CN113249337B - 鼠抗新型冠状病毒n蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 - Google Patents

鼠抗新型冠状病毒n蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供两株鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用，通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT‑PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，并用ELISA方式对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗新型冠状病毒N蛋白基因工程抗体的研发奠定了基础；该鼠源性新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体与新型冠状病毒N蛋白反应高效价，且结合特异性强，可用于新型冠状病毒N蛋白的检测，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。

Description

鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于抗体的制备及序列测定领域，尤其是涉及鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）属于冠状病毒科，是有包膜的，正义的单链RNA病毒。SARS-CoV-2基因组由约30000个核苷酸组成，它的基因组包含14个开放阅读框（ORF），其中三分之二编码组成复制酶复合物的16个非结构蛋白（nsp 1-16）。剩下的三分之一编码9种辅助蛋白（ORF）和4种结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelopeprotein，E蛋白）。其中S蛋白和N蛋白是其中最重要的用于检测的靶点蛋白。S蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白，与病毒的传染能力密切相关，S蛋白包含S1、S2两个亚基。S1主要包含有受体结合区（receptor binding domain，RBD），负责识别细胞的受体，S2含有膜融合过程所需的基本元件。M蛋白负责营养物质的跨膜运输、促进新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。E蛋白较小，是与包膜结合的蛋白。
N蛋白在感染过程中大量表达，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。N蛋白与病毒RNA一起进入宿主细胞，促进病毒的复制和病毒颗粒的组装和释放。N蛋白包含两个不同的RNA结合区(N-末端结构域[NTD]和C-末端结构域[CTD])，它们由连接区(Lkr)连接，其中含有丰富的丝氨酸/精氨酸(sr-rich)结构域(Srd)。SARS-CoV N-NTD和N-CTD均为阳性氨基酸，已被报道与病毒RNA基因组结合。血清学诊断表明，SARS患者血清中抗N蛋白特异性抗体的敏感性和持久性均高于SARS-CoV的其他结构蛋白。此外，抗-N蛋白抗体在感染早期检测到的特异性很高。N蛋白常作为冠状病毒诊断检测工具，是新冠免疫学快速诊断试剂盒的核心原料，对新冠病毒的诊断和排查具有重要价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用。
本发明采用的技术方案是：鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，命名为DG8，保藏编号为CGMCC No.21916；或者命名为BG1，保藏编号为CGMCC No.21917。
鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，抗体DG8，包括轻链可变区和重链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ ID NO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ IDNO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1 GYTFTDYSMH（CDRH1）
SEQ ID NO:2 WINTETGEPTYADDFQG（CDRH2）
SEQ ID NO:3 GGYDSDGGYYALDY（CDRH3）
SEQ ID NO:4 GTTENIYGALN（CDRL1）
SEQ ID NO:5 GAINLVD（CDRL2）
SEQ ID NO:6 QNVLSPPFT（CDRL3）
或者，
抗体BG1，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ IDNO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3。
SEQ ID NO:11 GYTFRNYGMN（CDRH1）
SEQ ID NO:12 WINTYTGEPTYADDFKG（CDRH2）
SEQ ID NO:13 SPLIRSYFDY（CDRH3）
SEQ ID NO:14 SASSSVSYLH（CDRL1）
SEQ ID NO:15 DTSKLSS（CDRL2）
SEQ ID NO:16 QQWSSNPYT（CDRL3）
优选地，抗体DG8重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:7
GPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFQGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEATATYFCSRGGYDSDGGYYALDYWGQGTSVTVSSAK
轻链可变区序列
SEQ ID NO:9
DIQMTQSPASLSASVGETVTIACGTTENIYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGAINLVDGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLSPPFTFGGGTKLEIKRA
或者，
抗体BG1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:17
GPELKKPGETVKISCKASGYTFRNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNIKNEDTATYFCARSPLIRSYFDYWGQGTTLTVSSA
轻链可变区序列
SEQ ID NO:19
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYLHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLSSGVPARFSGSGSGTSFSLTISSMEVEDAATYYCQQWSSNPYTFGGGTKLEIKRAD
优选地，抗体DG8由保藏编号为CGMCC No. 21916的鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生；
抗体BG1由保藏编号为CGMCC No. 21917的鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生。
核酸分子，包含编码权利要求2或3的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的核苷酸。
优选地，核酸分子编码抗体DG8的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，核酸分子编码抗体DG8的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:8
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCCAGGGACGGTTTGACTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGCCACGGCTACATATTTCTGTTCTAGAGGGGGCTATGATTCCGACGGAGGTTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:10
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCGCATGTGGAACAACTGAGAATATTTACGGTGCTTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAATCAACTTGGTAGATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTCAAAATGTGTTAAGTCCTCCGTTCACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
或者，
核酸分子编码抗体BG1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，核酸分子编码抗体BG1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:18
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCAGAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACATCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGATCCCCATTAATACGGTCTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCC
轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:20
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGTCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTTCTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGTTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGTACACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGAT
鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备检测鼠抗新型冠状病毒N蛋白抗原试剂中的应用。
优选地，将鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
检测新型冠状病毒的检测试剂盒，含有鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
优选地，为胶体金法检测试剂盒，抗体BG1为包被抗体，抗体DG8为金标抗体；或者，抗体 DG8为包被抗体，抗体BG1为金标抗体。
本发明具有的优点和积极效果是：由上述鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株制备得到腹水，其中的鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体与新型冠状病毒N蛋白反应效价高达106，基于该单克隆抗体建立的检测方法，不与甲型流感病毒 (H1N1)、甲型流感病毒(H3N2)、乙型流感病毒(Yamagata)、乙型流感病毒(Victoria)、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、链球菌、白色念珠菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、地方性冠状病毒（229E、OC43、NL63、HKU1）产生交叉反应，与荧光定量PCR检测方法符合率高，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。
附图说明
图1抗体BG1和DG8的纯化后蛋白电泳图；1.BG1; 2. DG8 ; 3. Marker
图2抗体BG1的腹水效价测定结果；
图3抗体DG8的腹水效价测定结果；
生物材料：DG8，保藏日期为2021年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 21916；
生物材料：BG1，保藏日期为2021年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号是CGMCC No. 21917。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明涉及鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，其中一株命名为DG8，属杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.21916；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2021年3月24日，检测为存活。另一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株命名为BG1，属杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.21917；保藏地为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2021年3月24日，检测为存活。
本发明涉及鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株通过小鼠杂交瘤单克隆抗体筛选及RT-PCR法克隆Ig可变区基因，获得稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株及其可变区序列，对抗体结合特异性进行了鉴定，为抗新型冠状病毒N蛋白基因工程抗体的研发奠定了基础。
鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生的抗体DG8，包括轻链可变区和重链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ IDNO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
SEQ ID NO:1 GYTFTDYSMH（CDRH1）
SEQ ID NO:2 WINTETGEPTYADDFQG（CDRH2）
SEQ ID NO:3 GGYDSDGGYYALDY（CDRH3）
SEQ ID NO:4 GTTENIYGALN（CDRL1）
SEQ ID NO:5 GAINLVD（CDRL2）
SEQ ID NO:6 QNVLSPPFT（CDRL3）
抗体DG8重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:7
GPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFQGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEATATYFCSRGGYDSDGGYYALDYWGQGTSVTVSSAK
轻链可变区序列
SEQ ID NO:9
DIQMTQSPASLSASVGETVTIACGTTENIYGALNWYQRKQGKSPQLLIYGAINLVDGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVATYYCQNVLSPPFTFGGGTKLEIKRA
编码抗体DG8的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，核酸分子编码抗体DG8的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:8
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCAACATATGCAGATGACTTCCAGGGACGGTTTGACTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGCCACGGCTACATATTTCTGTTCTAGAGGGGGCTATGATTCCGACGGAGGTTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAA
轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:10
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCGCATGTGGAACAACTGAGAATATTTACGGTGCTTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGATCTATGGTGCAATCAACTTGGTAGATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTCAAAATGTGTTAAGTCCTCCGTTCACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCT
鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生的抗体BG1包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ IDNO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3。
SEQ ID NO:11 GYTFRNYGMN（CDRH1）
SEQ ID NO:12 WINTYTGEPTYADDFKG（CDRH2）
SEQ ID NO:13 SPLIRSYFDY（CDRH3）
SEQ ID NO:14 SASSSVSYLH（CDRL1）
SEQ ID NO:15 DTSKLSS（CDRL2）
SEQ ID NO:16 QQWSSNPYT（CDRL3）
抗体BG1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示；
重链可变区序列
SEQ ID NO:17
GPELKKPGETVKISCKASGYTFRNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNIKNEDTATYFCARSPLIRSYFDYWGQGTTLTVSSA
轻链可变区序列
SEQ ID NO:19
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYLHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLSSGVPARFSGSGSGTSFSLTISSMEVEDAATYYCQQWSSNPYTFGGGTKLEIKRAD
编码抗体BG1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，核酸分子编码抗体BG1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:18
GGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCAGAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACATCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGATCCCCATTAATACGGTCTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCC
轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO:20
GACATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCCTCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGTCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTTCTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGTTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGTACACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGAT
由上述鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株制备得到腹水，其中的鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体与新型冠状病毒N蛋白反应效价高达106，基于该单克隆抗体建立的检测方法，不与甲型流感病毒 (H1N1)、甲型流感病毒(H3N2)、乙型流感病毒(Yamagata)、乙型流感病毒(Victoria)、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、链球菌、白色念珠菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、地方性冠状病毒（229E、OC43、NL63、HKU1）产生交叉反应，与荧光定量PCR检测方法符合率高，以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的临床应用价值。
本方案所涉及的两种抗体尤其适合搭配制成双抗体夹心法免疫胶体金试纸条，其中抗体BG1为包被抗体，抗体DG8为金标抗体，制得的双抗体夹心法免疫胶体金试纸条灵敏性更高，同时，也可将抗体BG1做为金标抗体，抗体DG8为包被抗体。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株的筛选
将含有SARS-CoV-2-N基因片段的重组质粒转化到宿主大肠杆菌（BL21系列的Rosetta(DE3)菌）中，重组菌在含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，按1:100比例转接上述培养基进行诱导表达，当菌液OD值在0.4~0.6 之间时，加入IPTG 终浓度为1mM，30℃培养4小时，离心收集菌体。菌体湿重约2g 加入30mL PBS 重悬，冰水混合物中超声破碎，功率为400 W ，超声3 s，间隔5 s，直至菌液不黏稠且澄清后，离心去掉菌体碎片，上清过0.45μm 滤膜，经亲和层析镍柱纯化获得SARS-CoV-2-N蛋白，用于特异性单克隆抗体的筛选。
首次免疫剂量为50μgSARS-CoV-2-N蛋白/只小鼠，佐剂为弗氏完全佐剂，皮下多点注射，与二次免疫间隔时间为2周；二次免疫免疫剂量为50μgSARS-CoV-2-N蛋白/只小鼠，佐剂为弗氏不完全佐剂，腹腔注射，与三次免疫间隔时间为2周；三次及以后免疫剂量、途径、佐剂同第二次免疫方式，两次免疫之间的间隔时间为2周，至第四次免疫。小鼠尾静脉取血测定效价，待效价达到1：8000以上进行细胞融合。
融合前3天免疫50μgSARS-CoV-2-N蛋白，无需佐剂。小鼠眼球取血后，取成功免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合（以10：1比例），融合时在37℃水浴的环境下，将50%的PEG在1min之内加入混匀且弃去上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团之中，37℃水浴震荡1min，静置1min，在2min之内加入10ml无血清1640培养基。800rpm，6min离心，弃去上清，用含有HAT的1640培养基重悬细胞，并移液入96孔板(2.5x107细胞/板)。在37℃、5％CO2条件下培养细胞。融合后第三天半换液，第七天全换液。
融合板中克隆足够大时，每孔取100μl上清液进行检测，方法与检测效价相同。检测OD值为阴性孔两倍以上作为阳性孔，进行下一步克隆化培养。将筛选阳性的杂交瘤克隆从96孔板扩至 24 孔板培养3-5天，再次进行培养上清筛选检测，检测阳性的克隆再进行下一步的亚克隆培养，剩余细胞冻存。收集24孔板中杂交瘤细胞，细胞计数，将细胞密度调整为10个/mL；将细胞铺到96孔板中，每孔100μl，37°C、5% CO2孵箱培养；培养 10 天左右，可见克隆形成，选取只有单个克隆的孔，吸取培养上清，检测方法同前，选取阳性克隆，扩至24 孔板培养，再次上清检测后，选择阳性克隆进行第二轮的亚克隆培养，一般进行多轮亚克隆培养后，直至所有检测孔均为阳性为止，即获得稳定的杂交瘤细胞株。选取阳性杂交瘤培养上清，采用抗体亚型检测试纸检测抗体的亚型，本发明中的单克隆抗体编号为BG1和DG8，为鼠源IgG1亚型，轻链为κ链。
实施例2：鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备
2.1 腹水制备及纯化
无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以5×106/0.5ml/只的细胞量腹腔注射到液体石蜡预致敏的Balb/c小鼠体内。7至10天后收集腹水，室温3000rpm，10min，收集上清。采用辛酸-硫酸铵法对腹水中的抗体进行粗纯，粗纯后的抗体按照GE公司提供的纯化手册，利用AKTA蛋白纯化系统，经1ml Protein G纯化预装柱进行进一步的纯化。所得抗体纯品用于后续的抗体检测及功能实验。纯化后结果见附图1。
2.2 单克隆抗体效价检测
以间接ELISA方法进行腹水效价测定。包被SARS-CoV-2-N蛋白10ug/ml，100ul/孔。5%BSA作为封闭液。将腹水从1：1000开始进行倍比稀释，共稀释12个梯度，Promega酶标抗体作为二抗1：6000稀释后使用，OD为450nm读值，同时设定不包被组进行对照，抗体稀释2048000倍时的OD值大于对照组的2.1倍以上，表明腹水效价已达1：2048000。结果见附图2和附图3，制备的腹水中的鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体与SARS-CoV-2-N蛋白反应效价高达106。
实施例3：鼠源性抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的基因验证
RT-PCR法克隆Ig可变区基因
总RNA提取，单链cDNA合成：
用Trizol法（试剂盒购自Invitrogen）提取BG1和DG8杂交瘤细胞株的总RNA，用M-MLV逆转录酶（购自Invitrogen）将总RNA逆转为cDNA文库。
重链骨架区上游引物
P1：5’SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG3’（SEQ ID NO:11）
重链可变区下游引物
P2：5’TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA3’（SEQ ID NO:12）
轻链前导肽上游引物
P3：5’ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3’（SEQ ID NO:13）
轻链可变区下游引物
P4：5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT3’（SEQ ID NO:14）
配制PCR反应体系（50μl）如下：
cDNA:2μl；上游引物(10μM):2μl；下游引物(10μM):2μl；dNTP mixture:2μl；pfuDNA聚合酶(5U/μl):1μl；10 X pfu Buffer Ⅱ:5μl；ddH2O:补足至50μl。
反应条件：95℃预变性5min；重复如下循环35次：95℃30s，58℃30s，72℃1min；最后，72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。将回收后的VL、VH片段分别与pMD19-T(simple)载体(Takara公司)进行连接，连接体系如下：
VL PCR产物/VH PCR产物各70ng，pMD19-T(simple) 载体1μl，Solution I连接反应液5μl；ddH2O补足至10μl，4℃连接过夜。
连接产物转化入E.coli DH5α感受态细菌中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，37℃震摇2小时后进行菌液PCR鉴定，以对应抗体的cDNA为阳性对照。配制反应体系（25μl）如下：
菌液：1μl，上游引物(10μM)：1μl；下游引物(10 μM) ：1μl；dNTP Mixture (各2.5Mm) 2 μl；Taq DNA聚合酶 (5U/μl)：0.5 μl；10×Taq Buffer (Mg2+ plus)：2.5 μl；补水至25μl。反应条件同前。
选取菌PCR阳性的克隆扩大培养，用质粒提取试剂盒(Takara公司)提取阳性克隆质粒，送检测序。每个抗体的每条链至少送检5个克隆样品，至少三个样品测序结果相同为止。成功克隆得到抗体BG1和DG8的重链、轻链可变区序列，经比对符合典型抗体可变区序列特征。
实施例4：新型冠状病毒N蛋白检测试剂盒（胶体金法）的制备及应用
基于上述鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，通过胶体金免疫层析技术，开发出新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法），主要用于检测人鼻咽拭子样本中的新型冠状病毒，并进行了特异性和临床样本检测，试剂盒制备过程及检测结果如下：
4.1 金标抗体制备
量取50mL胶体金溶液，加至已灭菌干燥处理的烧杯中，置于电热磁力搅拌器上进行搅拌，500-600rpm，边搅拌边加入0.1M K2CO3溶液，调节pH至9.5；标记：分别加入抗新型冠状病毒N蛋白抗体DG80.3mL（2mg/mL），转速同上，搅拌1h；封闭：加入10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液5mL，2%PEG20000 2.5ml，转速同上，搅拌1h；低速离心：1500 转/分钟，4℃离心30min，弃沉淀，取上清；高速离心：上清11000转/分钟，4℃离心50min，弃上清，沉淀用胶体金重悬液定容至5mL。
4.2 金标垫制备
用数控裁条机裁切玻璃纤维素膜，规格为20mm×300mm×20条；取5mL金标抗体；用三维平面点膜喷金仪将金标抗体喷于玻璃纤维素膜上，调用程序1，速度为100mm/sec、喷金量为8.0ul/cm，喷金压力为1.0kg/cm2，喷金长度为300mm，共计20条；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30%，烘干2h。
4.3 包被膜制备
检测线包被液配制：取抗新型冠状病毒N蛋白抗体BG1（2mg/mL）各0.5mL，分别加入10uL 1%的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；质控线包被液配制：取0.1ml羊抗鼠IgG（20mg/mL），加入0.4mL PBS、10uL 1%的硫柳汞钠溶液，使用微型混合器震荡2min，充分震荡混匀；用三维平面点膜喷金仪将质控线包被液和检测线包被液划在硝酸纤维素膜（NC膜）上，调用程序0，质控线为1号泵，检测线为3号泵，速度为100mm/sec、划膜量均为0.8uL/cm，划膜长度为300mm，质控线划在距膜顶端12mm处，检测线划在距膜顶端17mm处，质控线与检测线相距5mm。用铅笔标出质控线（C线）和检测线（T线）的位置；在电热恒温培养箱中，37℃，湿度小于30%，烘干16h。
4.4 制卡
用数控裁条机裁切吸水纸，规格为20mm×300mm×20条；组装：将包被好的NC膜贴在底板上，保证边缘对齐，上述制备好的金标垫、吸水纸进行贴膜制成大板，层压参数：金标垫搭上NC膜2mm，吸水纸搭上NC膜5mm；切条：将组装好的大板用微电脑自动斩切机切割成宽度为3.0mm的试纸条。装卡：将切好的试纸条装配到完好的塑料卡中，用压壳机压紧。封袋：将1个卡和1个干燥剂一起放入铝箔袋中，使用封口机进行封口，封口宽度2mm。
4.5 特异性分析
表1
Figure 710029DEST_PATH_IMAGE001
建立应对不同病毒/细菌的检测方法，结构如表1所示，制得的试剂条不与甲型流感病毒 (H1N1)、甲型流感病毒(H3N2)、乙型流感病毒(Yamagata)、乙型流感病毒(Victoria)、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、链球菌、白色念珠菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、地方性冠状病毒（229E、OC43、NL63、HKU1）产生交叉反应，具有很高的检测准确率。
4.6临床样本比对
将新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）与荧光定量PCR方法进行比对，对比试验，测定128例临床样本，并进行一致性分析，结果显示，我司试剂灵敏度为89.19% (33/37)、特异性为100.00% (91/91)、总符合率为96.9%，符合率高。
本方法采用胶体金免疫层析法对人鼻咽拭子样本中的新型冠状病毒进行定性检测，10min即可完成样本检测，大大缩短了检测耗时，不需特定场地、人员、设备，操作简便，应用场景丰富。认为以该抗体为原料开发的试剂盒具有较好的临床应用价值。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津一瑞生物科技股份有限公司
北京金山川科技发展有限公司
天津喜诺生物医药有限公司
<120> 鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用
<130> 2021
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Tyr Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Thr Thr Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ala Ile Asn Leu Val Asp
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Asn Val Leu Ser Pro Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
1 5 10 15
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln
20 25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr
35 40 45
Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Gln Gly Arg Phe Asp Phe Ser
50 55 60
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys
65 70 75 80
Asn Glu Ala Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Arg Gly Gly Tyr Asp Ser
85 90 95
Asp Gly Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Lys
115
<210> 8
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacctgagc tgaagaagcc tggagagaca gtcaagatct cctgcaaggc ttctggttat 60
accttcacag actattcaat gcactgggtg aagcaggctc caggaaaggg tttaaagtgg 120
atgggctgga taaacactga gactggtgag ccaacatatg cagatgactt ccagggacgg 180
tttgacttct ctttggaaac ctctgccagc actgcctatt tgcagatcaa caacctcaaa 240
aatgaggcca cggctacata tttctgttct agagggggct atgattccga cggaggttac 300
tatgctttgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc caaa 354
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Ala Cys Gly Thr Thr Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ile Asn Leu Val Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Pro Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacatccaga tgactcagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcgcatgtg gaacaactga gaatatttac ggtgctttaa attggtatca gcggaaacag 120
ggaaaatctc ctcaactcct gatctatggt gcaatcaact tggtagatgg catgtcatcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tattctctca agatcagtag cctgcatcct 240
gacgatgttg caacgtatta ctgtcaaaat gtgttaagtc ctccgttcac gttcgggggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgggct 327
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Pro Leu Ile Arg Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu His
1 5 10
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys
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20 25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr
35 40 45
Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser
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Ala
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<400> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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Asp Thr Ser Lys Leu Ser Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Val Glu
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
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acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgt cttctggagt ccctgctcgc 180
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gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtacacgtt cggtggtggg 300
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Claims (10)

1.鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株，其特征在于：命名为DG8，保藏编号为CGMCCNo.21916；或者命名为BG1，保藏编号为CGMCC No.21917。
2.鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体DG8，包括轻链可变区和重链可变区，重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、SEQ ID NO:2所示的CDRH2和SEQ IDNO:3所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的CDRL1、SEQ ID NO:5所示的CDRL2和SEQ ID NO:6所示的CDRL3；
或者，
抗体BG1，重链可变区包括如SEQ ID NO:11所示的CDRH1、SEQ ID NO:12所示的CDRH2和SEQ ID NO:13所示的CDRH3，轻链可变区包括如SEQ ID NO:14所示的CDRL1、SEQ ID NO:15所示的CDRL2和SEQ ID NO:16所示的CDRL3。
3.根据权利要求2所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体DG8重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示；
或者，
抗体BG1重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:17所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQID NO:19所示。
4.根据权利要求2或3所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于：抗体DG8由保藏编号为CGMCC No. 21916的鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生；
抗体BG1由保藏编号为CGMCC No. 21917的鼠抗新型冠状病毒N蛋白杂交瘤细胞株产生。
5.核酸分子，其特征在于：包含编码权利要求2或3所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的核苷酸。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码抗体DG8的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述核酸分子编码抗体DG8的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或者，
所述核酸分子编码抗体BG1的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述核酸分子编码抗体BG1的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
7.权利要求2-4中任一所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备检测鼠抗新型冠状病毒N蛋白抗原试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备检测鼠抗新型冠状病毒N蛋白抗原试剂中的应用，其特征在于：将鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片。
9.检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求2-4中任一所述的鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：为胶体金法检测试剂盒，抗体BG1为包被抗体，抗体DG8为金标抗体；或者，抗体 DG8为包被抗体，抗体BG1为金标抗体。
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