CN107827951A - 一种具有雄性免疫避孕功能的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有雄性免疫避孕功能的多肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列为：PPRPSSSGYK；通过生物信息学技术预测并合成针对小鼠ZNF185基因的多肽，该多肽通过曲细精管注射可获得良好的免疫避孕效果，且不会造成睾丸及附睾损伤，本发明将为男性避孕疫苗研发提供新的靶标。

Description

一种具有雄性免疫避孕功能的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白多肽疫苗，具体地说是一种具有雄性免疫避孕功能的多肽及其应用，具有一定的免疫避孕效果，属于蛋白多肽疫苗领域。

背景技术

世界人口的高增长率和非意愿妊娠的高发生率一直影响着社会经济发展和人类身心健康。传统的避孕方法（输精管结扎、激素类避孕药以及避孕套等）都存在一定的局限性。因此，寻找一种安全、方便、有效、可逆、非激素类的避孕措施对控制人口增长和避免非意愿性妊娠具有十分重要的意义。近年来男性避孕疫苗成为研究特点，针对男性避孕疫苗的研究日益增多，可能成为控制人口过度增长的理想措施，而抗原靶点的选择是其中的关键。

发明内容

本发明目的是提供一种具有雄性免疫避孕功能的多肽，应用于雄性免疫避孕，配合相应佐剂，通过睾丸曲细精管注射，获得良好的免疫避孕效果。

本发明的技术方案为：

一种具有雄性免疫避孕功能的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：PPRPSSSGYK。

其中，所述多肽含有小鼠的ZNF185多肽。

锌指蛋白(Zincfingerprotein,ZNF)185是一种LIM(Lin-1,Isl-1andMec-3)蛋白，其N末端含有与肌动蛋白结合的ATD(actin-targeting-domain)结构域。ZNF185在睾丸中的表达显著高于其它组织，特别是在精子和间质细胞中呈高表达。此外，ZNF185在性成熟睾丸中表达显著高于性成熟前。研究发现，ZNF185是避孕疫苗的有效靶点。本发明通过筛选ZNF185抗原表位合成了一种具有雄性免疫避孕功能的多肽。

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽作为避孕疫苗的应用。

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽的使用方法为曲细精管注射免疫方法，具体操作为：取10µg本发明所述多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫体，进行初次免疫，共免疫1次。

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽的制备方法，通过生物信息学软件预测并确定ZNF185抗原表位，制备ZNF185优势抗原表位多肽；具体操作为：

（1）应用DNAStar软件的Gamier-Robson和Chou-Fasman法预测ZNF185形成α螺旋、β折叠和转角的情况；

（2）应用DNAStar软件的Kyte-Doolittle法预测ZNF185的亲水性；

（3）应用DNAStar软件的KarplusSchulz法预测ZNF185的可塑性；

（4）应用DNAStar软件的Emini法预测ZNF185的表面可及性；

（5）应用DNAStar软件的Jameson-Wolf法预测ZNF185的抗原性区域；

（6）根据上述步骤（1）-（5）的蛋白质二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性及抗原性预测结果综合考虑，选择最优氨基酸序列，并合成本发明具有雄性免疫避孕功能的多肽。

本发明的优点在于：成功筛选ZNF185抗原表位并合成相应多肽，通过曲细精管注射获得了良好的免疫避孕效果，且不会造成睾丸及附睾损伤，为男性避孕疫苗提供了新的靶标。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明多肽的氨基酸序列的二级结构及抗原性分析（应用DNAStar软件预测ZNF185抗原表位，根据蛋白质二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性及抗原性预测结果综合考虑，选择最优氨基酸序列合成多肽）；

图2为ELISA法检测免疫后小鼠血清抗体滴度变化（将本发明多肽免疫小鼠，抗体滴度随免疫周数的增加而逐渐上升，且曲细精管注射获得更高的抗体滴度；*^,b：p<0.05，与PBS组比；其中，PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽）；

图3为本发明多肽免疫对各组小鼠精子畸形率的影响（将本发明多肽免疫小鼠，小鼠精子畸形率无明显变化(P>0.05)；其中，PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽）；

图4为本发明多肽免疫后各组小鼠睾丸的病理组织学变化（将本发明多肽免疫小鼠，小鼠睾丸组织未发生明显病理组织学变化，但生精细胞数量较对照组明显降低；其中，A：PBS-IP组，B：PBS-IS组，C：Peptide-IP组，D：Peptide-IS组；PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽）；

图5为本发明多肽免疫后各组小鼠附睾的病理组织学变化（将本发明多肽免疫小鼠，小鼠附睾组织未发生明显病理组织学变化，但管腔中成熟的精子量减少；其中，A：PBS-IP组，B：PBS-IS组，C：Peptide-IP组，D：Peptide-IS组；PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽）。

具体实施方式

本发明公开了一种具有雄性免疫避孕功能的多肽及其应用，下列实例旨在进一步举例描述本发明，并不用于限定本发明。所以对本发明所作的本领域技术人员根据上述发明内容对该实施方案进行非本质的改进和完善,仍属于本发明的保护范畴。

实施例1

一种具有雄性免疫避孕功能的多肽，所述多肽的氨基酸序列为：PPRPSSSGYK；

其中，所述多肽含有小鼠的ZNF185多肽。

锌指蛋白(Zincfingerprotein,ZNF)185是一种LIM(Lin-1,Isl-1andMec-3)蛋白，其N末端含有与肌动蛋白结合的ATD(actin-targeting-domain)结构域。ZNF185在睾丸中的表达显著高于其它组织，特别是在精子和间质细胞中呈高表达。此外，ZNF185在性成熟睾丸中表达显著高于性成熟前。研究发现，ZNF185是避孕疫苗的有效靶点。本发明通过筛选ZNF185抗原表位合成了一种具有雄性免疫避孕功能的多肽。

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽的制备方法，通过生物信息学软件预测并确定ZNF185抗原表位，制备ZNF185优势抗原表位多肽；具体操作为：

（1）应用DNAStar软件的Gamier-Robson和Chou-Fasman法预测ZNF185形成α螺旋、β折叠和转角的情况；结果显示，α螺旋分布比较均匀；β折叠比较少，主要位于86-91、295-297、575-580和607-610位氨基酸残基；此外，转角主要分布于各β折叠单元之间。

（2）应用DNAStar软件的Kyte-Doolittle法预测ZNF185的亲水性；结果显示，ZNF185亲水性区域分布比较均匀，高亲水性区域主要位于13-25、42-51、72-81、98-112、157-164、172-180、225-235、306-317、386-400、419-433、453-465、476-488、520-530和540-553位氨基酸残基。

（3）应用DNAStar软件的KarplusSchulz法预测ZNF185的可塑性；结果显示，高可塑性区域主要分布于7-40、42-85、91-115、122-144、150-166、238-256、264-282、300-330、345-361、385-401、416-436、471-492、494-518和 520-557 位氨基酸残基。

（4）应用DNAStar软件的Emini法预测ZNF185的表面可及性；结果显示，可及性较高区域主要分布于19-24、44-51、72-82、98-106、136-143、157-165、172-180、224-235、308-314、416-423、478-486、544-553和650-657位氨基酸残基。

（5）应用DNAStar软件的Jameson-Wolf法预测ZNF185的抗原性区域；结果显示，高抗原性区域主要分布于7-26、47-64、68-83、94-115、127-165、225-254、297-363、384-402、416-469、476-502、518-574和644-677位氨基酸残基。

（6）根据上述步骤（1）-（5）的蛋白质二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性及抗原性预测结果综合考虑，选择亲水性、可塑性、表面可及性及抗原性良好区域，尽量避开α螺旋、β折叠和转角区域，最终确定最优氨基酸序列为PPRPSSSGYK，如图1所示，然后合成本发明具有雄性免疫避孕功能的多肽（由上海吉尔生化公司合成）。

另外，需要说明的是本实施例1的上述结果均具有可重复性，本领域技术人员根据上述方法均能够重复上述结果。

实施例2

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽作为避孕疫苗的应用。

上述具有雄性免疫避孕功能的多肽的使用方法为曲细精管注射免疫方法，具体操作为：取10µg本发明所述多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫体即小鼠，进行初次免疫，共免疫1次。

一、将本发明多肽与佐剂混合后免疫雄性小鼠

1、动物分组

将24只BALB/c雄性小鼠（6-8周龄）分为4组。分组要素：免疫途径包括曲细精管注射(Seminiferoustubulesinjection,IS)和腹腔注射(intraperitonealinjection,IP)，免疫剂量(10µg和80µg)，以及佐剂（见表1）；

2、免疫途径

(1)腹腔注射免疫方法

取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次。取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行加强免疫，每周1次，共免疫3次；

(2)曲细精管注射免疫方法

取10µg多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次；

3、免疫避孕效果评估

(1)样本采集

于免疫后第0、2、4、6、8、10、12周，取小鼠尾静脉血约20µl，加入180µl抗体稀释液（含0.1%BSA的PBST稀释液），1500rpm离心5min。取上清，应用ELISA法检测IgG抗体滴度；

(2)抗体水平检测

步骤如下：抗原包被，4℃孵育过夜；5%BSA封闭液37℃封闭1h；加待测血清，37℃孵育1h；加酶标二抗，37℃孵育45min；加底物显色，室温避光显色15min；2M硫酸终止反应；全自动酶标仪检测450nm处的OD值。当OD值大于或等于空白孔2倍时定为阳性；

(3)免疫避孕效果检测

于免疫后第12周，将免疫过的雄性小鼠与正常雌性小鼠进行合笼,雌雄比例为2:1。次日晨检查雌鼠阴栓，将见有阴栓的雌鼠单独喂养，3-4周后观察计算各组雌性小鼠的妊娠率和每窝产仔数。

二、ELISA法检测血清中IgG抗体水平

1、主要试剂及其配制

ELISA包被缓冲液(pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液)：

Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1000mL，用NaOH调节pH值至9.6；

ELISA洗涤缓冲液(pH7.4，PBST)：含0.05%Tween-20的PBS溶液；

ELISA抗体稀释液：含0.1％BSA的洗涤缓冲液；

ELISA终止液：蒸馏水178.3mL逐滴加入浓硫酸(98%)21.7mL；

PBS（北京Solarbio公司）；

辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(美国proteintech公司)；

TMB单组份显色液（北京Solarbio公司）；

5%BSA封闭液（北京Solarbio公司）；

2、主要仪器

全自动酶标仪(BioTekInstruments,Inc.)；

96孔酶标板（北京Solarbio公司）；

3、动物分组

将24只BALB/c雄性小鼠（6-8周龄）分为4组。分组要素：免疫途径包括曲细精管注射(Seminiferoustubulesinjection,IS)和腹腔注射(intraperitonealinjection,IP)，免疫剂量(10µg和80µg)，以及佐剂（见下表1）；

表1实验动物分组

4、免疫途径

(1)腹腔注射免疫方法

取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次。取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行加强免疫，每周1次，共免疫3次；

(2)曲细精管注射免疫方法

取10µg多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次；

5、样本采集

初次免疫开始，在0、2、4、6、8、10、12周，分别取小鼠尾静脉血约20µl，室温静置2h。待血清析出后加入180µl抗体稀释液（含0.1%BSA的PBST稀释液），1500rpm离心5min。吸出上清，ELISA法检测IgG抗体滴度；

6、采用间接ELISA法测定抗体水平

操作流程具体步骤为：抗原包被，4℃孵育过夜；5%BSA封闭液37℃封闭1h；加待测血清，37℃孵育1h；加酶标二抗，37℃孵育45min；加底物显色，室温避光显色15min；2M硫酸终止反应；全自动酶标仪检测450nm处的OD值。每个步骤之间均用洗涤液洗涤3次，每次洗3min，每种试剂加入的体积均为100µl。当OD值大于或等于空白孔2倍时定为阳性；

7、结果显示，多肽免疫组的抗体滴度随免疫周数的增加而逐渐上升，于免疫后第12周达到高峰，此外曲细精管注射可获得更高的抗体滴度。其中，PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽（如图2所示）。

实施例3

本发明多肽的免疫避孕效果检测

1、主要试剂及其配制

ZNF185多肽（上海吉尔生化公司）；

BALB/c小鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司；

氟氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)（美国sigma公司）；

2、动物分组

将24只BALB/c雄性小鼠（6-8周龄）分为4组。分组要素：免疫途径包括曲细精管注射(Seminiferoustubulesinjection,IS)和腹腔注射(intraperitonealinjection,IP)，免疫剂量(10µg和80µg)，以及佐剂（如上表1所示）；

3、免疫途径

(1)腹腔注射免疫方法

取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次。取80µg多肽稀释至100µl，然后与100µl的弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，腹腔注射免疫小鼠，进行加强免疫，每周1次，共免疫3次；

(2)曲细精管注射免疫方法

取10µg多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫小鼠，进行初次免疫，共免疫1次；

4、生育力检测

于免疫第12周，将各组免疫过的雄性小鼠分别与正常雌性小鼠进行合笼，雌雄比例为2:1。次日晨检查雌鼠阴栓，将见有阴栓的雌鼠单独喂养，3-4周后观察计算各组雌性小鼠的妊娠率和每窝产仔数。实验结果显示，多肽免疫组的交配率和妊娠率显著低于对照组(P<0.05)，其中曲细精管注射多肽组的交配率和妊娠率最低，而每窝产仔数差异不显著(P>0.05)（如下表2所示）；

表2多肽免疫对小鼠生育力的影响

注：同一列中含不同字母的各项之间差异显著(P<0.05)

以本发明多肽免疫小鼠，多肽免疫组的交配率和妊娠率显著低于对照组(P<0.05)，其中曲细精管注射多肽组的交配率和妊娠率最低，而每窝产仔数差异不显著(P>0.05)；

5、小鼠附睾精子计数、精子畸形率、精子活力及活率的测定

取10µl精子悬液加到细胞计数板上，在光学显微镜下观察细胞的活动度。将精子运动分为4级：Ⅰ级为快速、直线的向前运动；Ⅱ级为慢速或迟钝的直线或非直线向前运动；Ⅲ级为不向前运动；Ⅳ级为不活动；具体公式如下：

精子活力＝[(Ⅰ+Ⅱ)级/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)级]×100%；

精子活率＝[(Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ)级/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)级]×100%

实验结果显示，多肽免疫组的精子数、活力和活率均显著低于对照组(P<0.05)，其中曲细精管注射多肽组的精子数、活力和活率最低(如下表3所示)

表3多肽免疫对小鼠精子数、活力及活率的影响

注：同一列中含不同字母的各项之间差异显著(P<0.05)

以本专利中的多肽免疫小鼠，多肽免疫组的精子数、活力及活率均显著低于对照组(P<0.05)；

再取10ul上述附睾液做精子悬液涂片，空气干燥，甲醛固定30min，1%伊红染色1h，自来水冲洗，干燥后高倍镜下（40倍）观察精子形态。每张涂片计数300个精子，分别统计300个精子中头部畸形（包括短头、无钩、香蕉头等）和尾部畸形（包括卷、弯曲尾、尾尖弯曲等）的精子的数量；具体公式如下：

精子畸形率=畸形精子数量/300×100%

实验结果显示，与对照组比较，多肽免疫组小鼠的精子畸形率无明显变化(P>0.05)。其中，PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽（如图3所示）；

6、病理组织学检测

取小鼠睾丸、附睾等生殖器官经固定、切片、染色后进行病理组织学检测。实验结果显示，多肽免疫组小鼠的睾丸组织未发生明显病理组织学变化，但生精细胞数量较对照组明显降低（如图4所示）；多肽免疫组小鼠的附睾组织未发生明显病理组织学变化，但管腔中成熟的精子量减少（如图5所示）。其中，PBS-IP组为腹腔注射PBS，PBS-IS组为曲细精管注射PBS，Peptide-IP组为腹腔注射多肽，Peptide-IS组为曲细精管注射多肽。

本发明通过生物信息学技术预测并合成针对小鼠ZNF185基因的多肽，该多肽通过曲细精管注射可获得良好的免疫避孕效果，且不会造成睾丸及附睾损伤，本发明为男性避孕疫苗提供了新的靶标。

本发明中所用原料均为本领域生产中常用原料，均可从市场中得到，且对于生产结果不会产生影响；本发明中所采用的各种设备，均为本领域生产工艺中使用的常规设备，且各设备的操作、参数等均按照常规操作进行，并无特别之处。

Claims (6)

1.一种具有雄性免疫避孕功能的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为：PPRPSSSGYK。

2.根据权利要求1所述的一种具有雄性免疫避孕功能的多肽，其特征在于：所述多肽含有小鼠的ZNF185多肽。

3.一种如权利要求1或2所述具有雄性免疫避孕功能的多肽作为避孕疫苗的应用。

4.根据权利要求3所述有雄性免疫避孕功能的多肽作为避孕疫苗的应用，其特征在于：使用方法为曲细精管注射免疫方法。

5.根据权利要求4所述有雄性免疫避孕功能的多肽作为避孕疫苗的应用，其特征在于，具体操作为：取10µg本发明所述多肽稀释至10µl，然后与10µl的弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，曲细精管注射免疫体，进行初次免疫，共免疫1次。

6.一种如权利要求1所述的一种具有雄性免疫避孕功能的多肽的制备方法，其特征在于：通过生物信息学软件预测并确定ZNF185抗原表位，制备ZNF185优势抗原表位多肽；具体操作为：

（1）应用DNAStar软件的Gamier-Robson和Chou-Fasman法预测ZNF185形成α螺旋、β折叠和转角的情况；

（2）应用DNAStar软件的Kyte-Doolittle法预测ZNF185的亲水性；

（3）应用DNAStar软件的KarplusSchulz法预测ZNF185的可塑性；

（4）应用DNAStar软件的Emini法预测ZNF185的表面可及性；

（5）应用DNAStar软件的Jameson-Wolf法预测ZNF185的抗原性区域；

（6）根据上述步骤（1）-（5）的蛋白质二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性及抗原性预测结果综合考虑，选择最优氨基酸序列，并合成本发明具有雄性免疫避孕功能的多肽。