CN105001327A

CN105001327A - 抗p16单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105001327A
Application number: CN201510073905.6A
Authority: CN
Inventors: 杨清海; 陈惠玲; 王小亚
Original assignee: FUZHOU MAIXIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: FUZHOU MAIXIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-02-12
Also published as: CN105001327B

Abstract

发明公开了一种抗p16单克隆抗体，抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ？ID？No.2所示的DNA序列所编码，抗p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ？ID？No.3所示的DNA序列所编码；所述抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？No.4所示的氨基酸序列，所述p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？No.5所示的氨基酸序列。本发明获得的杂交瘤(30859-S17)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白p16分子和表达p16的淋巴细胞，能够检测高表达p16蛋白的皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌等多种肿瘤组织。

Description

抗p16单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种可以识别人p16蛋白质分子的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

p16分子定位于细胞核及细胞质，能特异性的结合细胞分裂周期(Cell Division Cycle)关键酶CDK4或CDK4与细胞周期素(Cyclin)的复合体，参与G1-S转换的调控，抑制CDK4的活性，阻止细胞进入S期，对RB基因控制的细胞增殖周期中起负调节作用。一旦p16基因缺失、突变等导致功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。因为p16通过与cyclin D竞争结合CDK4、CDK6抑制cyclin D/CDK4的活性，当去除p16的抑制作用后，将使细胞异常增殖，过度激活周期蛋白和/或抑制蛋白的失活，都会导致CDKs的过度作用，导致细胞非正常增生。而一旦p16失活，则会引起细胞恶性增殖。细胞中，p16蛋白的表达通常受到另两种抑癌蛋白：p53和RB的调控，处于低水平状态。

研究表明，p16异常表达可用于各种肿瘤的研究，如卵巢癌(袁碧波，张士伟，孙保存，刘容珍，卵巢肿瘤p16蛋白的表达及意义，中国肿瘤临床，2000，4(27)：265-267)、肺腺癌(陆金友，汤一珍，刘丽华，孟刚，肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后的关系，安徽医科大学学报，1999,6(34)：452-454)、直肠癌(张远,王小强,王金柱,白旭升，直肠癌p16蛋白表达的检测及其意义，陕西肿瘤医学，2001,6(9):105-107)、乳腺癌(崔素萍，王花丽，彭伟，刘海静，侯琳，张波，乳腺癌组织p16异常表达的相关分析，北京大学学报，2012,5(44)：755-759)。目前研究表明p16在高级别宫颈上皮内肿瘤和高危型HPV感染的肿瘤中高表达(齐朝阳，陈艳，曾鸿，高宇琳，郭红梅，宫颈上皮内肿瘤p16、p53、Ki67、p63的表达与HPV感染及其临床意义，实用医学杂志，2011,27(20):3639-3640)。p16蛋白分子量为16kDa左右，选择不同的抗原进行免疫，制备出不同结合特性的抗体，对表达抗原细胞具有不同的识别能力和模式。鉴于p16分子在肿瘤病理研究中的重要性，已有不同的抗体制备用于不同免疫学方法。

公开号为CN 101446591A的发明专利“p16^INK4a双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒”，用p16^INK4a多克隆抗体包被酶标板、生物素标记的p16^INK4a单克隆抗体进行宫颈癌筛查。公开号为CN1201210197293的发明专利“一种检测肿瘤标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用”也提供了一种肿瘤抑癌基因p16的抗原氨基酸序列，应用该多肽抗原能检测肺癌的食管癌患者血中相应的特异性抗原表位。该抗原多肽及其抗体可用于制备肿瘤早期诊断试剂，开发肿瘤的靶向药物。目前在肿瘤诊断中使用最多的p16抗体为克隆号E6H4抗体。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可被广泛应用、可准确诊断各种肿瘤类型的抗p16单克隆抗体。

本发明的技术手段为：

本发明对p16分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-32a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组p16筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为1.92×10⁹。免疫印记(Western blotting)实验显示该抗体能特异识别重组的p16蛋白以及表达p16分子的肿瘤细胞。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：

一种抗p16单克隆抗体，抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.2所示的DNA序列所编码，抗p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的DNA序列所编码；所述抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，所述p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

优选的，所述抗p16单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系30859-S17分泌。

优选的，获得所述抗p16单克隆抗体时免疫小鼠用的抗原为重组p16抗原蛋白，所述重组p16抗原蛋白由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达而获得。

优选的，所述重组p16抗原蛋白包括以下一个或几个部分：促使分泌表达的信号肽序列、具有抗原性的p16片段和用于重组蛋白的蛋白标签。

优选的，所述信号肽序列为大肠杆菌果胶酶信号肽序列，所述p16片段为411-750位氨基酸蛋白序列，所述蛋白标签为5-7个组氨酸。

优选的，所述抗p16单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

优选的，所述抗p16单克隆抗体能够识别重组p16抗原蛋白和肿瘤细胞表面的p16分子。

优选的，制备以上所述的抗p16单克隆抗体的方法，包括以下几步：

第一步免疫小鼠：先对p16分子序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-32a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠；

第二步获得杂交瘤细胞系：经细胞融合、重组p16筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系；

第三步获得单克隆抗体：将第二步中的杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体；

第四步鉴定单克隆抗体的亚类：用ELISA技术测定第三步中的单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为1.92×10⁹；

第五步免疫印迹：通过免疫印记实验显示该抗体能特异识别重组的p16蛋白和表达p16分子的肿瘤细胞。

优选的，所述抗p16单克隆抗体用于检测肿瘤和正常组织细胞中的p16表达情况，检测方法包括以下一种或几种：免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法。

优选的，所述抗p16单克隆抗体应用在免疫组化病理诊断剂中。

本发明的有益效果是:

其一、本发明获得的杂交瘤(30859-S17)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白p16分子和表达p16的淋巴细胞，能够检测高表达p16蛋白的皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌等多种肿瘤组织。

其二、本发明获得的杂交瘤(30859-S17)为一种IgG1类抗体，与p16蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

其三、本发明获得的杂交瘤(30859-S17)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。

其四、本发明细胞株制备的抗体在平滑肌瘤、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌的诊断中特异性、敏感性整体基本同对照抗体相当，且在表达强度上稍强于对照抗体。因此，本发明的p16单克隆抗体在检测诊断方面可被广泛应用，可准确诊断各种肿瘤类型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：纯化的p16重组抗原蛋白图。

其中，1，2为表达产物300mM咪唑洗脱的结果，Marker为分子量蛋白，表达产物为GST和p16的融合蛋白，分子量约为43kDa，使用12％SDS-PAGE凝胶。

图2：30859-S17抗体对肿瘤细胞的识别特性和实际应用效果图。

其中，单克隆抗体30859-S17对Hela细胞制备物的的免疫印迹检测结果，Marker为分子量标记，30859-S17单克隆抗体可特异性识别Hela细胞中分子量大小约为16kDa的条带，具有很高的特异性。

图3：p16单克隆抗体的免疫组织化学检测结果图中的对照抗体E6H4。

图4：p16单克隆抗体的免疫组织化学检测结果图中的p16抗体。

其中，应用纯化的本发明p16抗体同商品化抗体E6H4在组织芯片上进行免疫组织化学检测，左为对照抗体E6H4，右为本发明p16抗体。本抗体的敏感性、特异性同对照抗体一致，强度稍强于对照抗体。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

第一步：重组P16融合蛋白的制备

一、基因克隆

p16单克隆按照Uniprot数据库中登录号为P427712的蛋白质序列及对应Genbank中NP_000068的核酸序列，设计特异性上游引物prIHC-13F:5’-CGGGATCCGGTGGTGGTATGGAGCCGGCGGCGGGGAG-3’及下游引物prIHC-13R:5’-CCGCTCGAGATCGGGGATGTCTGAGGGACCTT-3’，从淋巴细胞中的反转录产物中扩增包括编码全长156个氨基酸的基因片段。

在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入BamHI和XhoI酶切位点； PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET-30-GST进行BamHI和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；加入0.1mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白为GST蛋白和P16蛋白的融合蛋白，在二者之间有一个由三个甘氨酸构成的连接短肽，用于提高P16蛋白折叠的效率，并保持相对对立的抗原性，该融合蛋白还带有组氨酸标签，便于使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测。

图1为融合GST蛋白的重组p16蛋白的表达和纯化结果。由图1中所示，重组p16蛋白分子量约为43kDa，蛋白纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

第二步：杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将第一步中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只；每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

免疫小鼠用的抗原为重组p16抗原蛋白，上述重组p16抗原蛋白由序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达而获得。

上述促使分泌表达的信号肽序列、具有抗原性的p16片段和用于重组蛋白的蛋白标签。具体的，上述信号肽序列为大肠杆菌果胶酶信号肽序列，上述p16片段为411-750位氨基酸蛋白序列，上述蛋白标签为5-7个组氨酸。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min；弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞；在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min；弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀；再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中；将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选；阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基；两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养；五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。获得的小鼠杂交瘤细胞系30859-S17。

第三步：腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml；悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠；7天后开始收集腹水；取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min；小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度；纯化的抗体保存于-20℃。

上述获得的抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由序列表中的SEQ ID No.2所示的DNA序列所编码，抗p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由序列表中的SEQ ID No.3所示的DNA序列所编码；上述抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，上述p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

第四步：单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。

倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h；倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h；倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h；倾空液体，用PBS-T清洗3次。

然后每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组P16蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。第四步中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育 1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。

用酶标仪测定波长450nm的吸光值，画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A，然后利用下列公式计算出亲和常数为1.92×10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的p16蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性。

免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳；按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体30859-S17(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDoc MP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

其免疫印迹实验结果如图2中所示，其中Marker为分子量标记，30859-S17单克隆抗体可特异性识别Hela细胞中分子量大小约为16kDa的条带，具有很高的特异性。

第五步：抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，要证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，证实完成后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。

Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA,加入2.5μL oligo(dT)12–18primer(10mM),及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。

随后加入5μL RT buffer(5X),2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时；70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。；将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。

设置PCR扩增程序，通常为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25各循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320－340之间，重链的长度在340－370之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

第六步：组织芯片染色和鉴定

一、芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内15min,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μ m，将连续切片漂在凉水中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟；滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟；甩去PBS，滴加封闭液(动物非免疫血清)室温孵育10分钟；甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟；苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

应用纯化的本发明P16抗体同商品化抗体E6H4在组织芯片上进行免疫组织化学检测，其结果如图3-4所示，其中图3为对照抗体E6H4，图4为本发明P16抗体。本抗体的敏感性、特异性同对照抗体一致，强度稍强于对照抗体。

三、数据统计

上述抗p16单克隆抗体能够识别重组p16抗原蛋白和肿瘤细胞表面的p16分子。根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率(着色样本数/样本总数)，结果见表1。

表1 p16同对照抗体E6H4在各种肿瘤组织中的表达比较

组织类型	病例数	阳性	阴性	％+	％-
						平滑肌瘤
p16	58	1	57	1.72％	98.28％

E6H4	58	2	56	3.45％	96.55％
						乳腺癌
p16	53	18	35	33.96％	66.04％
						E6H4	53	17	36	32.08％	67.92％
肺癌
						p16	15	13	2	86.67％	13.33％
E6H4	15	14	1	93.33％	6.67％
						淋巴瘤
p16	76	21	55	27.63％	72.37％
						E6H4	76	25	51	32.89％	67.11％
食管癌
						p16	43	17	26	39.53％	60.47％
E6H4	43	13	30	30.23％	69.77％

本发明获得的杂交瘤(30859-S17)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白p16分子和表达p16的淋巴细胞，能够检测高表达p16蛋白的皮肤鳞状细胞癌、胰腺癌、黑素瘤、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌等多种肿瘤组织。

本发明获得的杂交瘤(30859-S17)为一种IgG1类抗体，与p16蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

本发明获得的杂交瘤(30859-S17)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。

本发明细胞株制备的抗体在平滑肌瘤、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、食管癌、宫颈癌的诊断中特异性、敏感性整体基本同对照抗体相当，且在表达强度上稍强于对照抗体。因此，本发明的p16单克隆抗体在检测诊断方面可被广泛应用，可准确诊断各种肿瘤类型。

本发明的杂交瘤(30859-S17)于2015年02月05日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为：CGMCC No.10404，建议分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

SEQ ID No.1：

ATGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCGATCCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCGAGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCCGCCACTCTCACCCGACCCGTGCACGACGCTGCCCGGGAGGGCTTCCTGGACACGCTGGTGGTGCTGCACCGGGCCGGGGCGCGGCTGGACGTGCGCGATGCCTGGGGCCGTCTGCCCGTGGACCTGGCTGAGGAGCTGGGCCATCGCGATGTCGCACGGTACCTGCGCGCGGCTGCGGGGGGCACCAGAGGCAGTAACCATGCCCGCATAGATGCCGCGGAAGGTCCCTCAGACATCCCCGAT

SEQ ID No.2：

CAGGGTGAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACGTGTTTACTTTTTGGATGCAGTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGTCGGTAGAAGATACACTCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATACATCCTCCAGCACAGTCTACATGCAACTCAGTACCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTTCCCGGCGGCGACAACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCAAGCTTGTCTATCCACTGGCCCCT

SEQ ID No.3：

GATATCATGATGACCCAAACTCCACTCTCTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAAGTCAACTCAGAGCTTCTATGAGGGAAAAGGGTATTTGATTTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATGGCTCTAAATTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGATGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGTGCATTTTAGCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGGATCCATCTTC

SEQ ID No.4：

QGELQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTGYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGDGATRYTQKFKGKATLTADTSSSTVYMQLSTLASEDSAVYYCATGVFDNWGQGTTLTVSSAKTTPKLVYPLAP

SEQ ID No.5：

DIMMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSTQSFYEGKGYLIWLLQRPGQSPKRLIYGSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCVQVHFSTFGGGTKLEIKRADAAPTGSIF

Claims

1.一种抗p16单克隆抗体，其特征在于，抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.2所示的DNA序列所编码，抗p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的DNA序列所编码；所述抗p16单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，所述p16单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述抗p16单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系30859-S17分泌。

3.根据权利要求2所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，获得所述抗p16单克隆抗体时免疫小鼠用的抗原为重组p16抗原蛋白，所述重组p16抗原蛋白由SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达而获得。

4.根据权利要求3所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述重组p16抗原蛋白包括以下一个或几个部分：促使分泌表达的信号肽序列、具有抗原性的p16片段和用于重组蛋白的蛋白标签。

5.根据权利要求4所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述信号肽序列为大肠杆菌果胶酶信号肽序列，所述p16片段为411-750位氨基酸蛋白序列，所述蛋白标签为5-7个组氨酸。

6.根据权利要求1所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述抗p16单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述抗p16单克隆抗体能够识别重组p16抗原蛋白和肿瘤细胞表面的p16分子。

8.制备权利要求1-7任意一项中所述的抗p16单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下几步：

9.根据权利要求1所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述抗p16单克隆抗体用于检测肿瘤和正常组织细胞中的p16表达情况，检测方法包括以下一种或几种：免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法。

10.根据权利要求9所述的抗p16单克隆抗体，其特征在于，所述抗p16单克隆抗体应用在免疫组化病理诊断剂中。