CN105837684A - 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用 - Google Patents

一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105837684A
CN105837684A CN201610296488.6A CN201610296488A CN105837684A CN 105837684 A CN105837684 A CN 105837684A CN 201610296488 A CN201610296488 A CN 201610296488A CN 105837684 A CN105837684 A CN 105837684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
rna
kit
preparation
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610296488.6A
Other languages
English (en)
Inventor
孙树汉
王芳
朱怡卿
刘岩
马金召
黄金凤
袁继行
杨富
薛赓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN201610296488.6A priority Critical patent/CN105837684A/zh
Publication of CN105837684A publication Critical patent/CN105837684A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体是一种抗RNA表观遗传修饰m6A的单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的复合物、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单抗在检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的应用。本发明的单克隆抗体可特异性识别吸附在硝酸纤维素膜上的变性状态下的m6A分子，实现准确、灵敏地检测RNA的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布，可用于研究RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作用，对基因表达的转录后调控机制及相关疾病的研究具有十分重大的意义。

Description

一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用
技术领域
本发明涉及医学生物工程技术领域，具体地说，是一种抗m6A单克隆抗体，以及该单克隆抗体在研究RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作用中的应用。
背景技术
化学修饰是人类基因组丰富的组件，存在于DNA和蛋白质上，其动态变化通过参与基因表达调控，决定细胞的状态，影响细胞的分化和发育。最新的研究表明，RNA的化学修饰也存在这类似的动态调控机制。其中，m6A作为真核生物最常见的RNA转录后修饰形式，成为了近年来表观遗传学研究的热点。m6A是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化修饰形式，广泛出现在mRNA、tRNA、rRNA以及ncRNA中，其导致了超过80％的RNA碱基甲基化。研究证实，基于m6A修饰的RNA甲基化调控通过调节RNA的代谢，参与机体发育、代谢及繁殖的整个过程。该表观修饰表达丰度的变化与肥胖和糖尿病等多种疾病密切相关。但目前人们对m6A的研究还十分有限，其在转录物中的分布和具体生物学功能仍不明确。
因此，制备具有高特异性、高亲和力的m6A单克隆抗体，实现准确、灵敏地检测RNA的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布，对基因表达的转录后调控机制及相关疾病的研究具有十分重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗RNA表观遗传修饰m6A的单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的复合物、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单抗在检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的应用。
本发明针对m6A的分子量只有281Da，免疫原性较弱的问题，在抗体制备过程中通过与半抗原偶联提高m6A的免疫原性。常见的半抗原包括BSA、OVA和KLH，鉴于KLH分子量最大、免疫原性最好，本发明通过活化KLH的羧基基团与m6A的氨基偶联，形成具有较好免疫原性的蛋白-核苷偶联复合物。
本发明克服传统ELISA筛选方法假阳性多、工作量大的缺陷，采用多轮点杂交技术筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株，作为抗m6A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的单克隆抗体的获得采用了本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化而得到。
本发明的第一方面，提供一种用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物(简称KLH-m6A复合物)，包括核苷及其偶联的载体蛋白。其中核苷是m6A，其化学结构如下式所示；其中偶联的载体蛋白是钥孔血蓝蛋白(KLH,keyhole limpet hemocyanin)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
本发明的第二方面，提供一种抗m6A单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCC No：C201619的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的第三方面，提供一种杂交瘤细胞株，命名为RME，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2016年1月22日，保藏编号CCTCC No：C201619。
本发明的第四方面，提供一种上述抗m6A单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
a)合成上述的由核苷m6A和载体蛋白KLH组成的KLH-m6A复合物；
b)将上述复合物作为免疫原免疫小鼠；
c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；
d)经过多轮筛选获得分泌识别m6A单分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
e)通过在小鼠体内接种上述杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到所述的抗m6A单克隆抗体。
较优的，所述的步骤b中将成功获得的KLH-m6A复合物同免疫佐剂混合。
较优的，所述的步骤c中免疫小鼠为鼠龄8～12周的雌性BALB/c健康小鼠；取免疫小鼠的脾脏细胞同小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞进行融合。
较优的，所述的步骤d中采用倍比稀释技术制备单克隆细胞株，经多轮点杂交技术筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株，作为抗m6A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
较优的，所述的步骤e中扩大培养杂交瘤细胞至106个，接种小鼠腹腔，生产腹水抗体，将腹水应用IgG抗体纯化试剂盒纯化获得抗m6A线性表位的单克隆抗体。
本发明的第五方面，提供上述用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第六方面，提供上述抗m6A单克隆抗体在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第七方面，提供上述杂交瘤细胞株在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒为点杂交、Northern Blot或免疫共沉淀等的试剂或试剂盒。
较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒是检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中RNA甲基化程度的试剂或试剂盒。所述的肿瘤为肝癌。
本发明优点在于：
本发明提供一种抗RNA表观遗传修饰m6A的具有高特异性、高亲和力的单克隆抗体，该单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性识别吸附在硝酸纤维素膜上的变性状态下的m6A分子，实现准确、灵敏地检测RNA的甲基化水平及m6A在RNA转录物的分布，可用于研究RNA甲基化修饰对人类器官发育和肿瘤发生等生理及病理过程的调控作用，对基因表达的转录后调控机制及相关疾病的研究具有十分重大的意义。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2016年1月22日
保藏编号：CCTCC No：C201619
分类命名：杂交瘤细胞株RME
附图说明
图1是点杂交检测图，其中A是普通细胞培养上清与m6A结合的点；B是杂交瘤细胞株培养上清与m6A结合的点。
图2是Northern Blot检测图，其中1、2、3条带分别是肝癌组织RNA抽提物、LM3细胞RNA抽提物和7701细胞RNA抽提物与杂交瘤细胞培养上清结合的图，4是空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1.m6A偶联复合物的制备：
本发明将抗原m6A与钥孔血蓝蛋白KLH偶联，以偶联物作为免疫原，增强小分子m6A的免疫原性。本发明使用商品化偶联试剂盒(ReadiLinkTM KLH Conjugation kit，AAT)进行偶联，具体操作步骤如下：
1.准备KLH-m6A连接
1)用200ul的ddH2O来溶解KLH(禁忌漩涡振荡和加热)。
2)称取2mg的m6A，用450ul的偶联缓冲液(conjugation bufferrong)溶解。
3)将200ul的KLH溶液和450ul的m6A进行混合，成为KLH-m6A混合液。
4)用1ml的ddH2O溶解EDC，取50ul加入KLH-m6A混合液，迅速并轻柔混匀，然后室温孵育2h。
2.将KLH-m6A进行去盐离子纯化
1)用10ml的ddH2O来稀释纯化缓冲液(Purification Buffer Salts)。
2)扭下去盐离子柱的底座，松开盖子，将柱子放在收集管中。
3)1,000g离心2分钟，弃储存液。
4)加1ml的纯化缓冲液(Purification Buffer Salts)，1,000g离心2分钟，弃滤液再重复三次。
5)将离心柱置于新的收集管，小心地将室温孵育2h后的样品加入去盐离子柱的中心，1,000g离心2分钟。
6)收集样本于1.5ml EP管，-20度储存。
实施例2.抗m6A的单克隆抗体的制备和纯化
1.抗原混合液的制备
取25ul的m6A偶联复合物，加入25ul的生理盐水进行，成为50ul的抗原稀释液，与50ul的佐剂迅速混合，即100ul的抗原混合液(此为每只BABL/C小鼠的免疫用量)。
2.免疫动物
本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，免疫佐剂为KX0210041，购自北京博奥龙免疫技术有限公司。
1)腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠(100ul/只)。
2)每隔一个月进行重复免疫，免疫三次。
3.单克隆抗体的制备和纯化
将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。
具体方法如下：
1)将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。
2)ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，即认为此为单克隆。即通常认为的建株成功的细胞株。
3)将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106/管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。
4)细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。
5)腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
实施例3.抗m6A的单克隆抗体的鉴定及检测应用
1.单克隆抗体的点杂交检测应用：
分别将m6A核苷溶液和KLH蛋白溶液点样于硝酸纤维素膜上，待溶液吸干，加封闭液于室温封闭至少1h；PBST洗液洗膜5次，用所制备的单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜。孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗，孵育1h，PBST洗液洗膜5次。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色，结果如图1所示。
结果表明该单克隆抗体能较为特异性地识别m6A，而不识别载体蛋白KLH。
2.单克隆抗体的Northern Blot检测应用：
变性的小鼠肝癌组织RNA、LM3细胞RNA和7701细胞RNA进行琼脂糖电泳；通过虹吸将RNA转移至尼龙膜上；紫外灯下交联；含10％脱脂奶粉的PBS封闭1h；PBST洗液洗膜5次，用所制备的单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜。孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗，孵育1h，PBST洗液洗膜5次。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色，结果如图2所示。
结果表明单克隆抗体可用于分析组织和细胞来源的RNA中m6A的分布。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物，包括核苷及其偶联的载体蛋白，其中核苷是m6A，其化学结构如下式所示；其中偶联的载体蛋白是钥孔血蓝蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
2.一种抗m6A单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCC No：C201619的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC No：C201619。
4.一种如权利要求2所述的抗m6A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)合成如权利要求1所述的蛋白-核苷偶联复合物；
b)将上述复合物作为免疫原免疫小鼠；
c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；
d)经过多轮筛选获得分泌识别m6A单分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
e)通过在小鼠体内接种上述杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到所述的抗m6A单克隆抗体。
5.一种如权利要求1所述的用于制备抗m6A单克隆抗体的蛋白-核苷偶联复合物在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
6.一种如权利要求2所述的抗m6A单克隆抗体在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
7.一种如权利要求3所述的杂交瘤细胞株在制备用于检测RNA甲基化的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
8.如权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于，所述的免疫检测试剂或试剂盒为点杂交、Northern Blot或免疫共沉淀的试剂或试剂盒。
CN201610296488.6A 2016-05-06 2016-05-06 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用 Pending CN105837684A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296488.6A CN105837684A (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610296488.6A CN105837684A (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105837684A true CN105837684A (zh) 2016-08-10

Family

ID=56591643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610296488.6A Pending CN105837684A (zh) 2016-05-06 2016-05-06 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105837684A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106589121A (zh) * 2016-12-06 2017-04-26 河北意和医学检验所有限公司 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法
CN106831984A (zh) * 2017-02-14 2017-06-13 中国人民解放军第二军医大学 一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用
CN107236045A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备方法
CN107828740A (zh) * 2017-11-29 2018-03-23 武汉大学 Homer3单克隆抗体及其应用
CN113717279A (zh) * 2021-07-28 2021-11-30 武汉爱博泰克生物科技有限公司 m6A重组兔单克隆抗体及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUTH ESPUNY等: "A Monoclonal Antibody That Specifically Recognizes m6A Nucleoside", 《NUCLEOSIDES & NUCLEOTIDES》 *
无: "CAG28309.2", 《GENEBANK》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106589121A (zh) * 2016-12-06 2017-04-26 河北意和医学检验所有限公司 一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法
CN106831984A (zh) * 2017-02-14 2017-06-13 中国人民解放军第二军医大学 一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用
CN107236045A (zh) * 2017-05-08 2017-10-10 中国人民解放军第二军医大学 一种抗m6A单克隆抗体的制备方法
CN107828740A (zh) * 2017-11-29 2018-03-23 武汉大学 Homer3单克隆抗体及其应用
CN107828740B (zh) * 2017-11-29 2020-06-09 武汉大学 Homer3单克隆抗体及其应用
CN113717279A (zh) * 2021-07-28 2021-11-30 武汉爱博泰克生物科技有限公司 m6A重组兔单克隆抗体及制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105837684A (zh) 一种抗m6A单克隆抗体的制备与应用
CN103936853B (zh) 一种检测tim-3试剂盒及其使用方法
CN109897829B (zh) 分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
CN104762267B (zh) 杂交瘤细胞afb1‑2a4及其产生的黄曲霉毒素b1单克隆抗体
CN111943882B (zh) 腐霉利半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN115724958B (zh) 抗诺如病毒gⅱ基因组衣壳蛋白vp1的单克隆抗体及其应用
CN113354600A (zh) 一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN111333503A (zh) 三氯杀螨醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112094352B (zh) 一种抗IgM单克隆抗体
CN116462758B (zh) 抗人ptprz1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用
CN108218747A (zh) 氟苯尼考半抗原、人工抗原与单克隆抗体及其酶联免疫检测方法
CN112760323A (zh) 一种直肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在制备检测制剂中的应用
CN106244559B (zh) 一种分泌抗人IL-37b单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗人IL-37b单克隆抗体及其应用
CN109535255A (zh) 一种抗人cd26抗体及其在检测试剂盒中的应用
CN105132376B (zh) 一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用
CN113896758A (zh) 龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110981961B (zh) 一种特异结合癌细胞蛋白b7-h4的纳米抗体h6的序列和应用
CN107236045A (zh) 一种抗m6A单克隆抗体的制备方法
CN101280014A (zh) 抗CyclinD1人源单链抗体
CN111961002A (zh) 吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
DE102011008153A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein
CN109678945A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a抗原表位、其预测与验证方法及单克隆抗体的制备方法
CN105925538B (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用
CN106831984A (zh) 一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用
CN106543285A (zh) 抗Ttyh1单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160810

RJ01 Rejection of invention patent application after publication