CN111138381A

CN111138381A - 一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111138381A
Application number: CN201911360335.3A
Authority: CN
Inventors: 王睿睿
Original assignee: National Marine Environmental Monitoring Center
Current assignee: National Marine Environmental Monitoring Center
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111138381B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用。本发明提供的烯酰吗啉半抗原既最大程度地保留了烯酰吗啉的化学结构，又通过化学合成，引入了可以与蛋白质偶联的含氮基团，合成方法简单，产物纯度、得率较高；使用该半抗原作为原料制备适合动物免疫的抗原体系，制备的单克隆抗体特异性、亲和力、抗体效价均较好，可用于制备酶联免疫试剂盒，检测成本低、检测方法快速、高效、准确，适用于蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的现场监控和大量样本筛查。

Description

一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用。

背景技术

烯酰吗啉(Dimethomorph)是一种肉桂酸类化合物的衍生物，1988年首次报道在法国用于防治葡萄霜霉病和马铃薯、番茄晚疫病等，是一种新的防治霜霉属病原真菌病害的高效内吸收杀菌剂，并且对苯酰胺类杀菌剂的抗性和敏感菌株都有较高的活性，在实际应用中，烯酰吗啉是继甲霜灵之后防治卵菌病害的又一种理想杀菌剂，特别适合于苯酰胺类杀菌剂抗病性病原个体占优势的田间进行抗药性治理。

但通过长期的实验室研究发现，烯酰吗啉可以使实验动物发生癌变和基因突变，烯酰吗啉残留超标可能会影响食品安全以及环境安全。

我国于2016年在国标中规定，烯酰吗啉在水果：瓜果类水果(甜瓜除外)最大残留0.2mg/kg。2015年，美国EPA发布终期条例修订烯酰吗啉在草莓中的最大残留限量，经过EPA评估最终将烯酰吗啉在草莓中的限量修订为0.9mg/kg。因此，为了确保食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。国内外，对于烯酰吗啉的检测方法主要采用气相谱法，气相色谱法精确可靠、灵敏度高，但前处理步骤多，回收率偏低。酶联免疫测定具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备和人员要求低及样品前处理简单等优点，适合现场监控和大规模样本筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种烯酰吗啉半抗原及其制备方法和应用，以解决现有技术中存在的上述问题。

第一方面，本发明提供了一种烯酰吗啉半抗原，其分子结构式如下式I所示：

第二方面，本发明提供了一种上述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝摩尔比为1:1-4.5:1-3，反应温度为75℃，反应时间为1.5h；反应液变粘稠，红棕色，停止反应，加入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品；经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得白色固体即产物1。

优选地，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2-3:1-2；

更优选为1:2.5:1.5。

步骤2)采用四氢呋喃溶解膦酰基乙酸三乙酯，冰盐浴控温4℃，分批加入，0.6g的氢化钠，室温反应1h；之后加入步骤1所得产物1的四氢呋喃溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油装物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体即为产物2；其中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.8-1.2:0.6-1.5。

优选地，上述步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.9-1.1:0.8-1.1，更优选为1:1:0.92。

步骤3)取步骤2)中所得产物2，采用无水乙醇溶解，室温下加入氢氧化钠，搅拌反应2h；反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体，即产物3。

步骤4)取步骤3)中所得产物3，二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺溶解在乙酸乙酯中，室温搅拌反应8h，离心去沉淀，向上清液中加入吗啉，搅拌反应3h；反应结束后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得产物4；其中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比1:0.8-2:0.8-2:0.5-2。

优选地，上述步骤4)中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比为1:0.9-1.5:0.9-1.5:0.9-1.5；更优选为1:1.2:1.2:1。

步骤5)称取铁粉，加入到90℃盐酸的水溶液中，不断搅拌，1h后，加入步骤4)所得产物4，加热到95℃，反应4h，调节pH在8-9，然后加入活性炭继续搅拌40min，趁热过滤，滤液倒入烧杯中冷却结晶，滤饼用热的乙醇洗涤三次合并滤液，然后倒入冷水中，晶体自然析出；得淡黄色固体，真空干燥，称重，得固体，即为烯酰吗啉半抗原。

第三方面，本发明提供了一种烯酰吗啉抗原，其通过上述的烯酰吗啉半抗原与载体蛋白交联获得，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵白蛋白(OVA)。

第四方面，本发明提供了上述的烯酰吗啉抗原的制备方法，步骤如下：

步骤1)烯酰吗啉半抗原50mg用稀盐酸溶解，滴加1.5％亚硝酸钠溶液，冰浴下持续搅拌。溶液变成蓝黑色后，停止加入亚硝酸钠溶液，继续反应15min。

步骤2)滴加到浓度为10-20mg/mL的载体蛋白溶液，搅拌，调节pH至10，2-8℃下反应3h，透析3天，即得烯酰吗啉抗原，其中，烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的摩尔比为10-70:1；优选地，20-60:1；更优选为30-50:1；具体地，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白。

第五方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性识别上述的烯酰吗啉半抗原或上述的烯酰吗啉抗原。

第六方面，本发明提供了一种检测蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的方法，所述方法包括使用上述的烯酰吗啉单克隆抗体的试剂进行检测或测定的步骤。

第七方面，本发明提供了上述的烯酰吗啉半抗原、烯酰吗啉抗原、烯酰吗啉单克隆抗体，在制备用于检测蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的试剂盒中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述的试剂盒为酶联免疫试剂盒。

另一方面，本发明提供了一种蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的检测试剂盒，其包括上述的烯酰吗啉抗原和/或其检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述的烯酰吗啉抗原的检测试剂为上述的单克隆抗体。

本发明提供的烯酰吗啉半抗原既最大程度地保留了烯酰吗啉的化学结构，又通过化学合成引入了可以与蛋白偶联的含氮基团，合成方法简单，纯度、产率较高；用该半抗原作为原料，制备适于动物免疫的抗原体系免疫动物，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好；所得的抗体用于酶联免疫试剂盒，使用方便、检测成本低、检测方法快速、高效、准确，适合蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的现场控制和大量样本的筛查。本发明的烯酰吗啉半抗原在烯酰吗啉的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为烯酰吗啉抗原合成图。

图2为烯酰吗啉ELISA标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：烯酰吗啉半抗原的合成

步骤1)对硝基苯甲酰氯50.0g(购自上海麦克林生化科技有限公司，货号N814650)，以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝(购自上海麦克林生化科技有限公司，货号A822326)摩尔比为1:2.5:1.5，反应温度为75℃，反应时间为1.5h。反应液变粘稠，红棕色，停止反应，倒入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品。经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得46.1g白色固体即产物1，产率92.2％。

步骤2)用四氢呋喃40mL溶解膦酰基乙酸三乙酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号T107132)29.5g，冰盐浴控温4℃，分批共加入5.2g，0.6g的氢化钠，室温反应1h。再加入18.0g步骤1所述的产物1的四氢呋喃(10mL)溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯(60mL×2)萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤(100mL×2)后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油装物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体21g即为产物2，产率82.5％。

步骤3)取10g步骤2中所述的产物2，用无水乙醇60mL溶解，室温下加入氢氧化钠15.0g，搅拌反应2h。反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯250mL×2萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体7.2g(产物3)。

步骤4)取5.0g产物3，二环己基碳二亚胺4.8g(购自sigma中国，货号D80002)，N-羟基琥珀酰亚胺2.68g(购自sigma中国，货号130672)溶解在30mL乙酸乙酯中，室温搅拌反应8h，离心去沉淀，向上清液中加入吗啉，搅拌反应3h。反应结束后，用水100mL×3洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得产物4。

步骤5)称取铁粉7g，加入到25mL盐酸的水溶液(90℃)中，不断搅拌，1h后，加入步骤4所述产物4，加热到95℃，反应4h，调节pH在8-9，然后加入活性炭继续搅拌40min，趁热过滤，滤液倒入烧杯中冷却结晶，滤饼用热的乙醇洗涤三次合并滤液，然后倒入冷水中，晶体自然析出。得淡黄色固体，真空干燥，称重，得固体2.4g，即为烯酰吗啉半抗原。

实施例2：烯酰吗啉半抗原的鉴定

实施例1中的产物3、产物4、产物5样本送至北京中科汇仁科技有限公司进行核磁鉴定，具体结果如下：

取上述实施例1的产物3结构表征为：

¹H NMR:δ6.16(1H,s),6.99(2H,ddd,J＝8.0,1.3,0.6Hz),7.38(2H,ddd,J＝8.5,1.5,0.5Hz),7.50-7.61(4H,7.53(ddd,J＝8.0,1.5,0.6Hz),7.58(ddd,J＝8.5,1.6,0.5Hz)).

取上述实施例1的产物4结构表征为：

¹H NMR:δ3.51-3.67(8H,3.59(ddd,J＝15.2,10.2,3.2Hz),3.62(ddd,J＝12.2,3.2,2.4Hz)),6.35(1H,s),6.82(2H,ddd,J＝8.4,1.2,0.5Hz),7.31-7.40(4H,7.34

ddd,J＝8.4,1.9,0.5Hz),7.37(ddd,J＝8.4,1.4,0.5Hz)),7.57(2H,ddd,J＝8.4,1.7,0.5Hz).

取上述实施例1的产物5结构表征为：

¹H NMR:δ3.51-3.67(8H,3.59(ddd,J＝15.2,10.2,3.2Hz),3.62(ddd,J＝12.2,3.2,2.4Hz)),6.36(1H,s),6.82(2H,ddd,J＝8.4,1.2,0.5Hz),7.31-7.40(4H,7.34(ddd,J＝8.4,1.9,0.5Hz),7.37(ddd,J＝8.4,1.4,0.5Hz)),7.57(2H,ddd,J＝8.4,1.7,0.5Hz).

实施例3：烯酰吗啉抗原

步骤2)一份滴加到浓度为20mg/mL的牛血清白蛋白溶液(pH 8.3，0.2M的碳酸盐缓冲溶液)(购自sigma公司，货号5479)，另一份滴加到10mg/mL的卵清蛋白溶液(购自sigma公司，货号A5503)(pH 8.3，0.2M的碳酸盐缓冲溶液)中，搅拌，调节pH至10，2-8℃下反应3h，用0.01M的PBS透析3天，分装，-20℃保存。

实施例4：烯酰吗啉抗原免疫动物

使用偶联蛋白，烯酰吗啉-牛血清白蛋白作为免疫抗原，对6周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，免疫剂量60μg/只，首次免疫为弗氏完全佐剂，之后使用弗氏不完全佐剂，第五次免疫结束后，10天后尾静脉采血，分离血清测试免疫血清的特异性。最后一次免疫三天后摘取小鼠脾脏，做细胞融合。

实施例5：细胞融合

取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1:10的比例混合，1000rpm离心10min，弃上清，置39℃水浴预热，60s内加完预热至38℃的1mL50％PEG1500，然后在90s内加入30mL预热至37℃的DMEM不完全培养基，室温静置10min，弃上清，加入20mL，20％FCS和HAT的DMEM培养基重悬。加入到已有饲养细胞的96孔板上，培养7d后，观察细胞的生长状况，取上清进行抗体检测。

实施例6：抗烯酰吗啉抗体杂交瘤细胞的筛选

用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液，将偶联好的包被抗原(烯酰吗啉-卵清蛋白)，5000倍稀释包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，以0.8％明胶封闭每孔，37℃放置3h；将细胞上清、1:500稀释的阳性参考血清和1:500稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用60min；洗涤后加入1:10000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置20min，洗涤后加入底物TMB-H₂O₂，避光显色15min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液终止反应。经酶标仪测定OD₄₅₀nm值：以空白对照调零，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值≥2.1，检测孔判为阳性，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值＜1.5的检测孔判为阴性，比值介于中间判为可疑。

实施例6：有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆

采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。10天后取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至所有细胞孔上清液检测均为阳性；将多次亚克隆培养后的阳性细胞扩大培养和冻存，获得稳定分泌烯酰吗啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为3-2-B。

实施例7：生产抗烯酰吗啉单克隆抗体的腹水

BALB/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5mL。16天后，腹腔接种5×10⁵杂交瘤细胞，10天后，处死小鼠，无菌条件下将腹水吸出。室温静止30min，10000rpm，离心10min，收集上清，分装，-70℃冻存备用。

实施例8：烯酰吗啉ELISA标准曲线的制作

将烯酰吗啉-卵清蛋白包被原用碳酸盐缓冲液稀释到1μg/mL的浓度，加入到酶标板中，4℃过夜包被。将烯酰吗啉标准品(购自sigma中国，货号46027)用0.01M，pH7.2的磷酸盐缓冲液(含15％甲醇)系列稀释，每孔加入50μL，之后加入适当稀释的抗烯酰吗啉单克隆抗体，37℃温浴30min，洗板，加入羊抗鼠酶标二抗反应30min，洗涤酶标板后，加入TMB底物，显色后2M硫酸加入终止反应，酶标仪测试OD值。用每个浓度的标准品溶液得吸光度值除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分比吸光度值。以烯酰吗啉标准品浓度(ng/mL)的浓度为X轴，百分比吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图2所示。

百分比吸光度值％＝B/B₀×100％

实施例9：烯酰吗啉酶联试剂盒的准确度试验

黄瓜样品样品前处理：准确称取5g黄瓜样本，加入20mL，70％甲醇水溶液，40000转，均质2min，定容至25ml，10000rpm离心20min，去沉淀，取100μL上清与加400μL样本稀释液，即可用于酶联免疫分析，稀释倍数为25倍。

采用实施例8中的方法制备的酶标板，取三个浓度的烯酰吗啉标准品溶液，分别为25μg/kg、100μg/kg、200μg/kg，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做3个平行，分别计算回收率。

结果表明烯酰吗啉在黄瓜样本中添加回收率在91.5％-101.4％之间，烯酰吗啉检测试剂盒的准确度较高。

表1烯酰吗啉ELISA添加回收率试验

实施例10：烯酰吗啉酶联试剂盒的精密度试验

从每批实施例8中的方法制备的酶标板中，各抽出10个微孔，测定1ng/mL标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CV％(表2)。

表2所示，批内变异系数范围在12.3-15.6％之间，符合变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。

表2烯酰吗啉ELISA试剂盒精密度试验

实验例11：试剂盒稳定性

试剂盒保存条件为2～8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、烯酰吗啉添加实际测定值均在正常范围之内。37度加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标符合要求。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

Claims

1.一种烯酰吗啉半抗原，其特征在于，其分子结构式如下式I所示：

2.一种制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1)以无水乙醇为溶剂，对硝基苯甲酰氯:氯苯:三氯化铝摩尔比为1:1-4.5:1-3，反应温度为75℃，反应时间为1.5h；反应液变粘稠，红棕色，停止反应，加入2M硫酸水溶液处理，抽滤、水洗，将滤饼加入稀氢氧化钠溶液中，加热搅拌，水洗至中性，干燥得黄色粗产品；经热95％乙醇溶解、过滤、重结晶得白色固体即产物1，

步骤2)采用四氢呋喃溶解膦酰基乙酸三乙酯，冰盐浴控温4℃，分批加入，0.6g的氢化钠，室温反应1h；之后加入步骤1)所得产物1的四氢呋喃溶液，滴毕后，40℃反应5h，TLC显示反应完毕，再加入水，静置分层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，稀盐酸洗涤后经过无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压蒸除溶剂，剩余黄色油装物中加入乙醇50mL，加热溶解后冷却析晶，过滤，滤饼用冷乙醇洗涤，60℃干燥得黄色固体即为产物2；其中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.8-1.2:0.6-1.5，

步骤3)取步骤2)中所得产物2，采用无水乙醇溶解，室温下加入氢氧化钠，搅拌反应2h；反应结束后加水，用盐酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，脱溶得白色固体，即产物3，

步骤4)取步骤3)中所得产物3，二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺溶解在乙酸乙酯中，室温搅拌反应8h，离心去沉淀，向上清液中加入吗啉，搅拌反应3h；反应结束后，用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除乙酸乙酯，得产物4；其中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比1:0.8-2:0.8-2:0.5-2，

步骤5)称取铁粉，加入到90℃盐酸的水溶液中，不断搅拌，1h后，加入步骤4)所得产物4，加热到95℃，反应4h，调节pH在8-9，然后加入活性炭继续搅拌40min，趁热过滤，滤液倒入烧杯中冷却结晶，滤饼用热的乙醇洗涤三次合并滤液，然后倒入冷水中，晶体自然析出；得淡黄色固体，真空干燥，称重，得固体，即为烯酰吗啉半抗原，

3.根据权利要求2所述的制备如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原的制备方法，其中，在步骤1)中，对硝基苯甲酰氯、氯苯和三氯化铝的摩尔比为1:2-3:1-2，优选为1:2.5:1.5；在步骤2)中，膦酰基乙酸三乙酯、氢化钠和产物1的摩尔比为1:0.9-1.1:0.8-1.1，优选为1:1:0.92；在步骤4)中，产物3、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和吗啉的摩尔比为1:0.9-1.5:0.9-1.5:0.9-1.5，优选为1:1.2:1.2:1。

4.一种烯酰吗啉抗原，其特征在于，其通过权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原或权利要求2或3所述的方法制备的烯酰吗啉半抗原与载体蛋白交联获得，所述的载体蛋白选自：牛血清白蛋白或鸡卵白蛋白。

5.一种制备如权利要求4所述的烯酰吗啉抗原的制备方法，其包括如下步骤：

步骤1)取权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原或权利要求2或3所述的方法制备的烯酰吗啉半抗原50mg用稀盐酸溶解，滴加1.5％亚硝酸钠溶液，冰浴下持续搅拌；溶液变成蓝黑色后，停止加入亚硝酸钠溶液，继续反应15min；

步骤2)滴加到浓度为10-20mg/mL的载体蛋白溶液，搅拌，调节pH至10，2-8℃下反应3h，透析3天，即得烯酰吗啉抗原，其中，烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的摩尔比为10-70:1；优选地，20-60:1；更优选为30-50:1；其中，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白或卵清蛋白。

6.一种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性识别权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原或权利要求4所述的烯酰吗啉抗原。

7.一种检测蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的方法，其中，所述的方法包括使用权利要求6所述的单克隆抗体的试剂进行检测或测定的步骤。

8.如权利要求1所述的烯酰吗啉半抗原、如权利要求2或3所述的方法制备的烯酰吗啉半抗原、如权利要求4所述的烯酰吗啉抗原、如权利要求6所述的烯酰吗啉单克隆抗体，在制备用于检测蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的试剂盒中的用途；所述的试剂盒为酶联免疫试剂盒。

9.一种蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求4所述的烯酰吗啉抗原和/或其检测试剂。

10.根据权利要求9所述的蔬菜、水果中烯酰吗啉残留的检测试剂盒，其特征在于，所述的烯酰吗啉抗原的检测试剂为权利要求6所述的单克隆抗体。