CN105695419B

CN105695419B - 杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体

Info

Publication number: CN105695419B
Application number: CN201610175113.4A
Authority: CN
Inventors: 张金阳; 靳子安; 宋玉竹; 韩芹芹; 陈强; 夏雪山
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2016-03-25
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: CN105695419A

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体，该杂交瘤细胞株4C9保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO.C2015198，其可以用于制备高效价抗His标签蛋白单克隆抗体，抗His 标签蛋白鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达10⁶；本发明提供的抗His标签蛋白单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对His标签蛋白的表达分析准确，可应用于测定带His标签蛋白的重组蛋白的表达情况验证及His标签重组蛋白的浓度测定。

Description

杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体。

背景技术

His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH，其特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。

His标签融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）进行纯化。IMAC是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni²⁺-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe³⁺-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga³⁺-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。尽管该技术已较为成熟，但该类填料价格一直居高不下。因此，研制出抗His标签蛋白的单克隆抗体，并建立其相应的重组蛋白鉴定和浓度测定技术，对于His重组蛋白纯化的质量检测具有较强的必要性。

本发明利用带His标签蛋白免疫小鼠后利用杂交瘤技术筛选出可高效识别His标签单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C9。His标签单抗可以用来鉴定His标签的蛋白质的表达情况，并与重组蛋白组合，用于重组蛋白的浓度测定。

发明内容

本发明的目的是提供一株杂交瘤细胞株4C9，该细胞株已于2015年12年16日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO. C2015198，分类命名为杂交瘤细胞株4C9；其具有序列表中SEQ ID NO：1所示的抗His标签蛋白单克隆抗体轻链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO：2所示的抗His标签蛋白单克隆抗体重链可变区编码基因序列。

本发明另一目的是提供一种抗His标签蛋白单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO：C2015198的杂交瘤细胞株4C9分泌产生；其轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；重链可变区具有序列表中SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；该抗His标签蛋白单克隆抗体可以识别所有带有His标签的重组蛋白。

本发明另一目的是将抗His标签蛋白单克隆抗体应用在带His标签重组蛋白表达情况检测和浓度测定中。

本发明提供的杂交瘤细胞株4C9是采用两个带有相同His标签的不同重组蛋白分别作为免疫原和检测原进行免疫和筛选获得的，其具体步骤为：将基因工程表达的带His标签重组狂犬病毒L蛋白作为免疫原，对BALB/c小鼠免疫3-5次，加强免疫于细胞融合3天前以不含佐剂的2倍抗原剂量进行。采用双抗原同步检测ELISA方法进行筛选融合细胞：第一采用带His标签重组狂犬病毒L蛋白进行筛选以排除不产生抗体的阴性细胞及针对免疫原以外抗原的克隆；第二以带His标签的重组HCV NS3蛋白筛选，对两种抗原均产生强阳性反应的克隆进行有限稀释，12天后采用带His标签重组HCV NS3蛋白进行抗体检测，重复2-3次，直到所有亚克隆孔均呈阳性反应时，即筛选获得杂交瘤细胞株4C9。

本发明提供的抗His标签单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株4C9注射预先用灭菌液体石蜡处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗His标签蛋白单克隆抗体。

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：腹水4℃ 12000 rpm离心15min，去除杂质。取1份腹水与2份醋酸盐缓冲液（0.06M NaAc）混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸 33μl/mL腹水。室温混合30 min，4℃静置 2h以上，使其充分沉淀。4 ℃，12000rpm离心 30 min，弃沉淀。上清经砂芯漏斗或125μm的尼龙网过滤后，加入1/10体积的0.1MpH 7.4 PBS，用2M NaOH调pH值至7.4。冰浴下在30min内加入0.277g/mL的硫酸铵，使成45％饱和度。4 ℃静置1h以上。4℃，10000 rpm离心30min，弃上清。沉淀用适量含137mM NaC1、2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH 7.4 PBS溶解，于50~100倍体积的上述PBS中4 ℃透析过夜。取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS PAGE 检测抗体纯度。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明提供的杂交瘤细胞株4C9可以用于制备高效价抗His标签蛋白单克隆抗体，抗His标签蛋白鼠腹水抗体酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定的效价可达1.28×10⁶；

（2）本发明提供的抗His标签蛋白单克隆抗体可应用于带His标签蛋白的重组蛋白的鉴定和含量测定。

附图说明

图1为用纯化后的本发明杂交瘤细胞株4C9 C2015198分泌的单克隆抗体在检测带His标签重组蛋白的免疫印迹图；图中M：分子质量标记；1：诱导前的全菌蛋白质样品；2：诱导表达细菌超声破碎的全菌体蛋白质样品；

图2为竞争性ELISA方法检测带His标签重组蛋白的标准曲线图。

具体实施方式

下面用实施例对本发明做进一步阐述，应当理解为，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制，本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所做的任何变动都将落在权利要求书的范围内，实施例中百分比均为体积百分比。

实施例1：杂交瘤细胞株4C9的制备

1、免疫和检测原的制备及动物免疫

作为免疫原的带His标签重组狂犬病毒L蛋白的载体构建和蛋白表达与纯化的具体过程参见文献Zhang J, Jin Z, Sun T, et al. Prokaryotic Expression,Purification, and Polyclonal Antibody Production of a Truncated RecombinantRabies Virus L Protein[J]. Iranian Journal of Biotechnology, 2015, 13(2): 18-24.

而同样带His标签蛋白的重组HCV NS3蛋白的原核表达载体构建及蛋白纯化的具体步骤参见文献孙涛, 杨光文, 张金阳, 等. 丙型肝炎病毒 NS3 蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 生物工程学报, 2015, 31（5）: 711-712.

以纯化的带His标签重组狂犬病毒L蛋白对6-8周龄雌性BALB/c小鼠3只进行免疫。第一次免疫将重组蛋白与等体积福氏完全佐剂混合乳化充分，于小鼠腹、背部皮下多点注射，剂量为50μg/只。第二次免疫于首免2周后进行，采用福氏不完全佐剂与重组蛋白等体积充分乳化，小鼠皮下注射。第三次免疫在第二次免疫后两周进行。在第二次免疫结束后，即以尾静脉采血，测定血清中抗体效价。当血清效价达到10000以上时，选择效价最高的小鼠以腹腔和尾静脉注射冲击免疫，剂量为60μg/只。

2、细胞融合

加强免疫3天后，以50%聚乙二醇（分子量1450）作为融合剂进行细胞融合。将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0以个数比3：1混合，再缓慢（1min内加完）加入0.8mL预热至37℃的50% PEG1450，作用时间为90s，再以预热至37℃的无血清无抗生素的RPMI1640基础培养液重悬细胞，1000rpm离心7min去除融合剂PEG1450，再以含20%胎牛血清（体积比）的HAT完全培养基重新悬起细胞，以200μL/孔铺于96孔板中，于37℃，5% CO₂培养箱中培养，在融合后第5天，以50-100μL/孔的HAT培养液对细胞进行补液。

3、间接ELISA筛选阳性细胞株

在融合后12天，细胞量大约占孔底2/3，取100μL上清进行ELISA筛选。

上述间接ELISA筛选抗His标签阳性细胞的具体步骤如下：

（1）抗原包被：以浓度为2μg/mL的重组HCV NS3蛋白包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜，以含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤一次；

（2）封闭：以含5%脱脂奶的磷酸盐缓冲液作为封闭液，37℃作用1小时，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤一次；

（3）培养上清孵育：将融合细胞的培养上清吸取100μL加至酶标板中，置于37℃条件下作用2小时，以含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤三次，以免疫小鼠血清作为阳性对照，而未免疫的小鼠血清和无细胞孔的培养上清作为阴性对照；

（4）二抗反应：将HRP标记的羊抗鼠抗体以1：10000的比例稀释，将每孔加入100μL，置于37℃条件下作用1小时，以含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤五次；

（5）显色：每孔加入100μL TMB显色液，37℃条件下避光反应15分钟，每孔加入50μL终止液终止显色；

（6）结果判读：以450nm单波长测定各孔吸光度值，以与阴性对照孔吸光度值的比值（P/N）>2.1为限，作为判定阴性和阳性的临界点。

经ELISA筛选，3次亚克隆化获得1株能稳定分泌抗His标签蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，命名为杂交瘤细胞株4C9。该小鼠杂交瘤细胞系已于2015年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2015198。

实施例2：杂交瘤细胞株4C9的亚型鉴定

取杂交瘤细胞的培养上清，采用SouthernBiotech SBA Clonotyping System-HRP（Cat.No. 5300-05）进行亚型鉴定。

将捕获抗体溶于PBS至浓度为6μg/mL（5-10μg/mL），100μL/孔，室温包被2h，以PBS洗1遍，5%脱脂奶封闭2h，以PBS洗2遍，加入单抗细胞培养上清，室温摇床孵育2小时，以PBS洗3遍，加入1：400（1：250-500）稀释的HRP-标记羊抗鼠不同亚型抗体二抗（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，λ，κ），孵育1小时，以PBST洗5遍，加入100μL含0.03% H₂O₂的柠檬酸缓冲液和0.15% ABTS（SouthernBiotech公司）的底物显色，15min钟后，加2M H₂SO₄终止反应；450nm读取吸光度值，结果显示，本发明杂交瘤细胞株4C9的亚型为IgG1型鼠源单克隆抗体，轻链为κ链。

实施例3：抗体的可变区序列测定

取杂交瘤细胞以PBS洗一遍，加入Trizol裂解，抽取细胞总RNA，取1μg模板RNA，加入Oligo（dT）1μL，再加DEPC水使总体积至12μL，轻轻混匀，离心，65℃ 5min，置冰上。随后加入4μL 5×反应buffer，1μL RiboLock^TM RNase抑制剂，2μL 10mM dNTP，1μL RevertAid^TMM-MuL V反转录酶，轻弹混匀，42℃反应1小时。70℃作用5min以终止反应，获得的cDNA保存于-20℃。以获得的第一链cDNA为模板扩增抗体轻、重链可变区基因，引物序列参考文献WangZ, Raifu M, Howard M, et al. Universal PCR amplification of mouseimmunoglobulin gene variable regions: the design of degenerate primers and anassessment of the effect of DNA polymerase 3′ to 5′ exonuclease activity[J].Journal of Immunological Methods, 2000, 233(1-2):167-177.所述方法设计和合成。PCR程序设置为：94℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 2min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用试剂盒纯化回收后，连接到载体pMD19-T中，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。其中的引物序列分别为：轻链可变区引物为：

5’-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’和5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’；

重链可变区引物为：

5’-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’；

5’-SARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3’；

5’-SARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3’；

5’-CAGGTTACTCTGAAAGWGTSTG-3’；

5’-GAGGTCCARCTGCAACARTC-3’；

5’-CAGGTCCAACTVCAGCARCC-3’；

5’-GAGGTGAASSTGGTGGAATC-3’；

5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’；其中S、M、N、R、Y和W为兼并碱基，A/G＝R； A/C＝M；A/T＝W； C/G=S； C/T＝Y； A/C/G/T=N。

得到的基因序列结果：轻链可变区编码基因序列长363bp，序列如SEQ ID NO：1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由121个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO：3所示。重链可变区编码基因序列长339bp，序列如SEQ ID NO：2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由113个氨基酸组成，序列如SEQID NO：4所示。

实施例4：本发明制备的单克隆抗体在免疫印迹法检测带His标签重组蛋白中的应用

取实施例1中的带His标签狂犬病毒重组L蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明杂交瘤细胞系4C9腹水对带His标签蛋白的识别效果。将诱导前和诱导后的狂犬病毒重组L蛋白工程菌收集后，加上样buffer煮沸，上样进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法以Bio-Rad转膜仪中将凝胶蛋白转至NC膜上，再5%脱脂奶溶液于4℃封闭过夜。以含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液洗1遍后，加入单克隆抗体4C9（1：1000）于37℃孵育2小时。以含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液洗3遍后，加入1：5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP（杭州华安生物技术有限公司），37℃孵育1小时。以含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液洗3遍后，加入沉淀型单组分TMB底物溶液（天根生化科技(北京)有限公司）显色。结果如图1所示，由图可见，在诱导前的菌体蛋白中无条带出现，而在诱导表达重组蛋白表达的菌体中有特异性的目的条带出现，且大小与预期的重组蛋白大小一致。可见，用本发明杂瘤细胞系4C9 CCTCC NO：C2015198分泌的单克隆抗体可以很好的检测带His标签的重组蛋白，且具有较好的特异性。

实施例5：间接竞争性ELISA方法测定His重组蛋白浓度

本实施例的竞争性ELISA方法包括包被于酶标板的带His标签狂犬病毒重组L蛋白（实施例1制备的重组L蛋白）、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，由实施例1制备的由小鼠杂瘤细胞系4C9 CCTCC NO：C2015198分泌的单克隆抗体，其他辅助试剂包括样本稀释液、封闭液、显色液及终止液。

以包被缓冲液将重组L蛋白稀释至10μg/mL，在96孔酶标板中每孔加入100μL，4℃包被过夜。包被后用洗涤液（PBST）洗板3次，每孔加入200μL含5%脱脂奶的封闭液，37℃封闭1小时。封闭结束后，用洗涤液（PBST）洗板3次，在酶标板孔内加入特定浓度的杂交瘤细胞系4C9分泌的单克隆抗体和带His狂犬病毒L重组蛋白（自200μg/mL作为起始浓度，进行倍比稀释到0.03125μg/mL，每个样品做3个重复），总体积保持在100μL/孔，37℃孵育2小时。接着加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育1小时。最后在形成的复合物中加入底物显色液，100μL/孔，37℃避光孵育15min。以50μL/孔的量加入2M H₂SO₄，根据450nm波长吸光度值大小判定样品His标签重组蛋白的存在及浓度大小。

结果判定：以重组L蛋白标准品的浓度做横坐标，450nm波长吸光度值抑制率为纵坐标制作标准曲线（图2），得到计算公式，根据待测样品的吸光度值计算得到浓度值，再×待测蛋白分子量/重组蛋白标准品分子量，即得待测样品中的重组蛋白的含量；该方法的最低检测限为0.04μg/mL。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 杂交瘤细胞株4C9及其产生的抗His标签蛋白单克隆抗体

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

gagattgtga tcacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtcg gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgagtt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360

tcc 363

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

gaagtccagc tgcaggagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60

tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggaag tattaatcac 180

aacgagaact tcaaggacaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca acagcctgac aactgaggac tctgccgtct atttctgtgc aggcgggggg 300

ggctactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Glu Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser

115 120

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ile Asn His Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gayattgtgm tsacmcarwc tmca 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atagacagat gggggtgtcg ttttggc 27

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

sargtnmagc tgsagsagtc 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

sargtnmagc tgsagsagtc wgg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggttactc tgaaagwgts tg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaggtccarc tgcaacartc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caggtccaac tvcagcarcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggtgaass tggtggaatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatgtgaact tggaagtgtc 20

Claims

1.一株杂交瘤细胞株4C9，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C2015198。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株4C9分泌产生的抗His标签蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体的轻链可变区编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，重链可变区编码氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求2所述的抗His标签蛋白单克隆抗体在带His标签的重组蛋白的检测和浓度测定中的应用。