CN106771150A - 一种检测烯酰吗啉残留的elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测烯酰吗啉残留的ELISA检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括：包被有烯酰吗啉包被抗原的酶标板、烯酰吗啉标准品、烯酰吗啉抗体、浓缩洗涤液、酶标二抗、底物显色液、反应终止液。该试剂盒检测方法是利用烯酰吗啉免疫原免疫实验动物得到烯酰吗啉抗体，并以烯酰吗啉为标准品，以烯酰吗啉半抗原与载体蛋白偶联物作为包被原，实现高效快速检测烯酰吗啉残留。

Description

一种检测烯酰吗啉残留的ELISA检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于蔬菜水果农药残留检测技术，具体涉及一种用于烯酰吗啉残留分析的ELISA检测试剂盒及检测方法。

技术背景

烯酰吗啉属于肉桂酸衍生物，对由鞭毛菌亚门卵菌纲真菌所引起的农作物病害（如蔬菜霜霉病、烟草黑胫病等）具有极好的防治效果，其作用机制是破坏病菌细胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解，而使病菌死亡，是我国当前使用较为广泛的杀菌剂之一。烯酰吗啉具有内吸性传导作用，施药于农作物根部时，可运输至植物的各个部位，施药于农作物叶片时，药物可进入叶片内部，因此极易残留在果蔬的可食用部分中，虽性较低，但因近年来使用范围日渐增大，其残留情况已得到了人们的关注。我国规定无公害果蔬中规定最大残留限量为5 mg/kg（葡萄）和10 mg/kg（野苣），欧盟规定烯酰吗啉在洋葱、大蒜和葱中的MRL值不得超过0.15 mg/kg。

已报道的烯酰吗啉残留检测方法主要为色谱分析，如液相色谱法、气相色谱法、气质-液质联用法等，但这些检测方法存在成本高、分析步骤繁琐等不足，且检测样品需分离、提取、纯化等一系列前处理才可进行检测，并且样品前处理过程中需使用大量有机试剂，由此产生了一系列的环境污染问题，不适用于生产实践中的大规模检测，因此，研发一种高效快捷的烯酰吗啉残留检测分析方法是目前亟需解决的问题。

1971年，Engvall和Perlman首次报道了酶联免疫吸附试验（ELISA）。随着时代的发展，科学家们解决了酶联免疫反应过程中特异性低的问题，ELISA检测法因其敏感性高、检测速度快、易于标准化、对农作物无污染等优点已投入生产并应用于农业实践中。ELISA检测基本原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，并固相在表面进行抗原-抗体反应，用洗涤法洗出液相中的游离成分，随后通过颜色反应及酶标仪进行检测结果的分析。目前世面上已有多种关于农药残留的ELISA检试剂盒，但尚未见到有关于烯酰吗啉残留分析ELISA检测试剂盒的相关报道。本发明为果蔬中的烯酰吗啉残留分析提供了一种新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测烯酰吗啉残留的ELISA检测试剂盒及检测方法，该试剂盒主要用于检测果蔬中所残留的烯酰吗啉，具有待测样品前处理简单、成本低、适用于大量检测等优点，为高效、迅速检测果蔬中烯酰吗啉的残留提供了一种新方法。

本发明提供的烯酰吗啉多克隆抗体的制备方法，首先制备烯酰吗啉人工抗原，将乙二醇取代苯环上氯原子，随后与牛血清蛋白进行偶联，其结构式如下：

将制备好的烯酰吗啉人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的抗体即为烯酰吗啉多克隆抗体。

所述烯酰吗啉抗体的制备过程中所使用的免疫原为烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的偶联物，载体蛋白可为牛血清蛋白（BSA）、兔血清蛋白、血蓝蛋白。其中，烯酰吗啉抗体可为羊源、马源或兔源等抗体。

本发明提供烯酰吗啉多克隆抗体的制备方法具体步骤如下：

（1）取烯酰吗啉和氟化钾，溶解于乙二醇溶液中，搅拌，反应温度控制在85 ℃，反应结束后冷却至室温，并将反应溶液倒入冰水中，沉淀完全后经抽滤、洗涤、干燥后得粉末状物体，即为烯酰吗啉半抗原。

（2）取烯酰吗啉半抗原溶于DMF中，加入预先溶于DMF的等摩尔1'1-羰基咪，均匀搅拌；待反应结束后，将反应溶液缓慢滴加至碳酸缓冲液溶解的牛血清蛋白（BSA）中，反应温度为4 ℃，均匀搅拌10 h，离心，取上清液，透析三天，其中每隔8 h更换透析液，透析后收集产物，为烯酰吗啉人工抗原。

（3）利用已制备好的烯酰吗啉人工完全抗原免疫新西兰大白兔，四次免疫后，测定其效价符合要求时，取血并分离血清，即为烯酰吗啉多克隆抗体。

本发明提供一种ELISA检测试剂盒，包括包被有烯酰吗啉包被抗原的酶标板、烯酰吗啉标准品、烯酰吗啉抗体、洗涤液、酶标记物、底物显色液、反应终止液。

试剂盒中所述包被有烯酰吗啉包被抗原的酶标板制备过程中所使用的包被抗原是嘧霉抗原与载体蛋白的偶联复合物，包被缓冲液为0.05 mol/L PH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，封闭液为1 %的BSA/PBS缓冲液。

试剂盒中所述酶标记物中的标记酶可选择辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，该试剂盒中的酶标记物为辣根过氧化物酶（HRP）所标记的羊抗兔抗体。

试剂盒中所述洗涤液为PH 4.7的PBST溶液，其配制步骤如下：称取Na₂HPO₄·12H2O34.4 g，NaCl 22.5 g，NaH₂PO₄ 3.45 g于容器中，加入1000 mL双蒸水，将PH调至7.4。

试剂盒中所述底物显色为液为TMB-过氧化氢脲溶液，其配制步骤如下：底物液A：称取无水乙酸钠4.1g，过氧化氢脲214.3 mg，β-糊精1.25 g于容器中，加双蒸水至500 mL，调节PH至5.0，4℃保存；底物液B：称取50 mg TMB溶于5 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前需现场配制，其步骤如下：量取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B均匀混合20 min。

试剂盒中所述反应终止液为1.25 mol/L的H₂SO₄。

利用试剂盒检测果蔬中烯酰吗啉残留的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品。

（2）取相同体积的待测样品和包被缓冲液加入孔内， 37 ℃包被40 min；用洗涤液洗涤3 次，每次3 min；

（3）加入封闭液封闭，清洗后沥干；

（4）在包被有烯酰吗啉抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的烯酰吗啉抗体及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；

（5）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；

（6）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；

（7）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；

（8）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。

本发明试剂盒的分析原理是：

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，该方法中使用的酶标二抗，可以针对抗体的多个部位，反应中存在放大效应，因此，其灵敏度较高。将烯酰吗啉偶联抗原包被于酶标板上，加入样本（待测样本或标准品），使其烯酰吗啉人工抗原相结合，随后加入酶标二抗，使之与“烯酰吗啉人工抗原-烯酰吗啉待测样品”形成复合物，加入底物显色液，待显色反应结束后加入终止液，样本OD值与其所含烯酰吗啉残留物的含量成负相关。

本发明的有益效果：ELISA试剂盒能用于检测样品中的烯酰吗啉残留，其待测样品前处理简单，要求较低，可实现同时检测大量样品的目的；检测方法具有简单易行，特异性高，成本较低且精准度高等特点。相比于传统的高效液相色谱、气相色谱等方法更适于大量样品的检测。

具体实施方式

以下将结合具体的实施例对本发明做进一步阐述，这些实施例仅用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

实施例1

烯酰吗啉半抗原制备

称取烯酰吗啉500 mg和氟化钾350 mg，溶解于50 mL 乙二醇溶液中，搅拌34 h，反应温度控制在85 ℃，反应结束后冷却至室温，并将反应溶液倒入冰水中，沉淀完全后经抽滤、洗涤、干燥后得粉末状物体，即为烯酰吗啉半抗原。

实施例2

烯酰吗啉人工抗原制备

称取0.4 mmol烯酰吗啉半抗原溶于2.0 mL DMF中，25 ℃ 时溶解，加入预先溶于2.0mL DMF的等摩尔1'1-羰基咪，25 ℃时均匀搅拌4 h。待反应结束后，将反应溶液缓慢滴加至碳酸缓冲液（PH 9.6, 0.2 mol/L, CBS）溶解的牛血清蛋白（BSA）中，反应温度为4 ℃，均匀搅拌10 h，然后5000 r/min离心30 min，取上清液，透析三天，其中每隔8 h更换透析液，透析后收集产物，为烯酰吗啉人工抗原。

实施例3

烯酰吗啉抗体制备

利用已制备好的烯酰吗啉人工完全抗原免疫新西兰大白兔，取3 mg烯酰吗啉人工抗原溶于1 mL生理盐水中，将稀释过后的烯酰吗啉人工抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，每只白兔免疫剂量为0.3mg/次，在白兔背部皮下多点免疫，每隔15天加强免疫。初次免疫选用免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合乳化后物质，第二次及之后的免疫选用免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后物质。第三次免疫加强后18天，于兔耳缘静脉处取血，并采用ELISA检测法对其抗血清效价进行测定。第四次免疫后，测定其效价符合要求时，于兔心脏处取血并分离血清。

实施例4

ELISA法测定抗体效价

（1）将抗原包被于酶标板上，每孔100 μL ，过夜，用PBST（含有0.1 % Tween-20的0.01mol/L，PH 7.4的PBS缓冲液）缓冲液洗涤酶标板，静置3 min后拍干。

（2）每孔加入100 μL 1%卵清蛋白，37 ℃孵育1 h。此步骤重复一次。

（3）每孔加入利用倍比稀释法稀释为不同浓度的抗体，并设置阴性血清空白对照，37 ℃孵育1h。

（4）每孔加入100 μL HRP羊抗兔抗体，37 ℃孵育1 h。

（5）每孔加入100 μL 现配的底物显色液，37 ℃显色15 min。观察颜色变化。

（6）每孔加入50 μL 反应终止液。

（7）利用酶标仪检测结果A值。

实施例5

烯酰吗啉酶联免疫吸附分析检测试剂盒，其包括以下组分：

（1）包被有烯酰吗啉包被抗原的酶标板；

（2）烯酰吗啉标准品；

（3）烯酰吗啉抗体；

（4）辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体；

（5）洗涤液：Na₂HPO₄·12H2O 68.8 g，NaH₂PO₄ 6.9 g，NaCl 45 g；

（6）底物液：底物液A：无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg；底物液B：100 mg TMB，10 mL DMSO；

（7）反应终止液：1.25 mol/L的H₂SO₄。

（8）说明书一份。

实施例6

利用试剂盒检测果蔬中烯酰吗啉残留，其步骤如下：

（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品。

（2）取0.1 mL待测样品和0.1 mL包被缓冲液加入孔内，并设置阳性对照（烯酰吗啉标准品包被），37 ℃包被40 min。洗涤，沥干，其中，用洗涤液洗涤3 次，每次3 min。加入0.4mL封闭液封闭30min，清洗后沥干。

（3）在包被有烯酰吗啉抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的烯酰吗啉抗体及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次。

（4）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次。

（5）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化。

（6）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应。

（7）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。

Claims (6)

1.一种烯酰吗啉多克隆抗体的制备方法，其特征在于：首先制备烯酰吗啉人工抗原，将乙二醇取代苯环上氯原子，随后与牛血清蛋白进行偶联，其结构式如下：

将制备好的烯酰吗啉人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的抗体即为烯酰吗啉多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的烯酰吗啉多克隆抗体的制备方法，其特征在于：制备烯酰吗啉抗体过程中所使用的免疫原为烯酰吗啉半抗原与载体蛋白的偶联物；载体蛋白可为牛血清蛋白或卵清蛋白；烯酰吗啉抗体优选兔源抗体。

3.根据权利要求1所述的烯酰吗啉多克隆抗体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）取烯酰吗啉和氟化钾，溶解于乙二醇溶液中，搅拌，反应温度控制在85 ℃，反应结束后冷却至室温，并将反应溶液倒入冰水中，沉淀完全后经抽滤、洗涤、干燥后得粉末状物体，即为烯酰吗啉半抗原；

（2）取烯酰吗啉半抗原溶于DMF中，加入预先溶于DMF的等摩尔1'1-羰基咪，均匀搅拌；待反应结束后，将反应溶液缓慢滴加至碳酸缓冲液溶解的牛血清蛋白（BSA）中，反应温度为4 ℃，均匀搅拌10 h，离心，取上清液，透析三天，其中每隔8 h更换透析液，透析后收集产物，为烯酰吗啉人工抗原；

（3）利用已制备好的烯酰吗啉人工完全抗原免疫新西兰大白兔，四次免疫后，测定其效价符合要求时，取血并分离血清，即为烯酰吗啉多克隆抗体。

4.一种检测果蔬中烯酰吗啉残留的ELISA检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：包被有烯酰吗啉包被抗原的酶标板、烯酰吗啉标准品、烯酰吗啉抗体、浓缩洗涤液、酶标物、底物显色液、反应终止液。

5.根据权利要求 4所述的检测果蔬中烯酰吗啉残留的ELISA检测试剂盒，其特征在于试剂盒中的浓缩洗涤液为PH 4.7的PBST溶液，该溶液组分有Na₂HPO₄·12H2O 34.4 g，NaH₂PO₄ 3 .45 g，NaCl 22.5 g；

试剂盒中的酶标物为酶标二抗，即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；

试剂盒中的底物显色液为TMB-过氧化氢脲溶液，其配制步骤如下：底物液A：称取无水乙酸钠4.1 g，β-糊精1.25 g，过氧化氢脲214.3 mg置于容器中，加双蒸水至500 mL，调节PH至5.0；底物液B：取50 mg TMB溶于5 mL DMSO中；

反应终止液为1.25 mol/L的H₂SO₄。

6.一种利用权利要求4所述试剂盒检测果蔬中烯酰吗啉残留的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入取10 mL提取液，充分研磨并过滤，所得滤液经处理后即为待测样品；

（2）取相同体积的待测样品和包被缓冲液加入孔内， 37 ℃包被40 min；用洗涤液洗涤3 次，每次3 min；

（3）加入封闭液封闭，清洗后沥干；

（4）在包被有烯酰吗啉抗原并封闭好的酶标板孔中，加入相同体积的烯酰吗啉抗体及待测样品，37 ℃孵育40 min后用洗涤液洗涤，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；

（5）加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体，37 ℃孵育40min后用洗涤液，静置5min，甩掉洗液，将酶标板拍干，洗涤3次；

（6）加入新鲜配制的底酶标板物显色液，每孔0.1 mL，37 ℃反应30min，观察颜色变化；

（7）待显色反应结束后，加入终止液，每孔0.05 mL，终止反应；

（8）将酶标板置于酶标仪中，于490 nm波长处测定检测结果。