26.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，在另外的5年的过程中，如果没有采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，所述指示是在所述受试者中具有高度的远处复发风险，并且进一步包括使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法、内分泌疗法或者另一种辅药疗法治疗所述受试者。

27.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：

将所述受试者鉴定为经历过使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行长达5年的一段时间的治疗而没有癌症复发；

根据所述BCI值，将所述受试者分类为在终止所述治疗后具有或者不具有高度的癌症远处复发风险；以及

如果所述受试者具有高度的复发风险，使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法治疗所述受试者另外一个疗程。

28.一种确定受乳腺癌困扰的受试者对扩展治疗的必要性的方法，所述方法包括：

对所述表达水平进行求和以形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与在使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行5年或5年以下的初始治疗后不需要使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或内分泌疗法进行任意额外的治疗相关联；以及

根据所述BCI将所述样品分类为指示需要或者不需要额外的治疗。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述额外的治疗是5年或5年以下的初始治疗后进行的5年或5年以上疗程的治疗。

30.一种治疗受乳腺癌困扰的受试者的方法，所述方法包括：

对所述表达水平进行求和以形成乳腺癌指数(BCI)值，其中，较低的BCI值与较低的远处复发风险相关联；以及

根据针对所述受试者进行的BCI值确定结果，治疗所述受试者。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，在5年或5年以下的初始疗程的过程中，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，指示在所述受试者中具有高度的远处复发风险，并且采用化学疗法治疗所述受试者。

32.根据任意权利要求30所述的方法，其中，五年以内，如果使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，指示在所述受试者中具有低度的远处复发风险，并且使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法治疗所述受试者。

33.根据权利要求30所述的方法，其中，在另外的5年时间的过程中，如果没有采用芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法进行治疗，指示在所述受试者中具有高度的远处复发风险，并且使用芳香化酶抑制剂、靶向疗法、内分泌疗法或者另一种辅药疗法治疗所述受试者。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有淋巴结阴性(N0)乳腺癌。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有HER2阴性乳腺癌。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过从所述mRNA制备cDNA来确定所述mRNA表达水平。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，使用聚合酶链式反应(PCR)进一步扩增所述cDNA。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述确定包括使用阵列。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品剖取自从所述受试者取下的组织。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。

41.根据权利要求19至40中任一项所述的方法，其中，计算BCI，将个体癌症复发风险作为连续BCI变量的一部分进行评估，其中，所述复发风险随所述BCI变量呈线性关系地增加。

42.根据权利要求24至41中任一项所述的方法，其中，所述芳香化酶抑制剂、靶向疗法或者内分泌疗法是它莫西芬。

43.根据权利要求19至42中任一项所述的方法，其中，所述复发风险是远处复发风险。