CN113354600A - 一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。所述烯酰吗啉半抗原的结构式如式I所示；再以此为基础制备烯酰吗啉人工抗原和抗体，并建立了一种基于抗体的检测烯酰吗啉的免疫分析方法，对烯酰吗啉的最低检测限为1.43ng/mL，IC50为4.34ng/mL，线性范围为2.17～8.69ng/mL，表明本发明制备的人工抗原具有良好的免疫原性，可以用于后续制备烯酰吗啉多克隆抗体、单链抗体和纳米抗体并建立相对应免疫分析法，在烯酰吗啉检测中具有较大的应用前景。

Description

一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种烯酰吗啉半抗原、 人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
烯酰吗啉属于羧酸酰胺类杀菌剂，因其能引起孢子囊壁的分解，从而使菌体 死亡，被广泛应用于防治葡萄，土豆，辣椒等蔬菜的霜霉病，晚疫病，冠腐病和 根腐病等真菌性病害。然而烯酰吗啉使用后容易在环境中蓄积，例如地表和地下 水，废水，污泥，土壤。此外，烯酰吗啉会对DNA谱图进行修饰，从而造成不 良的遗传变化，对人类和其他生物均显示出明显的毒性。
由于烯酰吗啉的残留引起的环境及健康问题，我国2019年颁布的GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》明确规定了烯酰吗啉 在蔬菜、水果及干制水果中最大残留量为0.01g/kg～30mg/kg，在饮料类及调味 料中最大残留量为5.0mg/kg～80mg/kg。近十几年来，食品农药残留物在世界 范围内引起人们的关注，关于烯酰吗啉超标的事件也时有发生，加强农产品中烯 酰吗啉检测亟不可待。现有常见的检测烯酰吗啉的方法有：主要有高效液相色谱 法，荧光光谱法，气相色谱法，紫外光谱法，液相色谱串联质谱法等仪器分析方 法，但是仪器分析法由于其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员 操作，不适于大量样本筛查。因此建立快速、便捷的烯酰吗啉残留检测方法显得 十分重要。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法，具有样本前处理简便、操 作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快 速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言， 抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应 的抗原结构。例如中国专利CN110845444A、CN111138381A均公开有烯酰吗啉 半抗原，但是依然有限，因此，提供更多抗原结构稳定，可制备出对高特异性抗 体，能够快速、灵敏、准确的检测烯酰吗啉的半抗原具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种烯酰吗 啉半抗原。
本发明另一目的是提供一种烯酰吗啉人工抗原。
本发明的再一目的是提供一种抗烯酰吗啉抗体。
本发明的再一目的是提供所述烯酰吗啉半抗原、人工抗原及制备的抗体在免 疫检测烯酰吗啉含量中的应用。
本发明的上述目是通过以下技术方案给予实现：
本发明提供了一种烯酰吗啉半抗原，其结构式如式I所示：
Figure BDA0002960688670000021
本发明对烯酰吗啉分子进行改造，在苯环甲氧基的邻位上，通过甲酰化反应 引入醛基，然后再经羧甲基羟胺肟化得到半抗原，该半抗原未改变烯酰吗啉骨架 结构和原有侧链，与烯酰吗啉结构高度一致，有利于高特异性抗体的诱导。
本发明还提供所述烯酰吗啉半抗原的制备方法，先将烯酰吗啉与三氯氧磷和 DMF发生反应制备出甲酰化烯酰吗啉中间体；再将中间体与羧甲基羟胺半盐酸 盐在吡啶/甲醇存在的条件下发生反应，即制得式I所示烯酰吗啉半抗原。其反应 式如下所示：
Figure BDA0002960688670000022
作为一种优选地可实施方式，所述烯酰吗啉半抗原的制备方法，包括如下步 骤：
(1)取摩尔比为1:5:12的烯酰吗啉，三氯氧磷，DMF；将烯酰吗啉溶于 DMF的溶液，用冰盐浴冷却至0℃。一滴一滴地加入三氯氧磷，控制滴加速度 使反应温度低于5℃。加完后，在0～5℃之间搅拌0.5h。然后用油浴加热至90℃， 反应5h。反应停止后，将反应物倒入冰水混合物中，用氢氧化钠溶液调混合物 pH到7。用乙酸乙酯萃取。合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。 蒸干溶剂后，经硅胶柱层析分离得到白色中间体。
(2)中间体与羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1:1.5，中间体与羧甲基羟胺 半盐酸盐溶于吡啶/甲醇混合溶液中，60℃反应7h。反应停止后，旋蒸干溶剂， 加入冰水，用盐酸溶液调pH 3，用乙酸乙酯萃取。合并有机相，用饱和食盐水 洗涤，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析分离，旋蒸除掉有机试剂后得到白色固体 产物，即制得式I所示烯酰吗啉半抗原。
本发明还提供所述烯酰吗啉半抗原在制备烯酰吗啉人工抗原或抗体中的应 用。
一种烯酰吗啉人工抗原，由式I所示半抗原与大分子载体蛋白偶联得到，所 述烯酰吗啉人工抗原具有式Ⅱ所示结构：
Figure BDA0002960688670000031
优选地，结构式中的载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)、钥孔 血蓝蛋白(KLH)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或卵清蛋白(OVA)。其中，式Ⅱ-BSA， 式Ⅱ-LF，式Ⅱ-KLH和式Ⅱ-ConA用于制备免疫原，式Ⅱ-OVA用于制备包被 原。
本发明还提供所述烯酰吗啉人工抗原的制备方法，其特征在于，将式I所示 烯酰吗啉半抗原通过活泼酯法与大分子载体进行偶联。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：将烯酰吗啉半抗原、EDC和NHS溶 于适量的DMF中，4℃搅拌反应过夜，离心取上清即活化好的烯酰吗啉半抗原 衍生物；将活化好的半抗原衍生物逐滴加入到含有5mg/mL大分子载体的PBS 缓冲溶液中，4℃搅拌反应12h，4℃下用PBS透析3天，每天换3次透析液，得 到烯酰吗啉人工抗原，分装，并低温保存备用；所述的烯酰吗啉半抗原与载体蛋 白的摩尔比为40～100∶1。
本发明还提供所述烯酰吗啉人工抗原在制备抗烯酰吗啉抗体中的应用。
本发明还提供一种抗烯酰吗啉抗体，是以上述烯酰吗啉人工抗原制备得到。
优选地，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和纳米抗体。
优选地，所述单克隆抗体的制备方法如下：
选取适龄雌性Balb/C小鼠进行免疫，第4次免疫和第5次免疫后测定抗血 淸的效价和抑制率，在细胞融合前3天加强免疫；取加强免疫后的小鼠脾细胞和 骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；将扩 大培养的杂交瘤细胞注入己提前注射石蜡的小鼠体内，收集腹水，纯化，得到单 克隆抗体。
本发明还提供所述半抗原、人工抗原以及抗体在免疫法检测烯酰吗啉中的应 用。
本发明还提供一种直接检测烯酰吗啉的快速检测免疫分析方法，包括如下步 骤：
(1)将所述的烯酰吗啉免疫原免疫动物制备抗烯酰吗啉单克隆抗体；
(2)将所述烯酰吗啉包被原包被在微孔板上，将上述制备得到的抗烯酰吗 啉单克隆抗体加入微孔板中；
(3)采用间接竞争ELISA方法对待测样品中的烯酰吗啉进行检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种烯酰吗啉半抗原，该烯酰吗啉半抗原未改变烯酰吗啉 骨架结构和原有侧链，与烯酰吗啉结构高度一致，有利于高特异性抗体的诱导。 同时，本发明提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动 物后使机体产生特异的针对抗烯酰吗啉的抗体，效价高、检测效率高，对烯酰吗 啉的最低检测限为1.43ng/mL，IC50为4.34ng/mL，线性范围为2.17～8.69ng/mL。 克服了传统检测烯酰吗啉的仪器法存在周期长、专业性强、成本高，不适宜现场 批量快速检测等缺点，无法实现烯酰吗啉的快速检测的问题。本发明的抗原抗体 合成过程简单、成本较低，并为开发出成本低廉，检测效率高、操作简单的酶联 免疫快递检测工具，奠定基础，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明烯酰吗啉免疫原和包被原的紫外吸收光谱图。
图2为本发明基于烯酰吗啉单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1烯酰吗啉半抗原的制备
反应方程如下所示：
Figure BDA0002960688670000051
具体地，在一个装有机械搅拌器的圆底三颈瓶中，加入烯酰吗啉(2g， 5.15mmol)溶于5mL DMF的溶液，用冰盐浴冷却至0℃。一滴一滴地加入三氯 氧磷(3.9g，25.75mmol)，控制滴加速度使反应温度低于5℃。加完后，在4℃ 拌0.5h。然后用油浴加热至90℃，反应5h，反应停止后，将反应物倒入冰水混 合物中，在搅拌下滴加5mol/L的氢氧化钠溶液调混合物pH到7。用乙酸乙酯(100 mL*3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(50mL*3)洗涤，无水硫酸钠干燥。 蒸干溶剂后，经200～300目硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得到白色固体856mg(40％yield)，即中间体。
将上述得到的中间体(800mg，1.92mmol)溶于10mL吡啶/甲醇(1∶1)混 合溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐(367.2mg，2.88mmol)，60℃反应7h。反 应停止后，旋蒸干溶剂，加入50mL冰水，用1mol/L的盐酸溶液调pH 3，用乙 酸乙酯(100mL*3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(50mL*3)洗涤，无水 硫酸钠干燥，经200～300目规格的硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)， 旋蒸除掉有机试剂后得到白色固体产物，即烯酰吗啉半抗原。ESI-MS：489.142[M+H]+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.24(s,1H),7.56–7.50(m,2H), 7.46(d,J＝1.6Hz,1H),7.42–7.36(m,2H),7.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.80(s,1H), 4.80(s,2H),3.86(s,3H),3.82(s,3H),3.62(d,J＝1.8Hz,7H).13C NMR(125MHz, DMSO-d6)δ171.99,167.34,151.56,149.43,146.17,141.55,134.82,134.73,129.87, 128.83,128.43,127.96,125.94,114.30,110.63,67.74,66.48,61.19,56.24,46.27.；其 结构式如式I所示：
Figure BDA0002960688670000061
实施例2烯酰吗啉人工抗原的制备
一种烯酰吗啉人工抗原的制备方法，主要包括免疫原和包被原的合成。免疫 原与包被原的制备不同之处在于载体种类，所述免疫原采用的载体蛋白为牛血清 蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)； 所述的包被原采用载体蛋白为卵清蛋白(OVA)。免疫原/包被原的制备方法为采 用活泼酯法。
(1)免疫原的合成
将实施例1的烯酰吗啉半抗原20.0mg(0.04mmol)、24.8mg EDC和13.8mg NHS溶于1.5mL的DMF中，4℃搅拌反应过夜，离心后取上清为A液。分别称 取上述四种载体蛋白(BSA，LF，KLH，ConA)20mg溶于4mL PBS缓冲溶液 (0.01M，pH 7.4)中，搅拌溶解制成B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴加入到 B液中，4℃下磁力搅拌反应12h。离心后，取上清液，4℃下用PBS透析3天， 每天换3次透析液。得到四种免疫原(式Ⅱ-BSA，式Ⅱ-LF，式Ⅱ-KLH和式 Ⅱ-ConA)。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于0.5mL离心管中。 制备得到四种免疫原，冻存于-20℃冰箱中，备用。
(2)包被原的合成
其合成步骤与上述免疫原的合成步骤基本一致，唯一不同的是将所用的载体 蛋白换成OVA，由此可得包被原式Ⅱ-OVA。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管 500μL分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中，备用。
(3)免疫原与包被原的表征
免疫原与包被原的鉴定采用紫外扫描的方法，在200～400nm波长范围内测定免疫原和包被原的紫外吸收光谱，比较不同物质的扫描曲线，鉴定半抗原与载体蛋 白是否偶联成功。由于载体蛋白和半抗原在紫外光谱条件下都具有最大吸收峰, 如果偶联成功，特征吸收峰会相互叠加，从而导致最大吸收峰的蓝移。如图1所 示，在280nm左右有载体蛋白特征吸收峰，免疫原和包被原的特征吸收峰都出 现了明显的蓝移，所以从紫外光谱扫描结果可以证明烯酰吗啉免疫原与包被原均 偶联成功。
实施例3烯酰吗啉人工抗原单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和纳米抗体的 制备
(1)单克隆抗体的制备
动物免疫：用健康的6周龄的Balb/c雌鼠作为实验动物，将实施例2制备的 四种免疫原(式Ⅱ-BSA，式Ⅱ-LF，式Ⅱ-KLH和式Ⅱ-ConA)分别与等量的佐 剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，在小鼠颈背 部和腹腔进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。 首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完 全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每每隔2周免疫一次，期间尾巴静脉取 少量血进行抗体质量鉴定，待抗体稳定后，选择性能最佳的老鼠进行细胞融合， 细胞融合前3天，直接注射0.5mg免疫原小鼠腹腔内追加免疫一次。
抗血清效果评价：以实施例2制备得到的烯酰吗啉包被原，取上述采集的的 小鼠血清为检测抗体，采用间接竞争ELISA法测定小鼠血清的抗血清效价与抑 制率，综合考虑各抗血清的效价、抑制率，对其进行评价。具体操作步骤如下：
1)包板：将烯酰吗啉包被原用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6)稀释至1000ng/mL， 按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL封 闭液(5％脱脂牛奶)37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于 4℃待用，得到包好的酶标板。
2)血清效价与抑制检测：将步骤1)包好的酶标板，效价列：每孔分别加 入50μLPBS和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K) 的血清；抑制列：每孔加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(烯酰吗啉)和50μL 按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K)的血清，做2组平行。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗 (羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入 100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终 止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。
细胞融合和阳性杂交瘤的筛选：选择血清效价最高，抑制率最好的Balb/c 小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞 上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，筛选出能稳定分泌 均一抗体单个细胞，扩大培养，具体步骤如下：
1)复苏骨髓瘤细胞：将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解 冻，融化后l000r/min离心7min，在超净工作台中倒掉上清液，并在细胞沉淀中 加入完全培养液约lmL，吹散细胞，用移液枪取出和完全培养基混均后放入9cm 培养皿中，并扩大至5～6皿，其间需换液1～2次，当每个培养皿的细胞铺满底 部时，可用于细胞融合。
2)饲养细胞制备：在细胞融合前1天对昆明鼠进行摘眼球处死，经75％酒 精浸泡5min后移入超净工作台进行解剖。剪开腹部，剥离腹部皮肤，暴露腹肌， 然后用小镊子挑起腹膜，在小鼠腹膜上开一个小口，注入3mL HAT完全培养基， 用移液枪反复抽吸冲洗，并用移液枪将腹腔串.包含饲养层细胞的培养越取出， 重复操作2～3次，以保证得到足够的饲养层细胞。
3)脾细胞制备：将已多次免疫检血合格的Balb/c小鼠眼眶放血，收集血清， 后在75％酒精浸泡5min消毒，移入超净工作台进行解剖。无菌取出脾脏，用 PPMI-1640基础培养基冲洗后于培养皿中待用。用一次性注射器吸取培养基，左 手用镊子夹住取下的脾脏，右于将注射器插入脾脏，缓慢注入培养基，以将脾脏 里的细胞洗出。反复进行且至脾脏由深红色转为无色透明状,弃脾脏。将混合的 培养基收集到，50mL离心管中，封口后离心，转速l000r/min共8min。离心后 弃去上淸液，待用。
4)细胞融合：将离心去上清液的骨髄瘤细胞和免疫脾细胞按1:5左右混合 于离心管内，加入25mL的基础培养基，封口后离心，转速1000r/min共8min。 离心后弃上清待用。将经离心混合的骨髄瘤细胞和免疫脾细胞弃上清，离心管口 朝下用枪吸掉的多余的培养基。将沉淀的细胞用手指弹松，把离心管置于37℃ 温水中，用枪头吸取预热至37℃的PEG0.8mL，在1min内将PEG缓慢加入到 沉淀的细胞中，每加一滴PEG就用枪头轻柔搅拌一下以混均，静置于1min，预 热好完全培养基，在2min内加入10mL，伴随轻轻搅拌，沿壁加入，使PEG分 开。离心管封口1000r/min离心10min，例掉上清，加入HAT培养基，用弯头吸 管轻轻吸液放液，轻柔搅拌，取出离心管中的HAT培养基和大约75mL左右HAT 新鲜培养基混合，均匀加入到前一天准备的10块含有饲养细胞的96孔培养板中。 保持每孔中添加饲养细胞的HAT培养基和含有融合细胞的HAT培养基体积相同， 每板共使用HAT培养基大约24mL左右。
5)阳性杂交瘤的筛选：融合后7～10天内使用HAT培养基，再使用HT培 养基换液，14天后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时(一 般细胞融合12天左右即可)，抽取多孔培养板中里的上淸，用间接ELISA检测 培养液中的特异性抗体，选择效价高和对药物抑制强的阳性杂交瘤细胞，筛选出 融合效果最好的阳性孔，做好标记。无菌条件下，用显微镜挑取阳性孔中团簇生 长的细胞，移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔， 待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，icELISA检测，同样以效价和抑制 率做为衡量指标，取呈阳性强者利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3～4轮 (注意每轮挑出的阳性孔细胞需扩大培养，后冻存备用)，直至每板每个孔都为 阳性且经检测效价和抑制相近，至此杂交瘤细胞系建立成功，得到能稳定分泌均 一抗体的杂交瘤细胞系。挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培 养板或细胞培养皿中扩大培养，及时冻存。
单克隆抗体的大量制备：在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克降后， 通常以体外培养法和动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单克隆抗体。常规的做 法是：提前在十多只8周龄以上的Balb/c小鼠的腹腔内注射液体石碏，剂量为 0.5mL/只，1～2两周后在小鼠的腹腔注射杂交瘤细胞。接种细胞后每天观察小 鼠状态，特别是从第七天开始，小鼠的腹腔会胀大，在小鼠死亡前用一次性注射 器无菌采取腹水，将采集的腹水12000r/min离心10min,去除上层脂肪和下层纤 维蛋白，收集中间层，用icELlSA法测定其效价和抑制率，纯化后在-20℃保存 备用。
(2)多克隆抗体的制备
将实施例2制备的免疫原与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用 不完全弗氏佐剂)混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉 多种注射方式免疫体重为2.5～3kg的新西兰大白兔，每种免疫原对应注射两只。 第一次免疫间隔四周后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫一周后耳缘静脉取 血，并利用间接ELISA测定血清效价，当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强 免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃，12000r/min下离心10min， 取上清分装于离心管中，于-20℃下保存使用。
(3)单链抗体的制备
提取烯酰吗啉单克隆细胞或经烯酰吗啉免疫原免疫后的小鼠脾脏细胞的 RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体 的轻重链基因，插入表达质粒TCI菌株，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法 进行纯化得到抗烯酰吗啉的单链抗体，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装， -20℃保存。
(4)纳米抗体的制备
动物免疫：将实例2制备的四种免疫原(式Ⅱ-BSA，式Ⅱ-LF，式Ⅱ-KLH 和式Ⅱ-ConA)分别与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗 氏佐剂)混合乳化，对骆驼进行间隔免疫，间隔免疫分析检测并得到骆驼的外周 血用于后续构建纳米抗体的制备。
纳米抗体的制备与纯化：从外周血分离出淋巴细胞，提取出RNA,反转录为 cDNA,利用nested-PCR技术对VHH基因进行扩增，与pComb3XSS载体连接后 转入电转感受态Ecoli.TG1构建VHH基因文库，经辅助噬菌体M13K07救援后 得到噬菌体展示纳米抗体文库。利用固相亲和淘筛技术淘出抗烯酰吗啉的纳米抗 体。
实施例4基于单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立
(1)包被及封闭
用包被液将烯酰吗啉包被原稀释至62.5ng/mL，37℃包被过夜。第二天用 PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每 孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。
(2)标准曲线的建立
1)实验方法
将包好的酶标板，每孔加入一系列不同浓度的50μL的烯酰吗啉标准品和 50μL浓度为3.5μg/mL抗烯酰吗啉单克隆抗体，37℃孵育40min，用PBST洗涤 五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵 育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避 光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm 处的吸收值。以烯酰吗啉准品浓度对横坐标，B/B0(加入烯酰吗啉的孔的OD450/ 未加入烯酰吗啉的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
2)实验结果
基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图2所示，可以看出， 标准曲线呈S型，线性相关性较好，对烯酰吗啉的最低检测限为1.43ng/mL，IC50为4.34ng/mL，线性范围为2.17～8.69ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，其结构式如式I所示：
Figure FDA0002960688660000011
2.权利要求1所述烯酰吗啉半抗原的制备方法，其特征在于，先将烯酰吗啉与三氯氧磷和DMF发生反应制备出甲酰化烯酰吗啉中间体；再将中间体与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶/甲醇存在的条件下发生反应，即制得式I所示烯酰吗啉半抗原。
3.权利要求1所述烯酰吗啉半抗原在制备烯酰吗啉人工抗原或抗体中的应用。
4.一种烯酰吗啉人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述烯酰吗啉半抗原与大分子载体偶联得到，具有式Ⅱ所示结构：
Figure FDA0002960688660000012
5.根据权利要求4所述烯酰吗啉人工抗原，其特征在于，所述大分子载体为载体蛋白：牛血清蛋白、乳铁蛋白、钥孔血蓝蛋白、伴刀豆球蛋白A或卵清蛋白。
6.权利要求3或4所述烯酰吗啉人工抗原的制备方法，其特征在于，将式I所示烯酰吗啉半抗原通过活泼酯法与大分子载体进行偶联。
7.权利要求4所述的烯酰吗啉人工抗原在制备抗烯酰吗啉单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、纳米抗体方面的应用。
8.一种抗烯酰吗啉抗体，其特征在于，是以权利要求4所述烯酰吗啉人工抗原为免疫原制备得到。
9.权利要求4所述烯酰吗啉人工抗原或权利要求8所述烯酰吗啉抗体在免疫法检测烯酰吗啉中的应用。
10.一种检测烯酰吗啉的方法，其特征在于，基于间接ELISA方法进行检测，用权利要求1所述烯酰吗啉半抗原与卵清白蛋白偶联得到的完全抗原作为包被原，用权利要求7所述烯酰吗啉抗体作为检测抗体进行检测。
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