CN116854628B - 一种氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。所述氟吡菌胺半抗原结构如式(I)所示，本发明通过在氟吡菌胺的苯环上引入具有一定长度间隔臂的羧基活性基团得到半抗原，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该氟吡菌胺半抗原保留了氟吡菌胺的所有特征基团，最小改变氟吡菌胺原有结构特征，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。再通过上述半抗原制备人工抗原和抗体，制备得到的氟吡菌胺单克隆抗体的效价≥64000，对氟吡菌胺的最低检测限为1.73ng/mL，IC₅₀为15.62ng/mL，线性范围为3.90～62.57ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广。

Description

一种氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

2,6-二氯-N-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺(fluopicolide，简称氟吡菌胺)，其分子式为C₁₄H₈Cl₃F₃N₂O，分子量为383.58。氟吡菌胺是德国拜耳作物科学公司开发的一种新型吡啶酰胺类内吸性杀菌剂，对霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常见卵菌纲病害具有广谱治疗作用，特别适用于优质、绿色有机蔬菜的生产。

氟吡菌胺对人体具有一定毒性，毒性学关注阈值风险评估方法将其定义为对人具有高(Ⅲ级)毒性，同时还具有基因毒性。GB 2763-2021《食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量》收录了氟吡菌胺这种农药，同时规定了在相关农作物中的最大允许残留限量，但并没有指定或推荐检测方法。因此，开发对植物源性食品中氟吡菌胺残留的检测方法具有重要意义。

目前，文献报道的关于氟吡菌胺残留的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱串联质谱法和液相色谱串联质谱法，这些方法都存在前处理操作繁琐、检测时间较长、仪器价值昂贵、对操作人员技术要求比较高等缺点，难于实现快速、简捷、高通量检测，不符合“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”现场快速检测的要求。而免疫分析法以其灵敏度高、特异性高、快速简便等优点被广泛应用在农药残留检测领域，因此免疫分析为氟吡菌胺残留的现场快速检测提供了一条新的分析方法。

然而农药相对分子质量一般小于1000，不具备刺激机体产生针对农药抗原决定簇的免疫原性，必须与大分子蛋白连接后才能刺激机体产生抗体。半抗原的结构对方法的检出限和选择性至关重要，因此需要首先合成可直接与大分子载体(一般为蛋白质)偶联，并能最大程度模拟待测分子结构的半抗原，所以小分子半抗原结构的设计非常重要，建立免疫分析方法的关键在于其半抗原和人工抗原的设计和合成。中国专利CN111484448A公开了氟吡菌酰胺的半抗原及其制备方法和应用，所述氟吡菌酰胺英文名称为fluopyram，化学名为N-{2-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]乙基-a,a,a-邻三氟甲基苯甲酰胺}。商品名称：路富达，CAS登记号:658066-35-4，分子式为：C₁₆H₁₁ClF₆N₂O，相对分子量为：396.71。但是目前还未见有关于氟吡菌胺的半抗原、人工抗原、抗体等的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中检测氟吡菌胺周期长、专业性强、成本高且不适宜现场大批量快速检测、缺少氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体的缺陷和不足，提供一种氟吡菌胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种氟吡菌胺半抗原。

本发明的第二个目的在于提供所述氟吡菌胺半抗原的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供一种氟吡菌胺人工抗原。

本发明的第四个目的在于提供所述氟吡菌胺人工抗原的制备方法。

本发明的第五个目在于提供一种氟吡菌胺抗体。

本发明的第六个目在于提供一种检测氟吡菌胺的试剂盒。

本发明的第七个目在于提供一种检测氟吡菌胺的免疫分析方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种氟吡菌胺半抗原，所述半抗原的结构式如式(I)所示：

本发明提供的氟吡菌胺半抗原是在氟吡菌胺的苯环上引入具有一定长度间隔臂的羧基活性基团，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；所述氟吡菌胺半抗原最大程度保留了氟吡菌胺的所有特征基团，最小改变氟吡菌胺原有结构特征，使得氟吡菌胺抗原的免疫原性明显增强，用氟吡菌胺半抗原与载体蛋白偶联后得到的氟吡菌胺人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答效应增强，以利于制备出特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。

本发明还提供所述氟吡菌胺半抗原的制备方法，先将2,6-二氯-4-氨基苯甲酸和二碳酸二叔丁酯在碱性条件下发生反应制备中间体1，然后中间体1与2-氨甲基-3-氯-5-三氟甲基吡啶反应制备中间体2，接着中间体2在酸性条件下脱去保护基制备中间体3，最后中间体3和丁二酸酐发生缩合反应制备氟吡菌胺半抗原4，即式(I)所示氟吡菌胺半抗原；上述反应方程式如下所示：

具体地，包括如下步骤：

(1)由于2,6-二氯-4-氨基苯甲酸中的同时存在氨基和羧基两个活性基团，因此需要先将氨基进行保护，以便羧基进行下一步反应。氨基保护优先使用Boc-酸酐，因为Boc-酸酐易于水解除去，又具有一定的稳定性，且水解产物不会带来副反应。2,6-二氯-4-氨基苯甲酸与Boc-酸酐的摩尔比为1:1.2～1.3，溶剂为1,4-二氧六环和水的混合溶剂(体积比为2:1)，室温搅拌3.5h，减压除去二氧六环，用乙酸乙酯萃取分层，水层加柠檬酸酸化后有大量淡黄色沉淀产生，并用饱和食盐水洗涤三次，得到中间体1；

(2)所述的中间体1和2-氨甲基-3-氯-5-三氟甲基吡啶的摩尔比为1:1，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，冷凝回流3h，减压蒸馏后得到中间体2；

(3)所述的中间体2在酸性条件下脱去保护基，得到中间体3；

(4)所述的中间体3与丁二酸酐的摩尔比为1:1，溶剂DMSO，加入适量的1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)作催化剂，室温搅拌，通过缩合反应制备得到淡黄色粗产物，粗产物经柱层析分离提纯，真空干燥后得到氟吡菌胺半抗原4，即式(I)所示氟吡菌胺半抗原

本发明还提供所述氟吡菌胺半抗原在制备氟吡菌胺人工抗原中的应用，将氟吡菌胺半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物即为氟吡菌胺人工抗原。

本发明还提供一种氟吡菌胺人工抗原，所述氟吡菌胺人工抗原的结构式如式(II)所示：

所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)。

所述氟吡菌胺人工抗原的制备方法，为采用活泼酯法将载体蛋白牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白偶联于式(I)所示氟吡菌胺半抗原的羧基上。

本发明还提供一种氟吡菌胺人工抗原组合，包括免疫原和包被原，所述免疫原为上述载体蛋白为牛血清白蛋白的氟吡菌胺人工抗原；所述包被原为上述载体蛋白为鸡卵清白蛋白的氟吡菌胺人工抗原。

本发明还提供所述氟吡菌胺人工抗原在制备氟吡菌胺抗体中的应用。

本发明还提供所述氟吡菌胺人工抗原组合在氟吡菌胺检测或在制备氟吡菌胺检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种氟吡菌胺抗体，是以上述氟吡菌胺人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。

进一步地，是以上述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的氟吡菌胺人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。

进一步地，所述的氟吡菌胺抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或者基因工程抗体。

本发明还提供一种检测氟吡菌胺的试剂盒，所述试剂盒包含上述氟吡菌胺人工抗原和上述任一所述氟吡菌胺抗体。

进一步地，所述试剂盒包含上述载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的氟吡菌胺人工抗原作为包被原和上述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的氟吡菌胺人工抗原为免疫原免疫动物制备得到的抗体。

进一步地，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包含酶联免疫反应相关试剂。

本发明还提供一种检测氟吡菌胺的免疫分析方法，是以上述氟吡菌胺人工抗原为包被原，以上述任一所述氟吡菌胺抗体为检测抗体进行检测。所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。

进一步地，是以上述载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的氟吡菌胺人工抗原为包被原，以上述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)的氟吡菌胺人工抗原为免疫原免疫动物制备得到的抗体进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种氟吡菌胺半抗原，通过在氟吡菌胺的苯环上引入具有一定长度间隔臂的羧基活性基团得到半抗原，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该氟吡菌胺半抗原保留了氟吡菌胺的所有特征基团，最小改变氟吡菌胺原有结构特征，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。通过上述半抗原制备的人工抗原和抗体，得到的氟吡菌胺单克隆抗体的效价≥64000，且检测灵敏度高、特异性强，对氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、氟啶虫酰胺、氟醚菌酰胺和氟唑环菌胺等均无交叉反应，即在免疫检测过程中不会受到这些结构类似物的干扰，极大的降低了检测过程的假阳性或假阴性。采用本发明提供的氟吡菌胺抗原、抗体制备的酶联免疫试剂盒对氟吡菌胺的最低检测限为1.73ng/mL，IC₅₀为15.62ng/mL，线性范围为3.90～62.57ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广。

附图说明

图1为氟吡菌胺单克隆抗体的抗体效价结果。

图2为基于氟吡菌胺单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1氟吡菌胺半抗原的合成与鉴定

一种氟吡菌胺半抗原的制备方法，其包括如下步骤：

(1)取1.65g(10mM)2,6-二氯-4-氨基苯甲酸、3mL二氧六环和1.5mL水，溶于氢氧化钠溶液(1M，15mL)中，于冰水浴中冷却至0～5℃，加入2.62g(12mM)Boc-酸酐，自然升至室温下反应3h，减压蒸出二氧六环，用10mL乙酸乙酯萃取分层，弃去有机相，水相加柠檬酸酸化至大量淡黄色沉淀析出，抽滤，用10mL饱和食盐水洗涤，真空干燥，得到中间体1；

(2)取3.07g(10mM)中间体1用DMSO(100mL)溶解，加入2.1g(10mM)2-氨甲基-3-氯-5-三氟甲基吡啶和1.98mL三乙胺，室温搅拌反应3h。反应结束后先用饱和食盐水洗涤反应液，再用饱和碳酸钠水溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得中间体2；

(3)取4.97g(10mM)中间体2，3mL二氯甲烷(CH₂Cl₂)和1.5mL85％的磷酸溶液，室温搅拌3h，加15mL冰水冷却至0℃，缓慢滴加50％的氢氧化钠溶液调节pH至8左右，用20mLCH₂Cl₂萃取两次，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏后得到中间体3。

(4)取1.59g(4mM)中间体3和0.4g(4mM)丁二酸酐中溶于15mL的DMSO中，滴加1.17mL(8mM)DBU，常温搅拌3h。反应结束后，使用2M的盐酸将反应物pH值调为2，加入100mL乙酸乙酯萃取三次，有机相由无水硫酸钠干燥后，减压浓缩后得到淡黄色粉末粗产物半抗原，粗产物经层析柱分离纯化，最终得到氟吡菌胺半抗原4。

将上述制备得到氟吡菌胺半抗原4进行核磁鉴定，结果如下所示：

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆,ppm)δ：12.13(s,1H,-COOH)，，10.03(s,1H,-NH-)，8.75(m,1H，-NH-)，7.93～8.49(s,4H,Ph-H)，4..47(d,2H,-CH₂-)，2.47～2.70(m,4H,-CH₂-CH₂-)。

¹³C NMR(75MHz,DMSO-d₆,ppm)δ：167.6～177.2(3C,-CO)，，120.4～156.5(11C,Ph-C)，123.8(1C,-CF₃)，28.5～44.1(3C,-CH₂-)。

经鉴定，氟吡菌胺半抗原4的结构式如式(I)所示：

实施例2氟吡菌胺人工抗原(免疫原)的制备

一种氟吡菌胺人工抗原(免疫原)的制备方法，步骤如下：

取实施例1所述的氟吡菌胺半抗原12.5mg(0.025mmol)，10.84mg的NHS，10.30mg的DCC，溶于1.5mL DMSO，25℃磁力搅拌反应4h。离心后取上清液为A液。称取载体蛋白BSA20mg溶于2mL PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)中，搅拌溶解制备B液。磁力搅拌下，吸取A液滴加到B液中，4℃反应12h。用PBS透析纯化3天，每天换液3次，得到与牛血清白蛋白偶联的氟吡菌胺人工抗原，分装，-20℃保存，备用。

实施例3氟吡菌胺人工抗原(包被原)的制备

一种氟吡菌胺人工抗原(包被原)的制备方法，步骤如下：

对于上述的氟吡菌胺半抗原对应的包被原的合成方法，其合成步骤与免疫原的合成步骤一致，唯一不同的是将所用的载体蛋白换成OVA，由此可得与卵清蛋白偶联的氟吡菌胺人工抗原，分装，-20℃保存，备用。

实施例4吡菌胺抗体的制备

一种氟吡菌胺单克隆抗体，其制备方法为：

(1)动物免疫

将实施例2制备的免疫原与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，对健康的6～8周雌性Balb/c小鼠进行间隔免疫，ELISA检测小鼠血清效果，取效果最好的一只小鼠脾脏用于细胞融合。

(2)细胞融合与筛选

取产生特异性抗体的Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP20融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性细胞孔。利用有限稀释法或显微克隆法对阳性细胞孔进行克隆化，即可得到能稳定分泌氟吡菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)腹水制备与抗体纯化

采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水。用辛酸-硫酸胺法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。

(4)抗体测试

采用间接ELISA方法测定抗体效价，以吸光值在1.0±0.1为准。如图1所示，结果显示，氟吡菌胺单克隆抗体的效价≥64000，抑制率80％。

实施例5基于氟吡菌胺单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立

1、确定包被原浓度及抗体稀释倍数

以实施例3中制备的氟吡菌胺人工抗原为包被原，实施例4中制备的氟吡菌胺单克隆抗体为检测抗体，通过棋盘滴定法，确定合适的包被原浓度和抗体稀释倍数。将包被原稀释成不同浓度包板，抗体呈梯度稀释，在包好的酶标板中，每孔分别加入不同浓度的氟吡菌胺标准液和抗体各50μL，37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1：5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应，用酶标仪读取450nm处的吸光值。选择A_450nm在1.0～1.5之间的包被原浓度和抗体稀释倍数组合作下一步的抑制曲线绘制，最终确定包被原浓度为12.5ng/mL，抗体浓度为0.5μg/mL。

2、标准曲线的建立

(1)实验方法

向包被原浓度为12.5ng/mL的酶标板中，每孔加入50μL(0.5μg/mL)氟吡菌胺单克隆抗体和一系列不同浓度的50μL的氟吡菌胺标准品，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1：5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H₂SO₄)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以氟吡菌胺标准品浓度对横坐标，B/B₀(加入氟吡菌胺的孔的OD₄₅₀/未加入氟吡菌胺的孔的OD₄₅₀)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。

(2)实验结果

基于氟吡菌胺单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图2所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，所述氟吡菌胺单克隆抗体对氟吡菌胺的最低检测限为1.73ng/mL，IC₅₀为15.62ng/mL，线性范围为3.90～62.57ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广。

实施例6氟吡菌胺单克隆抗体的特异性检测

1、实验方法

采用实施例4制备的氟吡菌胺单克隆抗体对氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、氟啶虫酰胺、氟醚菌酰胺和氟唑环菌胺等可能同时残留的杀菌剂类农药进行交叉反应率的检测，具体方法同实施例5。

2、实验结果

实验结果如下表1所示，结果表明采用实施例4制备的氟吡菌胺单克隆抗体对氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、氟啶虫酰胺、氟醚菌酰胺和氟唑环菌胺等均无交叉(小于0.5％)，说明采用实施例4制备的氟吡菌胺单克隆抗体特异性良好，不易造成假阳性。

表1氟吡菌胺结构及功能类似物交叉反应结果

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

Claims (10)

1.一种氟吡菌胺半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.权利要求1所述氟吡菌胺半抗原的制备方法，其特征在于，先将2,6-二氯-4-氨基苯甲酸和二碳酸二叔丁酯在碱性条件下发生反应制备中间体1，然后中间体1与2-氨甲基-3-氯-5-三氟甲基吡啶反应制备中间体2，接着中间体2在酸性条件下脱去保护基制备中间体3，最后中间体3和丁二酸酐发生缩合反应制备氟吡菌胺半抗原4，即为式（I）所示氟吡菌胺半抗原；所述中间体1结构式如式1所示，中间体2结构式如式2所示，中间体3结构式如式3所示：

，/>，

。

3.权利要求1所述氟吡菌胺半抗原在制备氟吡菌胺人工抗原中的应用。

4.一种氟吡菌胺人工抗原，其特征在于，所述氟吡菌胺人工抗原的结构式如式（II）所示：

式（II）。

5.权利要求4所述氟吡菌胺人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将载体蛋白牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白偶联于权利要求1中式（I）所示氟吡菌胺半抗原的羧基上，即得。

6.一种氟吡菌胺人工抗原组合，其特征在于，包括免疫原和包被原，所述免疫原为权利要求4中载体蛋白为牛血清白蛋白的氟吡菌胺人工抗原；所述包被原为权利要求4中载体蛋白为鸡卵清白蛋白的氟吡菌胺人工抗原。

7.权利要求4所述氟吡菌胺人工抗原在制备氟吡菌胺抗体中的应用。

8.一种氟吡菌胺抗体，其特征在于，是以权利要求4所述氟吡菌胺人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。

9.一种检测氟吡菌胺的试剂盒，其特征在于，包含权利要求4所述氟吡菌胺人工抗原和权利要求7所述氟吡菌胺抗体。

10.一种检测氟吡菌胺的免疫分析方法，其特征在于，以权利要求4所述氟吡菌胺人工抗原为包被原，以权利要求7所述氟吡菌胺抗体为检测抗体进行检测。