CN109609466B - 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 - Google Patents

鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109609466B
CN109609466B CN201910069129.0A CN201910069129A CN109609466B CN 109609466 B CN109609466 B CN 109609466B CN 201910069129 A CN201910069129 A CN 201910069129A CN 109609466 B CN109609466 B CN 109609466B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aspergillus
monoclonal antibody
polysaccharide
seq
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910069129.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109609466A (zh
Inventor
苑庆华
何永胜
张桐嘉
樊琳琳
王玉芳
臧丹戎
黄炎彬
王兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beihai Xinglong Biological Product Co ltd
Beijing Gold Mountainriver Tech Development Co ltd
Era Shanghai Biotechnology Co ltd
Tianjin Xinuo Biological Pharmaceutical Co ltd
Tianjin Era Biology Technology Co ltd
Original Assignee
Beihai Xinglong Biological Product Co ltd
Beijing Gold Mountainriver Tech Development Co ltd
Era Shanghai Biotechnology Co ltd
Tianjin Xinuo Biological Pharmaceutical Co ltd
Tianjin Era Biology Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beihai Xinglong Biological Product Co ltd, Beijing Gold Mountainriver Tech Development Co ltd, Era Shanghai Biotechnology Co ltd, Tianjin Xinuo Biological Pharmaceutical Co ltd, Tianjin Era Biology Technology Co ltd filed Critical Beihai Xinglong Biological Product Co ltd
Priority to CN201910069129.0A priority Critical patent/CN109609466B/zh
Publication of CN109609466A publication Critical patent/CN109609466A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109609466B publication Critical patent/CN109609466B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，曲霉菌多糖单克隆抗体及在试剂盒中的应用。本发明的有益效果是：本发明通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗曲霉菌多糖抗体的杂交瘤及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗曲霉菌多糖基因工程抗体的研发奠定了基础；该鼠源性曲霉菌多糖单克隆抗体与曲霉菌多糖具有高效价，且结合特异性强，可用于曲霉菌多糖的检测。

Description

鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于抗体的制备及序列测定领域，尤其是涉及一种鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
背景技术
真菌感染尤其是深部真菌感染所引起的疾病称为真菌病。自然界真菌种类很多，与细菌相比，对人致病者相对较少。但是近年来由于广谱抗生素、肾上腺皮质激素和免疫抑制剂的大量临床应用，真菌感染有明显增长趋势。而目前作为诊断真菌病的基本方法包括：临床表现，真菌学、免疫学和病理学。最直接的方法是能够证明真菌存在于组织中，或在渗出物中可分离培养。但是由于大量广谱抗生素的广泛使用，其培养阳性率也是很低。
烟曲霉(Aspergillu fumigatus，A.fumigatus)在自然界中广泛分布，其分生孢子漂浮在空气中，通过呼吸道进入人体，主要引起肺部感染，其次是颅内感染、外耳病、鼻窦炎，偶有通过皮肤、腹膜、肾、骨、眼睛及消化道感染的报道。其中，曲霉特别是烟曲霉已经逐渐成为临床上一种重要的致病真菌。侵入性曲霉致病的两个主要风险因素为中性粒细胞的减少和皮质激素的使用。感染所致侵袭性肺曲霉菌病是引起高危患者(如中性粒细胞减少症、造血干细胞移植、长期高剂量使用激素和血液恶性肿瘤等免疫力低下患者)致死性感染的主要原因。
十多年前，一项大规模前瞻性临床试验，依照欧洲癌症研究和治疗组织和真菌病研究组(EORTC/MSG)的推荐诊断标准，通过连续检测血清GM抗原诊断成人中性粒细胞减少患者中侵袭性曲霉菌的发病情况，第一次验证了GM试验是成人IA发病检测指标的金标准。GM试验是帮助早期发现侵袭性曲霉菌感染的有效检测手段，是特异性检测血清中或组织液中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，由于GM量的多少与组织中真菌含量密切相关，因此检测GM抗原不仅可以帮助临床早期发现IA并早期进行干预，还可以对治疗效果进行监测和评估，同时对患者的临床结局起到提示作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
本发明采用的技术方案是：鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，命名为3G3，其微生物保藏编号是CGMCC No.16813。
鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；
重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：
SEQ ID NO:1 GFDFSRYWMS(CDRH1)
SEQ ID NO:2 EINPDSSTINYTPSLKD(CDRH2)
SEQ ID NO:3 NSYGTLDY(CDRH3)
轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：
SEQ ID NO:4 WASQSISNSLH(CDRL1)
SEQ ID NO:5 FASQSIS(CDRL2)
SEQ ID NO:6 QQGHTWPHT(CDRL3)
优选地，由保藏编号是CGMCC No.16813的鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株产生。
优选地，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7
QVELQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKHTLYLQMSKVRSEDTALYYCARNSYGTLDYWGQGTALTVSS
SEQ ID NO:8
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCWASQSISNSLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIDSVETEDFGMYFCQQGHTWPHTFGAGTKLELKRA
一种核苷酸分子，核苷酸分子包含编码曲霉菌多糖单克隆抗体的核苷酸序列。
优选地，核苷酸分子编码曲霉菌多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸分子编码曲霉菌多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:9
GGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCTTCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAACATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAAATTCCTACGGTACCCTGGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO:10
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCTGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTTTGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCGACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGGGTCACACCTGGCCTCACACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCT
一种检测曲霉菌抗原试剂盒，包含鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗曲霉菌多糖抗体的杂交瘤及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗曲霉菌多糖基因工程抗体的研发奠定了基础。
2、本发明提供的鼠源性曲霉菌多糖单克隆抗体，其腹水与曲霉菌多糖反应效价高达1×106，且结合特异性强，不与荚膜多糖、甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖产生交叉反应，基于这些特性此单克隆抗体可用于曲霉菌多糖的检测。
附图说明
图1为抗体3G3的效价测定图；
图2为抗体3G3的交叉反应图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。
本发明涉及鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，生物材料命名为3G3，属杂交瘤细胞，其微生物保藏编号是CGMCC No.16813，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2018年11月22日，检测为存活。
1鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体
由鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株产生的鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；其中，重链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：
SEQ ID NO:1 GFDFSRYWMS(CDRH1)
SEQ ID NO:2 EINPDSSTINYTPSLKD(CDRH2)
SEQ ID NO:3 NSYGTLDY(CDRH3)
轻链可变区序列的CDR区中包含三个序列，分别为：
SEQ ID NO:4 WASQSISNSLH(CDRL1)
SEQ ID NO:5 FASQSIS(CDRL2)
SEQ ID NO:6 QQGHTWPHT(CDRL3)
具体地，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO:7
QVELQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKHTLYLQMSKVRSEDTALYYCARNSYGTLDYWGQGTALTVSS
SEQ ID NO:8
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCWASQSISNSLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIDSVETEDFGMYFCQQGHTWPHTFGAGTKLELKRA
1.1小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选
①采用醇沉离心、肼解亚硝酸制备曲霉菌多糖，将其与KLH进行耦连。耦连比为5：1。耦连物通过ConA柱子进行KLH与KLH-糖的分离。以耦连物为免疫原，免疫Balb/c小鼠。筛选条件为：雄性，4周龄；
②首次免疫剂量为50ug糖/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，与二次免疫间隔时间为3周；二次免疫免疫剂量为50ug糖/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：6000以上进行细胞融合。
③融合前3天免疫50ug糖，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合(以10：1比例)，融合时在37℃水浴的环境下，将50％的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。
④融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测OD值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37℃、5％CO2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为3G3，为鼠源IgG2a亚型，轻链为κ链。
1.2腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。以终浓度为33％的饱和硫酸铵对抗体进行粗纯，方法为取1份腹水加1份PBS，滴加1份饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃过夜，10000rpm离心10min除去上清，用少量PBS溶解沉淀，在4℃环境下用PBS透析除盐24h，期间换液3次。粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。
1.3单克隆抗体效价检测
以间接ELISA方法进行效价测定。包被提取的糖10ug/ml浓度，100ul/孔。1％BSA作为封闭液。将制备的腹水从1：1000开始进行2倍稀释，共稀释12个梯度，Promega酶标抗体1：6000稀释，OD为450nm读值，同时设定不包被组进行对照。如图1所示，当腹水稀释128000倍时的OD值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达128000。
1.4与其他糖的交叉反应性
用间接ELISA方法检测单克隆抗体与其他糖的交叉反应性。将荚膜多糖、甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖和曲霉菌多糖按照10ug/ml浓度进行包被，纯化后的腹水作为一抗，Promega抗鼠酶标抗体作为二抗。结果见图2，可见抗体3G3与其他糖无交叉反应，表明该抗体具有很强的特异性。
2编码曲霉菌多糖单克隆抗体的核苷酸序列
编码曲霉菌多糖单克隆抗体的核苷酸序列也包括编码曲霉菌多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和编码曲霉菌多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
编码曲霉菌多糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列，SEQ ID NO:9
GGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCTTCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAACATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAAATTCCTACGGTACCCTGGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA
编码曲霉菌多糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列，SEQ ID NO:10
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCTGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTTTGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCGACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGGGTCACACCTGGCCTCACACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCT
2.1RT-PCR法克隆Ig可变区基因
1)总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法(试剂盒购自Invitrogen)提取3G3杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶(购自Invitrogen)将总RNA逆转为cDNA文库。
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’(SEQ ID NO:11)
重链可变区下游引物
P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’(SEQ ID NO:12)
轻链前导肽上游引物
P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’(SEQ ID NO:13)
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’(SEQ ID NO:14)
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10X pfu BufferⅡ:5μl；ddH2O:补足至50μl。
反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：
VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。
连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系(25μl)如下：
菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10μM)：1μl；dNTP Mixture(各2.5Mm)2μl；Taq DNA聚合酶(5U/μl)：0.5μl；10×Taq Buffer(Mg2+ plus)：2.5μl；补水至25μl。反应条件同前。
选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体3G3的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。
3一种检测曲霉菌抗原试剂盒，包含上述鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体。主要用于检测人血清和肺泡灌洗液中的曲霉菌多糖，对于IA的早期快速检测具有重要的意义。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Figure BDA0001956692960000091
Figure BDA0001956692960000101
Figure BDA0001956692960000111
Figure BDA0001956692960000121
Figure BDA0001956692960000131
Figure BDA0001956692960000141
序列表
<110> 天津一瑞生物科技股份有限公司
天津喜诺生物医药有限公司
北京金山川科技发展有限公司
北海市兴龙生物制品有限公司
一瑞（上海）生物科技有限公司
<120> 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
<130> 2019
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Ser Tyr Gly Thr Leu Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Trp Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Gly His Thr Trp Pro His Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Glu Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys His Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Tyr Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asp Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
<210> 9
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaggtggcc tggtgcagcc tggaggatcc ctgaaactct cctgtgcagc ctcaggattc 60
gattttagta gatactggat gagttgggtc cggcaggctc cagggaaagg gctagaatgg 120
attggagaaa ttaatccaga tagcagtacg ataaactata cgccttctct aaaggataaa 180
ttcatcatct ccagagacaa cgccaaacat acgctgtacc tgcaaatgag caaagtgaga 240
tctgaggaca cagcccttta ttactgtgca agaaattcct acggtaccct ggactactgg 300
ggccaaggca ccgctctcac agtctcctca 330
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgct gggccagcca aagtattagc aacagcctac actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caaggcttct catcaagttt gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcgacag tgtggagact 240
gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag ggtcacacct ggcctcacac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327

Claims (6)

1.鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为3G3，其微生物保藏编号是CGMCCNo.16813。
2.一种鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体，其特征在于：包含重链可变区序列和轻链可变区序列；
所述重链可变区序列的CDR区由三个序列组成，分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示；
所述轻链可变区序列的CDR区由三个序列组成，分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6所示。
3.根据权利要求2所述的鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体，其特征在于：由保藏编号是CGMCC No.16813的鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株产生。
4.根据权利要求3所述的鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体，其特征在于：重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
5.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求3或4所述曲霉菌多糖单克隆抗体的核苷酸序列。
6.一种检测曲霉菌多糖的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2-5中任一所述鼠抗曲霉菌多糖单克隆抗体。
CN201910069129.0A 2019-01-24 2019-01-24 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Active CN109609466B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910069129.0A CN109609466B (zh) 2019-01-24 2019-01-24 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910069129.0A CN109609466B (zh) 2019-01-24 2019-01-24 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109609466A CN109609466A (zh) 2019-04-12
CN109609466B true CN109609466B (zh) 2022-03-01

Family

ID=66020785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910069129.0A Active CN109609466B (zh) 2019-01-24 2019-01-24 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609466B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925446B (zh) * 2020-09-29 2020-12-25 天津喜诺生物医药有限公司 鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN114316056A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 天津一瑞生物科技股份有限公司 一种鼠抗ndm型碳青霉烯酶杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN117430707B (zh) * 2023-10-25 2024-04-19 重庆天科雅生物科技有限公司 一种cik细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149632A (en) * 1988-01-13 1992-09-22 De Staat Der Nedelranden Vertengwoordigd Door De Minister Van Welzijn Method for the detection of molds in foodstuffs and human and animal body fluids
CN101149377A (zh) * 2007-10-29 2008-03-26 南方医科大学珠江医院 用于检测曲霉的抗体
WO2011048598A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating aspergillosis
CN105154492A (zh) * 2015-11-04 2015-12-16 鲁东大学 一种提高红曲霉多糖产量的液体发酵方法
CN108201119A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 吉林农业大学 一种功能性多糖质复合改性可食性淀粉膜
WO2018208977A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 The Johns Hopkins University Optimizing diagnostics for galactofuranose containing antigens

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5149632A (en) * 1988-01-13 1992-09-22 De Staat Der Nedelranden Vertengwoordigd Door De Minister Van Welzijn Method for the detection of molds in foodstuffs and human and animal body fluids
CN101149377A (zh) * 2007-10-29 2008-03-26 南方医科大学珠江医院 用于检测曲霉的抗体
WO2011048598A1 (en) * 2009-10-22 2011-04-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating aspergillosis
CN105154492A (zh) * 2015-11-04 2015-12-16 鲁东大学 一种提高红曲霉多糖产量的液体发酵方法
CN108201119A (zh) * 2016-12-19 2018-06-26 吉林农业大学 一种功能性多糖质复合改性可食性淀粉膜
WO2018208977A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 The Johns Hopkins University Optimizing diagnostics for galactofuranose containing antigens

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunochemical detection of molds: a review;S Li等;《J Food Prot》;20001231;第63卷(第2期);第281-291页 *
Mykoserologie – sind wir weitergekommen? Aspergillus;R. Kappe等;《Mycoses》;20100531;第53卷(第1期);第26-29页 *
烟曲霉抗原及实验诊断的研究进展;徐华等;《国外医学(微生物学分册)》;20021025;第25卷(第5期);第37-39页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109609466A (zh) 2019-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021155861A1 (zh) 人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体及其应用
CN108250296B (zh) 全人源抗人pd-l1单克隆抗体及其应用
CN109609466B (zh) 鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN111925446B (zh) 鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN109628410B (zh) 一种鼠抗曲霉菌多糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
WO2020156509A1 (zh) 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途
AU2020390926A1 (en) Development and application of therapeutic agents for TSLP-related diseases
CN111925993B (zh) 一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN112500485B (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
WO2020259550A1 (zh) 抗cea抗体及其应用
CN112538115B (zh) 一种抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
CN112661849B (zh) 一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用
CN113248617B (zh) 抗Cyclophilin A的单克隆抗体及其在治疗炎症中的应用
CN114106187A (zh) 一种靶向ogt的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用
CN110483640B (zh) 白介素-6r的人源化单克隆抗体、其编码基因及应用
CN114317455B (zh) 鼠抗mcr-1蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
CN112592405A (zh) 抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
WO2017198148A1 (zh) 一种il-13抗体及其制备方法和应用
CN107964045B (zh) 一种人鼠嵌合抗CXCR2全分子IgG及其应用
CN115433276B (zh) 一种vhh抗体或其抗原片段的突变体及其应用
CN110885372A (zh) 一种抗念珠菌甘露聚糖的兔源单克隆抗体及其应用
CN114057880B (zh) 一种dll3单克隆抗体
CN118530947B (zh) 鼠抗克柔念珠菌甘露聚糖杂交瘤细胞株及单克隆抗体
CN118562012B (zh) 鼠抗近平滑念珠菌甘露聚糖杂交瘤细胞株及单克隆抗体
CN118515775B (zh) 一种鼠抗克柔念珠菌甘露聚糖杂交瘤细胞株及单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant