JPH01503755A - Ｍｃａ１６‐８８によって認識される抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＣ＾１６−８８によって認識される抗原見肌凶１遣 結腸直脹癌は男女ともに被る米国で二番目に多い癌である。今のところこの疾患 に対する適用可能な治療は外科手術であるが、腫瘍が体腔を越えて拡大したり局 部リンパ節へ転移したり、患者にとって予後は芳しくない、近年報告された無作 為抽出Ｐｈａｓｅ−ＩＩ活性特異性免疫療法実験では予後が著しく向上されてお り、ここでは、Ｔｉｃｅ　ＢＣに（ＢａｅｉｌｌｕｓＣａｌ＋ａｅｔｔｅ　Ｃｕ ｅｒｉｎ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ。

シカゴ、ＩＬ）と混合した自己由来腫瘍細胞を患者に免疫感作すると皮膚遅延過 敏症反応が極めて高まり、４年間にわたり再発及び死亡率が著しく減少した（３ ）１結腸癌関連抗原の同定について記述しである出版物は多数あ−る（４〜９） 、これらの抗原の大部分は、何等かの形態の結腸腫瘍（抽出物、分離細胞、膜調 製物他）又は結腸腫瘍細胞系をマウスに免疫感作することで産生されるモノクロ ーナル抗体を使用して同定された。これらのマウス抗体は、マウスにおいて抗原 性を有すると考えられる範囲の抗原を同定する。これ等の研究に加えて、腫瘍物 質に対して特異反応性を示すヒトモノクローナル抗体についても幾つかの報告が ある（１９）。

本発明者等は、自己由来腫瘍細胞及びＢＣＣで免疫療法プロトコルにより能動免 疫感作した結腸直腸患者から抽出した抹消底Ｂ細胞を使用して、ヒト抗饅瘍モノ クローナル抗体を生産する方法を開発することに成功した（１）、健康な個体に も見られる組織成分をしばしば認識する、例えばＣＥ＾のようなヒト結腸癌に対 して産生されるマウスモノクローナル抗体とは異なり、本発明のヒトモノクロー ナル抗体は、ＣＥ＾、血液型決定基若しくは組織適合性抗原に反応性を示さず、 自己由来宿主において免疫原として認識されるエピトープに制限された特異性を 特徴とする。

本発明者等は、上記ヒトモノクローナル抗体を腫瘍抗原を同定するためのプロー ブとして使用し、結腸腫瘍、結腸腫瘍細胞系の抽圧物及びヌードマウスにおいて 産生されたヒト腫瘍異種移植片中の特定の抗原を同定した。当該抗原は、全結腸 直腸腫瘍の約６０％に検出されている、ヒトモノクローナル抗体（ＨＣ＾）１６ −８８によって認識されるエピトープを含むことを特徴とする０本発明者等は、 ヒトＭＣ＾１６−８８によって同定されるエピトープが、このエピトープを含む ヒト抗原をマウスに免疫感作して産生されたものであってもマウスモノクローナ ルには認識されないことを発見した。

発明の概要 本発明は、ヒトモノクローナル抗体１６−８８によって認識されるエピトープと 、本発明者が同定、単離及び特性化した前記エピトープを含むヒト腫瘍抗原と、 前記エピトープを含有するヒトＭＣ＾１６−８８に対する抗イデイオタイプ抗体 とに係る。更に本発明は、癌治療の診断と監視のための、前記エピトープを含む 抗原に対する抗体の使用と、前記エピトープを含む腫瘍細胞に対する免疫反応と 同様の免疫反応を誘発するためのワクチン調製における前記抗原の使用とに関す る。

図面の簡単な説明 第１図はヒトＭＣ＾１６−８８によって認識される抗原の精製方法をまとめた流 れ図である。第２図は前記抗原のＨＰＬＣゲル濾過ｊｌ！−離を表す、第３図及 び第４図は前記抗原の５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット精製を示す、第 ５図、第６図及び第７図はそれぞれ、純粋勾配ＰＡにＥ、ショ糖密度勾配遠心分 離及び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の特性化を示す。

好適実施例の説明 本発明者等はヒトＭＣ＾１Ｂ−８８によって認識されるエピトープを含む抗原を 調査した結腸腫瘍の約６０％に発見した（１０）。

更に本発明者は、結腸癌細胞系ＨＴ−２９，５Ｗ１４６３．５Ｗ９４８、Ｓ−４ ０３、ＬＳ１７４、ＬｏＶｏ及び−１Ｄｒ（＾ＴＣＣ，Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ、Ｍ Ｄ）が同じ抗原を含むこと３発見した。ヒトＮＣ＾１６−８８の適合正常結腸組 織との反応性は低いので、この抗原が結腸腫瘍細胞内で優先的に発現されること は明らかである。

更に、本発明者はこの抗原を結腸癌患者の血清中で検出したが、正常な個体から 採った血清には検出可能なレベルの抗原は見られなかった。興味深いことに、明 らかに重い腫瘍をもつ患者は、ＣＥ＾レベルは低いがヒトＭＣ＾によって認識さ れる抗原のレベルが非常に高く、一方その他の患者は有意量のＣＥ八と共に検出 可能であるが低い抗原のレベルを有していた。ヒトＭＣ＾１６−８８によって認 識されるエピトープを含む抗原は、ｇ１康な個体の血清中又は正常な組織中では 検出可能なレベルはないので、腫瘍標識としての有効性はＣＥ＾と相補的である 。従って、単独で使用しても他の腫瘍抗原と組み合わせて使用しても、予後及び 監視のための免疫試薬としては非常に価値のあるツールである（１１）、更にこ れは体液／宿主応答を刺激するためのワクチンに使用することもできる（１２． １３）。

ヒトＭＣ＾１６−８８は、この抗原を単離及び生化学的特性化するための貴重な プローブであることが立証された。しかし、同じ抗原にある異なるエピトープを 認識する、本発明者等が調製したマウスモノクローナル抗体５７５−２０及び８ １０−１２を使用することが必要である場合もある。

抗原の精製は、塩沈降、ゲル？過クロマトグラフィー及びアフィニティークロマ トグラフィーによって実施した。

精製抗原は、純粋勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（純粋ＰＡにＥ）では単 独タンパク質として移動し、還元条件下の変性勾配ポリアクリルアミドゲル電気 泳動では一連のタンパク質として近似移動した。

天然タンパク質の分子量は、ゲルー過によると約９００にであり、純粋ＰＡにＥ によると１００〜１４０にであった０分子量の相違は、分子の形状が球状タンパ ク質の形状ではないか又はある種の非タンパク質物質（例えば脂質）がタンパク 質に付着しているかのいずれかを示すものである。このことは、天然抗原のショ 糖密度遠心分離によって裏付けされており、それによると４３によりわ゛ずかに 大きいサイズであった。つまり、その密度によって決定された天然分子の見掛け の大きさも、非球状タンパク質形状であるか又は非タンパク質成分を含む抗原が 付着していることを示唆している。

抗原の還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量を決定すると、４３に〜３ ５にの範囲の近似移動する一連のタンパク質であった。

３Ｈグルコサミンを用いて抗原に固有標識をつける実験では、このタンパク質に は炭水化物かわずがしか、又は全く付着していないことが判った。更に、３４ｓ ｏ、をタンパク質に取り込もうとしてもうまくぃがないことがらこのタンパク質 がＴａ酸塩化されないことが判る。しがし、３２ｐＱ、が取り込まれたことで、 タンパク質がリン酸化されることが判る。

本発明者等はこの腫瘍関連抗原を、１６−８８ヒトモノクローナル抗体との反応 性によって単離した０種々の結腸癌中及び種々の結腸癌患者の血清中にこの抗原 が存在することに基づけば、診断のため及びワクチン開発のために、これは重要 な抗原である。この抗原は、ヒトＭＣ＾１６−８８との免疫反応性と、等；焦電 気泳動と組み合わせた分子量特性化とによって定義され、明確に同定される。

ヒトモノクローナル抗体１６−８８を使用して、本発明者等は、ＭＣ＾１６−８ ８エピトープを表す組換えタンパク質の産生のためにＥ、ｅｏｌｉ発現ライブラ リーを検査した（２０）、　５種類の陽性クローンを詳細に分析し、ヒトサイト ケラチン１８番に対するｃＤＮ＾から一連のクローンを誘導した（第８図＾）、 このことは、ＤＮＡ配列分析及び文献の配列（２１）との比較によって確認され た。この実験から得られる重要な結論は、Ｒｏｅ＋ａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、によっ て配列決定され且つクローンｒＣＴ＾１０゜２及びｒＣＴ＾１２．１に発現され るサイトケラチン１８番遺伝子の領域が、ヒトＭＣ＾１６−８８規定のエピトー プを含有しないことである。このエピトープは、ｒＣＴ＾５６．１によって規定 されるサイトケラチン１８番のアミノ末端部内に包含される。

サイトケラチン１８番に対する反応性に加えて、ＭＣ＾１６−８８規定エピトー プはサイトケラチン類の他のメンバーに発現される。この例を第８図Ｂに示す、 特異的抗血清を用いてｒＣＴ＾４５．１及びｒＣＴ＾５２．１を分析すると、こ れは組換えサイトケラチン１９番として同定された。　ＭＣ＾１６−８８規定エ ピトープを担持する２種の遺伝子生産物はサイトケラチン類のメンバーであるこ とが判った。これ等は、生化学分析によって規定される近似移動する幾つかのタ ンパク質のうちの２種のみを表す、明らかに、ＭＣ＾１６−８８によって規定さ れる重要なエピトープは、タンパク質の中間フィラメント類の他のより制限され たエピトープとは区別される（表３）。

ＭＣ＾１６−８８によって認識される腫瘍関連抗原はＩＴ−２９細胞系から精製 された。この抗原はサイトケラチン８．１８及び１９に関係するようである。そ れはヒトモノクローナル抗体１６−８８によって認識されるエピトープがこれら の分子に見られるし、サイトケラチン８．１８及び１９に特異的なマウスモノク ローナル抗体によって認識されるエピトープはこの抗原に反応性を示すことから 判る。この抗原は、天然サイトケラチン８．１８及び１９とは違って、水性溶液 における溶解度及び分子量がより小さいことでサイトケラチン８．１８及び１９ （ＩＩＴ−２９細胞中に存在すると報告されたサイトケラチンの全部）とは異な る。更に、抗原複合体における２種のポリペプチドのＮ末端タンパク質配列デー タは、この抗原のアミノ酸配列がサイトケラチン８．１８及び１９に対して報告 されたアミノ酸配列とは異なることを示している。

抗原の精製に加えて、本発明者等は更に、マウス抗イデイオタイプモノクローナ ル抗体の単離物に対するＭＣ＾１６−８８反応性を特徴付けた（表２）。

ＭＣ＾１６−８８に　っ−古Ｌｊ　れる　、のヒトＮＣ＾１６−８８によって認 識される抗原の精製処理をまとめた流れ図を第１図に示す、洗浄剤ＮＰ−４０（ Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）を含有するｗＬ街液液中腫瘍細胞系、Ｈ Ｔ−２９を抽出すると、清澄化の後に、ヒトＭＣ＾１６−８８によって認識され る抗原を含有する水溶液となった。透析後、このタンパク質を２０％硫酸アンモ ニウム（＾、Ｓ、）を用いて沈降させた。遠心分離して、再溶解沈澱物をＴＳＫ ４０００Ｓｌｌｌゲル濾過カラム上で分別した。

ゲルー過カラムから得た抗原プールをチオプロピル−セファロース６Ｂカラムに 直接適用し、１０−Ｍジチオトレイトールで溶出させた。第３図及び第４図は、 精製中の抗原プールの５ＯＳ−ＰＡにＥ分析及びウェスタンプロット分析を示す 、レーン＾〜Ｅは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクーマシーブル ーの染色を示し、レーンＦ〜ｌはプローブとしてＮＣ＾１６−８８を使用したウ ェスタンプロット分析をポス。レーン＾はＳＯＳ分子量標準であり、レーンＢ及 ＴｊＦは粗抽出物であり、レーンＣ及びＣは２０％硫酸アンモニウム沈澱物であ り、レーンＤ及びＨはＴＳＫ４０００ゲル濾過クロマトグラフィーであり、レー ンＥ及びＩはチオプロピル−セファロースクロマトグラフィーである。

Ｕｌｌ並１ 天１１ｉ原！υ（瓜 非変性抗原の純度をサイズ排除ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ及びアガロース ＩＥＦによって評価した。この結果から、分析ＨＰＬＣを使用すると単独ピーク が得られ、分析ＩＥＦを使用すると等電ｐＨ５，３±０．３で単独バンドが得ら れることが判った（第２図）、つまり、天然抗原はこれらの基準ではほぼ均質な タンパク質の特性を有する。第２図は、！（ＰＬＣＬルが過、アニオン交換ＨＰ ＬＣ及び等電点電気泳動による精製抗原の分析を表す。

＾、　Ｚｏｒｂａｘ　ＣＦ−４５０カラム（９，４ｎ＋ｍ　ｘ　２５ｃｍ）（Ｄ ｕＰｏｎｔ）をＰＢＳ中で平衡にし、分子量標準値を調整し、精製抗原の分離の ために使用した。

一＾２８０　Ｉ Ｂ、　Ｐｈａｒｍａｅｉａ　Ｍｏｎｏ　Ｑカラム（５ｍｍ　ｘ　５ｃｍ、アニオ ン交換）を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０（ＩＩ衝液Ａ）中で平衡化させ、精 製抗原の試料を負荷し、緩衝液＾から緩衝液＾＋１．０　Ｍ　ＮａＣ１への直線 的勾配をもつカラムをつくった。

−＾２８０れ■ 一−−−Ｎａｃ１濃度 ｉ五１＋ ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって測定される天然抗原の分子量は、サ イズ排除カラムクロマトグラフィ量は、ＦｒａＬｏＨｅｌ　ＨＷ５５Ｆ−６５Ｆ 及び５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００といった他のゲル濾過マトリックスで確証 された。第５図は、純粋勾配ＰＡにＥによって測定すると分子量が約１００〜１ ４０にて゛あることを示す、異なる方法で測定したときのこの分子量の差は、ゲ ルー過系で純粋勾配ＰＡＧＥ緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１Ｍホウ酸、ｐ Ｈ８，３）を使用した場合、及び純粋ＰＡにＥ系で非ホウ酸塩含有緩衝液（０， ０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．５Ｍグリシン、ｐＨ８，３）に置き換えた場合でもその ままである。

ゲル濾過とゲル電気泳動との分子量の差は、ＭＣ式１６−８８によって認識され る抗原の形状が、ゲルシ過による分子量測定で推定されたように、球状ではない ことを示唆する。この分子の形状についての情報を得るために、ショ糖密度勾配 遠心分離を実施した。第６図は、抗原が、天然形態において密度が４３によりわ ずかに大きいタンパク質の特性を有することを示す。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル″へゞ゛第７図では抗原は、還元条件下で５Ｄ Ｓ−ＰＡ［；Ｅによって測定されたように分子量４３に〜３５にの一連のポリペ プチドバンドとして現れた。タンパク質バンドは免疫反応性であり、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥに続く電気溶出によって分離することができた。これらのバンドのパター ン、位置及び免疫反応性のいずれもが非還元条件では同じ系中で変化しなかった 。

レーン１〜９は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル；気泳動後のクーマシーブルー の染色を示し、レーン１０〜１８は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル；気泳動後 のＭＣ式１Ｂ−９９を使用したウニ砒酸アンモニウム沈澱物であり、レーン２及 び１１は電気溶出タンパク質バンドへであり、レーン３及び１２は電気溶出タン パク質バンドＢであり、レーン４及び１３は電気溶出タンパク質バンドＣであり 、レーン５及び１４は電気溶出タンパク質バンドＤであり、レーン６及び１５は 電気溶出タンパク質バンドＥであり、レーン７及び１６は電気溶出タンパク質バ ンドＦであり、レーン８及び１７は電気溶出タンパク質バンドＧであり、レーン ９及び１８は電気溶出タンパク質バンドＨである。

先ｉ玖盗１ 実施例に示すように、ＢＴ−２９細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ標識を３１グルコサミン 、５％５Ｑ、及び３２ｐＱ、を使用して実施することにした。

抗原は１ｇ８分子であってヒトＭＣ＾１６−８８を用いて沈降させることができ ないので、抗原に対するマウスモノクローナル抗体を免疫沈降に使用した。これ らの実験では３Ｈグルコサミン若しくは３５Ｓ０４の取り込みはわずかじか又は 全く見られなかった。しかし、５２ｐＱ、を使用したときには抗原の標識が行わ れ、これはタンパク質がリン酸化されたことを示す。

１動ｎ ヒトＭＣ＾１６−８８によって認識される精製抗原を１％アガロースゲル中で等 電点電気泳動させた。抗原は、約ｐＨ５，５の等電点て単独バンドとして現れた （第２図Ｃ）。

ＭＣ式１６−８８によってＶ　される組　え「原のクローニング細胞系）ＩＴ２ ９から調製されるｅＤＮＡを担持するλ０ＲＦ８ファージのライブラリー（２０ ）をＭＣ式１６−１１１８及びマウスＭＣ＾５７５−２０を用いて検査した。全 部で１６０，０００個の（７４％ｃＤＮ＾インサートをもつ）組換えファージを スクリーニングした。　ＭＣＡ３７５−２０に反応性を示す２種のクローンを単 にし、例えばｒＣＴ＾１０．０（第８八図及び表３）のごとく特性化した。更に 、ＭＣ式１６−８８に反応性を示す３種のクローンを単離し、第８図及び表３に 示すようにクローンｒＣＴ＾５６．１．４５．１及び５２．１の特性化を行った 。

患者の血清中の　原、出 患者の血清の標本をヒトＭＣ屓６−８８によって認識される抗原についてスクリ ーニングし、ＣＥ＾及びＦＨＡＰレベルを監視した。このテストの結果は表１の 通りである。テストした血清中の抗原のレベルは、ＣＥ＾及びＦＨＡＰの高いレ ベルとは無関係であって、相補的であると言える。

マウスモノクローナル　体による　２、の；η：ＭＣ＾１６−８８によって認識 される抗原に免疫反応性を示す幾つかのマウスモノクローナル抗体を誘導した。

そのなかで、マウスモノクローナル５７５−２０及び８１０−１２はこの抗原を 認識し、競合アッセイでは、それらのいずれもヒトＭＣ＾１６−８８によって認 識される特異的エピトープと反応しなかった（抗原複合体は、分子量４０Ｋを有 するサイトケラチン１９を除いた前記サイトケラチンのどれよりも小さい分子量 ４３〜３５Ｋを有する、密接に関係するポリペプチドから成る。抗原複合体から 八〜Ｈで標識された８つのバンドを電気溶出し、ウェスタンプロット及びＥｌ＾ によって分析した０表５から判るように、ＭＣ＾１６−８８はバンドＢ〜Ｈを認 識した。抗サイトケラチン８はバンドＡ〜Ｈを認識し、抗サイトケラチン１８は バンドＢ〜Ｆのみ認識し、抗サイトケラチン１９はバンドＥ〜）のみ認識した。

マウスに精製抗原を免疫感作して製造したマウスＭＣ＾（ＭＣ＾５７５−２０） はバンドＡ〜Ｇに反応する。これは、マウスＭＣ＾がＭＣ＾１６−８８由来の異 なるエピトープに反応することを示唆するものであり、このことは、＋′Ｉ標Ｊ ＭＣ＾１６−８８を使用する競合ラジオイムノアッセイによって確証された。

ウェスタンプロットの結果は、これらの各ポリペプチドを用いたＥｌ＾によって 確証された。これらのデータは、サイトケラチン８．１８及び１９に特異的なモ ノクローナル抗体によって認諾されるエピトープが抗原に見られることを示す。

ＭＣ＾によってＵされる　５、のＥＩＡ！ｌ；表６には、種々の中間フィラメン トタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の標本を用いた抗原の特性化と、精 製中間フィラメントタンパク質の標本に対するＭＣ＾１６−８８の反応性をまと めである。

サイトケラチン８．１８及び１９に特異的なモノクローナル抗体とマウスモノク ローナル抗体ＭＣ＾５７５−２０のみが抗原と反応する抗体である１ＭＣ＾５７ ５−２０の反応性は抗原及びサイトケラチン１８に対しては同じであるが、他の 中間フィラメントタンパク質に対しては反応性を示さない、抗サイトケラチン８ 及び１８の反応性は、精製サイトクラチンに対するよりも抗原に対する方がより 高い、これは、抗原上のエピトープがそのままのサイトケラチンに容易に接触で きないことによるものであろう、従って抗原は、サイトケラチン８．１８及び１ ９に共通するエピトープを含む、更に、ヒトＭＣ＾１６−８８は、抗原、サイト ケラチン８．１８、及び恐らくデスミンにあるエピトープを認識するがとメンチ ンにあるエピトープを認識しない。

イーイオタイブマウスモノクローナル１体による　原のＭＣ＾１６−８８に結合 するために抗原に直接競合性を示す幾つかのマウスモノクローナル抗体を誘導し た０表２はこれらの抗イデイオタイプ抗体の反応性を示す。

１６−８８エピトープのｔ ヒトモノクローナル抗体１６−８８は、精製タンパク質を使用するウェスタンプ ロットにおいて、中間フィラメントタンパク質サイトケラチン１８及びデスミン に含まれるエピトープを認識する。更に、１６−８８モノクローナルは、ｆｉｃ ｏｌｌｈｙｐａｑｕｅによって抹消血から単離し、エタノールで固定したリンパ 球を染色する。このことは、前記リンパ球はケラチンを含まないが他の中間フィ ラメントタンパク質を含むので、これらに限定されることはないが、サイトケラ チン８．１８及びデスミンを含む中間フィラメントとして公知の細胞骨格タンパ ク質類に属する少なくとも３〜４種の遺伝子産生物に共通するエピトープを１６ −８８が認識することを間接的に証明するものである。

ＭＣ＾１６−８８に　っ　稗−れ　、の５ＤＳ−ＰＡにＥ分析後に電気溶出され たバンドＧ及びｔｌ（’それぞれ第７図のレーン８及び１７とレーン９及び１８ ）からＮ末端タンパク質配列が分析できた。タンパク質配列を＾ｐｐｌｉｅｄＢ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、製の自動気相配列器上で実施した。この結果は、 バンドＧとＨとは大きさが異なるが、同じＮ末端タンパク質配列を有することを 示した。既知のタンパク質配列と比較すると、ＭＣ＾１６−８８によって認識さ れる抗原のポリペプチドはサイトケラチン８及び１９と幾分相同である（約２０ ％）ことが判った。しかし、上記サイトケラチンと同一ではなくて、サイトケラ チン１８との相同性は実質的に見られなかった。この抗原はサイトケラチン８． １８及び１９と共通のエピトープを有するが、明らかに異なるタンパク質を表す 。

８つの近似移動したバンドＡ〜Ｈ（第７図のレーン１〜９及び１１〜１８）はヒ トＭＣ＾１６−８８によって認識される抗原のサブユニットである。バンドＧ及 びＨのＮ末端は以下のようである：Ｇ：Ｖ　Ｌ　Ｅ　Ｖ　Ｄ　Ｐ　Ｎ　Ｉ　Ｑ　 Ａ　Ｖ　ＲＴ　Ｑ　Ｘ　Ｋ　Ｘ　Ｘ　Ｉ　Ｘ　Ｔ　Ｌ　Ｎ　Ｎ　ＫＨ：ＶＬＥＶ ＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱＥＫＸＱＩＫＴＬＮＸＸＦＡＳＦ上記配列においてＸは未 決定アミノ酸を表す。

旺四亙五 ブダペスト条約要項に基づき、１９８４年１月３０日付けでヒトモノクローナル 抗体ＭＣ＾１６−８８を産生ずるヒトＢ細胞誘導細胞系を、１２３０１　Ｐａｒ ｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２、 ＵＳＡの＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （＾ＴＣＣ）に寄託し、受託番号８８８４９５を得た。

ブダペスト条約要項に基づき、　１９８７年７月２日付けでマウスバイブ！、Ｉ 　トー？細胞系ＭＩＤ　９５、ＭＩＤ２６８及ヒＭＩＤ６５６ヲＡＴＣＣに寄託 し、それぞれ受託番号ＨＢ９４７０．ＨＢ９４７１及びＨＢ９４７２を得た。

ブダペスト条約要項に基づき、１９８８年６月３０日付けでマウスハイブリドー マ細胞系５７５−２０及び８１０−１２をＡＴＣＣに寄託した。

Ｋ舅上 緻鳳ｌ ＾ｍｅｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ Ｃ）、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄからヒト結腸腺癌細胞系ＨＴ−２９を取得した。１０％０％ウ シ胎清を補充したダルベツコ改変イーグル培地中で細胞を培養した。細胞を５％ Ｃ０２雰囲気中３７℃でインキユベートシた。

ヒトＭＣ＾１６−８８の　び　制 ヒトモノクローナル抗体１６−８８を産生ずる二倍体細胞系を、１０％０％ウシ 胎清を補充したＲＰ旧１６４０の存在下に中空ファイバーカートリッジ内で成長 させた。抗体（ヒトｈＭ）をゲルー過及びイオン交換クロマトグラフィーによっ て精製した。

マ　スモノクローナル　の Ｂｈｌｂ／ｃマウス（生後６〜８週間）に完全フロインドアジュバント中のＨＴ −２９細胞由来の精製抗原５０．ＩＩを免疫感作した。

不完全アジュバントを用いて更に２つの抗原な免疫感作した。融合の３日前マウ スにＰＢＳ中の抗原５０Ｂを免疫感作した。

牌リンパ球を既存文献（１１）のようにマウス骨髄腫ＮＳ−１（ＡＴＣＣ）（比 ３：１）と融合させた。上澄み液を精製抗原に対するＥｌ＾よってスクリーニン グした。陽性培養を増殖させ、限界希釈法によってクローン化した。

イーイ　イブマウス　ＭＩＤ６５　ＭＩＤ９５　び旧Ｄ２６８の生 Ｂａｆｆｂ／ｃマウスにヒトＩｙＭ（Ｍｉｌｅｓ）ＩＶ　２５ｕｙ、ヒトＩｇＭ 　２５ｕｆＩト腹腔内注射した。３日後マウスにシクロホスファミド（Ｓｉｇ＋ ｅａ）２００ＩＩｆ／ｋｙを注射し、更にシクロホスファミドを２日間隔で２回 注射した０次いでマウスに、精製１６−８８抗体（プール１６０）５０ｕｆＩに より、完全フロインドアジュバント（Ｃｉｂｃｏ）中のらので１回、更に２週間 後手完全フロインドアジュバント（Ｇｉｂｃｏ）中のもので免疫感作した。１６ −８８に対して高血清反応性を示しＩｆＭに対して低反応性を示すマウスを１匹 抽出した。融合３日前にマウスにＰＢＳ中の１６−８８（プール１４１）５０１ １ｇを二次免疫感作した。ＰＥＧを使用して比３：１で胛リンパ球を骨髄腫Ｎ５ −１（ＡＴＣＣ）と融合させた。１６−８８競合アッセイにおいて陽性を示した がＩｇＭと結合しなかった培養と増殖させて凍結保存した。更に、旧Ｄ６５、Ｍ ＩＤ９５及びＭＩＤ２６８は（１６−８８と同じ患者のリンパ球から誘導した） １６−５２抗体と結合しなかった。

ＨＴ−２９のコＨグルコ　ミン標： ＨＴ−２９＋！Ｂ胞を、１０％０％ウシ胎清（［；１ｂｃｏ、Ｉｎｃ、）で補充 したＲＰＭ１１６４０を入れたフラスコ内で増殖させた。　ＲＰ旧６４０を用い て洗浄した後に細胞を、グルコースを含まない、透析して熱失活させた９％ウシ 胎児血清と熱失活させた１％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭ１１６４０中に入れ 、３７℃で６０分間インキュベートした０次いでこの培地を、０．０５ｍＣ１／ ｍｆｆ’Ｈグルコサミン（ＩＣＮ）を含有する培地と置き換えて、３７℃で１６ 時間インキュベートした　５Ｈグルコサミン含有培地を除去し、ＰＢＳを用いて 細胞を数回洗浄し、下記の溶菌緩衝液を用１１て抽出した。

１（Ｔ４９　のコ２　ルトホスフエート　：ＨＴ−２９結腸癌細胞を３２ｐオル トホスフエートを用いて既存文献（２２）のように標識した。即ち、２　ｘ　１ ０’個の細胞を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を含有す る５０ｍＭ　ｔｌＥＰＥｓ。

ｐ）１７．５を用いて２回洗浄し１次いで細胞をホスフェート非含有培地（高グ ルコースＥＭＥＭｊｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５ａｎｔａ　Ａｎｎａ 。

巳）中で１５分間培養し、５０ＱｐＣｉ　”ｐオルトホスフェート（ＮＥＮ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて、６％ＣＯ２雰囲気下３７℃で３ 時間パルスした。標識後、１００ｍＭフッ化ナトリウムと１００＋ＩＭビロリン 酸すトリウムと１．Ｏａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４とを含有する氷温ＰＢＳを 用いて細胞を２回洗浄し、上記のように可溶化した。

）ＩＴ−２９細　のコラＳスルフェート　：’ａｓＳスルフェートを用いて標識 するために、２ｘｌＯ’個の細胞をＨａａ＋ｓ　Ｆ−１２（Ｃｉｂｃｏ）を用い て２回洗浄し、１０％透析ＦＢＳを含有するＨａｍｓ　Ｆ−１２中で６％ＣＯ２ の雰囲気下３７℃で３０分間ブレインキュベートした０次いで、５００１１Ｃｉ 　”Ｓスルフェート（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を加え、 細胞を６％Ｃ０２下３７℃で１８時間培養した。この間に細胞は可溶化され、上 記のように予め透明化された。

１１食又ヌ立１ 上記のように生産したマウスモノクローナル抗体、５７５−２０（ＩｙＭｌ）を 用いて免疫沈降を実施した　ｓＨグルコサミン標識抽出物の５０＋ｕアリコート を抗体５０Ｂと混合し、３０分間２３℃に保った。ホルマリン固定Ｓｔａ　ｈ　 １ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｅｒｅｕｓプロティン＾の１０％溶液２００ｄを用いて ４℃で１６時間インキュベートして抗原−抗体複合体を沈降させた。２０，００ ０　ｘ　ｙで５分間遠心分離し、沈降物を数回洗浄し、５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプ ルば衝液を用いて処理した。

ヒトＭＣ八１６−８８に　って雷η・　れ　、の凍結ＢＴ−２９細胞を抽出緩衝 液（５０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，５◆１５０＋ａＭＮｈＣ１＋　５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ十０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ　＋　０．５％ＮＰ４０）と混合した。

細胞を４℃で６０分間撹拌し、次いで混合物を４℃で６０分間、１００．０００ 　ｘ　ｅで遠心分離した。得られた沈降物を廃棄し、清澄な上澄み液を回収し、 更に精製した。

ヒトＭＣ＾１６−８８に　って坤−れ　、の　゛抽出ＢＴ−２９細胞由来の清澄 な上澄液を４℃に維持し、飽和溶液を用いて２０％ＰｘＦｉアンモニウムにした 。混合物を４℃で６０分間撹拌し、４℃で３０分間、４０．０００　ｘ　ｇで遠 心分離し、上澄み液を除去し、関連抗原を含有するベレットを少量のゲル濾過緩 衝液（２５ｗ１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６，８）に再溶解した。

゛ルパクロマト　−フイー ＶＸ酸アンモニウム沈降抗原をクロマトグラフ分離するために、ゲル濾過緩衝液 中で平衡化させたＴＳＫ　４０００Ｓ１１（２，５ｘ６０ｃｍ）（Ｔｏｙｏ　５ ｏｄａ）ＨＰＬＣカラムを使用した。抗原をカラム上に負荷し、流量４．０ｍ１ １分で溶出させた。抗原を含むフラクションを次の精製ステップのためにプール した。　Ｆｒｉｅｔｏｇｅｌ　ＨＷ（Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ）、Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ Ｆ−４５０（ＤｕＰｏｎｔ）又はＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００（Ｐｈａｒｍａ ｅｉｉ、Ｉｎｃ、）といった他のゲル濾過マトリックスをＴＳＫ　４００ＯＳＷ カラムと置き換えても適していることが分かった。

プロピル−セファロース６Ｂ　ロット　−フィーチオプロピルーセファロース６ Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉｉ、Ｉｎｃ、）を洗浄し、ホスフェート緩衝生理食塩水中 で平衡化させた。ゲル濾過カラムから採取したサンプルを低流量（１５ｗ１１７ 時閲）でカラムに負荷した。まずＰＢＳで、次いでＰＢＳ”１．ＯＭ　ＮａＣｌ でタンパク質が溶出しなくなるまでカラムを洗浄した０次いで０．３Ｍ重炭酸ナ トリウム、ｐＨ８，４中の１０．０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び１． ＯｍＭ　ＥＤＴ＾を用いて抗原を溶出させた。

精製抗原プールを２５Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５に対して透析し、−２ ０℃で保存した。

ポリアクリルアミドゲル　泳 既存文献（１２）のように５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した 。ゲル組成物としては均質ゲル及び勾配ゲルを使用した。純粋勾配ゲル電気泳動 を既存文献（１３）同様に実施した（１３）。

ｌｉ点ｌ久漣ｌ ヒトＭＣ＾１６−８８によって認識される抗原の等電点電気泳動を、両性電解質 を含有する１％アガロースゲル（２５ｘ　１２５　ｘＯ，５ｍｍ）　、ｐＨ３， ５〜１０、Ｏ中で実施した。　１５００Ｖ、１５Ｊ１０ｍＡ及び１０℃で６０分 間予備泳動（ｐｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）　した後に、サンプルを与え、同じ条件 で１２０分間泳動させた。泳動後、２０％ＴＣＡ中にゲルを３０分間浸漬するこ とによってタンパク質を固定した。４０％エタノール、１０％酢酸中０．２５％ ＣＢＢ　Ｒ２８０によって１５分間ゲルを染色し、４０％エタノール、１０％酢 酸中で脱色した。ｐｌｌＦｕとして、Ｃ−Ｐｈｙｅｏｅｙａｎｉｍ（４，７５； ４．８５）、＾ｚｕｒｉｍＰ（５，０，６，０）、　）リフルオロアセチル化ミ オグロビンＮｅｔ（６，８６）、ミオグロビンＮｅｔ（６，４５）、ミオグロビ ンＭｅｔ　Ｅ（７，３０）といったタンパク質を使用した。

ニス　ンブロ・・ト Ｔｏｗｂｉｎ（１４）が記述しているように種々の抗原プールをウェスタンプロ ット分析した。タンパク質を移したニトロセルロースシートをプロット（ｂｌｏ ｔｔｏ）でブロックし、第一抗体のヒトＭＣ＾１６−８８か又は抗原（マウスＭ Ｃ＾１６−８８）に対するマウスモノクローナル抗体かを用いて調べ、更に適当 な信号を生成するためにペルオキシダーゼ−標識したヤギ抗ヒトＩｔＨ若しくは ヤギ抗マウスＩｇ（Ｃ１＾、Ｍ）［ＫＰＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤＩの第二 抗体と反応させた。使用した基質は、ＰＢＳ中でそれぞれ０．０６％及び０．０ ０３％にしたジメチルアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び過酸化水素であった。

Ｅｌ＾に　、の 本発明者等は、抗原を検出するために２種のＥｌ＾を開発した。第一アッセイで は抗原を同定するためにヒトＭＣ＾１６−８８を使用した。抗原を含む）ＩＴ− ２９タンパク質抽出溶液をＰＢＳで（例えば１１０１Ｉ／ｍｅから出発して）適 当に希釈してマイクロタイタープレート上に４℃で１６時間又は２３℃で２時間 固定した。タンパク質溶液を除去し、ＰＢＳ＋　０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を 用いて２回洗浄した。各ウェルの未反応部位を、２３℃で６０分間インキュベー トすることによって０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中のプロット＜ＰＢＳ中の５％ 非脂肪乾燥粉末ミルク）でブロックした。

洗浄後、ウェルをプロット中に希釈した第一抗体ヒトＭＣ＾１６−８８（１，０ ｕｇ／ａ＋ｆ）と反応させ、２３℃で６０分間インキュベートした。第一抗体を 除去し洗浄した後、ペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗ヒトＩ＃Ｍ（ＫＰＬ）の適当 な希釈液（１：３０，０００）でウェルを２３℃で６０分間処理した。抗ヒト抱 合体を除去して数回洗浄した後に、ウェルをペルオキシダーゼ基質（０，５Ｍ酢 酸ナトリウム、ｐ１１５．５中の０．００６％テトラメチルベンジジン及びｏ、 ｏｏｏ）％尿素ペルオキシダーゼ）を用いて処理した。

第二アッセイでは、この抗原に対して発生した２種のマウ、スモノクローナル抗 体、８１０−１２及び５７５−２０を使用した。

マウスＭＣＡ３１Ｏ−１２をＰＢＳ中３ｎｇ／、ｗ＋１の割合で４℃で１６時間 プレート上に固定した。洗浄後、２３℃で４５分間ウェルをブロックした（ＰＢ Ｓ中３％魚類ゼラチン）。洗浄後、抗体を含むテスト血清を入れたウェルをイン キュベートし、ペルオキシダーゼ標諾マウスＭＣ＾５７５−２０を用いて固定し 、３７℃で６０分間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０と含む１ ％グリセロールを用いて数回洗浄した後、前記同様の基質を用いてウェルを処理 した。４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

区り乳盪ユＪＬＭＥ 直線型１０〜４０％ショ糖勾配を遠心分離管内のＰＢＳ中に形成した。標準タン パク質若しくはヒトＭＣＡ１Ｂ−８８によって認識される精製抗原を各チューブ 内の勾配上に層状に置き、全てのチューブを、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｌ’１４１０ −タ内４°Ｃで１７時間、４０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、、で遠心分離した。容管の 内容物は分別され、２８０ｒ＋ｍでの吸光度を測定するか又はヒトＭＣ＾１Ｂ− ８８との反応性をＥＴ八によって測定することで抗原の相対分子サイズを決定し た。

１；　１号−／１　文貸八戸゛１１　日弓摩日１ｒ中１−゛シ１唱５と１ｚもの τ゛ある　：３、Ｈｏｏｖｅｒ、　Ｈ，Ｃ，、Ｊｒ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎ ｃｅｒ　１１９８５）　ＳＳ：１２３６−１２４３゜６、　Ｍａｇｎａｎｉ、Ｊ 、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、（１９８３）　４３：５４８９− ５４９２゜７、Ａｒｔｉｇａｓ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、　［１９８６）　４５：１８７４−１８８１゜８、Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ、　Ｍ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（１９８４）　４４：２４５− ２５３゜１０、Ｈａｓｐｅｌ、　Ｍ、Ｖ−ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、　（１９８５）　４５：３９Ｓ１−３９６１゜１１、Ｂｏｗｓｅｒ−Ｆｉｎ ｎ、　Ｒ，Ａ、’、　ｅｔ　ａｌ。

１３、Ｎｏｒｒｂｙ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＶｉｒＯｌ、　（１９８ ６１５Ｂ＋２１：５３６−５４１゜１４、Ｔｏｕｉｔｏｕ、　１．　ｅｔ　ａｌ 、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　（１９８５１６７：１２Ｓ７−１２６６゜１６、Ｌａ ｅｍｍｌｉ、υ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　＋１９７０１’２ ２７：６８０−６８５゜２１、Ｒｏｍａｎｏ、　Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉｆ ｆ　（１９８６）　３０：２４４−２５３゜特表千１−５０３７５５　（１０） 表３ １、ヒトサイトケラチン１８番に特異的なマウスＭＣ＾（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ　＃８１４３８５）。

２、ヒトサイトケラチン１９番に特異的なマウスＭＣ＾（ＩＣＮ　＃６３−７７ ３＞　。

３、真正サイトケラチン１８番（ＩＣＮ　＃７７１０３１）。

４、　ｒＴＣ＾：組換え結腸腫瘍抗原。

表４ 競合Ｒ１＾ −は競合がないことを示す。

値は５０％阻害を与えるνｇ／ｒａｌである。

表５ ａ　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後にバンドを電気溶出させた（３ ９）。ル−ン当たり抗原１０マイクログラムを使用し、５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースに移し、サイトケラチン８ ．１８及び１９とヒトＭＣ＾１６−８８とマウスＭＣ＾５７５−２０に対して特 異的なモノクローナル抗体を用いて検出した。

ｂ結果は０Ｄ４５０・０．５を与える抗体の濃度をμｇ／１ｔｒｌで表した。

Ｃ（−）はＭＣＡ濃度５．Ｏｐｙ／ｄまで陰性であることを表す。

寧ＭＣ＾１６−８８によって認識される抗原。

ＦＩＧ、　２Ｃ ｐＨ ＦＩＧ、　５ Ａ４５゜ １１１＋１ 国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ＡＴＴＣ受託番号ＨＢ３８、ＣＣＬ２３４、ＣＣＬ２３７、ＣＣＬ２３０及 びＣＣＬ２２９を有する結腸癌細胞系ＨＴ−２９、ＳＷ１４６３、ＳＷ９４８、 ＳＷ４０３及びＬｏＶｏ並びにＷｉＤｒに共通の腫瘍関連抗原に見られる、Ｗｉ ｓｔａｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，フィラデルフィア，ＰＡＵＳＡ市販のヒトモノク ローナル抗体１６−８８に免疫反応性を示すヒト腫瘍細胞エピトープ。
2. ２．ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで測定された分量約９００Ｋ及び等点電 気泳動点約ｐＨ５．５を有し、そのサブユニットがヒトモノクローナル抗体１６ −８８に免疫反応性を示す請求項１に記載のヒト腫瘍細胞エピトープを含有する ヒト腫瘍細胞抗原。
3. ３．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定する と約４３Ｋから約３５Ｋの範囲で移動するタンパク質を含有し、結腸癌細胞系Ｈ Ｔ−２９、ＳＷ１４６３、ＳＷ９４８、ＳＷ４０３、ＬｏＶｏ及びＷｉＤｒに共 通の腫瘍関連抗原に見られる、ヒトモノクローナル抗体１６−８８に免疫反応性 を示すヒト腫瘍細胞エビトープを含有するヒト腫瘍細胞抗原。
4. ４．部分アミノ酸配列ＶＬＥＶＤＰＮＩＱＡＶＲＴＱを含む請求項３に記載の抗 原。
5. ５．サイトケラチン１８及び１９に共通のエビトープを含有するが、サイトケラ チン１８及び１９の両方に対する抗皿清に反応性を示さない可溶性タンパク質を 含有する請求項３に記載の抗原。
6. ６．ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８９４５を有するヒトモノクローナル抗体ＩｇＭ１６ −８８を生産するためのＢ−細胞誘導細胞系。
7. ７．ヒトモノクローナル抗体ＩｇＭ１６−８８。
8. ８．被検体から採取した試験体を、請求項３に記載の抗原に対する抗体を含有す る試薬と反応きせ、得られた抗体／抗原免疫抱合体を検出することから成る、哺 乳動物被検体における腫瘍細胞の存在を検出する方法。
9. ９．前記被検体がヒトである請求項８に記載の方法。
10. １０．前記試薬がヒトモノクローナル抗体１６−８８を含有する請求項８に記載 の方法。
11. １１．少なくとも１種のモノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体５７５ −２０若しくは８１０−１２である請求項８に記載の方法。
12. １２．請求項８に記載の方法によって腫瘍細胞の存在及び量を測定することから 成る、癌療法を監視する方法。
13. １３．前記試薬がヒトモノクローナル抗体１６−８８を含有する請求項１２に記 載の方法。
14. １４．請求項１に記載のエビトープを動物に免疫感作することによって産生され る抗体。
15. １５．免疫原的に有効量の請求項３に記載の抗原を含有するワクチン。
16. １６．ヒトモノクローナル抗体１６−８８を動物に免疫感作することによって産 生される抗イディオタイプ抗体を合有する請求項１に記載のエビトープ。
17. １７．ＭＩＤ６５、ＭＩＤ９５及びＭＩＤ２６８から成る群から選択される請求 項１６に記載の抗イディオタイプ抗体。
18. １８．請求項１７に記載の抗イディオタイプ抗体を含有する抗イディオタイプワ クチン。
19. １９．検出可能標識若しくは細胞毒性化合物と請求項３に記載の抗原に対する抗 体とを含有する免疫化学試薬。
20. ２０．５７５−２０及び８１０−１２から成る群から選択されるマウスモノクロ ーナル抗体を生産するためのハイブリドーマ細胞系。
21. ２１．５７５−２０及び８１０−１２から成る群から選択されるマウスモノクロ ーナル抗体。
22. ２２．前記試薬が、１６−８８、５７５−２０及び８１０−１２から成る群から 選択される少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する請求項８に記載の方 法。