JPS6067431A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS6067431A JPS6067431A JP17677183A JP17677183A JPS6067431A JP S6067431 A JPS6067431 A JP S6067431A JP 17677183 A JP17677183 A JP 17677183A JP 17677183 A JP17677183 A JP 17677183A JP S6067431 A JPS6067431 A JP S6067431A
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- JP
- Japan
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- antibody
- afp
- monoclonal antibody
- hepatocarcinoma
- membrane
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はモノクローナル抗体に関する。
ガンのマーカーとして、α−フェトプロティン（Ａ１！
″Ｐ）及び胎児性抗原（ＯＥＡ）が、よく知られている
。ＯＥＡは、消化器系のガン細胞の膜表面に存在すると
されている。他方、ＡＦＰは、多くの肝ガン及びセルラ
インで産生することが認められているが、細胞質に存在
することか確かめられているにすぎず一膜表面に存在す
るか否かは必ずしも明らかではない。
″Ｐ）及び胎児性抗原（ＯＥＡ）が、よく知られている
。ＯＥＡは、消化器系のガン細胞の膜表面に存在すると
されている。他方、ＡＦＰは、多くの肝ガン及びセルラ
インで産生することが認められているが、細胞質に存在
することか確かめられているにすぎず一膜表面に存在す
るか否かは必ずしも明らかではない。
本発明者らは、モノクローナル抗体に制ガン剤や毒紫を
結合させる、いわゆる”ミサイル療法°°に適したＡＦ
Ｐ［対するモノクローナル抗存在するＡＦＰ及びそれケ
認識するモノクローナル抗体ン見出し、本発明に到達し
た。
結合させる、いわゆる”ミサイル療法°°に適したＡＦ
Ｐ［対するモノクローナル抗存在するＡＦＰ及びそれケ
認識するモノクローナル抗体ン見出し、本発明に到達し
た。
すなわち、本発明の要旨は、細胞膜表面π存在するＡＦ
Ｐ７認識するモノクローナル抗体にある。
Ｐ７認識するモノクローナル抗体にある。
月下、本発明の詳細な説明する。
本発明に係るモノクローナル抗体は１次のような方法で
得られる。
得られる。
すなわち、まずヒト胎盤由来のＡＦＰｙｙ、たとえばＢ
ＡＬＢ１０マウス等に免疫した後、牌臓を摘出し、ポリ
エチレングリコール！用い。
ＡＬＢ１０マウス等に免疫した後、牌臓を摘出し、ポリ
エチレングリコール！用い。
Ｐ３−Ｕｔ等のマウスミエローマ細胞と融合し。
常法によりバイブ］１ドーマを得ろ。そしてハイブリド
ーマ上清よりモノクローナル抗体ケ得る。
ーマ上清よりモノクローナル抗体ケ得る。
つぎに、常法により得られたこれらの抗体ケ用いて、肝
ガンセルライン（たとえば、ＰＬＯｌＫＮ、ＮｕＢ）１
７免疫組織化学的に染色し、陽性を示す抗体を選択する
。この横用は、アピオシン：ビオチン化ワサビペルオキ
シダーゼコンブ１ノッ々スｒＡＢＯｌキットン田電八
市−ス丹ディシュ・ベルオギシダーゼの酵素活性により
、ジアミノベンジジン！基質として用いて行なわれる。
ガンセルライン（たとえば、ＰＬＯｌＫＮ、ＮｕＢ）１
７免疫組織化学的に染色し、陽性を示す抗体を選択する
。この横用は、アピオシン：ビオチン化ワサビペルオキ
シダーゼコンブ１ノッ々スｒＡＢＯｌキットン田電八
市−ス丹ディシュ・ベルオギシダーゼの酵素活性により
、ジアミノベンジジン！基質として用いて行なわれる。
陽性を示す抗体乞大量に入手するには、この選択された
抗体を産生ずるハイプリドーマをＢ Ａ Ｌ Ｂ ／
Ｏマウス腹腔内に注射し、増殖させ、腹水ン採ＩＩゾす
ることにより行なうことができる。
抗体を産生ずるハイプリドーマをＢ Ａ Ｌ Ｂ ／
Ｏマウス腹腔内に注射し、増殖させ、腹水ン採ＩＩゾす
ることにより行なうことができる。
また、上記ハイブリドーマ？培養タンクで大量培養する
方法によることもできる。
方法によることもできる。
このよ５［して得られるモノクローナル抗体は次のよう
な性質ケ有する。
な性質ケ有する。
ｉ） １４Ｑラベル化した本抗体を用いて、胎盤白米Ａ
Ｆ ＰがＰＬＯ肝ガンセルラインの膜に対する結合を
阻害するか否かをみると、ＡＦＰか抗体とセルライン膜
との結合ケ競合的に阻害することかわかる。
Ｆ ＰがＰＬＯ肝ガンセルラインの膜に対する結合を
阻害するか否かをみると、ＡＦＰか抗体とセルライン膜
との結合ケ競合的に阻害することかわかる。
１ｉ）ｐＬａセルラインｖ”ｃ−ロイシンでラベルし、
その膜成分Ｙ”ト１１１’ンＸ Ｉ＋で可溶化し１本杭
体との結合ケみろと、明らかな結合性が認められる。
その膜成分Ｙ”ト１１１’ンＸ Ｉ＋で可溶化し１本杭
体との結合ケみろと、明らかな結合性が認められる。
また、培養土清中の分泌蛋白にも結合性が確認される。
！１ｉ）ＰＬｃセルラインの可溶化膜成分ならびに培養
土清中の抗体反応物ｔ、オファレル（０’ Ｆａｒｒｅ
ｌ）らの方法に準じて二次元電気泳動ン行なうと、膜由
来、培養土清由来のいずれの結合物もＡＦＰの性質（等
電点、分子量）を有することがわかる。
土清中の抗体反応物ｔ、オファレル（０’ Ｆａｒｒｅ
ｌ）らの方法に準じて二次元電気泳動ン行なうと、膜由
来、培養土清由来のいずれの結合物もＡＦＰの性質（等
電点、分子量）を有することがわかる。
１ｙ）ＰＬＯセルラインの膜分画ントリプシン。
グロテアーゼ、チモトリブシン等の蛋白質分解酵素で消
化すると１本杭体との結合性は低下又は低下傾向ケ示す
。
化すると１本杭体との結合性は低下又は低下傾向ケ示す
。
また、゛トリトンＸ ＩＩ処理で低下傾向ケ示し、リパ
ーゼ処理により、その結合性は増加する。
ーゼ処理により、その結合性は増加する。
このような本発明に係るモノクローナル抗体は、細胞膜
表面に存在するＡＦＰを認識するので、肝ガン治療、特
にミサイル療法用の抗体として有用であり、さらに細胞
診等の診断・検査薬としても有用である。
表面に存在するＡＦＰを認識するので、肝ガン治療、特
にミサイル療法用の抗体として有用であり、さらに細胞
診等の診断・検査薬としても有用である。
以下、実施例により本発明ｔさらＶζ詳細に説明する。
ヒトＡＦＰとして、胎盤よりｆ＃製された純度９ｑ％以
上で、免疫化学的にヒトアルブミン（Ｈ８Ａ）と反応し
ないもの（■森氷生科仙製）？用いた。
上で、免疫化学的にヒトアルブミン（Ｈ８Ａ）と反応し
ないもの（■森氷生科仙製）？用いた。
このヒトＡＦＰケ、ＢＡＬＢ１０マウスに１０μｇ１ｇ
回、フロイントの完全アジュバントとともに感作し、最
終免疫は静脈より注射し、３日後に牌ｇａｖ摘出し、ポ
リエチレングリコール≠１Ｉｏｏ’ｉ；ｇ６用いＰ３−
Ｄ／マウスミエローマと融合し、常法によりハイプリド
ーマを作製した。クローニングは限界希釈法を用い、同
法′（！″を回以上行なった。なお、大量の抗体は、Ｂ
ＡＬＢ１０マウス腹水系により採取した。
回、フロイントの完全アジュバントとともに感作し、最
終免疫は静脈より注射し、３日後に牌ｇａｖ摘出し、ポ
リエチレングリコール≠１Ｉｏｏ’ｉ；ｇ６用いＰ３−
Ｄ／マウスミエローマと融合し、常法によりハイプリド
ーマを作製した。クローニングは限界希釈法を用い、同
法′（！″を回以上行なった。なお、大量の抗体は、Ｂ
ＡＬＢ１０マウス腹水系により採取した。
抗ＡｉＦｐ抗体を産生するハイプリドーマは。
６回の融合により、約ダ００クローンが選別された。そ
の５ち、ｌ／クローンの培養上清の抗体価ＩｇＧＪｉｔ
ｖ表／［示す（上清’１ｉ１０倍濃縮した後、測定。）
。
の５ち、ｌ／クローンの培養上清の抗体価ＩｇＧＪｉｔ
ｖ表／［示す（上清’１ｉ１０倍濃縮した後、測定。）
。
表 ｌ
※″ｈｙｂｒｉｔｅｃ″：ハイブリテック社製抗ＡＦＰ
モノクローナル抗体 （２）抗体の選択： ａ）セルラインは、−週間以上、イーグルＭＥＭＹ基本
とした培地に代えて培養俊。
モノクローナル抗体 （２）抗体の選択： ａ）セルラインは、−週間以上、イーグルＭＥＭＹ基本
とした培地に代えて培養俊。
リン酸緩衝液で９回洗浄し、ＩＪ直ちにハイブリドーマ
培養上清と反応させる方法、及び、１ｉ）ｑ ％バラホ
ルムアルデヒド固定後、・メタノール、 Ｈ２Ｏ２溶液
で、内因性酵素ケ不活化し、抗体と反応させる方法、を
用いた。
培養上清と反応させる方法、及び、１ｉ）ｑ ％バラホ
ルムアルデヒド固定後、・メタノール、 Ｈ２Ｏ２溶液
で、内因性酵素ケ不活化し、抗体と反応させる方法、を
用いた。
抗体の検出はベクタスタイン（■θｃｔ、ａｓｔａｉｎ
）社のＡＢＣキットを用い、ホースラディツシュ・ベ
ルオギシダーゼの酵素活性により、基質としてジアミノ
ベンジジンを用いて行なった。
）社のＡＢＣキットを用い、ホースラディツシュ・ベ
ルオギシダーゼの酵素活性により、基質としてジアミノ
ベンジジンを用いて行なった。
ｂ）セルラインと維持
ヒト肝ガンのセルラインとしては、ＫＮ、ＰＬＯ，また
、胎児性肝細胞由来のガン細胞株ＮｕＥｙ、その他コン
トロールとして、ヒト胃ガン培養株ＮＡＴＯ［［、ＭＫ
ＮダＳ。
、胎児性肝細胞由来のガン細胞株ＮｕＥｙ、その他コン
トロールとして、ヒト胃ガン培養株ＮＡＴＯ［［、ＭＫ
ＮダＳ。
大腸ガンＣＩの各細胞株を用いた。なお。
培養細胞は、ユθチ牛脂児血清含有ＲＰＭ工／Ａ’ｌθ
の培養液で３７．０℃、５％ＣＯ２、ｑ５％Ａｉｒの条
件で維持、増殖させた。
の培養液で３７．０℃、５％ＣＯ２、ｑ５％Ａｉｒの条
件で維持、増殖させた。
ｃ） 上記（１）の抗ＡＦＰモノク占−ナル抗体を含む
培養上清及びその希釈物（，２８倍まで）ｗ肝ガンセル
ラインＰＬＯ：ＫＮならびに胎児肝細胞ＮｕＫと免疫組
織化学的に反応させたところ、／９Ｆ／ユに強い反応を
認めた。この反応は無固定標本でも、固定、メタノール
、Ｈ２０□処理法のいずれでも同様であった。
培養上清及びその希釈物（，２８倍まで）ｗ肝ガンセル
ラインＰＬＯ：ＫＮならびに胎児肝細胞ＮｕＫと免疫組
織化学的に反応させたところ、／９Ｆ／ユに強い反応を
認めた。この反応は無固定標本でも、固定、メタノール
、Ｈ２０□処理法のいずれでも同様であった。
マク、コントロールとして市販の抗ＡＦＰモノクローナ
ル抗体（）・イブリテツク社製）を、抗体価としてＩＯ
３にあわせて反応させたが、他のノ・イブリド−マクロ
ーンと同様に陽性反応は認められなかった。
ル抗体（）・イブリテツク社製）を、抗体価としてＩＯ
３にあわせて反応させたが、他のノ・イブリド−マクロ
ーンと同様に陽性反応は認められなかった。
／９Ｆ／２は表７に示すように抗体価が特に強いもので
もなく、またＩｇＧ量が多いというものでもないが、上
記のように、他と異なり陽性を示した。
もなく、またＩｇＧ量が多いというものでもないが、上
記のように、他と異なり陽性を示した。
一万、ＡＦ’Ｐの産生が認められないセルラインＭＫＮ
ｌ／ｌＪ％ＫＡＴＯＩＩＴ、０／にはこの１ｑＦ１２は
反応しなかった。
ｌ／ｌＪ％ＫＡＴＯＩＩＴ、０／にはこの１ｑＦ１２は
反応しなかった。
上記のようにして得られる本発明に係る七ツクローナル
抗体（７９Ｆ／２）について、さらに次のような検討ン
行なった。
抗体（７９Ｆ／２）について、さらに次のような検討ン
行なった。
Ａ 胎盤ＡＦＰとＰＬＯ膜との本抗体の競合反応二
ａ）抗体０１戸４Ｃラベル：
ロイシンン含まないＲＰＭ工 ／Ａ４ｔＯ培地にＳμＯ
ｉ ／ｍｌ Ｏ） １％度の１１−１４０−ロイシンＶ
力口え、！； Ｘ ／ ０６セル／ｌｎｅ ０）ｆＡ度
で６０時間培養し、その培養液乞′°プロティンＡセフ
ァロース”によっテ％’１！ｌ 製り、、＋４Ｑラベル
化モノクローナル抗体とした。
ｉ ／ｍｌ Ｏ） １％度の１１−１４０−ロイシンＶ
力口え、！； Ｘ ／ ０６セル／ｌｎｅ ０）ｆＡ度
で６０時間培養し、その培養液乞′°プロティンＡセフ
ァロース”によっテ％’１！ｌ 製り、、＋４Ｑラベル
化モノクローナル抗体とした。
ｂＪ 肝ガンセルラインＰＬＯのラベルと１１ケ分画の
可溶化： 上記りと同様の条件で培養し、培地、 ７ｉｊｌ ＋ｊｌを回収して用いた。膜分画は、細１Ｊ
、１ カ ｒｎ宴辿ｌ川用移 ｌ ０ 万×Ｑ−Ａ ６
分の沈査７２回洗浄して用いた。膜の 可溶化ハ、７％１トリ） ｙ （Ｔｒｉｔ、ｏｎ）ｘｌ
ｏｏ”、ｘＯｍＭ）リスーＭＣＩ緩 衝液（ｐＨｆ；、０）で行ない、抗体との反応には、リ
ン酸−生理的食塩水緩衝 液で１Ｑ倍希釈して用いた。
可溶化： 上記りと同様の条件で培養し、培地、 ７ｉｊｌ ＋ｊｌを回収して用いた。膜分画は、細１Ｊ
、１ カ ｒｎ宴辿ｌ川用移 ｌ ０ 万×Ｑ−Ａ ６
分の沈査７２回洗浄して用いた。膜の 可溶化ハ、７％１トリ） ｙ （Ｔｒｉｔ、ｏｎ）ｘｌ
ｏｏ”、ｘＯｍＭ）リスーＭＣＩ緩 衝液（ｐＨｆ；、０）で行ない、抗体との反応には、リ
ン酸−生理的食塩水緩衝 液で１Ｑ倍希釈して用いた。
リ ＰＤＩＯカラム（ファルマシア社製）によって脱塩
、リン酸−生理的食塩水 緩衝液で平衡化した１４Ｑラベル抗体欠用い、ＰＬＯセ
ルライン膜と胎盤由来 ＡＦＰと競合実験ケ行なった。その結 果を図１に示す。図／から明らかなよ うに、ＡＦＰン反応液中に加えた場合、その濃度に依存
してＰＬＯ膜に結合す る抗体は少なくなった。また、 ＡＰ’Ｐと抗体の結合
物とみもれる可溶性の放 射能もＡＦＰ濃度に依存して増加した。
、リン酸−生理的食塩水 緩衝液で平衡化した１４Ｑラベル抗体欠用い、ＰＬＯセ
ルライン膜と胎盤由来 ＡＦＰと競合実験ケ行なった。その結 果を図１に示す。図／から明らかなよ うに、ＡＦＰン反応液中に加えた場合、その濃度に依存
してＰＬＯ膜に結合す る抗体は少なくなった。また、 ＡＰ’Ｐと抗体の結合
物とみもれる可溶性の放 射能もＡＦＰ濃度に依存して増加した。
Ｂ 二次元電気泳動法によるモノクローナル抗体結合物
質の検出： 肝ガンセルラインＰＬＣｙ１４０−ロイシンでラベルし
、その培養土清中の筋分子１５１：物を集め、本抗体と
反応させプロティンＡ結合性の放射ｊＥの存否？祢ると
、明し〕かな抗体結合物が認められた。
質の検出： 肝ガンセルラインＰＬＣｙ１４０−ロイシンでラベルし
、その培養土清中の筋分子１５１：物を集め、本抗体と
反応させプロティンＡ結合性の放射ｊＥの存否？祢ると
、明し〕かな抗体結合物が認められた。
また、培養液ｌθｍｌ、細胞タ×７０６由来の膜可溶画
分Ｙ、２μｇの本抗体と反応酸゛プロティンＡ”で精製
し、抗体結合物實を得た。
分Ｙ、２μｇの本抗体と反応酸゛プロティンＡ”で精製
し、抗体結合物實を得た。
これらの結合物ｔオファレルらの方法
にしたかつて、二次元電気泳動法によって検出すると、
本抗体由来のＨ鎖、Ｌ鎖の他に分子＠′乙４ＺＫ、等定
点グ、７のＡＦＰか認められた。
本抗体由来のＨ鎖、Ｌ鎖の他に分子＠′乙４ＺＫ、等定
点グ、７のＡＦＰか認められた。
これらのスポットは、すべて、ＰＬＯ
培養土渭と可溶化膜で同一であった。
０ 肝ガンセルラインＰＬＯ膜の酵素、薬剤処理後の結
合性； Ｐ Ｌ Ｃ！ Ｃｌ）膜分画ントリプシン、グロテアー
ゼ、チモ） ＩＩプシン等の蛋白分解酵素で消化した場
合、本抗体の結合性は低” Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ ／ Ｑ
θ”処理でも、低下傾向？示したが、リガーゼの処理に
よっては逆にその結合性が増加した。
合性； Ｐ Ｌ Ｃ！ Ｃｌ）膜分画ントリプシン、グロテアー
ゼ、チモ） ＩＩプシン等の蛋白分解酵素で消化した場
合、本抗体の結合性は低” Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ ／ Ｑ
θ”処理でも、低下傾向？示したが、リガーゼの処理に
よっては逆にその結合性が増加した。
図１は、本発明に係るモノクローナル抗体Ｚ用いて、Ａ
ＦＰがＰＬＯセルライン膜と抗体との結合ｙ＋［’害す
るか否かをテストした結果ケ示す。 出願人 三菱化成工業株式会社 代理人 弁理士 長谷用 − （ほか１名〕 口面の１７１部（内容に変更なし） 図 １ ＡＦＰ（／ｌ、） ］：１−ｆｒＡ：ネ山ｊ−Ｅ書（方式）％式％ ２ 発明の名称 しツクローナル抗体 ３３ 補正をりる者 車外との関係 特Ｖ「出願人 （Ｊ９６）三菱化成工業株式会社 １１代理人 〒１０４１ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ばか１名）
ＦＰがＰＬＯセルライン膜と抗体との結合ｙ＋［’害す
るか否かをテストした結果ケ示す。 出願人 三菱化成工業株式会社 代理人 弁理士 長谷用 − （ほか１名〕 口面の１７１部（内容に変更なし） 図 １ ＡＦＰ（／ｌ、） ］：１−ｆｒＡ：ネ山ｊ−Ｅ書（方式）％式％ ２ 発明の名称 しツクローナル抗体 ３３ 補正をりる者 車外との関係 特Ｖ「出願人 （Ｊ９６）三菱化成工業株式会社 １１代理人 〒１０４１ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ばか１名）
Claims (1)
- （１） 細胞膜表面に存在するα−フェトプロティン（
ＡＦＰＪを認識するモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17677183A JPS6067431A (ja) | 1983-09-24 | 1983-09-24 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17677183A JPS6067431A (ja) | 1983-09-24 | 1983-09-24 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6067431A true JPS6067431A (ja) | 1985-04-17 |
| JPH0469998B2 JPH0469998B2 (ja) | 1992-11-09 |
Family
ID=16019536
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17677183A Granted JPS6067431A (ja) | 1983-09-24 | 1983-09-24 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6067431A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2222591B (en) * | 1988-08-09 | 1992-04-15 | Tokuyama Soda Kk | Monoclonal antibodies and process for production of monoclonal antibodies |
| US10479827B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-11-19 | Sysmex Corporation | Monoclonal antibody reacting with glycopeptide, and use thereof |
| US10772976B2 (en) | 2016-10-24 | 2020-09-15 | Sysmex Corporation | Method for detecting AFP |
-
1983
- 1983-09-24 JP JP17677183A patent/JPS6067431A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2222591B (en) * | 1988-08-09 | 1992-04-15 | Tokuyama Soda Kk | Monoclonal antibodies and process for production of monoclonal antibodies |
| US10479827B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-11-19 | Sysmex Corporation | Monoclonal antibody reacting with glycopeptide, and use thereof |
| US10772976B2 (en) | 2016-10-24 | 2020-09-15 | Sysmex Corporation | Method for detecting AFP |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0469998B2 (ja) | 1992-11-09 |
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