CN115322089B - 一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本申请适用质量检测技术领域，提供覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用，本申请既最大程度保留覆盆子酮特征结构，又具有可与载体蛋白发生偶联的羧基；用覆盆子酮半抗原与载体蛋白偶联后得到的覆盆子酮人工抗原，能通过动物体内免疫应答反应产生特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立覆盆子酮的各种免疫分析方法提供基础；利用本申请检测覆盆子酮的方法与现有覆盆子酮检测方法相比，不使用大型色谱质谱仪器，无需专业的操作人员和技术，操作简单方便；有机试剂用量较少，环境污染较低；以此基础制备胶体金免疫层析试纸条等方法，检测时间可由原来的30‑50min缩短为10～15min，极大缩短检测时间。

Description

一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用

技术领域

本发明属于质量检测技术领域，尤其涉及一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用。

背景技术

覆盆子酮(CAS：5471-51-2)是一种全球认可使用的安全食用香料，天然存在于覆盆子(树莓)等中，也可人工合成。覆盆子酮可用于覆盆子、葡萄、菠萝等香型香精的配制，亦可作为修饰剂或定香剂大量用于日用香料、食品香料、日化香精和烟用香精中。已成为一种具有极高经济价值的香料。此外，在医药、农业、渔业等也有广泛应用。

食品安全国家标准食品添加剂使用标准(GB 2760-2014)中规定覆盆子酮可应用于一些食品中，但在一些食品中不允许添加任何香料香精。国家标准电子烟(GB41700-2022)中规定了覆盆子酮在电子烟烟液中的使用限量为20mg/g。然而，因覆盆子酮价格低廉、增香效果好，存在违规违禁使用的风险隐患。建立快速检测准确检测覆盆子酮含量的分析方法，对于保障食品安全意义重大。

目前，覆盆子酮的监测，主要依赖仪器分析方法，如气相色谱法、气相色谱串联质谱法、高效液相色谱法-串联质谱法等。这些方法虽然检测结果准确可靠，但是依赖昂贵仪器，不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，需发明一种针对覆盆子酮的快速、简便的检测方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种覆盆子酮半抗原，旨在提供一种针对覆盆子酮的快速、简便的检测方法。

本发明实施例是这样实现的，一种覆盆子酮半抗原，所述覆盆子酮半抗原的结构式如下所示：

本发明实施例的另一目的在于一种覆盆子酮半抗原的制备方法，包括：

将覆盆子酮和2-溴乙酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾，室温反应过夜后，用饱和食盐水淬灭反应，经萃取、洗涤、干燥处理，得到目标产物；

将所述目标产物溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸进行室温反应处理，经浓缩、纯化，得到覆盆子酮半抗原。

本发明实施例的另一目的在于一种覆盆子酮人工抗原，所述覆盆子酮人工抗原是由上述的覆盆子酮半抗原或上述的覆盆子酮半抗原的制备方法制备得到的覆盆子酮半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。

本发明实施例的另一目的在于一种覆盆子酮人工抗原的制备方法，包括：

将上述的覆盆子酮半抗原或上述的覆盆子酮半抗原的制备方法制备得到的覆盆子酮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将载体蛋白溶解后加入，搅拌均匀后，再搅拌加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温偶联过夜，经透析，得到覆盆子酮人工抗原。

本发明实施例的另一目的在于一种覆盆子酮抗体，所述覆盆子酮抗体是由上述的覆盆子酮人工抗原或由上述的覆盆子酮人工抗原的制备方法制备得到的覆盆子酮人工抗原经动物免疫得到。

本发明实施例的另一目的在于一种根据上述的覆盆子酮人工抗原或由上述的覆盆子酮人工抗原的制备方法制备得到的覆盆子酮人工抗原或者根据上述的覆盆子酮抗体在覆盆子酮免疫检测中的应用或者在制备覆盆子酮免疫试剂盒、或胶体金免疫层析试纸条、或时间分辨荧光试纸条中的应用。

本发明实施例提供的覆盆子酮半抗原，既最大程度保留了覆盆子酮特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用覆盆子酮半抗原与载体蛋白偶联后得到的覆盆子酮人工抗原，能更好的通过动物体内免疫应答反应产生特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立覆盆子酮的各种免疫分析方法提供基础；同时，采用本发明的覆盆子酮人工抗原得到的覆盆子酮抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好，可应用于食品特别是烟草中覆盆子酮快速、灵敏免疫检测；另外，利用本申请进行直接检测覆盆子酮的方法与气相色谱、气相色谱质谱等现有覆盆子酮检测方法相比，一方面是不使用大型色谱质谱仪器，无需专业的操作人员和技术，操作简单方便；另一方面是有机试剂用量较少，环境污染较低；再一方面是以此基础制备胶体金免疫层析试纸条等方法，检测时间可由原来的30-50min缩短为10～15min，极大缩短检测时间。

附图说明

图1是本申请实施例提供的覆盆子酮半抗原的红外谱图；

图2是本申请实施例提供的覆盆子酮半抗原的质谱谱图；

图3是本申请实施例提供的覆盆子酮间接竞争ELISA方法标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、检测成本低等特点，已广泛应用于医药、农药、毒素等领域。利用免疫分析原理，制备覆盆子酮半抗原、人工抗原和抗体，并开展应用，实现覆盆子酮的快速、灵敏、简单易操作检测，对加强食品安全监管、保障食品安全具有重要意义。目前尚未见有关覆盆子酮免疫检测研究报道。

在本发明实施例中，所述覆盆子酮半抗原的结构式如下所示：

本发明提供的覆盆子酮半抗原保留了覆盆子酮所有的特征基团和结构，同时引入羧基基团，可与载体蛋白偶联，为后续动物免疫应答和高特异性灵敏度抗体制备奠定了基础。

本发明实施例还提供了一种上述覆盆子酮半抗原的制备方法，其步骤为：

将覆盆子酮和2-溴乙酸乙酯溶于干燥DMF，加入碳酸钾，室温反应过夜。用饱和食盐水淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到目标产物。将目标产物溶于干燥二氯甲烷中，加入三氟乙酸。室温反应一小时，浓缩。用HPLC制备色谱纯化，即得到覆盆子酮半抗原。

其中，所述覆盆子酮、2-溴乙酸乙酯、碳酸钾的摩尔比例为1:(1～2):(3～5)。

其中，所述目标产物与三氟乙酸的摩尔比为1:(1～2)。

本发明所涉及的覆盆子酮半抗原的合成方法涉及的关键因素是在覆盆子酮分子结构的羟基上引入具有羧基的活性手臂，合成步骤短，两步反应即可完成，工艺条件温和，无需高温高压，操作简单。

本发明实施例还提供了一种覆盆子酮人工抗原，包括免疫抗原和包被抗原，即上述覆盆子酮半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。所述覆盆子酮人工抗原的结构式如下所示：

其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)。

本发明实施例还提供了一种上述覆盆子酮人工抗原的制备方法。

具体地，覆盆子酮半抗原与载体蛋白通过碳二亚胺法偶联制备人工抗原。

将覆盆子酮半抗原溶于DMF中，将载体蛋白溶解后加入，搅拌均匀后，再搅拌加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温偶联过夜；偶联混合物于4℃下PBS透析，得到覆盆子酮人工抗原；其中所述覆盆子酮半抗原与载体蛋白的摩尔比为400-600：1。

更具体地，分别将100-140mg的上述覆盆子酮半抗原溶解于0.2-1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)获得溶液①和溶液②；将蛋白(50mg BSA、50mg OVA)分别溶于10mL的0.01M PBS缓冲液中获得BSA的PBS溶液和OVA的PBS溶液；在搅拌下分别将制得的溶液①、溶液②滴加到BSA的PBS溶液、OVA-PBS溶液中，磁力搅拌10min；得到的溶液中分别加入1.2-1.5倍于覆盆子酮半抗原摩尔质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温避光反应过夜；待反应完成后，用PBS透析，得到覆盆子酮人工抗原。

作为本发明提供的所述覆盆子酮人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～8.0。

作为本发明提供的所述覆盆子酮人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。

上述覆盆子酮半抗原分子量小于一千，虽然具有免疫反应性，但不具有免疫原性。通过覆盆子酮半抗原与载体蛋白偶联结合，能制备具有免疫原性的覆盆子酮人工抗原。

本发明实施例还提供了一种覆盆子酮抗体，它是由上述覆盆子酮人工抗原特异性制备。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

具体的，所述的覆盆子酮抗体为本领域抗体常规方法制备，能与覆盆子酮抗原发生特异性免疫反应。

在一个具体的实施方案中，所述覆盆子酮抗体为特异性针对上述覆盆子酮半抗原和人工抗原的鼠源单克隆抗体。

采用本发明的覆盆子酮人工抗原得到的覆盆子酮抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的单克隆抗体的效价可达200000，最低检测限为0.35ug/L，半抑制浓度为3.12ug/L。

本发明实施例还提供了上述覆盆子酮人工抗原、抗体在覆盆子酮检测中的的应用。

所述的覆盆子酮免疫检测包括但不限于覆盆子酮ELISA检测方法、ELISA试剂盒、胶体金试纸条、时间分辨荧光试纸条。

本发明实施例还提供了一种直接检测覆盆子酮ELISA分析方法，包括：

将上述覆盆子酮人工抗原免疫动物制备覆盆子酮的单克隆抗体，其中载体蛋白为牛血清白蛋白；

将覆盆子酮人工抗原作为包被原包被在微孔板上，其中载体蛋白为鸡卵清白蛋白，

然后将制备得到覆盆子酮的单克隆抗体加入微孔板中；

加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中覆盆子酮的含量。

下面结合具体实施例进一步详细说明本申请，但实施例仅是本申请的优选实施方式，并不是对本申请的限定。

实施例1

本实施例提供了一种覆盆子酮半抗原的制备方法，步骤如下：

将覆盆子酮(3mmol)和4-溴丁酸乙酯(6mmol)溶于干燥DMF(10mL)，加入碳酸钾(10mmol)，室温反应过夜。用饱和食盐水(20mL)淬灭反应，乙酸乙酯(20mL)萃取有机相，水(20mL)洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到目标产物2。将化合物2溶于干燥二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(3mmol)。室温反应一小时，浓缩。用HPLC制备色谱纯化，即得到覆盆子酮半抗原(产率92％)。

图1-2分别为覆盆子酮半抗原的红外谱图以及质谱谱图。

实施例2

本实施例提供了一种覆盆子酮人工抗原(免疫抗原)的制备方法，步骤如下：

取实施例1制备的覆盆子酮半抗原(0.2mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在溶液中加入(0.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),25℃条件下搅拌反应15min,随后，向反应液中加入(0.3mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，25℃下搅拌反应12h。反应液离心后取上清液0.5mL，在0.5h内缓慢加入到12mL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)的CBS缓冲溶液中(0.1M,pH9.6),混合液搅拌反应4h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与BSA偶联的覆盆子酮人工抗原(免疫抗原)，分装，-20℃保存。

实施例3

一种覆盆子酮人工抗原(包被抗原)的制备方法，步骤如下：

取实施例1制备的覆盆子酮半抗原(0.25mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在搅拌调价下加入60μL三正丁胺和30μL氯甲酸异丁酯，25℃条件下搅拌反应1h。随后，将反应液中加入到，在0.5h内缓慢加入到15mL浓度为12mg/mL的卵清蛋白(OVA)的CBS缓冲溶液中(0.1mol/L,pH9.6),混合液搅拌反应2h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与OVA偶联的覆盆子酮人工抗原(包被抗原)，分装，-20℃保存。

实施例4

本实施例提供了一种覆盆子酮单克隆抗体的制备方法，步骤如下：

1.动物免疫

取健康的6～8周雌性BALB/c小鼠5只，采用腹腔注射免疫方法进行免疫，共免疫6次。初次免疫用PBS缓冲溶液(0.15mol/L,pH7.4)稀释实施例2中覆盆子酮免疫抗原至1mg/mL，随后加入等体积的弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL。初次免疫后两周，取与初次免疫相同的剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL进行加强免疫。此后，每隔两周加强免疫一次。在细胞融合实验前3天，取覆盆子酮免疫抗原直接进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射200μL。

表1覆盆子酮免疫抗原的免疫程序

2.血清效价测定

三免、四免、五免后7d，采用断尾方式对小鼠采血，间接非竞争ELISA方法测定小鼠血清效价，具体步骤如下：

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释实施例3中制备的覆盆子酮包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干；

(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS封闭液(0.01mol/L,pH7.4)200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(3)加血清：每孔加入100μL以PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)倍比稀释的小鼠抗血清，空白对照中只加入PBS缓冲溶液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。

(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。

(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。

(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。以样品孔吸光值接近于1的稀释倍数作为阳性血清的效价。

3.杂交瘤细胞融合和筛选

选择效价最高的小鼠，进行小鼠免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合，步骤如下：

(1)骨髓瘤细胞制备

融合前7-10d,将SP2/0骨髓瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％的CO₂培养箱中培养。待SP2/0瘤细胞处于对数生长期，并且数量达到1-4×10⁷时收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，制备瘤细胞悬浮液，计数待用。

(2)免疫脾细胞制备

选取效价最高的小鼠，摘眼球取血，并分离血清作为后续阳性对照。颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中浸泡消毒10min，超净工作台中无菌操作取出小鼠脾脏，清除脾脏上结缔组织。用注射器针头刺穿脾脏后将脾脏置于120目尼龙滤网上，并用注射器的胶头适度研磨挤压，使脾细胞释放到10mL的RPMI-1640基础培养液中。用20mL的RPMI-1640培养液洗涤脾细胞和滤网三次，合并培养液，并使用胶头滴管吹打，经1000rpm离心10min，用30mL的RPMI-1640培养基悬浮，制成脾细胞悬浮液，计数待用。

(3)杂交瘤细胞融合

将瘤细胞和脾细胞按照数量比5-10:1混合，置于50mL离心管中，1000rpm离心10min,弃去上清。轻弹离心管底部，使细胞松散均匀。在37℃无菌水浴条件下转动离心管先慢后快加入的1mL温浴处理的聚乙二醇(PEG)30s内加完。静置1min。随后，先快后慢在5min内加入20mL温浴处理的RPMI-1640培养液，终止PEG融合反应。然后37℃静置10min。细胞融合液经800rpm离心10min,弃去上清液，轻缓的重悬入40mL含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

(4)杂交瘤细胞株的筛选

在杂交瘤细胞融合后的第d天，使用RPMI-1640筛选培养液半换液，第5d用含20％的胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液全换液，在第7d取细胞上清进行筛选。先用间接非竞争ELISA筛选出阳性细胞孔，随后用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抗体竞争性筛选。选择对覆盆子酮均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得稳定分泌覆盆子酮单克隆抗体的细胞株。

4.小鼠腹水制备

取6-8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油0.5mL致敏；7d后每只小鼠腹腔注射2×10⁶杂交瘤细胞。7d后，待小鼠腹腔明显膨大后注射器抽取腹水，-20℃保存。待小鼠腹腔再次膨大，重复抽取腹水，每只小鼠重复抽取2-3次。

5.抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化，制备覆盆子酮单克隆抗体。抗体经冷冻干燥后，分装，-20℃保存。

6.抗体效价测定

参照步骤(1)中抗血清效价测定步骤，用间接非竞争ELISA方法测定抗体的效价。结果表明，覆盆子酮单克隆抗体的效价＞200000。

实施例5

本实施例提供了覆盆子酮间接竞争ELISA检测方法和特异性评价

1.间接竞争ELISA检测步骤

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释实施例3中制备的覆盆子酮包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干。

(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS缓冲液200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干。

(3)加抗体和覆盆子酮样品或标准液：每孔加入50μL经含10％甲醇的PBS缓冲液稀释2000倍的单克隆抗体(实施例4制备)，空白对照中只加入含10％甲醇的PBS缓冲液。随后每孔加入50μL经10％甲醇PBS缓冲液稀释的覆盆子酮标准溶液或提取液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。

(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；

(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。

(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。

(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。

2.间接竞争ELISA检测方法检测性能

采用线性方程对覆盆子酮浓度对数和吸光值抑制率进行拟合，如图3所示，得到线性方程为Y＝-37.823X+46.535，经过计算，覆盆子酮间接竞争ELISA方法的抑制中浓度IC₅₀为0.81μg/L，最低检测限IC₁₀为0.07μg/L，线性范围(IC_10-90)为0.07-9.24μg/L。

3.间接竞争ELISA检测其他类似物的交叉反应率

采用建立的间接竞争ELISA方法对覆盆子酮和3种结构类似物(苯酚、4-羟基亚苄基丙酮、对羟基苯甲醛)测定交叉反应率。方法显示覆盆子酮抗体与其结构类似物无明显交叉反应，交叉反应率均小于0.005％，表明获得的覆盆子酮单克隆抗体具有很高的特异性，且检测方法特异性较强。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种覆盆子酮人工抗原，其特征在于，所述覆盆子酮人工抗原是由覆盆子酮半抗原与载体蛋白通过碳二亚胺法偶联制备得到；

所述覆盆子酮半抗原的结构式如下所示：

2.一种覆盆子酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括：

将覆盆子酮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将载体蛋白溶解后加入，搅拌均匀后，再搅拌加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温偶联过夜，经透析，得到覆盆子酮人工抗原；

所述覆盆子酮半抗原的结构式如下所示：

3.根据权利要求2所述的覆盆子酮人工抗原的制备方法，其特征在于，所述覆盆子酮半抗原与载体蛋白的摩尔比为(400～600)：1。