CN107523553A

CN107523553A - 一株分泌抗2型猪链球菌ak蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN107523553A
Application number: CN201710718052.6A
Authority: CN
Inventors: 潘秀珍; 高基民; 孙卫平; 王长军; 李先富; 沈玉洁; 张艳梅
Original assignee: MILITARY MEDICAL INST NANJING MILITARY AREA COMMAND OF CHINESE PLA
Current assignee: MILITARY MEDICAL INST NANJING MILITARY AREA COMMAND OF CHINESE PLA
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2017-12-29

Abstract

本发明公开了一株分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体及其应用。一株分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月25日，保藏号为CCTCC NO：C201763。本发明所述的保藏号为CCTCC NO：C201763的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。本发明的抗体效价很高，具有很好的特异性。

Description

一株分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于病原微生物免疫学检测技术领域，涉及一株分泌抗2型猪链球菌 AK蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一种重要的人兽共患病原菌，能导致人或猪患多种疾病，包括脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎及败血症等，给猪养殖业带来巨大的经济损失，同时也给人类公共卫生安全造成严重的威胁。根据 S.suis荚膜多糖的类型，可将其分为35种血清型(包括1/2型和1～34型)，其中 S.suis 1型、1/2型、2型、7型、9型及14型都具有致病性，但以S.suis 2分布最广，致病力最强。S.suis 2呈全球性分布，加拿大、美国、丹麦、荷兰、泰国等国家曾多次发生该病原暴发或流行。我国于1998年在江苏和2005年在四川相继暴发的S.suis疫情，导致了严重的公共卫生事件，引起了世界范围内对S.suis 感染的关注。由于对S.suis 2的致病机制尚不明确，加之长期使用抗生素等化学药物容易导致细菌产生耐药性，导致对细菌感染的治疗难度增加。目前已有报道 S.suis 2多重耐药性菌株的出现，使得S.suis 2的预防和控制面临严峻的挑战。氨基酸代谢途径由大量的关键酶和中间体参与形成一个复杂的调控网络，其中包括天冬氨酸激酶。激酶是一类从高能供体分子转移磷酸集团到特定靶分子的酶，往往是许多在细胞的信号传导及其复杂的生命活动中起到了广泛的作用。天冬氨酸激酶(Aspartokinase,AK)是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的限速酶,它是多聚体和变构酶，催化ATP的γ-磷酸基转移到天冬氨酸形成天冬氨酰-P。天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中有几种重要的代谢中间体和产物，其代谢中间体包括二氨基庚二酸，是细菌细胞壁生物合成中交联所需的关键组分，代谢终产物包括赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸，这些都是细菌协调生理需求必不可少的氨基酸。可见，天冬氨酸激酶在细菌生理代谢活动中起着重要的作用。目前，关于天冬氨酸激酶在S.suis感染致病机理中的作用的研究尚无报道。

目前，杂交瘤单克隆抗体的应用范围愈来愈广泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等等。其实，抗体不仅仅用于医学和生物学,它的应用范围已扩大到农业、工业、基础研究、环境保护和食品检测等各个方面。特别是近几年来,抗体在动植物疾病的防治方面越来越活跃。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中有很大的应用价值，是亲和层析的配体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制。单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势，单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原抗体反应的特异性，减少了与其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可行度更大。AK参与细菌氨基酸生物合成途径中赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸等氨基酸的合成，这些氨基酸对细菌的生理活动至关重要。另外，合成途径的中间产物二氨基庚二酸，对维持细菌细胞壁的稳定非常重要。天冬氨酸族氨基酸生物合成途径在人类体内不存在，AK在人体内没有同源蛋白，因此AK也是一个潜在的抵抗S.suis 感染的新药设计靶点。

本发明单克隆抗体可用于AK蛋白结构和功能的研究,也能够用于S.suis感染血清学诊断方法的研究，为研究AK在S.suis感染致病机理中的作用机制奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一株分泌抗2型猪链球菌AK单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明的又一目的是提供该单克隆抗体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 2E9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月25日，保藏号为CCTCC NO：C201763。

本发明所述的抗2型猪链球菌AK单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

(1)以纯化的重组AK蛋白为免疫原，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠四次，待小鼠体内血清抗体效价达到最高峰时分离脾细胞；

(2)采用淋巴细胞杂交瘤技术将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；

(3)纯化的重组AK蛋白作为抗原包被酶标板，用间接ELISA法筛选阳性克隆，用有限稀释法进行连续克隆化；用Western blot再次验证筛选得到的阳性克隆；再通过染色体计数证明筛选得到杂交瘤细胞，最终获得稳定分泌抗2 型猪链球菌AK单克隆抗体杂交瘤细胞株2E9；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月25日，保藏号为CCTCCNO：C201763。

其中，步骤(1)特征在于：选用6周龄雌性Balb/c小鼠，将弗氏完全佐剂与重组AK蛋白等体积乳化作为免疫原，每只小鼠皮下注射抗原免疫量为100μg；每间隔14天追加免疫，并改用弗氏不完全佐剂乳化，共3次，免疫原注射量保持不变；在细胞融合前3天腹腔注射加强免疫，免疫剂量仍为100μg/ 只鼠。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO：C201763的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明所述的单克隆抗体在制备S.suis感染血清学诊断试剂中的应用。

有益效果

1.本发明采用淋巴细胞杂交瘤技术，分离经重组AK蛋白免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经ELISA、Western Blot、染色体计数鉴定，成功获得一株分泌抗2型猪链球菌AK单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E9，保藏号为CCTCC NO：C201763。

2.本发明获得的杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，制备腹水抗体，纯化腹水后得到单克隆抗体，单克隆抗体亚型鉴定其为lgG2b型，用间接ELISA检测抗体效价为1∶409600，抗体效价高。

3.本发明的抗2型猪链球菌AK特异性单克隆抗体具有很好的特异性，对猪链球菌AK蛋白具有识别作用，可以用于制备猪链球菌诊断试剂，作为鉴定该病原的有力工具，为人感染猪链球菌的快速诊断、流行病学检测和防控奠定实验基础。

吧

附图说明

图1克隆孔杂交瘤细胞

图2抗体效价

图3 Western blot检测抗AK单克隆抗体的特异性

图4抗体纯化结果

生物材料保藏信息

杂交瘤细胞株2E9S.suis-AK，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2017年4月25日，保藏编号为CCTCC NO： C201763。

具体实施方式

实施例1：免疫和细胞融合、筛选及克隆化

1.选用6周龄雌性Balb/c小鼠。将弗氏完全佐剂与重组AK蛋白(“2型猪链球菌天冬氨酸激酶的原核表达及抗原性检测”中国病原学杂志，2017,12(4))等体积乳化作为免疫原，每只小鼠皮下注射抗原免疫量为100μg；每间隔14天追加免疫，并改用弗氏不完全佐剂乳化，共3次，免疫原注射量保持不变；在细胞融合前3 天腹腔注射加强免疫，免疫剂量仍为100μg/只鼠。

2.细胞融合、筛选及克隆化

小鼠加强免疫3天后无菌取脾细胞(1×10⁷)和SP2/0细胞(2×10⁶)，再加入预热至37℃的50％PEG1459进行融合，融合细胞悬浮于HAT培养基中，分装于铺有饲养细胞的96孔板中，100μL/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，第4 天半量换HAT培养基，第7天改用HT培养基，第14天改用DMEM完全培养基。重组AK蛋白包被酶标板，间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性克隆孔，阳性克隆通过有限稀释法进行连续3-4次克隆化。

实施例2：间接ELASA方法检测抗体

经筛选及连续克隆化获得一株稳定分泌抗AK单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E9。将杂交瘤细胞2E9注射入小鼠腹腔(10天前腹腔注射石蜡)，2×10⁵个/只，待小鼠腹部膨大后采集腹水。采用间接ELASA方法检测抗体。

每孔加入100μl 5μg/ml的重组AK蛋白，4℃过夜包被；PBST洗板三次，加入300μl3％BSA封闭液，37℃封闭2h；弃封闭液，PBST洗板三次，加入 100μl杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h；PBST洗板三次，加入酶标二抗， 37℃孵育1h；PBST洗板三次，加入TMB显色。

结果显示：用杂交瘤制备的腹水经ELASA检测，抗体效价为1∶409600，杂交瘤细胞培养上清效价为1:3200，表明腹水来源的单克隆抗体效价高(图2)。

实施例3：Western blot鉴定抗AK单克隆抗体

将重组AK蛋白进行10％的SDS-PAGE，电泳后转膜PVDF；5％脱脂奶粉37℃ 封闭1h，TBST洗三次；2E9腹水(1:5000)孵育，4℃过夜，TBST洗三次； HRP-羊抗鼠(1:5000)孵育，37℃1h，TBST洗三次；DAB显色显示条带。

Western blot结果(图3)显示，2E9腹水与重组AK蛋白在50KD处有反应条带。单克隆抗体与AK蛋白能发生特异性反应。

实施例4：腹水单克隆抗体的初步纯化

采用正辛酸—硫酸铵法初步纯化抗体。

(1)2E9腹水上清用0.45μm滤膜过滤，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液 (pH4.0)稀释后，逐滴加入辛酸(25μl/ml)，室温搅拌30min，于4℃静置2h，使其充分沉淀。

(2)12000r/min，4℃，30min，收集上清，过滤上清液，加入1/10体积的10*PBS(0.1M pH7.4)，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵0.277g/ml上述混合液(0℃ 条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，硫酸铵全部溶解后，再搅拌30min，使溶液完全平衡，静置过夜。

(3)12000r/min，4℃，30min，吸走上清，将抗体沉淀溶解于PBS中，装入透析袋中，1000ml去离子水中透析3小时，换液3次。最后在0.01M PBS中透析过夜。将透析好的单克隆保存于终浓度10％的甘油，-80℃保存备用。

用Protein G亲和层析柱继续纯化：

a.将初步纯化的腹水与结合缓冲液等体积混合。

b.把上述混合液加到层析柱中，流速为1ml/min，收集穿柱液。

c.用30ml左右结合缓冲液洗柱子，直到A₂₈₀不变。

d.加入5ml洗脱缓冲液，收集洗脱液并立即加入十分之一体积Tris-HCl(PH 9.0)中和液。

最终得到纯化的抗AK单克隆抗体，SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色可清晰显示单克隆抗体的重链(55KD)和轻链(30KD)。

实施例5：Western blot检测抗AK单克隆抗体的特异性

将猪链球菌2型菌株05ZYH33、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌的全菌蛋白进行10％的SDS-PAGE，电泳后转膜PVDF；5％脱脂奶粉37℃封闭1h，TBST洗三次；2E9腹水(1:5000)孵育，4℃过夜， TBST洗三次；HRP-羊抗鼠(1:5000)孵育，37℃1h，TBST洗三次；DAB显色显示条带。

Western blot结果显示，2E9腹水仅与05ZYH33在50KD处有反应条带。表明单克隆抗体能与05ZYH33的AK蛋白发生特异性反应。

Claims

1.一株分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E9，其特征在于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月25日，保藏号为CCTCC NO：C201763。

2.一种制备权利要求1所述的分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于包含如下步骤：

(2)采用淋巴细胞杂交瘤技术将分离的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；

(3)纯化的重组AK蛋白作为抗原包被酶标板，用间接ELISA法筛选阳性克隆，用有限稀释法进行连续克隆化；用Western blot再次验证筛选得到的阳性克隆；再通过染色体计数证明筛选得到杂交瘤细胞，最终获得保藏号为CCTCC NO：C201763的稳定分泌抗2型猪链球菌AK单克隆抗体杂交瘤细胞株2E9。

3.根据权利要求3所述的制备分泌抗2型猪链球菌AK蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于：(1)选用6周龄雌性Balb/c小鼠，将弗氏完全佐剂与重组AK蛋白等体积乳化作为免疫原，每只小鼠皮下注射抗原免疫量为100μg。(2)每间隔14天追加免疫，并改用弗氏不完全佐剂乳化，共3次，免疫原注射量保持不变。(3)在细胞融合前3天腹腔注射加强免疫，免疫剂量仍为100μg/只鼠。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

5.权利要求4所述的单克隆抗体在制备S.suis感染血清学诊断试剂中的应用。