CN111925993B - 一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 - Google Patents

一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗曲霉菌半乳甘露聚糖基因工程抗体的研发奠定了基础；该鼠源性曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体与曲霉菌半乳甘露聚糖反应高效价，且结合特异性强，可用于曲霉菌半乳甘露聚糖的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。

Description

一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及 应用
技术领域
本发明属于抗体的制备及序列测定领域，尤其是涉及一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
背景技术
烟曲霉(Aspergillu fumigatus，A.fumigatus)在自然界中广泛分布，其分生孢子漂浮在空气中，通过呼吸道进入人体，主要引起肺部感染，其次是颅内感染、外耳病、鼻窦炎，偶有通过皮肤、腹膜、肾、骨、眼睛及消化道感染的报道。随着糖皮质激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂使用以及器官移植患者的增多，免疫抑制患者中侵袭性曲霉病(InvasiveAspergillosis,IA)的发病率呈迅速上升趋势。烟曲霉是引起免疫抑制患者肺部侵袭性曲霉感染的最常见病原菌，此外还有黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等。由于缺乏典型的临床表现及有效的早期诊断方法，IA的死亡率高达50％-100％。早期快速检测是IA的有效治疗及降低死亡的关键因素。
半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)是存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守性的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子的标志物。当曲霉菌吸入进入人体肺组织中吞噬细胞便快速将其吞噬，消化处理后释放出真菌细胞壁结构成分。通过血清、支气管肺泡灌洗液、尿液、脑脊液均可监测到半乳甘露聚糖，因此，对GM测定是曲霉菌感染的敏感指标。GM试验特异性检测血清中或组织液中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，是早期发现侵袭性曲霉菌感染的有效检测手段，由于GM量的多少与组织中真菌含量密切相关，因此，检测GM抗原不仅可以帮助临床早期发现IA并早期进行干预，还可以对治疗效果进行监测和评估，同时对患者的临床结局起到提示作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
本发明采用的技术方案是：一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，保藏编号是CGMCC No.20281，命名为EH7。
优选地，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；
重链可变区序列的CDR区中包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的三个序列；
SEQ ID NO:1(CDRH1)
VQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMS
SEQ ID NO:2(CDRH2)
WVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKD
SEQ ID NO:3(CDRH3)
KFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPRGIYAMDYWGQGTSVTVSS
轻链可变区序列的CDR区中包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的三个序列；
SEQ ID NO:4(CDRL1)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVYTAVA
SEQ ID NO:5(CDRL2)
WYQQKPGQSPKLLISASYRNT
SEQ ID NO:6(CDRL3)
GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQENHRIPWTFGGGTKLEIKRA
优选地，由保藏编号是CGMCC No.20281的鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株产生。
优选地，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示；
SEQ ID NO:7
VQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINP
DSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPRGIYAMD
YWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:8
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVYTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASY
RNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQENHRIPWTFGGGTKLEI
KRA
一种核苷酸分子，核苷酸分子包含编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的核苷酸序列。
优选地，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
SEQ ID NO:9
GTGCAGCTGCAGGAATCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCT
GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGT
TGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAA
TCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATC
ATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGT
GAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACCGCGGGGTATATAT
GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG
SEQ ID NO:10
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGAC
AGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGTACACTGCTGTAGCC
TGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCA
TCCTACCGGAACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGG
ACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTT
TATTACTGTCAGGAAAATCATCGTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACC
AAGCTGGAAATCAAACGGGCT
一种检测曲霉菌半乳甘露聚糖的试剂盒，含有鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体。
本发明具有的优点和积极效果是：本发明提供了一种鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，由其制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达106，不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖产生交叉反应，基于这些特性该单克隆抗体可用于曲霉菌半乳甘露聚糖的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。
附图说明
图1抗体EH7的纯化后蛋白电泳图；1.Marker；2.EH7；
图2抗体EH7的腹水效价测定结果；
图3抗体EH7的交叉反应测定结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，生物材料命名为EH7，属杂交瘤细胞，其保藏编号是CGMCC No.20281，保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2020年8月27日，检测为存活。
本发明涉及鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗曲霉菌半乳甘露聚糖基因工程抗体的研发奠定了基础。
鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株产生鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，包含重链可变区序列和轻链可变区序列；
重链可变区序列的CDR区中包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的三个序列；
SEQ ID NO:1(CDRH1)
VQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMS
SEQ ID NO:2(CDRH2)
WVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKD
SEQ ID NO:3(CDRH3)
KFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPRGIYAMDYWGQGTSVTVSS
轻链可变区序列的CDR区中包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的三个序列；
SEQ ID NO:4(CDRL1)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVYTAVA
SEQ ID NO:5(CDRL2)
WYQQKPGQSPKLLISASYRNT
SEQ ID NO:6(CDRL3)
GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQENHRIPWTFGGGTKLEIKRA
具体的，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示；
SEQ ID NO:7
VQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINP
DSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPRGIYAMD
YWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:8
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVYTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASY
RNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQENHRIPWTFGGGTKLEI
KRA
苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸分子编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:9
GTGCAGCTGCAGGAATCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCT
GAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGT
TGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAA
TCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATC
ATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGT
GAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACCGCGGGGTATATAT
GCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG
SEQ ID NO:10
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGAC
AGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGTACACTGCTGTAGCC
TGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCA
TCCTACCGGAACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGG
ACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTT
TATTACTGTCAGGAAAATCATCGTATTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACC
AAGCTGGAAATCAAACGGGCT
由这种鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达106，不与隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖产生交叉反应，基于这些特性这此单克隆抗体可用于曲霉菌半乳甘露聚糖的检测。
下面结合附图对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株的筛选
采用液体沙氏培养基培养曲霉菌，待菌丝体长至黄豆粒大小时离心收集菌丝体和培养液上清，上清经旋蒸浓缩后加三倍体积无水乙醇进行过夜醇沉，沉淀经水溶解即为粗制曲霉菌半乳甘露聚糖，用于动物免疫。采用肼解-亚硝酸法进行进一步纯化粗糖获得精制曲霉菌半乳甘露聚糖，用于特异性单克隆抗体的筛选。
首次免疫剂量为50ug粗糖/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，皮下多点注射，与二次免疫间隔时间为2周；二次免疫免疫剂量为50ug糖/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，腹腔注射，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：8000以上进行细胞融合。
融合前3天免疫50ug糖，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合(以10：1比例)，融合时在37℃水浴的环境下，将50％的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，再在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。
融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测OD值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至24孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37℃、5％CO2孵箱培养；培养10天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为EH7，为鼠源IgG1亚型，轻链为κ链。
实施例2：鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备
2.1腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5x106/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的抗体进行粗纯，粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。纯化后结果见附图1。
2.2单克隆抗体效价检测
以间接ELISA方法进行腹水效价测定。包被曲霉菌半乳甘露聚糖10ug/ml，100ul/孔。1％BSA作为封闭液。将腹水从1：1000开始进行倍比稀释，共稀释12个梯度，Promega酶标抗体作为二抗1：6000稀释后使用，OD为450nm读值，同时设定不包被组进行对照，抗体稀释2048000倍时的OD值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达1：2048000。结果见附图2，制备的腹水与曲霉菌半乳甘露聚糖反应效价高达106。
2.3与其他多糖的交叉反应性
用间接ELISA方法检测单克隆抗体与其他糖的交叉反应性。将隐球菌荚膜多糖、念珠菌甘露聚糖、肽聚糖、脂多糖、1，3-β-葡聚糖和曲霉菌半乳甘露聚糖按照10ug/ml浓度进行包被，纯化后的抗体作为一抗，Promega抗鼠酶标抗体作为二抗。结果见图3。可见抗体EH7与其他糖无交叉反应，表明该抗体具有很强的特异性。
实施例3：鼠源性抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的基因验证
RT-PCR法克隆Ig可变区基因
总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法(试剂盒购自Invitrogen)提取EH7杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶(购自Invitrogen)将总RNA逆转为cDNA文库。
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’(SEQ ID NO:11)
重链可变区下游引物
P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’(SEQ ID NO:12)
轻链前导肽上游引物
P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’(SEQ ID NO:13)
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’(SEQ ID NO:14)
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10X pfu BufferⅡ:5μl；ddH2O:补足至50μl。
反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：
VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple)载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。
连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系(25μl)如下：
菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10μM)：1μl；dNTP Mixture(各2.5Mm)2μl；Taq DNA聚合酶(5U/μl)：0.5μl；10×Taq Buffer(Mg2+plus)：2.5μl；补水至25μl。反应条件同前。
选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体EH7的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。
实施例4：曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒(胶体金法)的制备及应用
检测曲霉菌半乳甘露聚糖的试剂盒，包含上述鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，主要用于检测人血清和肺泡灌洗液中的曲霉菌半乳甘露聚糖，对于侵袭性曲霉菌感染的早期快速检测具有重要的意义。基于该抗体，通过胶体金免疫层析技术，开发出曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒(胶体金法)，并进行了临床样本检测，试剂盒制备过程及临床样本检测结果如下：
4.1金标抗体制备
量取50mL胶体金溶液，加至已灭菌干燥处理的烧杯中，置于电热磁力搅拌器上进行搅拌，500-600rpm，边搅拌边加入0.1M K2CO3溶液，调节pH至9.5；标记：加入抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗体EH70.3mL(2mg/mL)，转速同上，搅拌1h；封闭：加入10％的牛血清白蛋白(BSA)溶液5mL，2％PEG20000 2.5ml，转速同上，搅拌1h；低速离心：1500转/分钟，4℃离心30min，弃沉淀，取上清；高速离心：上清11000转/分钟，4℃离心50min，弃上清，沉淀用胶体金重悬液定容至5mL。
4.2金标垫制备
用数控裁条机裁切玻璃纤维素膜，规格为20mm×300mm×20条；取5mL金标抗体；用三维平面点膜喷金仪将金标抗体喷于玻璃纤维素膜上，调用程序1，速度为100mm/sec、喷金量为8.0ul/cm，喷金压力为1.0kg/cm2，喷金长度为300mm，共计20条；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30％，烘干2h。
4.3包被膜制备
检测线包被液配制：取0.5mL抗曲霉菌半乳甘露聚糖抗体EH7(2mg/mL)，加入10uL1％的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；质控线包被液配制：取0.1ml羊抗鼠IgG(20mg/mL)，加入0.4mL PBS、10uL 1％的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；用三维平面点膜喷金仪将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜(NC膜)上，调用程序0，质控线为1号泵，检测线为3号泵，速度为100mm/sec、划膜量均为0.8uL/cm，划膜长度为300mm，质控线划在距膜顶端12mm处，检测线划在距膜顶端17mm处，质控线与检测线相距5mm。用铅笔标出质控线(C线)和检测线(T线)的位置；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30％，烘干16h。
4.4制卡
用数控裁条机裁切吸水纸，规格为20mm×300mm×20条；组装：将包被好的NC膜贴在底板上，保证边缘对齐，上述制备好的金标垫、吸水纸进行贴膜制成大板，层压参数：金标垫搭上NC膜2mm，吸水纸搭上NC膜5mm；切条：将组装好的大板用微电脑自动斩切机切割成宽度为3.0mm的试纸条。装卡：将切好的试纸条装配到完好的塑料卡中，用压壳机压紧。封袋：将1个卡和1个干燥剂一起放入铝箔袋中，使用封口机进行封口，封口宽度2mm。
4.5临床样本比对
将曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒(胶体金法)与法国Bio-Rad公司曲霉菌抗原检测试剂盒进行对比试验，测定101例临床样本，并进行一致性分析，结果显示，我司试剂灵敏度为92.0％、特异性为96.0％、总符合率为94.0％，Kappa值为0.87，大于0.75，为高度一致，认为两系统等效。本方法采用胶体金免疫层析法对血清和肺泡灌洗液样本中的曲霉菌半乳甘露聚糖进行定性检测，10min即可完成样本检测，大大缩短了检测耗时，有效解决了常规GM试验操作繁琐、时间长的问题。认为以该抗体为原料开发的试剂盒具有较好的临床应用价值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津喜诺生物医药有限公司
<120> 一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
<130> 2020
<140> 2020110454580
<141> 2020-09-29
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
20 25 30
Met Ser
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp
20 25 30
<210> 3
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
Pro Arg Gly Ile Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
35 40 45
Thr Val Ser Ser
50
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Arg Asn Thr
20
<210> 6
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Gln Glu Asn His Arg Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
35 40 45
Glu Ile Lys Arg Ala
50
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Pro Arg Gly Ile Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Tyr Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Asn His Arg Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 9
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgcagctgc aggaatctgg aggtggcctg gtgcagcctg gaggatccct gaaactctcc 60
tgtgcagcct caggattcga ttttagtaga tactggatga gttgggtccg gcaggctcca 120
gggaaagggc tagaatggat tggagaaatt aatccagata gcagtacgat aaactatacg 180
ccatctctaa aggataaatt catcatctcc agagacaacg ccaaaaatac gctgtacctg 240
caaatgagca aagtgagatc tgaggacaca gccctttatt actgtgcaag accgcggggt 300
atatatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc ag 352
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgtac actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggaacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcaggaa aatcatcgta ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa acgggct 327
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
saggtgmagc tkcassartc wgg 23
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggggstgty gttttggctg mrgagacrgt ga 32
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggattttc aagtgcagat tttcag 26
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggatacagtt ggtgcagcat cagcccgttt 30

Claims (6)

1.一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株，其特征在于：保藏编号是CGMCCNo.20281。
2.一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，其特征在于：由保藏编号是CGMCCNo.20281的鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求2所述的一种鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体，其特征在于：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求2或3所述鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述编码鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
6.一种检测曲霉菌半乳甘露聚糖的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2或3所述鼠抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体。
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