CN114989038B

CN114989038B - 一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用

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Publication number: CN114989038B
Application number: CN202210603345.0A
Authority: CN
Inventors: 沈玉栋; 张咏仪; 王弘; 杨金易; 徐振林; 孙远明
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2042-05-30
Also published as: CN114989038A

Abstract

本发明公开了一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用。本发明所述半抗原和人工抗原有利于诱导高特异性的烯酰吗啉抗体，在所述人工抗原的基础上，本发明筛选到了一种能与烯酰吗啉特异性结合的纳米抗体NbX‑8‑2，该纳米抗体具有优异的有机溶剂耐受性，且与多种类似物均无交叉反应，检测特异性强，可用于检测烯酰吗啉或制备烯酰吗啉检测产品。本发明利用所述纳米抗体还提供了一种烯酰吗啉的免疫学检测方法，所述方法的操作简单，耗时短，其对烯酰吗啉的线性检测范围为1.43～192.61ng/mL，半抑制浓度为16.63ng/mL，最低检测限为1.07ng/mL，检测灵敏度高。

Description

一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用。

背景技术

烯酰吗啉(Dimethomorph)又名安克、霜安，是一种高效的羧酸酰胺类真菌杀菌剂，被广泛应用于龙眼、荔枝、黄瓜、葡萄等果蔬作物的霜霉病和疫霉病的防治中。烯酰吗啉具有高效的治疗作用、优异的保护作用和较低的抗药风险，自20世纪90年代投入市场以来，其使用量和使用频率逐年上升。但由于烯酰吗啉具有中低毒性，超量使用后容易经吸附、沉降等方式进入土壤中积累并残留，导致土壤生态环境质量发生变化，进而对人的身体健康造成危害，不仅污染生态环境，还会造成严重的食品安全问题。市场监督管理局公布的食品安全监督抽检信息也显示烯酰吗啉超标情况屡有发生。因此，对烯酰吗啉残留进行灵敏、准确的检测，对生态和食品安全具有重要意义。

目前，国内外对于烯酰吗啉残留的检测方法主要有色谱法、色谱-质谱联用法和电化学方法等，此类检测方法的精度高，检出限低，但需要昂贵的设备和复杂的前处理过程，且需要专业人员操作，不适于现场大量样本的快速筛查。而免疫分析方法由于具有检测灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控，逐渐成为食品有害分析物检测的主流技术。

抗体是免疫分析方法的核心，目前的免疫分析检测方法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主。由于抗体的本质是蛋白质，其活性会影响最终检测结果的准确度和灵敏度。而在实际应用时，抗体容易受储藏和运输条件影响而失活，且在样品前处理阶段往往需要有机溶剂进行处理，有机溶剂的残留会使得检测效果大大降低。因此，在免疫分析方法中，抗体的稳定性起着十分关键的作用。因此，开发一种稳定性好的烯酰吗啉特异性抗体，对于烯酰吗啉的检测具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种烯酰吗啉半抗原。

本发明的第二个目的是提供所述烯酰吗啉半抗原的制备方法。

本发明第第三个目的是提供一种烯酰吗啉人工抗原。

本发明的第四个目的是提供所述半抗原或人工抗原在制备烯酰吗啉抗体中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种烯酰吗啉抗体。

本发明的第六个目的是提供所述抗体在检测烯酰吗啉或制备检测烯酰吗啉的产品中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种烯酰吗啉的酶联免疫检测方法。

本发明的第八个目的是提供一种烯酰吗啉酶联免疫检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁，其结构式如式(I)所示：

本发明通过对烯酰吗啉分子进行改造，获得了与烯酰吗啉结构高度一致，但有利于高特异性抗体诱导的半抗原DIM-H₁₁。

具体地，本发明通过水解吗啉基团引入羟基得到中间体DIM-1，然后经过氯化亚砜发生氯代反应引入氯原子，得到的酰氯化中间体DIM-2，再与γ-氨基丁酸进行取代反应得到半抗原DIM-H₁₁。

本发明所述烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁的制备方法为：先将烯酰吗啉与叔丁醇钾和四氢呋喃反应制备得到中间体DIM-1；再将中间体DIM-1与氯化亚砜反应制备得到氯化中间体DMI-2；最后将中间体DMI-2与γ-氨基丁酸、NaOH和水反应，即可制备得到式(I)所示烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁。

所述烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁的反应式如下所示：

本发明还提供了一种烯酰吗啉人工抗原，其结构式如式(II)所示：

本发明所述人工抗原通过活泼酯法将半抗原DIM-H₁₁与载体蛋白偶联制备得到。

具体地，所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。

本发明利用制备所得的人工抗原，利用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了一种特异性强的烯酰吗啉特异性纳米抗体，表明利用本发明所述抗原可以诱导得到高特异性的抗体。因此，本发明还申请保护所述半抗原DIM-H₁₁或所述人工抗原在制备烯酰吗啉抗体中的应用。

本发明还提供了一种烯酰吗啉抗体，所述抗体是以本发明所述人工抗原为免疫原制备得到，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、纳米抗体中的一种或多种。

本发明还提供了一种烯酰吗啉特异性纳米抗体，将其命名为纳米抗体NbX-8-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体地，所述纳米抗体NbX-8-2包括4个框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)。4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，框架区FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，框架区FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，框架区FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，框架区FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种编码所述纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

由于本发明已给出了所述烯酰吗啉特异性纳米抗体的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因的核苷酸序列，本领域技术人员可以在此基础上通过已知的重组DNA技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。

本发明利用制备所得的纳米抗体实现了对烯酰吗啉的检测。因此，本发明还申请所述抗体在检测烯酰吗啉或制备检测烯酰吗啉的产品中的应用。

本发明提供了一种烯酰吗啉的酶联免疫检测方法，具体为：用式(I)所示烯酰吗啉半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用本发明所述纳米抗体NbX-8-2作为检测抗体进行检测。

具体地，所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。

具体地，所述检测采用间接竞争酶联免疫分析方法。

本发明还提供了一种烯酰吗啉酶联免疫检测试剂盒，其含有本发明所述纳米抗体NbX-8-2。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种有利于诱导高特异性烯酰吗啉抗体的半抗原DIM-H₁₁和人工抗原，在此基础上，筛选获得了一种能与烯酰吗啉特异性结合的纳米抗体NbX-8-2。本发明所述纳米抗体具有优异的有机溶剂耐受性，在实际样品检测的前处理过程中具有良好的稳定性；且该抗体与多种类似物均无交叉反应(CR<2.2％)，能够特异性识别烯酰吗啉，特异性强，检测结果准确。因此，可将该抗体用于检测烯酰吗啉或制备用于检测烯酰吗啉的产品，具有极高的实用价值。

本发明还提供了一种烯酰吗啉的免疫学检测方法，所述方法的操作简单，耗时短，其对烯酰吗啉的线性检测范围为1.43～192.61ng/mL，半抑制浓度(IC₅₀)为16.63ng/mL，最低检测限(LOD)为1.07ng/mL，检测灵敏度高，适于推广使用。

附图说明

图1为制备所得的烯酰吗啉半抗原DMI-H₁₁的质谱图。

图2为烯酰吗啉半抗原、卵清白蛋白OVA、乳铁蛋白(LF)和烯酰吗啉人工抗原的紫外全波长扫描结果图。

图3为烯酰吗啉特异性纳米抗体NbX-8-2的氨基酸序列及结构域划分示意图。

图4为基于烯酰吗啉特异性纳米抗体NbX-8-2建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

图5为不同比例甲醇、乙醇、乙腈/PBS作为稀释液时纳米抗体NbX-8-2的活性曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1烯酰吗啉半抗原的制备

为获得能诱导高特异性烯酰吗啉抗体的半抗原，本发明通过对烯酰吗啉分子进行改造，获得了与烯酰吗啉结构高度一致，但有利于高特异性抗体诱导的半抗原DIM-H₁₁。

本发明通过水解吗啉基团引入羟基得到中间体DIM-1，然后经过氯化亚砜发生氯代反应引入氯原子，得到的酰氯化中间体DIM-2，再与γ-氨基丁酸进行取代反应得到半抗原DIM-H₁₁。

所述烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁的反应式如下所示：

具体地：将烯酰吗啉(2.0g，5.15mmol)置于50mL圆底烧瓶中，溶于15mL四氢呋喃(THF)，加入叔丁醇钾(3.5g，30.9mmol)和H₂O(185.4mg，10.3mmol)室温回流搅拌反应6h。反应停止后，将反应物倒入100mL冰水中，用1M HCl调混合物pH至3左右，用乙酸乙酯多次萃取。合并有机相，用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥。蒸干溶剂后，经100～200目硅胶柱层析梯度洗脱(石油醚：乙酸乙酯＝10：1～2：1)，旋转蒸发溶剂后得到黄色固体，即为中间体DIM-1。

将上述中间体DIM-1(800mg，2.5mmol)和氯化亚砜(1.8mL，25mmol)置于10mL圆底烧瓶中，70℃反应4h。反应停止后，旋蒸除掉多余的氯化亚砜，得到黄色粘稠酰氯化中间体DIM-2，无需纯化，直接用4mL四氢呋喃溶解后转移至50mL圆底烧瓶中。将γ-氨基丁酸(464.0mg，4.5mmol)与NaOH(180mg，4.5mmol)溶于15mL水中，搅拌下逐滴加入到上述酰氯化中间体DIM-2溶液中，常温反应8h。反应结束后，将反应物倒入100mL冰水中，用1M HCl调混合物pH到3左右，用乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥。蒸干溶剂后，经200～300目硅胶柱层析梯度洗脱(石油醚：乙酸乙酯＝5：1～1：1)，得到黄色固体，即半抗原DIM-H₁₁。

烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁的结构式如式(I)所示：

烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁的质谱图如图1所示，由质谱图可以看出，402.0为半抗原DIM-H₁₁的负离子分子峰，计算得其相对分子质量为403.12，与实际的相对分子质量相符，表明成功制备得到了烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁。

实施例2烯酰吗啉人工抗原的制备

本发明在实施例1制备所得半抗原DIM-H₁₁的基础上制备了烯酰吗啉人工抗原，主要包括免疫原和包被原的合成。免疫原与包被原的不同之处在于载体蛋白的种类，免疫原采用的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)，包被原采用载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)。免疫原/包被原的制备方法均为采用活泼酯法。具体步骤如下：

取0.02mmol半抗原、0.04mmol EDC和NHS溶于0.4mL DMF中，4℃搅拌反应过夜，离心后取上清为A液。称取载体蛋白(OVA和LF)各10mg分别溶于4mL CBS缓冲溶液(0.01M，pH9.6)中，搅拌溶解制成B液。磁力搅拌下，吸取A液平分逐滴加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后，取上清液，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原(其中DIM-H₁₁-OVA为包被原，DIM-H₁₁-LF为免疫原)。利用紫外分光光度计对制备得到的烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁、载体蛋白(乳铁蛋白LF、卵清白蛋白OVA)和烯酰吗啉人工抗原(DIM-H₁₁-OVA、DIM-H₁₁-LF)进行紫外全波长扫描，结果如图2所示。由图2所示结果可知，乳铁蛋白LF和卵清白蛋白OVA分别在210nm左右出现了显著的吸收峰，烯酰吗啉半抗原DIM-H₁₁在250nm左右出现了一定的吸收峰，而烯酰吗啉人工抗原同时具有半抗原DIM-H₁₁和载体蛋白的吸收特征和在最大吸收峰均有偏移；说明本发明成功合成了烯酰吗啉人工抗原。随后用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

烯酰吗啉人工抗原的结构式如式(II)所示：

实施例3骆驼免疫抗体文库的构建

1、骆驼免疫

本发明以制备得到的完全抗原DIM-H₁₁-LF作为免疫抗原，用健康的骆驼进行动物免疫。在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mg的免疫抗原。首次免疫将0.5mL完全弗氏佐剂与免疫抗原混合乳化后用于免疫，后续的加强免疫则用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后免疫，之后每间隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。

免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的10mL血液进行血清效价以及竞争反应检测。在第三、第四次免疫后，采集50～100mL外周血，用于构建纳米抗体文库。

2、骆驼淋巴细胞的分离

采集骆驼外周血需尽快进行淋巴细胞分离，具体操作方法如下：

将骆驼外周血与无菌生理盐水在无RNA酶的50mL离心管中以体积比2:1混合稀释。稀释后的外周血用商品化的淋巴细胞分离液分离淋巴细胞；在无菌的50mL离心管中加入15mL的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入15mL的稀释血液，800g离心25min；取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下1500g离心10min，弃上清；用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次1500g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，1mL一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用。

3、总RNA的提取

采用广州捷倍斯生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(R4105)提取上述分离保存的淋巴细胞总RNA，根据说明书进行操作即可。

取少许总RNA样品进行核酸电泳并用超微量分光光度计(nanodrop)测定RNA浓度。理想的RNA样品应完整无降解，从核酸电泳凝胶上可见清晰的28S和18S条带，且无基因组DNA混杂，在260nm及280nm下的紫外吸收值比值(A₂₆₀/A₂₈₀)应在2.0左右。如果出现基因组DNA污染，应在反转录前用DNA酶去除基因组DNA，并再次通过电泳验证基因组DNA已除去且RNA没有在此过程中发生降解；如果RNA已经发生降解，则需要重新提取RNA。

RNA应尽快反转录成cDNA或短暂保存在-80℃环境。

4、cDNA的合成

以提取的总RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体如下所示：

(1)按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；

表1 cDNA合成的第一步反应体系

Total RNA	3μg
		Oligo(dT)<sub>18</sub>primer	1μL
RNase free ddH<sub>2</sub>O	Up to 12μL

(2)上述反应体系于65℃孵育5min，冰浴冷却2min；

(3)按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；

表2 cDNA合成的第二步反应体系

步骤A反应后的体系	12μL
		5×Reaction Buffer	4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)	1μL
		10mM dNTP Mix	2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL)	1μL
		Total	20μL

(4)42℃孵育60min，70℃孵育5min；反转录产物cDNA于-80℃保存。

5、纳米抗体目的基因的扩增

采用巢式PCR对目的基因进行两步法扩增。

第一轮PCR用cDNA作为模板，利用引物Q1/Q2进行第一轮PCR反应，引物Q1/Q2的核苷酸序列如表3所示，第一轮PCR的反应体系如表4所示。

表3纳米抗体VHH目的基因扩增所用的引物及其核苷酸序列

引物Q1	5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′
		引物Q2	5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′
引物Q3	5′-ACTGGCCCAGGCGGCCGAGGTGCAGCTGSWGSAKTCKG-3′
		引物Q4	5′-ACTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCWGGGTC-3′

表4巢式PCR第一步反应体系

第一轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min，30cycle；72℃10min。

第二轮PCR：利用DNA回收试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Q3/Q4进行第二轮PCR反应，引物Q3/Q4的核苷酸序列如表3所示，第二轮PCR的反应体系如表5所示。

表5巢式PCR第二步反应体系

第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s，30cycle；72℃10min。

6、基因文库构建

(1)VHH目标基因及载体的酶切

利用SfiI酶对VHH目标基因及pComb3xss载体进行酶切反应。酶切条件：50℃恒温反应16h。

pComb3xss载体酶切产物通过琼脂糖凝胶回收分子量为3500bp的条带；VHH基因酶切产物通过DNA回收试剂盒直接清洁回收。

(2)酶切产物的连接

将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，16℃反应16h后用DNA回收试剂盒清洁回收。

(3)电击转化

取5μL连接产物加入50μL电转感受态E.coli TG1中，轻轻混匀后转移到0.2cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，电击后立即向电转杯分两次加入800μL和150μL预热到37℃的SOC培养基，收集到无菌离心管中，37℃，250rpm培养1h复苏细胞。

取50μL复苏菌液进行梯度稀释，将各浓度梯度稀释菌液各取100μL涂布于直径90mm的LB-Amp培养皿作为计数板，37℃培养过夜。剩余未稀释的复苏菌液全部涂布于直径120mm的LB-Amp培养皿，每1mL菌液涂布于2～3个培养皿作为扩增板，37℃扩增培养过夜。

统计计数培养皿上的菌落数，计算复苏菌液中的细菌总数，进行多次电击转化，使转化菌落总数累计达到10⁷cfu以上，此数目即为纳米抗体基因文库的库容量。

将扩增板中的转基因大肠杆菌菌落用细胞刮刀刮下，离心收集菌体，弃上清后重新加入LB-Amp(每电转一管加入0.5mL)重悬，混合均匀后加入终浓度为25％的无菌甘油(v/v)，取50μL菌液进行梯度稀释测定细胞数，其余菌液分装后于-80℃冻存；即为烯酰吗啉纳米抗体基因库。

7、噬菌体救援

根据上述转基因大肠杆菌细胞数测定结果接种10倍库容量以上的细胞于150mLLB-Amp中，控制OD_600nm＜0.2，37℃下250rpm培养至对数期(OD_600nm约0.4～0.6)；加入1mL滴度为10¹²cfu/mL以上的辅助噬菌体M13K07，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入Kana(卡那霉素，工作浓度为50μg/mL)于37℃，250rpm培养过夜。将菌液转移到离心瓶中，4℃条件下12000rpm离心15min，取上清，加入1/4体积的PEG/NaCl，冰浴2.5h以上。4℃条件下12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用750μL TBS重悬，转移到1.5mL离心管，25℃条件下4000rpm离心5min，过0.22μm聚醚砜滤膜。取10μL的噬菌体测定滴度，其余混合均匀后加入终浓度50％的无菌甘油(v/v)，-80℃保存，即为烯酰吗啉纳米抗体噬菌体库，可直接用于亲和淘选。

实施例4纳米抗体的亲和淘选及其鉴定

1、纳米抗体的亲和淘选

(1)抗原和载体蛋白固定化

亲和淘选使用吸附力较强的强吸附酶标板。每轮淘选包板1列，共4轮包板4列。AB孔用包被原载体蛋白OVA稀释至1mg/mL，CDEF孔用CB包被液将检测抗原DIM-H₁₁-OVA稀释至10μg/mL，加入强吸附板微孔中，每孔100μL，37℃静置过夜。此外，因骆驼可能免疫过多种载体蛋白，将ConA(刀豆蛋白)、LF(乳铁蛋白)、KLH(钥孔血蓝蛋白)三种免疫载体蛋白混合稀释，使终浓度均为2mg/mL，单独包被1列免疫原载体蛋白孔。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 1％的鱼胶蛋白溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。

(2)阳性噬菌体筛选

将实施例1中的噬菌体文库加入2个免疫原载体蛋白孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h(仅第1轮需要此步骤，第2、3、4轮直接从AB孔开始)。将游离噬菌体转移到包被原载体蛋白AB孔，每孔150μL，37℃震荡孵育1h。将游离噬菌体转移到3个有固定化抗原(DIM-H₁₁-OVA)的微孔中，每孔100μL，37℃震荡孵育1h。弃去孔中游离的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤微孔10次，再用PBS洗涤微孔5次。加入100μL 10mg/mL胰蛋白酶-TBS溶液37℃洗脱30min。收集噬菌体，取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于侵染5mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。第二天用5×PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。

在第二、三、四轮的淘选过程中，依次降低包被浓度，DIM-H₁₁-OVA的包板浓度分别降到1000ng/mL，500ng/mL，100ng/mL，重复步骤(2)的筛选方案。用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。药物洗脱浓度分别1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL。以上条件可以根据实际免疫情况进行调整，如果血清效价较低，可以适当提高淘选时的检测抗原DIM-H₁₁-OVA浓度；如果抑制率较低，则需适当提高竞争反应的药物浓度。

2、阳性克隆的鉴定

采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：

(1)抗原固定化

检测抗原DIM-H₁₁-OVA用包被液稀释至1μg/mL，每孔100μL，37℃静置过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)洗板两次后，每孔加入120μL 2％的脱脂奶粉溶液37℃静置3h。倒出孔内液体并在吸水纸上拍干，37℃烘干1h，4℃保存备用。

(2)纳米抗体小量表达

从第3、4轮淘选的output滴度测定平板上每轮随机挑选96个单菌落，接种到每孔装有0.5mL LB-Amp的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃，180rpm培养过夜，作为菌液“母板”。

从母板中每孔取出10μL菌液接种到另一块每孔装有1mL LB-Amp的96孔深孔板中，接种的孔编号要与母板对应，37℃，180rpm培养4h至对数期，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。

(3)酶联免疫鉴定阳性克隆

将培养过夜的加入IPTG的深孔板4000rpm，10min离心，加入50μL上清到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD₄₅₀大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

选取OD₄₅₀大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆进行阳性纳米抗体的鉴定。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的烯酰吗啉标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min，加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。

选取在板1中OD值大于阴性对照孔3倍，且具有明显抑制的克隆，记录其为NbX-8-2菌株，并将母板中对应孔的菌液转移到无菌离心管中，加入甘油冻存备用。

实施例5特异性纳米抗体NbX-8-2编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经过间接竞争ELISA鉴定获得的特异性纳米抗体NbX-8-2的菌株送到测序公司进行测序，获得特异性纳米抗体NbX-8-2的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得特异性纳米抗体NbX-8-2的氨基酸序列。

特异性纳米抗体NbX-8-2的VHH的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)所示：EVQLVDSGGGSVQSGGSLRLSCVVSGYEKRGYCMGWFRQAPGKEREGVVFTDLYGNTGHADSVKGRFTISQDNAKSTFYLQMNSLNPEDTATYYCASKYAVSCATTSTRATDFTYWGQGTQVTVSSGQAG

氨基酸序列及结构域划分示意图如图3所示。由图3可知，特异性纳米抗体NbX-8-2包括4个框架区(Framework region，FR)和3个互补决定区(Complementarity-determiningregion，CDR)。其中，第1～25位氨基酸序列为框架区FR1，序列为EVQLVDSGGGSVQSGGSLRLSCVVS(SEQ ID NO.2)；第26～33位氨基酸序列为互补决定区CDR1，序列为GYEKRGYC(SEQ ID NO.6)；第34～50位氨基酸序列为框架区FR2，序列为MGWFRQAPGKEREGVVF(SEQ ID NO.3)；第51～57位氨基酸序列为互补决定区CDR2，序列为TDLYGNT(SEQ ID NO.7)；第58～95位氨基酸序列为框架区FR3，序列为GHADSVKGRFTISQDNAKSTFYLQMNSLNPEDTATYYC(SEQ ID NO.4)；第96～115位氨基酸序列为互补决定区CDR3，序列为ASKYAVSCATTSTRATDFTY(SEQ ID NO.8)；第116～130位氨基酸序列为框架区FR4，序列为WGQGTQVTVSSGQAG(SEQ ID NO.5)。

编码纳米抗体NbX-8-2的基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.9)所示：GGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCCTGGCCCCAATAAGTAAAGTCAGTCGCCCGGGTGGATGTTGTCGCACAAGAGACTGCGTACTTTGACGCACAATAATACGTGGCCGTGTCCTCAGGGTTCAGGCTGTTCATTTGCAGATAAAATGTGCTCTTGGCGTTGTCCTGGGAGATGGTGAATCGGCCCTTCACGGAGTCTGCGTGTCCTGTGTTACCATAAAGGTCAGTAAACACGACCCCCTCGCGCTCCTTCCCTGGAGCCTGGCGGAACCAGCCCATGCAGTATCCCCTCTTTTCGTATCCAGAGACTACACAGGAGAGTCTCAGGGACCCTCCAGACTGCACCGAGCCTCCCCCCGAATCCACCAGCTGCACCTC

实施例6特异性纳米抗体NbX-8-2的大量制备

本发明以蛋白表达的形式制备特异性纳米抗体NbX-8-2，具体方法为：

用试剂盒提取所获得的特异性纳米抗体NbX-8-2的菌株中的质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coli BL21(DE3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于750mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD₆₀₀约为0.4～0.6时，加入IPTG(1:1000比例，v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清通过镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体NbX-8-2。

实施例7特异性纳米抗体NbX-8-2的应用

1、包被及封闭

用包被液将包被原DIM-H₁₁-OVA稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入1％的鱼胶蛋白溶液，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h，用密封袋装于4℃待用。

2、标准曲线的建立

(1)实验方法

用包被液将包被原DIM-H₁₁-OVA稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入120μL/孔2％的脱脂奶粉溶液，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的烯酰吗啉标准品，37℃孵育40min后，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL于37℃孵育30min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以烯酰吗啉标准品浓度对横坐标，B/B₀(加入烯酰吗啉的孔的OD₄₅₀/未加入烯酰吗啉的孔的OD₄₅₀)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(2)实验结果

基于特异性纳米抗体NbX-8-2建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图4所示。由图4可知，所得标准曲线呈S型，线性相关性较好，对烯酰吗啉的线性检测范围为1.43～192.61ng/mL，半抑制浓度(IC₅₀)为16.63ng/mL，最低检测限(LOD)为1.07ng/mL，检测灵敏度高。

3、特异性探究

(1)实验方法

配置其他6种与烯酰吗啉结构及功能类似的药物标准溶液，使用2中的间接竞争ELISA鉴定方法测定其他6种类似物，用酶标仪读取450nm处的OD值。绘制标准曲线，计算IC₅₀值与交叉反应率(CR)，CR(％)＝IC₅₀(标准品)/IC₅₀(类似物)如下：

(2)实验结果

表6纳米抗体NbX-8-2的特异性分析

特异性测定结果如表6所示，纳米抗体NbX-8-2与氟吗啉的交叉反应率为2.2％，与其他5种结构及功能类似物交叉反应率均低于1％，结果表明本发明所述纳米抗体NbX-8-2可以特异性识别烯酰吗啉，检测特异性高。

实施例8纳米抗体NbX-8-2的有机耐受性分析

(1)实验方法

用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％)的甲醇、乙醇、乙腈作为稀释液，将纳米抗体NbX-8-2稀释至同一工作浓度，以测定其与抗原的结合能力。未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对不同有机溶剂、同一有机溶剂不同浓度时的耐受能力。具体方法为：

将50μL的稀释好的纳米抗体NbX-8-2和50μL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗板五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H₂SO₄，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。

(2)实验结果

不同比例甲醇、乙醇、乙腈作为稀释液时纳米抗体NbX-8-2的活性曲线图如图5所示。由图5可知，纳米抗体NbX-8-2在10％的甲醇、乙醇或乙腈有机溶液下，仍具有90％以上的活性，且在低浓度的甲醇溶液(10％～30％)中，纳米抗体NbX-8-2活性增加。因此，该纳米抗体NbX-8-2具有优异的有机溶剂耐受性(甲醇、乙醇、乙腈)，在实际样品检测的前处理过程中，不会受到有机溶剂的影响，检测结果准确度高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种烯酰吗啉半抗原、人工抗原、纳米抗体及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Tyr Glu Lys Arg Gly Tyr

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Phe Thr Asp Leu Tyr Gly Asn Thr Gly His Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Ser Thr Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Lys Tyr Ala Val Ser Cys Ala Thr Thr Ser Thr Arg Ala Thr Asp

100 105 110

Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln

115 120 125

Ala Gly

130

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser

20 25

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Phe

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Ser Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Ala Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Tyr Glu Lys Arg Gly Tyr Cys

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Asp Leu Tyr Gly Asn Thr

1 5

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Ser Lys Tyr Ala Val Ser Cys Ala Thr Thr Ser Thr Arg Ala Thr

1 5 10 15

Asp Phe Thr Tyr

20

<210> 9

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggccggcctg gcctgaggag acggtgacct gggtcccctg gccccaataa gtaaagtcag 60

tcgcccgggt ggatgttgtc gcacaagaga ctgcgtactt tgacgcacaa taatacgtgg 120

ccgtgtcctc agggttcagg ctgttcattt gcagataaaa tgtgctcttg gcgttgtcct 180

gggagatggt gaatcggccc ttcacggagt ctgcgtgtcc tgtgttacca taaaggtcag 240

taaacacgac cccctcgcgc tccttccctg gagcctggcg gaaccagccc atgcagtatc 300

ccctcttttc gtatccagag actacacagg agagtctcag ggaccctcca gactgcaccg 360

agcctccccc cgaatccacc agctgcacct c 391

Claims

1.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式(I)所示：

2.一种烯酰吗啉人工抗原，其特征在于，所述人工抗原由权利要求1所述半抗原与蛋白载体偶联得到，其结构式如式(II)所示：

3.根据权利要求2所述人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为卵清白蛋白或乳铁蛋白。

4.权利要求1所述半抗原或权利要求2或3所述人工抗原在制备烯酰吗啉抗体中的应用。

5.一种烯酰吗啉抗体，其特征在于，所述抗体是以权利要求3所述人工抗原为免疫原制备得到。

6.根据权利要求5所述抗体，其特征在于，所述抗体为纳米抗体，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

7.一种编码权利要求6所述的纳米抗体的基因，其特征在于，基因的核苷酸序列如SEQID NO.9所示。

8.权利要求6所述抗体在检测烯酰吗啉或制备检测烯酰吗啉的产品中的应用。

9.一种烯酰吗啉的酶联免疫检测方法，其特征在于，用式(I)所示烯酰吗啉半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用权利要求6所述的纳米抗体作为检测抗体进行检测。

10.一种烯酰吗啉酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求6所述的纳米抗体。