CN103333863A - 一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao鼠源单克隆抗体细胞株是通过以甲醛灭活的猪链球菌2型菌株（05ZYH33）为免疫原免疫小鼠，在免疫后的小鼠体内抗体达到高峰时，用免疫后鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合，用ELISA法筛选出抗2型猪链球菌表面蛋白Sao鼠源单克隆抗体细胞株得到的。本发明的抗体具有很好的特异性。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
背景技术
猪链球菌（Streptococcus suis serotype,SS）是一种重要的人畜共患病的病原体。根据荚膜多糖的抗原性，SS可分为35个血清型，其中1、2、1/2、7、9、14型具有致病性，以2型（SS2）致病性最强。同为SS2菌株，其致病性又有强、弱和无之分。SS2疫病流行范围很广，在加拿大、美国、丹麦、荷兰等国曾多次发生流行。我国于1991年首次在广东省猪群中发生疫情，20多年来在湖北、湖南、江苏、江西、安徽、四川等南方省份的猪群中经常有此病流行，目前已形成和维持着多处疫源地，在适宜气候和环境条件下存在大规模暴发流行的可能。猪群对此病普遍易感，感染后可有急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等多种临床类型，如不及时治疗病死率可达40%甚至更高；病后幸存的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。目前在我国，猪链球菌感染每年造成的直接经济损失达数十亿元。特别值得关注的是，近年来我国发生的两起SS2暴发流行感染猪和人的公共卫生事件：1998年江苏病死猪10万余头，人群感染25例，其中中毒性休克综合征（Streptococcal toxic shock syndrome，STSS）患者16例，死亡13例（81.3%）；2005年四川省30余乡镇养殖的猪场流行该病，死亡猪几千头，人群感染204例，其中STSS型患者38例，死亡37例（97.4%）。同期广东、香港也有病例报导，江苏虽无人感染病例，但猪群流行此病，病死8万余头。与以往国际报导比较，这两次流行有以下特点：国外人感染病例均为散发，我国则呈现群体染病特点；国外病例临床表现为败血症或脑膜脑炎，预后较好，国内这两次流行有高比例的病人出现STSS，病程短，病情凶险，病死率高（81.3%～97.4%）。引起此次疫情的病原是具有荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、溶菌酶释放蛋白（muramidase releasedprotein，MRP）、胞外因子（extracellular factor，EF）、溶血素（suilysin，SLY）等毒力蛋白的2型猪链球菌强毒株，但致病机理尚不明确。
目前，杂交瘤单克隆抗体的应用范围愈来愈广泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等等。单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的 可能性，使试验结果可行度更大。Sao蛋白(Surface antigen one)是一个新近从猪链球菌中鉴定的表面蛋白，Sao蛋白免疫原性强且广泛存在于猪链球菌的34个血清型中，课题组前期工作也证实了Sao是一个很好的诊断抗原。Sao单克隆抗体的成功发明为猪链球菌快速、准确的诊断奠定了坚实的实验基础。
发明内容
本发明的目的是为了建立快速、可靠的2型猪链球菌侦检方法，提供一株抗2型猪链球菌表面蛋白Sao单克隆抗体细胞株。
本发明的另一目的是提供该杂交瘤细胞的制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株抗猪链球菌2型表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株通过如下方法制备：
（1）采用灭活的猪链球菌2型菌株05ZYH33四次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；
（2）将步骤（1）分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；
（3）以纯化后的重组Sao蛋白为抗原包被ELISA板，ELISA筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao的杂交瘤细胞株2F1。
其中，步骤（1）优选：选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫原，注射菌量为108cfu/只鼠，间隔1周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为109cfu/只鼠。
一种制备分泌抗猪链球菌2型表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包含如下步骤：
（1）采用灭活的2型猪链球菌菌株05ZYH33四次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；
（2）将步骤（1）分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；
（3）以纯化后的重组Sao蛋白为抗原包被ELISA板，采用间接ELISA法筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao的杂交瘤细胞株。
其中，步骤（1）优选：选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫 原，注射菌量约108cfu/只鼠，间隔1周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为109cfu/只鼠。
有益效果
本发明的抗猪链球菌2型表面蛋白Sao特异性单克隆抗体具有很好的特异性，对猪链球菌具有识别作用，可以作为鉴定该病原的有力工具。
具体实施方案
实施例1：免疫和细胞融合、筛选及克隆化
1.选用7周龄雌性BALB/c小鼠。采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫原，注射菌量约108cfu/只鼠，间隔1周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为109cfu/只鼠。
2．细胞融合、筛选及克隆化
小鼠加强免疫3天后无菌取脾脏细胞（2×108）和SP2/0细胞（4×107），再加入预热的50%PEG4000进行融合，融合细胞悬浮于HAT培养基中，分布于含饲养细胞的的96孔板中，0.1ml/孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3‐4天半量换HAT培养基，7天后改用HT培养基，14天后改用完全1640培养基。取杂交瘤细胞分泌上清以菌体ELISA方法进行抗体检测，阳性克隆通过有限稀释法进行3‐4次克隆化。
实施例2：全菌ELASA方法检测抗体
每孔加入100μl 1μg/ml的重组蛋白Sao(rSao)，4℃过夜包被，PBST洗板三次，加入100μl封闭液（1%BSA）37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗板三次，加入100加入移去PLL，加入50μl106cfu的ZY/H33菌悬液，600g离心10min，移去菌液，每孔加入60μl0.5%的戊二醛，温育15min，用PBST洗板两次，再用1%的BSA封闭1h，吸去封闭液，该板即可用于检测。检测时加入50μl的细胞上清或腹水稀释液，温育1h，再用PBST洗板三次，加入酶标二抗，温育1h，PBST洗板三次，OPD显色。
结果显示：通过方阵法确定全菌ELASA中包被抗原和酶标抗体的最适浓度，抗原包被的最适浓度为1μg/ml，酶标抗体的最适稀释度为1:4000。经筛选及克隆化共获得一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F1。应用这一株杂交瘤制备的腹水经ELASA检测，抗体效价为1：25600。
实施例3：Western bloting检测
将重组Sao蛋白进行12%的SDS‐PAGE电泳，电泳完毕后电转移至硝酸纤维素膜上，于4℃下转移90分钟；取出膜，37℃封闭60分钟，TBST洗三次；将膜与1:1000稀释的腹水抗体4℃孵育过夜，第二日摇床上37℃反应60分钟，TBST洗三次；将膜浸在HRP—羊抗鼠(1:10000)中，37℃反应60分钟，TBST洗三次；以底物DAB/CoCl2/H2O2显色，待有条带出现，立即用蒸馏水清洗以终止反应。
可以得出：以重组Sao蛋白进行SDS‐PAGE电泳并转膜后，以2F1腹水型抗体进行Western blot结果显示，抗体与重组Sao蛋白在约100KD处有反应条带。
实施例4：单克隆抗体的初步纯化
饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体。将腹水用生理盐水对倍稀释，电磁搅拌下缓缓加入饱和硫酸铵（事先用浓氨水调至pH7.8）至终浓度50%，4℃下静置1小时，4000转/分钟4℃离心20分钟，沉淀生理盐水溶解，电磁搅拌下缓缓加入饱和硫酸铵至终浓度33%，4℃下静置1小时，室温放置5分钟，4000转/分钟4℃离心20分钟，沉淀再用生理盐水溶解，33%饱和度再重复沉淀3次，最后一次沉淀溶于尽量少的生理盐水中，放入处理好的透析袋中，1000ml去离子水中透析3小时，换液3次。最后在0.01M PBS中透析过夜。将透析好的样品加入终浓度20%的甘油，‐20℃保存备用。
Claims (4)
1.1株分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F1，其特征在于该杂交瘤细胞株通过如下方法制备：
（1）采用灭活的2型猪链球菌菌株05ZYH33四次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；
（2）将步骤（1）分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；
（3）以纯化后的重组Sao蛋白为抗原包被ELISA板，使用重组Sao蛋白ELISA筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得杂交瘤细胞株2F1。
2.根据权利要求1所述的分泌抗猪链球菌2型表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F1，其特征在于：（1）选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫原，注射菌量为108cfu/只鼠，间隔1周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为109cfu/只鼠。
3.一种制备分泌抗猪链球菌2型表面蛋白Sao单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）采用灭活的2型猪链球菌菌株05ZYH33四次免疫雌性BALB/c小鼠，使小鼠体内抗体达到最高峰时分离脾脏B淋巴细胞；
（2）将步骤（1）分离的脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合；
（3）以纯化后的重组Sao蛋白为抗原包被ELISA板，使用重组Sao蛋白ELISA筛选阳性克隆；再进一步以重组Sao蛋白为抗原用Western blot法再次验证ELISA筛选得到的阳性克隆，最终获得分泌抗2型猪链球菌表面蛋白Sao的杂交瘤细胞株2F1。
4.根据权利要求3所述的制备分泌抗猪链球菌2型的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于：（1）选用雌性BALB/c小鼠，采用甲醛灭活的05ZYH33分离株为免疫原，注射菌量为108cfu/只鼠，间隔1周追加免疫共3次，在融合前3天加强免疫一次，菌量为109cfu/只鼠。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN107523553A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-12-29 | 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 | 一株分泌抗2型猪链球菌ak蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN109627333A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-04-16 | 新疆农业大学 | 新疆伊犁株马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体制备方法 |
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2013
- 2013-06-28 CN CN 201310270480 patent/CN103333863A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131002 |