CN113264834B - 一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于农产品质量检测技术领域，提供了一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。本发明提供了一种冷杉醇半抗原，通过以此冷杉醇半抗原为基础，可得到冷杉醇人工抗原，进而得到冷杉醇抗体。本发明的冷杉醇半抗原既最大程度保留了冷杉醇特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用冷杉醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的冷杉醇人工抗原，能更好的通过动物体内免疫应答反应产生特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立冷杉醇的各种免疫分析方法提供基础。采用本发明冷杉醇人工抗原得到的冷杉醇抗体的效价、灵敏度、亲和力好，可应用于农产品特别是烟叶中冷杉醇的快速、灵敏免疫检测。

Description

一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于农产品质量检测技术领域，尤其涉及一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。

背景技术

冷杉醇是烟草表面腺毛分泌物的主要成分之一，在烟叶烘烤和醇化过程中会降解为降龙涎香醚、龙涎香内酯等具有令人愉快的龙涎香香气的物质，因此也被认为是烟草香气成分重要的前体物质。冷杉醇常用于烟草浸膏中，对增加卷烟香气和吸味非常有效，具有重要的应用价值。通常情况下，冷杉醇主要存在于香料烟和雪茄烟中，但近年来相关研究表明冷杉醇也存在于一些香气较高的烤烟品种中。随着我国卷烟原料需求向高香气烟叶转变，迫切需要一种准确、快速、现场应用的冷杉醇检测方法，来为高香气烟草种质筛选、品质评价、栽培及生物调控等提供技术支撑。

目前，国内外检测冷杉醇主要采用色谱法。Severson等建立了测定烟叶表面化合物的气相色谱方法，Ding等建立了测定烟草顺-冷杉醇的正相液相色谱方法，付秋娟等建立了测定烟草顺-冷杉醇的反相液相色谱方法。基于色谱仪器的检测方法普遍存在样品前处理繁琐、有机试剂用量多、仪器贵重等问题，且不符合现场、快速、低成本、大批量检测要求。

近年来免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，也为冷杉醇检测分析提供了新的思路。特异性强、灵敏度高的抗体是建立免疫检测分析方法的关键，而半抗原和完全抗原结构又与抗体性能密切相关。而目前尚未有冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用的相关报道。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，旨在解决背景技术中指出的现有技术存在的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种冷杉醇半抗原，其结构式如下：

本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的冷杉醇半抗原的制备方法，包括以下步骤：

将冷杉醇溶于无水吡啶中，并加入丁二酸酐和二甲氨基吡啶，回流搅拌反应；

减压条件下将吡啶蒸发，用乙酸乙酯溶解残留物，随后进行洗涤；

将上层有机相用无水硫酸钠干燥后，进行减压浓缩；

所得物经硅胶柱层析纯化、梯度洗脱、收集洗脱液、浓缩后得到冷杉醇半抗原。

本发明实施例的另一目的在于提供一种冷杉醇人工抗原的制备方法，包括以下步骤：

采用所述的冷杉醇半抗原与载体蛋白反应得到冷杉醇人工抗原。

作为本发明实施例的另一种优选方案，冷杉醇半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过碳二亚胺法偶联制备免疫原；具体步骤包括：

取冷杉醇半抗原，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后在溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应；

向反应液中加入二环己基碳二亚胺，搅拌反应；

反应液离心后取上清液，加入到牛血清蛋白的缓冲溶液中，搅拌反应；

反应完成后的溶液进行透析，即得与牛血清蛋白偶联的冷杉醇人工抗原。

作为本发明实施例的另一种优选方案，冷杉醇半抗原与卵清蛋白(OVA)通过混合酸酐法形成包被原；具体步骤包括：

取冷杉醇半抗原，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，搅拌反应；

将反应液中加入卵清蛋白的缓冲溶液中，搅拌反应；

反应完成后的溶液进行透析，即得与卵清蛋白偶联的冷杉醇人工抗原。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述方法制备得到的冷杉醇人工抗原。

本发明实施例的另一目的在于提供一种冷杉醇抗体的制备方法，包括以下步骤：

采用所述的冷杉醇半抗原与载体蛋白反应得到冷杉醇人工抗原；

由冷杉醇人工抗原经动物免疫得到冷杉醇抗体。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述的冷杉醇抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述方法制备得到的冷杉醇抗体。

本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的冷杉醇抗体在检测农产品中冷杉醇含量中的应用。检测农产品中冷杉醇含量的方法，包括但不限于冷杉醇ELISA检测方法、ELISA试剂盒法、胶体金试纸条法或时间分辨荧光试纸条法。

本发明针对目前缺乏冷杉醇快速、灵敏检测方法的现实，提供了一种冷杉醇半抗原，通过以此冷杉醇半抗原为基础，可得到冷杉醇人工抗原，进而得到冷杉醇抗体。

本发明的冷杉醇半抗原既最大程度保留了冷杉醇特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；本发明中冷杉醇半抗原的制备方法，反应步骤仅一步，反应操作简单、反应条件温和并易于控制，制备的冷杉醇半抗原的纯度和产率较高。

用上述冷杉醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的冷杉醇人工抗原，能更好的通过动物体内免疫应答反应产生特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立冷杉醇的各种免疫分析方法提供基础。采用本发明冷杉醇人工抗原得到的冷杉醇抗体的效价、灵敏度、亲和力好，可应用于农产品特别是烟叶中冷杉醇的快速、灵敏免疫检测。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1

该实施例提供了一种冷杉醇半抗原，其结构式如下：

冷杉醇结构式如下：

可以看出，本发明提供的冷杉醇半抗原保留了冷杉醇所有的特征基团，最小改变冷杉醇原有的特征结构，同时引入羧基基团与载体蛋白偶联，为后续动物免疫应答和高特异性灵敏度抗体制备奠定了基础。

实施例2

该实施例提供了一种冷杉醇半抗原的制备方法，步骤如下：

将0.87g(3mmol)冷杉醇溶于10mL无水吡啶，加入1.5g(15mmol)丁二酸酐和0.05g二甲氨基吡啶(DMAP)，回流搅拌反应12h。减压条件下将吡啶蒸发，用10mL乙酸乙酯溶解残留物，随后分别用盐酸(1M，20mL，3次)、超纯水(20mL，1次)、饱和食盐水(20mL，1次)洗涤。随后上层有机相用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯：石油醚(5：5)进行梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩后得到冷杉醇半抗原(产率85％)。

冷杉醇半抗原合成路径如下：

本发明所涉及的冷杉醇半抗原的合成方法涉及的关键因素是在冷杉醇分子结构的羟基上引入具有羧基的活性手臂，合成步骤短，一步反应即可完成，工艺条件温和，无需高温高压，操作简单。

实施例3

该实施例提供了一种冷杉醇人工抗原(免疫抗原)的制备方法，步骤如下：

取实施例2制备的冷杉醇半抗原78.0mg(0.2mmol)，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在溶液中加入69.0mg(0.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，25℃条件下搅拌反应15min，随后，向反应液中加入62.7mg(0.3mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，25℃下搅拌反应12h。反应液离心后取上清液0.5mL，在0.5h内缓慢加入到12mL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)的CBS缓冲溶液中(0.1M，pH9.6)，混合液搅拌反应4h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与BSA偶联的冷杉醇人工抗原(免疫抗原)，分装，-20℃保存。

实施例4

该实施例提供了一种冷杉醇人工抗原(包被抗原)的制备方法，步骤如下：

取实施例2制备的冷杉醇半抗原97.5mg(0.25mmol)，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在搅拌条件下加入60μL三正丁胺和30μL氯甲酸异丁酯，25℃条件下搅拌反应1h。随后，将反应液在0.5h内缓慢加入到15mL浓度为12mg/mL的卵清蛋白(OVA)的CBS缓冲溶液中(0.1mol/L，pH9.6)，混合液搅拌反应2h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与OVA偶联的冷杉醇人工抗原(包被抗原)，分装，-20℃保存。

实施例5

该实施例提供了一种冷杉醇抗体的制备方法，由冷杉醇人工抗原经动物免疫得到，其能与冷杉醇发生特异性免疫反应。采用本发明的冷杉醇人工抗原得到的冷杉醇抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好。

该实施例中，所述冷杉醇抗体为特异性针对上述冷杉醇半抗原和人工抗原的鼠源单克隆抗体。

一种冷杉醇单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

1.动物免疫

取健康的6～8周雌性BALB/c小小鼠5只，采用腹腔注射免疫方法进行免疫，共免疫6次。初次免疫用PBS缓冲溶液(0.15mol/L，pH7.4)稀释实施例3中冷杉醇免疫抗原至1mg/mL，随后加入等体积的弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL。初次免疫后两周，取与初次免疫相同的剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL进行加强免疫。此后，每隔两周加强免疫一次。在细胞融合实验前3天，取冷杉醇免疫抗原直接进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射200μL。

表1冷杉醇免疫抗原的免疫程序

2.血清效价测定

三免、四免、五免后7d，采用断尾方式对小鼠采血，间接非竞争ELISA方法测定小鼠血清效价，具体步骤如下：

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释实施例4中制备的冷杉醇包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干；

(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS封闭液(0.01mol/L，pH7.4)200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(3)加血清：每孔加入100μL以PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)倍比稀释的小鼠抗血清，空白对照中只加入PBS缓冲溶液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。

(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。

(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。

(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。以样品孔吸光值接近于1的稀释倍数作为阳性血清的效价。

3.杂交瘤细胞融合和筛选

选择效价最高的小鼠，进行小鼠免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合，步骤如下：

(1)骨髓瘤细胞制备

融合前7-10d，将SP2/0骨髓瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％的CO₂培养箱中培养。待SP2/0瘤细胞处于对数生长期，并且数量达到1-4×10⁷时收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，制备瘤细胞悬浮液，计数待用。

(2)免疫脾细胞制备

选取效价最高的小鼠，摘眼球取血，并分离血清作为后续阳性对照。颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中浸泡消毒10min，超净工作台中无菌操作取出小鼠脾脏，清除脾脏上结缔组织。用注射器针头刺穿脾脏后将脾脏置于120目尼龙滤网上，并用注射器的胶头适度研磨挤压，使脾细胞释放到10mL的RPMI-1640基础培养液中。用20mL的RPMI-1640培养液洗涤脾细胞和滤网三次，合并培养液，并使用胶头滴管吹打，经1000rpm离心10min，用30mL的RPMI-1640培养基悬浮，制成脾细胞悬浮液，计数待用。

(3)杂交瘤细胞融合

将瘤细胞和脾细胞按照数量比5-10：1混合，置于50mL离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清。轻弹离心管底部，使细胞松散均匀。在37℃无菌水浴条件下转动离心管，先慢后快的加入1mL温浴处理的聚乙二醇(PEG)，30s内加完。静置1min。随后，先快后慢在5min内加入20mL温浴处理的RPMI-1640培养液，终止PEG融合反应。然后37℃静置10min。细胞融合液经800rpm离心10min，弃去上清液，轻缓的重悬入40mL含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

(4)杂交瘤细胞株的筛选

在杂交瘤细胞融合后的第d天，使用RPMI-1640筛选培养液半换液，第5d用含20％的胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液全换液，在第7d取细胞上清进行筛选。先用间接非竞争ELISA筛选出阳性细胞孔，随后用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抗体竞争性筛选。选择对冷杉醇均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得稳定分泌冷杉醇单克隆抗体的细胞株。

4.小鼠腹水制备

取6-8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油0.5mL致敏；7d后每只小鼠腹腔注射2×10⁶杂交瘤细胞。7d后，待小鼠腹腔明显膨大后注射器抽取腹水，-20℃保存。待小鼠腹腔再次膨大，重复抽取腹水，每只小鼠重复抽取2-3次。

5.抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化，制备冷杉醇单克隆抗体。抗体经冷冻干燥后，分装，-20℃保存。

6.抗体效价测定

参照血清效价测定步骤，用间接非竞争ELISA方法测定抗体的效价。结果表明，冷杉醇单克隆抗体的效价＞200000。

实施例6

与实施例5不同的是，本实施例中所述的冷杉醇抗体为本领域免疫抗体常规方法制备的多克隆抗体。

实施例7

冷杉醇间接竞争ELISA检测方法

1.间接竞争ELISA检测步骤

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释实施例4中制备的冷杉醇包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干。

(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS缓冲液200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干。

(3)加抗体和冷杉醇样品或标准液：每孔加入50μL经含10％甲醇的PBS缓冲液稀释2000倍的单克隆抗体(实施例5制备)，空白对照中只加入含10％甲醇的PBS缓冲液。随后每孔加入50μL经10％甲醇PBS缓冲液稀释的冷杉醇标准溶液或提取液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。

(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。

(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。

(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。

2.间接竞争ELISA检测方法检测性能

采用四参数logistic方程对冷杉醇浓度和吸光值抑制率进行拟合，得到冷杉醇间接竞争ELISA标准曲线为y＝-12.5627+(107.2637+12.5627)/(1+(x/0.5794)^0.3901)，方法的抑制中浓度IC₅₀为0.5794mg/kg，最低检测限IC₁₀为0.002mg/kg，线性范围(IC_20-80)为0.0166-20.24mg/kg。

实施例8

烟叶中冷杉醇的间接竞争ELIAS检测

1.烟叶冷杉醇的提取

准确称取0.5g雪茄烟叶粉末样品或鲜烟叶匀浆液，加入15mL离心管中。随后加入5mL甲醇，聚四氟乙烯密封盖密封后，20℃超声提取5min。静置5min后，吸取上清液1mL加入10mL离心管中，加入9mL含10％甲醇的PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)，制成冷杉醇提取液。

2.烟叶样品冷杉醇检测

选取雪茄烟叶和烤烟烟叶各3个，按照步骤1提取，采用实施例7冷杉醇间接竞争ELISA检测方法进行检测。每个样品测定3次，计算烟叶中冷杉醇含量和相对标准偏差(RSD)。结果如下：

表2烟叶中冷杉醇含量测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种冷杉醇半抗原，其特征在于，其结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的冷杉醇半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取冷杉醇、溶剂、丁二酸酐和催化剂进行反应；

将溶剂蒸发，并溶解残留物；

将上层有机相干燥、浓缩；

所得物经纯化、洗脱、收集洗脱液后得到冷杉醇半抗原。

3.一种冷杉醇人工抗原的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的冷杉醇半抗原与牛血清白蛋白通过碳二亚胺法偶联制备免疫原；具体步骤包括：

取冷杉醇半抗原、溶剂、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺进行反应；

反应液离心后取上清液，加入到牛血清蛋白的缓冲溶液中进行反应；

反应完成后的溶液进行透析，即得与牛血清蛋白偶联的冷杉醇人工抗原。

4.一种冷杉醇人工抗原的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的冷杉醇半抗原与卵清蛋白通过混合酸酐法形成包被原；具体步骤包括：

取冷杉醇半抗原、溶剂和氯甲酸异丁酯进行反应；

将反应液中加入卵清蛋白的缓冲溶液中，搅拌反应；

反应完成后的溶液进行透析，即得与卵清蛋白偶联的冷杉醇人工抗原。

5.一种如权利要求3或4所述的方法制备得到的冷杉醇人工抗原。

6.一种冷杉醇抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用权利要求3或4所述的冷杉醇人工抗原经动物免疫得到冷杉醇抗体。

7.根据权利要求6所述的冷杉醇抗体的制备方法，其特征在于，所述的冷杉醇抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。