CN114181102A - 己雷琐辛半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了己雷琐辛半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。本发明的己雷琐辛半抗原最大程度保留了己雷琐辛的特征结构，能更好地暴露半抗原的抗原决定簇，使得己雷琐辛半抗原的免疫原性明显增强；该己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联后得到的己雷琐辛免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，采用该抗体的免疫学方法可以检测出2.5ng/mg的己雷琐辛残留，为己雷琐辛快速检测提供了可行解决方案，整个检测流程只需要十多分钟，完全能够满足实际检测需求。

Description

己雷琐辛半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及了免疫化学分析技术领域，特别是涉及了己雷琐辛半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
背景技术
己雷琐辛，又名己间二酚，己基间苯二酚，六烷雷琐辛，4-己基间苯二酚，4-正己基间苯二酚。己雷琐辛作为一种十分有效的抗蠕虫药，已经在临床上得到广泛应用。在食品行业，作为一种优良的蔬菜、瓜果保鲜剂，用于蔬菜瓜果的保鲜。还作为一种能抑制褐变的抗氧护色剂，用于防止虾类褐变。近年来，欧洲、美国等国家对己雷琐辛的新用途陆续进行了开发。欧洲、美国的医学研究人员在治疗肿瘤病人的过程中，将己雷琐辛作为抗癌辅助剂，辅助其它药物进行肿瘤的治疗，取得了明显的效果。另外，国内外研究人员正在就己雷琐辛的新的用途进行探索和研究。
对食品、血液、尿液等样品中的己雷琐辛进行检测对于保障食品安全和人畜身体健康有重要意义。免疫学检测具有特异性好、灵敏度高、需求样本量少等优势，广泛应用于众多场景。但是，目前，国内还没有针对己雷琐辛半抗原的相关报道。
发明内容
本发明提供己雷琐辛半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，己雷琐辛半抗原，其具有如下结构式：
Figure BDA0003347431470000011
第二方面，所述的己雷琐辛半抗原的合成方法，其包括如下步骤：在二氯甲烷中，将己雷锁辛与甘氨酸混合；低温条件下，加入二氯亚砜；随后常温下反应获得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物；经过柱提纯，得到己雷琐辛半抗原。
作为本发明提供的所述的己雷琐辛半抗原的合成方法的一种优选实施方式，所述合成方法包括以下步骤：将1克己雷锁辛置于50ml三口烧瓶内，加入20ml二氯甲烷，称取2.1当量的甘氨酸加入反应瓶内，冰浴下滴加2ml二氯亚砜，升温至室温搅拌过夜，旋干溶剂及多余的二氯亚砜，得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物；经过柱提纯，获得己雷琐辛半抗原。
第三方面，己雷琐辛人工抗原，其中所述己雷琐辛人工抗原包括己雷琐辛免疫抗原和己雷琐辛包被抗原，其是由上述的己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联得到的。
第四方面，所述的己雷琐辛人工抗原的合成方法，其是采用EDC法或戊二醛法将上述己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联制备得到。
第五方面，己雷琐辛抗体，其是由上述的己雷琐辛免疫抗原经动物免疫得到。
第六方面，一种检测己雷琐辛的免疫学方法，其采用上述的己雷琐辛抗体；其中所述的方法不是疾病的诊断和治疗方法。
作为本发明提供的所述的免疫学方法的一种优选实施方式，待测样品经甲醇和烟酸处理。
作为本发明提供的所述的免疫学方法的一种优选实施方式，所述烟酸的浓度为0.25-2％。
作为本发明提供的所述的免疫学方法的一种优选实施方式，所述免疫学方法为免疫层析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析在内的任意一种免疫学分析方法。
本发明具有如下有益效果：
本发明中，在己雷琐辛1位羟基上衍生脂肪链连接臂，衍生的脂肪链连接臂末段带有氨基，本发明的己雷琐辛半抗原最大程度保留了己雷琐辛的特征结构，能更好地暴露半抗原的抗原决定簇，使得己雷琐辛半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的氨基；该己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联后得到的己雷琐辛免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，采用该抗体的免疫学方法，并将待测样品进行烟酸处理后可以检测出2.5ng/g的己雷琐辛，整个检测流程只需要十多分钟，完全能够满足实际检测需求。
本发明公开的己雷琐辛半抗原和人工抗原，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，可用于免疫动物获得高灵敏性、高特异性的抗体，为己雷琐辛的快速检测提供了有效技术方案。采用本发明所制备的单克隆抗体以及将待测样品进行烟酸处理后可以高灵敏检测样品中的己雷琐辛，检测灵敏性达到2.5ng/g，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明己雷琐辛半抗原的合成路线。
具体实施方式
第一方面，本发明实施例提供己雷琐辛半抗原，其具有如下结构式：
Figure BDA0003347431470000031
第二方面，本发明实施例提供上述己雷琐辛半抗原的合成方法。
具体地，上述结构的己雷琐辛半抗原的合成方法包括如下步骤：
在二氯甲烷中，将己雷锁辛与甘氨酸混合；低温条件下，加入二氯亚砜；随后常温下反应获得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物；经过柱提纯，得到己雷琐辛半抗原。
第三方面，本发明实施例提供己雷琐辛人工抗原，所述己雷琐辛人工抗原包括己雷琐辛免疫抗原和己雷琐辛包被抗原，其是由上述己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联得到的。
所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)或血蓝蛋白(KLH)中的任意一种，但不限于前面所列举的几种材料，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。
第四方面，本发明实施例提供己雷琐辛人工抗原的合成方法，其是采用EDC法或戊二醛法将所述己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联制备得到，步骤如下：
(1)EDC法：取载体蛋白(BSA、OVA、KLH、HSA)，用PBS稀释至10mg/ml，加入10倍以上载体蛋白当量的己雷琐辛半抗原，加入10倍以上载体蛋白当量的碳化二亚胺盐酸盐，于室温下反应2小时。用PBS透析除去未偶联的分子，即得完全抗原。
(2)戊二醛法：取载体蛋白(BSA、OVA、KLH、HSA)，用PBS稀释至10mg/ml，加入10倍以上载体蛋白当量的己雷琐辛半抗原，加入10倍以上载体蛋白当量的戊二醛，于室温下反应2小时。用PBS透析除去未偶联的分子，即得完全抗原。
第五方面，本发明实施例还提供一种己雷琐辛抗体，它是由上述己雷琐辛免疫抗原经动物免疫得到。
第六方面，本发明实施例提供一种检测己雷琐辛的免疫学方法，其采用上述己雷琐辛抗体和己雷琐辛包被抗原。
所述免疫学方法为免疫层析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析在内的任意一种免疫学分析方法。
检测己雷琐辛的免疫学方法中，需要采用处理液对待测样品进行处理。发明人在实践中发现，处理液为甲醇和烟酸。本发明人意外发现，所述烟酸的浓度为0.25％-2％时，可以显著提高检测的灵敏性。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1：己雷琐辛半抗原的合成(如图1所示)
将1克己雷锁辛置于50ml三口烧瓶内，加入20ml二氯甲烷，使己雷琐辛完全溶解，称取2.1当量的甘氨酸加入反应瓶内，冰浴下滴加2ml二氯亚砜，升温至室温搅拌过夜，旋干溶剂及多余的二氯亚砜，得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物，得到三种不同结构的半抗原分子(分别为己雷琐辛1位羟基与甘氨酸羧基发生酯化后的产物、己雷琐辛1位羟基与甘氨酸羧基发生酯化后的产物、己雷琐辛1位和3位羟基均与甘氨酸羧基发生酯化后的产物)。经过柱提纯，选取1位羟基与甘氨酸发生酯化反应的产物作为本发明半抗原，即己雷琐辛半抗原。
实施例2：己雷琐辛免疫抗原的合成
取载体蛋白(牛血清白蛋白，BSA)20mg溶于4ml磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，加入5mg己雷琐辛半抗原，混匀，加入5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，室温(25℃)反应2小时，用磷酸盐缓冲液(1×PBS)透析除去未结合到载体蛋白上的小分子，收集透析后的蛋白质即为己雷琐辛免疫抗原。
实施例3：己雷琐辛包被抗原的合成
称取5mg己雷琐辛半抗原，溶于1ml二甲亚砜中，逐滴加入含有20mg卵清蛋白(OVA)的磷酸盐溶液(4ml)中，加入2.5μL戊二醛溶液(50％)，混匀，4℃反应过夜。用磷酸盐缓冲液透析出去未结合到载体蛋白上的小分子，收集透析后的蛋白质即为己雷琐辛包被抗原。
实施例4：己雷琐辛抗体
将实施例2合成的己雷琐辛免疫抗原用生理盐水稀释至1mg/ml，然后与等体积弗氏佐剂(首次用弗氏完全佐剂，第二、三、四次用弗氏不完全佐剂)混合、乳化，免疫Bal B/C鼠，采用ELISA评价不同己雷琐辛免疫抗原的免疫效果，并制备己雷琐辛单克隆抗体。
其中，己雷琐辛单克隆抗体的制备流程为：
(1)融合前3天，用50μg抗原经腹腔加强免疫一次；
(2)融合前一天，制备饲养细胞，按照100μL/孔铺到96孔板中；
(3)摘眼球取血，脱颈处死，于75％酒精中浸泡5min；
(4)取出脾脏，于纱网上碾磨，显微镜下计数；
(5)1200rpm，5min，弃掉上清；
(6)按照1个骨髓瘤细胞对应5个脾细胞的比例加入骨髓瘤细胞，补加1640培养基至30mL，充分混匀；
(7)1200rpm，10min，弃上清；
(8)轻弹管底，充分重悬细胞；
(9)于37℃下，1min内沿管壁加入50％PEG1450 1mL；
(10)缓慢加入25mL 1640培养基；
(11)900rpm，7min，弃上清；
(12)120mL HAT培养液重悬细胞，按照100μL/孔铺到准备好的饲养细胞板中；于37℃5％二氧化碳培养箱中培养；
(13)第8天用HT培养基换液；
(14)第10天ELISA检测；
(15)用完全培养基稀释ELISA检测呈强阳性的孔中的细胞，使细胞浓度为5cells/mL；
(16)将细胞悬液按照200μL/孔分装到96孔板中，置于37℃5％二氧化碳培养箱中培养；
(17)待微孔中的细胞长到约100cells/孔时，进行ELISA检测；
(18)再次进行克隆筛选，直至所有有细胞的孔均呈阳性反应；
(19)随后转入24孔细胞培养板进行培养，随后用细胞培养瓶进行培养；
(20)按照100万个细胞/只小鼠的剂量腹腔注射BalB/C小鼠；
(21)收集腹水，纯化其中的抗体。
实施例5：检测己雷琐辛的免疫学方法
1.纳米颗粒标记己雷琐辛抗体的制备：按照Frens法(1973)制备40nm胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入7μL 0.2M碳酸钾的量调节pH；按照每毫升胶体金颗粒加入7μg己雷琐辛单克隆抗体，室温反应15min；加入牛血清白蛋白(BSA)，使其终浓度为1％，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mM Tris(pH8.0),0.5％Tween20、0.4％酪蛋白、2％蔗糖)重悬颗粒；
2.结合垫的制备：按照5μL/cm喷纳米颗粒标记己雷琐辛抗体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上，置于37℃烘干，裁成0.4cm宽，备用；
3.层析膜的制备：按照1μL/cm喷涂浓度为0.5mg/mL的己雷琐辛包被抗原于硝酸纤维素膜(Millipore 135)上，作为检测线；按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线，置于室温晾干，备用；
4.样品垫的制备：用样品处理液[100mM Tris(PH8.0)，0.5％Tween20]浸泡聚酯纤维素膜，置于37℃烘干，裁成1.2cm宽，备用；
5.试纸条的组装：将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上，裁成3.5mm宽的试纸条，干燥保存，备用；
6.试纸条的使用：(1)样品处理：①取样品(蔬菜、水果等)10g，剪碎，加入10ml样品处理液，振摇1min；10000rpm离心1min，取上清检测。②取样品(动物组织)，匀浆，取3g，加入样品处理液3ml，震荡混匀，置于100℃水浴10min，4000rpm离心5min，取中间层进行检测。③取样品(奶、尿)直接检测。(2)检测样品：将试纸条样品垫一端插入待检上清中，注意结合垫应在液面上方，静置5min，判读结果。当检测线不显色时，结果为阳性；当检测线出线时，结果为阴性。
7.结果。
采用不同的配方处理液处理加标样品(猪肉、上海青)，用所制备的试纸条检测。具体结果如表1-表4所示。根据表1-4可知，在样品处理液中添加甲醇有助于试纸条显色，但甲醇浓度过高会抑制抗原抗体的结合，从而导致显色的减弱。单从显色来看，猪肉样品添加5％-10％的甲醇显色最佳，而上海青样品甲醇的最佳用量为5％-20％。但从灵敏性上看，猪肉样品添加甲醇的浓度在10％时更佳，而上海青样品在10％-20％时皆佳。在实验中还意外地发现，添加烟酸可以明显提高试纸条的灵敏性而不影响显色。对猪肉样品而言，烟酸的添加量在0.5％以上时灵敏性即比不添加时提高4倍，而上海青样品则需要1％以上的用量。
表1样品处理液配方优化(猪肉-甲醇)
Figure BDA0003347431470000071
表2样品处理液配方优化(上海青-甲醇)
Figure BDA0003347431470000072
Figure BDA0003347431470000081
表3样品处理液配方优化(猪肉-烟酸)
Figure BDA0003347431470000082
表4样品处理液配方优化(上海青-烟酸)
Figure BDA0003347431470000083
往鸡肉中分别添加终浓度为500ng/g的氨苄西林、头孢氨苄、盐酸强力霉素、氟喹诺酮、林可霉素、莱克多巴胺、链霉素，试纸条检测结果均呈阴性。往豇豆角中分别添加终浓度为2μg/g氧乐果、氟虫氰、乐果、敌百虫、敌敌畏、克百威、氯氰菊脂，试纸条检测结果均呈阴性。上述结果说明该方法的特异性良好。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.己雷琐辛半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：
Figure FDA0003347431460000011
2.如权利要求1所述的己雷琐辛半抗原的合成方法，其特征在于，其包括如下步骤：在二氯甲烷中，将己雷锁辛与甘氨酸混合；低温条件下，加入二氯亚砜；随后常温下反应获得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物；经过柱提纯，得到己雷琐辛半抗原。
3.根据权利要求2所述的己雷琐辛半抗原的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤：将1克己雷锁辛置于50ml三口烧瓶内，加入20ml二氯甲烷，称取2.1当量的甘氨酸加入反应瓶内，冰浴下滴加2ml二氯亚砜，升温至室温搅拌过夜，旋干溶剂及多余的二氯亚砜，得己雷锁辛与甘氨酸的酯化物；经过柱提纯，获得己雷琐辛半抗原。
4.己雷琐辛人工抗原，其特征在于，所述己雷琐辛人工抗原包括己雷琐辛免疫抗原和己雷琐辛包被抗原，其是由权利要求1所述的己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联得到的。
5.如权利要求4所述的己雷琐辛人工抗原的合成方法，其特征在于，其是采用EDC法或戊二醛法将如权利要求1所述己雷琐辛半抗原与载体蛋白偶联制备得到。
6.己雷琐辛抗体，其特征在于，其是由权利要求4所述的己雷琐辛免疫抗原经动物免疫得到。
7.一种检测己雷琐辛的免疫学方法，其特征在于，其采用权利要求6所述的己雷琐辛抗体，其中所述的方法不是疾病的诊断和治疗方法。
8.根据权利要求7所述的免疫学方法，其特征在于，待测样品经甲醇和烟酸处理。
9.根据权利要求8所述的免疫学方法，其特征在于，所述烟酸的浓度为0.25-2％。
10.根据权利要求7所述的免疫学方法，其特征在于，所述免疫学方法为免疫层析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析在内的任意一种免疫学分析方法。
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