CN106191118B - 一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，成功构建了靶向ZNF185的shRNA，针对小鼠ZNF185基因的mRNA序列设计合成shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕研究提供新的靶点。

Description

一种慢病毒干扰载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种shRNA及其构建和应用，具体地说是一种靶向ZNF185的慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，属于分子生物学及生物医学领域。
背景技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是真核生物中高度保守的，由小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）介导的转录后基因沉默现象，在基因的功能研究中得到了广泛应用，并有望在疾病治疗中发挥重要的作用。锌指蛋白(zinc finger protein,ZNF)185是一种LIM蛋白。1997年，Heiss等人应用外显子捕获的方法，首先发现了ZNF185基因。后续的研究发现，ZNF185是一种特殊的锌指蛋白基因，在生物体的生长、发育、分化、肿瘤发生等过程中发挥重要的功能。研究发现ZNF185在小鼠睾丸组织中的表达显著高于其它组织，特别在睾丸间质细胞和精子中呈高表达。睾丸间质细胞是构成睾丸组织的重要细胞，在曲细精管周围的结缔组织中广为分布，其主要功能是分泌雄性激素和细胞因子，其中男性体内大约95%的睾酮均由间质细胞合成并分泌。研究表明，睾酮在人类精子发生、性分化调控、维持性功能与促进附属性腺发育等过程中发挥重要的作用。因此，ZNF185可能与睾丸间质细胞的睾酮分泌合成功能密切相关，进而调控精子的生成，而目前关于ZNF185在睾丸间质细胞睾酮分泌功能方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，设计了一种靶向ZNF185的慢病毒干扰载体及其构建方法和应用，针对小鼠ZNF185基因的mRNA序列设计合成shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕研究提供新的靶点。
本发明的技术方案为：
本发明针对与精子发生密切相关的重要基因ZNF185，设计并构建了一种shRNA，该shRNA能显著降低小鼠睾丸间质细胞中ZNF185的蛋白表达水平，同时不会损伤小鼠间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌。
一种慢病毒干扰载体，所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：
F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；
R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。
所述慢病毒转染小鼠睾丸间质细胞后，能显著敲低ZNF185蛋白的表达，细胞增殖能力未发生明显变化，睾酮分泌能力显著降低。
一种上述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体的构建方法，包括以下步骤：
（一）ZNF185干扰载体的构建
首先针对小鼠ZNF185基因（Gene ID: 22673）设计一套干扰序列，并合成miRNAoligos，退火后序列亚克隆到pcDNA6.2™-GW/ EmGFP-miR载体中，测序验证；
具体过程如下：
1、Oligo DNA的设计与合成
针对ZNF185基因序列，通过BLOCK-iT™ RNAi Express数据库提交基因信息选择干扰位点，设计互补的Oligo DNA，正义链的5′端添加了TGCT，反义链的5′端添加了CCTG。其正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；
阴性对照的正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3′；R:5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTT-3′；
2、miRNA载体的构建与验证
将上述步骤1合成好的Oligo DNA经退火后合成双链DNA，然后连接到pcDNA6.2™-GW/ EmGFP-miR载体中，将连接产物转化感受态细胞DH5α，最后挑取克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，得到阳性的克隆和质粒；
（二）ZNF185慢病毒载体构建
将上述步骤（一）构建的miRNA干扰载体经单酶切后纯化；然后将线性化的干扰质粒与pDONR221载体进行BP重组反应，以获得含干扰序列的入门载体；然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-dest进行LR重组反应，以获得含干扰序列的慢病毒表达载体；
具体过程如下：
1、干扰质粒线性化
1.1 配制30ul单酶切体系如下：
Sterile water 10.5ul
10x buffer (NEB buffer 3) 3.0ul
Eag I 1.5ul
干扰质粒 (~2ug) 10ul
Total 25ul
混合均匀后37℃孵育2小时；
1.2 用Axygen PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，最终溶于15 ul elution Buffer中；
2、BP重组
2.1 按下表配制BP重组体系：
TE buffer (elution buffer from Invitrogen miniprep kit) 5.0ul
Linearized attB expression clone 2.0ul
Doner vector with attP site (pDONR 221) 1.0ul
2.2 取出BP clonase II冰上溶解后混匀；
2.3 在2.1配制的体系中加入2.0ul BP clonase II，混合均匀；
2.4 室温孵育过夜；
2.5 取3ul至一管中，其余-20℃保存；
3．LR重组
3.1 按下表配制LR重组反应体系：
BP重组质粒 3.0ul
Destination vector (pLenti6.3/V5-DEST) 1.0ul
LR clonase enzyme mix 2.0ul
ddH2O 4.0ul
3.2 25℃反应5小时；
3.3 加入1ul的蛋白酶K，37℃反应10分钟；
3.4 取5ul重组反应液转化100ul的stbl3感受态细胞。细胞涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养；
3.5 从平板挑单克隆接种于4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
3.6 用Axygen质粒DNA质粒试剂盒提取质粒；
3.7 质粒测序验证，测序结果显示序列完全正确，慢病毒载体构建成功。
ZNF185基因慢病毒表达载体的包装，具体过程如下：
1、293T细胞长至培养瓶板底面积80%左右时，通过常规消化、收集、离心、重悬、洗涤后吹打分散，计数后稀释为6×106个/ml接种于培养皿中，37℃，体积分数5% CO2培养箱培养12h；
2、移去培养液，加入Opti-MEM培养液；
3、将3µg慢病毒表达载体和9µg Packaging Mix加入到1.5ml Opti-MEM中，混合液混匀；
4、将36µl lipofectamine2000和1.5ml Opti-MEM混匀，室温放置5min；
5、混匀步骤3和4得到的溶液，室温放置20min即得慢病毒；
6、将上述步骤5得到的慢病毒加入到步骤1的培养溶液中，37℃，体积分数5% CO2培养箱培养6h，换成含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液；
7、48h后收集步骤6得到的上清，500×g离心10min，弃上清，吹打悬浮，0.45µm滤器过滤；
8、将步骤7得到的过滤液50000×g离心2h，沉淀重悬于opti-MEM培养液，最终获得ZNF185-shRNA的慢病毒培养液。
ZNF185慢病毒干扰效率的检测
应用western blot方法检测ZNF185-shRNA的干扰效果，以未处理组和转染空载体慢病毒为对照组，结果显示ZNF185-shRNA能显著降低间质细胞ZNF185的表达。
ZNF185慢病毒对细胞增殖与睾酮分泌的影响
本发明通过CCK-8法和ELISA法检测转染ZNF185-shRNA的间质细胞的增殖能力与睾酮分泌，实验结果显示ZNF185干扰沉默后，睾丸间质细胞的增殖能力未发生明显变化，但睾酮分泌能力显著低于对照组。
一种上述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体作为避孕药物的应用。
本发明的优点在于：成功构建了靶向ZNF185的shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕提供新的靶点。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1 以本专利中ZNF185-shRNA包装出的慢病毒感染小鼠间质细胞，western blot实验证明ZNF185-shRNA干扰效果显著；本专利中的ZNF185-shRNA干扰序列能有效沉默间质细胞中ZNF185的表达。其中，1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组；
图2 以本专利中ZNF185-shRNA将ZNF185敲低后，CCK-8实验证明小鼠睾丸间质细胞的增殖能力未发生明显变化；其中，1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组；
图3 以本专利中ZNF185-shRNA将ZNF185敲低后，ELISA法检测发现小鼠间质细胞的睾酮分泌能力受到明显抑制；其中，1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
实施例1
一种慢病毒干扰载体，所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：
F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；
R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。
所述慢病毒转染小鼠睾丸间质细胞后，能显著敲低ZNF185蛋白的表达，细胞增殖能力未发生明显变化，睾酮分泌能力显著降低。
上述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体的构建方法，包括以下步骤：
1、ZNF185基因干扰载体的构建
1.1 Oligo DNA的设计与合成
根据基因序列和BLOCK-iT™ RNAi Express数据库提交的基因信息，选择干扰位点（干扰位点序列均经过Blast检验靶基因特异性），设计并合成互补oligo DNA；合成的序列如下，F: 5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R: 5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；合成的结构如下：
1.2 miRNA载体的构建与验证
（1）将合成的DNA依次溶解为100μM，按下表配置混合物，然后95℃ 5min，室温20min；
Reaction Component Concentration Volume(µl)
top strand oligo 100 μM 5
bottom strand oligo 100 μM 5
oligo annealing buffer 10× 2
ddH<sub>2</sub>0 8
Total volume 20
（2）将步骤（1）的产物按下表配置混合物，室温30min；
Reaction Component Concentration Volume(µl)
ligation buffer 5× 4
ds oligo 10nM 4
T4 DNA ligase 1U/µl 1
pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 2
ddH<sub>2</sub>O 9
Total volume 20
（3）取10µl步骤（2）的产物转化100µl感受态细胞DH5α，涂LB平板（含50µg/mlSpectinomycin）后，37℃孵育；
（4）每个平板分别挑取3个克隆，摇菌抽提质粒，取一部分测序，其余 -20℃保存。
2、ZNF185基因慢病毒表达载体的构建
2.1 miRNA载体的线性化
（1）按照下表配置单酶切体系，混合均匀后37℃孵育2h；（2）用Axygen PCR纯化试剂盒纯化含attB位点的线性dsDNA酶切产物，最终溶于15µl elution buffer中；
Reaction Component Volume(µl)
Sterile water 10.5
10x buffer (NEB buffer 3) 3
Eag I 1.5
干扰质粒 (~2ug) 10
Total volume 25
2.2 线性载体的BP重组
（1）按照下表配置BP重组体系；（2）室温孵育过夜；
Reaction Component Volume(µl)
TE buffer (elution buffer from Invitrogen miniprep kit) 5
Linearized attB expression clone 2
Doner vector with attP site (pDONR 221) 1
BP clonase II 2
Total volume 10ul
2.3 LP重组
（1）按照下表配置LP重组体系；
Reaction Component Volume(µl)
BP重组质粒 3
Destination vector (pLenti6.3/V5-DEST) 1
LR clonase enzyme mix 2
ddH<sub>2</sub>O 4
Total volume 10
（2）将混合液置于25℃反应5h；（3）加入1µl的蛋白酶K，37℃反应10min；（4）取少量（3）转化stbl3感受态细胞；（5）将stbl3细胞涂布于LB平板（含100µg/ml Ampicillin）上，37℃培养12h；（6）从平板挑单克隆，接种于LB培养基（含100µg/ml Ampicillin）中，37℃振荡培养12h；（7）DNA质粒试剂盒提取慢病毒表达载体；（8）取一部分进行测序，其余-20℃保存。
3、ZNF185基因慢病毒表达载体的包装
（1）293T细胞长至培养瓶板底面积80%左右时，常规消化、收集、离心、重悬、洗涤后吹打分散，计数后稀释为6×106个/ml接种于培养皿中，37℃，体积分数5% CO2培养箱培养12h；（2）移去培养液，加入Opti-MEM培养液；（3）将3µg慢病毒表达载体和9µg PackagingMix加入到1.5ml Opti-MEM中，混合液混匀；（4）将36µl lipofectamine2000和1.5ml Opti-MEM混匀，室温放置5min；（5）混匀（3）和（4）的溶液，室温放置20min即得慢病毒；（6）将上述慢病毒加入到（1）中，37℃，体积分数5% CO2培养箱培养6h，换成含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液；（7）48h后收集上清，500×g离心10min，弃上清，吹打悬浮，0.45µm滤器过滤；（8）将过滤液50000×g离心2h，沉淀重悬于opti-MEM培养液。
4、ZNF185慢病毒干扰效率的检测
应用western blot方法检测ZNF185-shRNA的干扰效果，以未处理组和转染空载体慢病毒为对照组，结果显示ZNF185-shRNA能显著降低间质细胞ZNF185的表达（详见图1），其中1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组。
实施例2
ZNF185-shRNA对小鼠睾丸间质细胞增殖能力的作用
1、标准曲线的制备
（1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
（2）按1︰2的体积比，依次用培养液等比例稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做5个细胞浓度梯度，每组3个复孔；
（3）接种后培养4 h左右使细胞贴壁，然后加入CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），O.D值为纵坐标（Y轴）的标准曲线，根据此标准曲线可测定出未知样品的细胞数量。
2、细胞增殖的检测
（1）设置空白对照组、实验组和阴性对照组，每组设置3个复孔；
（2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔100 mL，待细胞贴壁后，分别加入相应MOI值的不含病毒的培养基、含有干扰序列慢病毒的培养基和含有空载体慢病毒的培养基；将培养板放在培养箱，培养条件为37 ℃、体积分数5% CO2浓度；
（3）培养48h后，向每孔加入10 µL的CCK-8溶液，注意不要在孔中生成气泡，以免影响O.D值的读数；
（4）将培养板置于培养箱内孵育约2 h；
（5）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度；
（6）代入标准曲线计算出细胞数。
3、结果显示，与未处理组和感染空载体慢病毒组比较，ZNF185-shRNA处理后，小鼠睾丸间质细胞增殖能力未发生明显变化（未处理组vs感染ZNF185-shRNA组vs感染空载体慢病毒组 = 100% vs 91.2% vs 93.5%，p＞0.05，详见图2），其中1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组。
实施例3
ZNF185-shRNA对小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌能力的抑制
1、细胞长至培养孔板底面积80%，设置空白对照组、实验组和阴性对照组，每组设置3个复孔；
2、分别加入相应MOI值的不含病毒的培养基、含有干扰序列慢病毒的培养基和含有空载体慢病毒的培养基；
3、感染24h时观察细胞状态，若无大量细胞死亡，则继续感染；48h时再次进行观察，若无大量细胞死亡，补液后继续感染，直到感染率达到80%以上，更换为无病毒完全培养基；
4、继续培养96h，收集细胞培养上清液，按照睾酮检测试剂盒说明书处理后，送至潍坊医学院附属医院测睾酮的分泌量；
5、结果显示，与未处理组和感染空载体慢病毒组比较，ZNF185-shRNA能显著抑制间质细胞睾酮的分泌（未处理组vs感染ZNF185-shRNA组vs感染空载体慢病毒组 = 0.31μg/L vs 0.11 μg/L vs 0.29 μg/L，p＜0.01，详见图3），其中1组为未处理组，2组为感染ZNF185-shRNA的实验组，3组为感染空载体慢病毒的对照组。
本发明针对小鼠ZNF185基因的mRNA序列设计合成shRNA，该shRNA不会损伤小鼠睾丸间质细胞的增殖能力，但能有效抑制睾酮的分泌，为人类避孕研究提供新的靶点。
本发明是ZNF185在生殖细胞功能上的首次研究，首次证明ZNF185对睾丸间质细胞的睾酮分泌功能具有调节作用。
本发明中所用原料均为本领域生产中常用原料，均可从市场中得到，且对于生产结果不会产生影响；本发明中所采用的各种设备，均为本领域生产工艺中使用的常规设备，且各设备的操作、参数等均按照常规操作进行，并无特别之处。
慢病毒载体的shRNA序列：
F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；
R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′

Claims (4)

1.一种慢病毒干扰载体，其特征在于：所述载体含有小鼠的ZNF185基因干扰片段，所述慢病毒载体的shRNA序列是：
F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；
R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′。
2.一种如权利要求1所述靶向ZNF185的慢病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）ZNF185干扰载体的构建
首先针对小鼠ZNF185基因（Gene ID: 22673）设计一套干扰序列，并合成miRNAoligos，退火后序列亚克隆到pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR载体中，测序验证；
（二）ZNF185慢病毒载体构建
将上述步骤（一）构建的miRNA干扰载体经单酶切后纯化；然后将线性化的干扰质粒与pDONR221载体进行BP重组反应，以获得含干扰序列的入门载体；然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒目的载体pLenti6.3/V5-dest进行LR重组反应，以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（一）ZNF185干扰载体构建，具体过程如下：
(1)Oligo DNA的设计与合成
针对ZNF185基因序列，通过BLOCK-iT RNAi Express数据库提交基因信息选择干扰位点，设计互补的Oligo DNA，正义链的5′端添加了TGCT，反义链的5′端添加了CCTG；
其正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGTTCACTGGTATTCATGTACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTACATATACCAGTGAA-3′；R:5′-CCTGTTCACTGGTATATGTACTCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGAGTACATGAATACCAGTGAAC-3′；
阴性对照的正义链与反义链序列分别为：F:5′-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3′；R:5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTT-3′；
(2)miRNA载体的构建与验证
将上述步骤1合成好的Oligo DNA经退火后合成双链DNA，然后连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体中，将连接产物转化感受态细胞DH5α，最后挑取克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，得到阳性的克隆和质粒。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（二）ZNF185慢病毒载体构建具体过程如下：
(1)干扰质粒线性化
1.1 配制30ul单酶切体系，混合均匀后37℃孵育2小时；
1.2 用Axygen PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，最终溶于15 ul elution Buffer中；
(2)BP重组
2.1 配制BP重组体系：
2.2 取出BP clonase II冰上溶解后混匀；
2.3 在2.1配制的体系中加入2.0ul BP clonase II，混合均匀；
2.4 室温孵育过夜；
2.5 取3ul至一管中，其余-20℃保存；
(3)LR重组
3.1 配制LR重组反应体系：
3.2 25℃反应5小时；
3.3 加入1ul的蛋白酶K，37℃反应10分钟；
3.4 取5ul重组反应液转化100ul的stbl3感受态细胞；
细胞涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养；
3.5 从平板挑单克隆接种于4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
3.6 用Axygen质粒DNA质粒试剂盒提取质粒；
3.7 质粒测序验证，测序结果显示序列完全正确，慢病毒载体构建成功。
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