CN109970550B - 山梨酸半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及免疫化学分析技术领域,特别是涉及了山梨酸半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
背景技术
山梨酸及山梨酸钾是一种良好的食品防腐剂,广泛应用于农产品、食品等行业,通过对钾盐及山梨酸的应用,能够进行微生物生长的有效控制,实现其保质期的延长。在食品领域中,山梨酸钾及山梨酸的日允许量被严格界定,这两种物质食用过多将对人体造成伤害,不利于其肠道正常菌群的平衡性的维持,不利于其体内新陈代谢的正常维持。严重时会导致骨骼生长的抑制,威胁其肝脏、肾脏等的健康。我国食品法明确规定,食品中的山梨酸被严格限量。
山梨酸的常见检测方法包括薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法,这种方法的精确性比较高,但是实际操作难度高,对于工作的精确性要求比较高,它的检测成本也比较高,不适合进行大规模的推广及应用。上述方法中所用仪器设备操作复杂、成本高、对操作人员技术要求高,且不能立即显示结果,不适用于基层管理等部门对怀疑对象进行快速的在线检测和监控。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用,比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为山梨酸残留研究提供了一条新的分析检测方法。
在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测山梨酸残留量时,关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体,而要实现这一目标,前提条件就是得合成、制备出合适的山梨酸半抗原。但是,目前,国内还没有针对山梨酸半抗原的相关报道。
发明内容
为了弥补已有技术的缺陷,本发明提供山梨酸半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现:
本发明还提供上述山梨酸半抗原的合成方法,包括如下步骤:
进一步地,所述步骤S1包括如下步骤:在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1。
进一步地,所述步骤S2包括如下步骤:称取中间体1,用有机溶剂溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸半抗原;其中,所述碱性溶液采用质量浓度均为10%以上的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液。
本发明中,所述化合物1在三溴化硼的催化作用下,在有机溶剂中进行脱甲基反
应,裂解化合物1苯环上的甲氧基,以脱去甲基,制得式()所示结构的山梨酸半抗原,以式
()所示结构的山梨酸半抗原作为包被用山梨酸半抗原。
进一步地,具体操作为:将化合物1溶于有机溶剂中,在冰水浴的条件下,缓慢滴加
三溴化硼,滴加完毕后,保持冰水浴一定时间,然后于室温下继续反应,反应结束后用水终
止反应,向反应液中加入有机溶剂,析出絮状物,抽滤后分液,有机相经水洗、浓缩、过柱纯
化后得到式()所示结构的山梨酸半抗原。
进一步地,所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种;所述化合物1和三溴化硼的物质的量之比为1:(1.5-5)。
本发明还提供山梨酸人工抗原,所述山梨酸人工抗原包括山梨酸免疫抗原和山梨
酸包被抗原,所述山梨酸免疫抗原由式()所示结构的山梨酸半抗原与载体蛋白偶联而成,
所述山梨酸包被抗原由式()所示结构的山梨酸半抗原与载体蛋白偶联而成。
进一步地,上述山梨酸免疫抗原的合成方法包括如下步骤:将60mg的BSA 用
3.34mL pH 7.4的PBS溶解,得到PBS溶液;将10mg式()所示结构的山梨酸半抗原用1mL二乙
二醇乙醚溶解,然后滴加到上述PBS溶液中,搅拌30min,加入氰基硼氢化钠,室温搅拌2天后
用pH 7.4的PBS透析3天,离心分装冻存。
进一步地,上述山梨酸免疫抗原的合成方法包括如下步骤:将60mg的BSA 用
3.34mL pH 7.4的PBS溶解,得到PBS溶液;将10mg式()所示结构的山梨酸半抗原用1mL二乙
二醇乙醚溶解,然后滴加到上述PBS溶液中,搅拌30min,加入氰基硼氢化钠,室温搅拌2天后
用pH 7.4的PBS透析3天,离心分装冻存。
进一步地,上述山梨酸包被抗原的合成方法,包括如下步骤:称取120mg 的OVA,
加入2mL水、80uL 1N NaOH、60uL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚, 室温反应12小时,加入40ul
1N NaOH后反应12小时;反应结束后用生理盐水透析,透析后加入2.7mL水、1mL pH9.0 0.1M
硼酸缓冲液、和25mg式()所示结构的山梨酸半抗原,室温反应48h,用PBS透析3天,离心分
装冻存。
本发明还提供一种山梨酸抗体,它是由上述山梨酸免疫抗原经动物免疫得到。
本发明还提供一种上述山梨酸抗体在检测山梨酸残留中的应用。
本发明具有如下有益效果:
本发明中,提供两种不同结构的山梨酸半抗原,其中,式()所示结构的山梨酸半
抗原用作山梨酸免疫用半抗原,该山梨酸免疫用半抗原与目标待测物山梨酸相似程度高,
最大程度保留了山梨酸的特征结构,能更好地暴露半抗原的抗原决定簇,使得山梨酸半抗
原的免疫原性明显增强,又具有可以与载体蛋白发生偶联的醛基;该山梨酸免疫用半抗原
与载体蛋白偶联后得到的山梨酸免疫抗原去免疫动物,更有利于刺激动物免疫应答产生特
异性更强、灵敏度更高的抗体,经间接竞争ELISA检测山梨酸抗体的IC50为11mg/L,为后续建
立山梨酸的各种免疫分析方法提供基础。
本发明中创造性地将两种不同结构的山梨酸半抗原分别与载体蛋白偶联后制得山梨酸免疫抗原和山梨酸包被抗原,这种方法对山梨酸灵敏度高、特异性强,适合山梨酸残留的分析。
本发明中山梨酸半抗原的合成方法,使用的原料易得,反应操作较为简单,反应条件易于控制。本发明的山梨酸半抗原合成方法,山梨酸半抗原的纯度和收率高,整体的合成成本更具优势。
附图说明
图1为本发明实施例1中山梨酸免疫用半抗原的合成路线;
图2为本发明实施例4中山梨酸包被用半抗原的合成路线。
具体实施方式
本发明中,提供两种不同结构的山梨酸半抗原,其中,式()所示结构的山梨酸半
抗原用作山梨酸免疫用半抗原,该山梨酸免疫用半抗原与目标待测物山梨酸相似程度高,
最大程度保留了山梨酸的特征结构,能更好地暴露半抗原的抗原决定簇,使得山梨酸半抗
原的免疫原性明显增强,又具有可以与载体蛋白发生偶联的醛基;该山梨酸免疫用半抗原
与载体蛋白偶联后得到的山梨酸免疫抗原去免疫动物,更有利于刺激动物免疫应答产生特
异性更强、灵敏度更高的抗体,为后续建立山梨酸的各种免疫分析方法提供基础;避免了以
山梨酸为半抗原,因其结构中含有具有相同活性的基团-COOH,若直接与载体蛋白进行偶联
的话,活性基团被同时偶联而失去特征基团的可能性,无法产生针对目的基团的抗体。本发
明中,式()所示结构的山梨酸半抗原用作山梨酸包被用半抗原,有利于提高免疫检测的
灵敏度。
本发明的山梨酸半抗原,不仅合成方法简便、纯度较高,而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系,弥补了国内山梨酸免疫学检测方法技术领域的空白,为山梨酸免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。
第二方面,本发明提供上述山梨酸半抗原的合成方法。
其中,所述步骤S1包括如下步骤:在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1。其中,所述呋喃和叠氮乙酸乙酯的物质的量之比大于1,通过这种设置,使得呋喃过量,叠氮乙酸乙酯可以完全反应,而过量的呋喃可以直接蒸除,不仅可以提高中间体1的产率,而且分离纯化操作简单,中间体1的纯度高。所述二聚醋酸铑的质量为所述叠氮乙酸乙酯质量的0.05%以上。所述碘粒的物质的量为叠氮乙酸乙酯物质的量的2-3倍。所述氧化剂可以为本领域中能够与碘发生反应常用的氧化剂,作为优选,所述氧化剂为硫代硫酸钠,但不局限于此。本发明中,加入氧化剂的作用是为了将过量的碘氧化掉,本发明中对氧化剂的用量不作具体限定,只要达到上述效果即可。
所述步骤S2包括如下步骤:称取中间体1,用有机溶剂溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸半抗原;其中,所述有机溶剂优选但不局限为甲醇;所述碱性溶液为本领域进行该反应常用的碱性溶液,作为优选,所述碱性溶液采用质量浓度均为10%以上的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液。本发明中并不具体限定所述碱性溶液的添加量,可以采用本领域进行该类反应常用的碱性溶液的添加量。该步骤下,反应具有更高的效率和稳定性。
本发明的方法仅为一步反应,路线短,合成方法温和。
本发明中,所述化合物1的英文名为5-(4-methoxyphenyl)hexa-2,4-dienoicacid,分子式C13H14O3,相对分子量218.24800,CAS号 120554-24-7。
本发明中,所述化合物1在三溴化硼的催化作用下,在有机溶剂中进行脱甲基反
应,裂解化合物1苯环上的甲氧基,以脱去甲基,制得式()所示结构的山梨酸半抗原,以式
()所示结构的山梨酸半抗原作为包被用山梨酸半抗原。
优选地,具体操作为:将化合物1溶于有机溶剂中,在冰水浴的条件下,缓慢滴加三溴化硼,滴加完毕后,保持冰水浴一定时间,然后于室温下继续反应,反应结束后用水终止反应,向反应液中加入有机溶剂,析出絮状物,抽滤后分液,有机相经水洗、浓缩、过柱纯化后得到所述包被用山梨酸半抗原。
其中,所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷中的一种或多种,但不局限于此;所述化合物1和三溴化硼的物质的量之比为1:(1.5-5),更优选地,所述化合物1和三溴化硼的物质的量之比为1:3。本发明中,选用三溴化硼为催化剂,合理控制上述反应条件,反应效率高,目标物的纯度和收率高。
本发明根据山梨酸的结构特点,合理设计山梨酸半抗原的合成方法,使用的原料易得,反应操作较为简单,反应条件易于控制。本发明的山梨酸半抗原合成方法,山梨酸半抗原的纯度和收率高,整体的合成成本更具优势。
第三方面,本发明提供山梨酸人工抗原,所述山梨酸人工抗原包括山梨酸免疫抗
原和山梨酸包被抗原,所述山梨酸免疫抗原由式()所示结构的山梨酸半抗原与载体蛋白
偶联而成,所述山梨酸包被抗原由式()所示结构的山梨酸半抗原与载体蛋白偶联而成。
本发明中,所述山梨酸免疫抗原由式()所示结构的山梨酸半抗原与载体蛋白偶
联而成,引入的连接臂将载体蛋白对小分子的电子排布和空间结构的影响降到最低,并且
能更好地暴露半抗原的抗原决定簇,提高了半抗原的免疫原性,用这种山梨酸免疫抗原去
免疫动物,所得的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好。
本领域中,通常将同种结构的半抗原与不同的载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原,而本发明中创造性地将两种不同结构的山梨酸半抗原分别与载体蛋白偶联后制得山梨酸免疫抗原和山梨酸包被抗原,这种方法对山梨酸灵敏度高、特异性强,适合山梨酸残留的分析。
上述山梨酸免疫抗原的合成方法包括如下步骤:将60mg的BSA 用3.34mL pH 7.4
的PBS溶解,得到PBS溶液;将10mg式()所示结构的山梨酸半抗原用1mL二乙二醇乙醚溶解,
然后滴加到上述PBS溶液中,搅拌反应30min,加入氰基硼氢化钠,室温搅拌2天后用pH 7.4
的PBS透析3天,离心分装冻存。其中,所述氰基硼氢化钠和式()所示结构的山梨酸半抗原
的物质的量之比为5:1。
本发明中,发明人在实践中发现,将式()所示结构的山梨酸半抗原用二乙二醇乙
醚溶解,然后滴加到PBS溶液中,搅拌反应后形成的席夫碱是一种不稳定的状态,本发明中
还进一步加入氰基硼氢化钠,不稳定的席夫碱经氰基硼氢化钠的还原后变得更稳定,使获
得的山梨酸免疫抗原长时间存放效果也不会变差。
本领域中,对于含有醛基的半抗原与蛋白质氨基之间的偶联,通常采用胺醛缩合法。但是发明人在实践中发现,采用传统的胺醛缩合法偶联本发明中的山梨酸半抗原和载体蛋白时,山梨酸半抗原中的羧基会受到影响,存在失去特征基团的可能性,无法产生针对山梨酸的抗体。本发明采用上述方法合成山梨酸免疫抗原,山梨酸半抗原中的羧基不受影响,山梨酸半抗原与载体蛋白偶联后羧基依然暴露在外,可以更好的刺激机体产生效价、特异性、亲和力都比较好的抗体。
上述山梨酸包被抗原的合成方法,包括如下步骤:称取120mg 的OVA, 加入2mL水、
80uL 1N NaOH、60uL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚, 室温反应12小时,加入40ul 1N NaOH后反
应12小时;反应结束后用生理盐水透析,透析后加入2.7mL水、1mL pH9.0 0.1M 硼酸缓冲
液、和25mg式()所示结构的山梨酸半抗原,室温反应48h,用PBS透析3天,离心分装冻存。
本领域中,对于含有羟基的半抗原与载体蛋白之间的偶联一般采用CDI法。本发明舍弃了传统的CDI法,而创造性地采用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚法,这样既延长了山梨酸半抗原的手臂,又使山梨酸半抗原中的羧基暴露在外,使检测时的灵敏性增强。
第四方面,本发明提供一种山梨酸抗体,它是由上述山梨酸免疫抗原经动物免疫得到。
采用本发明的山梨酸免疫抗原得到的山梨酸抗体的效价、特异性、亲和力都比较好。
所述山梨酸抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外,对于所述山梨酸抗体,可以采用本领域常规方法来进行制备。例如,在所述山梨酸抗体为多克隆抗体的情况下,可以通过采用所述山梨酸免疫抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等、随后分离血清获得。在所述山梨酸抗体为单克隆抗体的情况下,可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体,或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内,在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水,由此获得单克隆抗体。
在一个具体的实施方案中,所述山梨酸抗体为鼠源单克隆抗体。
第五方面,本发明提供一种上述山梨酸抗体在检测山梨酸残留中的应用。
本发明通过免疫动物获得对山梨酸具有高度特异性的山梨酸抗体,利用抗原抗体的特异免疫学反应和易被识别的免疫标记放大技术,可以定性和半定量的检测食品中残留的山梨酸。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明,实施例仅是本发明的优选实施方式,不是对本发明的限定。
实施例1
一种山梨酸免疫用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
S1. 在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1;其中,所述呋喃和叠氮乙酸乙酯的物质的量之比为2:1;所述二聚醋酸铑的质量为所述叠氮乙酸乙酯质量的0.08%;所述碘粒的物质的量为叠氮乙酸乙酯物质的量的2.5倍;
S2. 称取中间体1,用甲醇溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取2-3次,合并有机相,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸免疫用半抗原;其中,所述碱性溶液采用质量浓度为10%以上的氢氧化钠水溶液。
实施例2
一种山梨酸免疫用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
S1. 在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1;其中,所述呋喃和叠氮乙酸乙酯的物质的量之比为3:1;所述二聚醋酸铑的质量为所述叠氮乙酸乙酯质量的0.1;所述碘粒的物质的量为叠氮乙酸乙酯物质的量的2倍;
S2. 称取中间体1,用甲醇溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取2-3次,合并有机相,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸半抗原;其中,所述碱性溶液采用质量浓度为10%以上的氢氧化钾水溶液,得到山梨酸免疫用半抗原。
实施例3
一种山梨酸免疫用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
S1. 在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1;其中,所述呋喃和叠氮乙酸乙酯的物质的量之比为4:1;所述二聚醋酸铑的质量为所述叠氮乙酸乙酯质量的0.2%;所述碘粒的物质的量为叠氮乙酸乙酯物质的量的3倍;
S2. 称取中间体1,用甲醇溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取2-3次,合并有机相,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸半抗原;其中,所述碱性溶液采用质量浓度为10%以上的氢氧化钠水溶液,得到山梨酸免疫用半抗原。
实施例4
一种山梨酸包被用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
提供化合物1,所述化合物1具有结构式;将0.002mol的化合物1溶于15mL二氯甲烷中,在冰水浴的条件下,缓慢滴加0.006mol三溴化硼,滴加完毕后,保持冰水浴30min,然后于室温下继续反应2h,反应结束后用水终止反应,向反应液中加入二氯甲烷,析出絮状物,抽滤后分液,有机相经水洗、浓缩、过柱纯化后得到所述山梨酸包被用半抗原。
实施例5
一种山梨酸包被用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
提供化合物1,所述化合物1具有结构式;将0.002mol的化合物1溶于三氯甲烷中,在冰水浴的条件下,缓慢滴加0.003mol三溴化硼,滴加完毕后,保持冰水浴25min,然后于室温下继续反应2h,反应结束后用水终止反应,向反应液中加入三氯甲烷,析出絮状物,抽滤后分液,有机相经水洗、浓缩、过柱纯化后得到所述山梨酸包被用半抗原。
实施例6
一种山梨酸包被用半抗原,其合成方法包括如下步骤:
提供化合物1,所述化合物1具有结构式;将0.002mol的化合物1溶于二氯乙烷中,在冰水浴的条件下,缓慢滴加0.01mol三溴化硼,滴加完毕后,保持冰水浴35min,然后于室温下继续反应2.5h,反应结束后用水终止反应,向反应液中加入二氯乙烷,析出絮状物,抽滤后分液,有机相经水洗、浓缩、过柱纯化后得到所述山梨酸包被用半抗原。
实施例7
一种山梨酸免疫抗原,其合成方法包括如下步骤:
将60mg的BSA 用3.34mL pH 7.4的PBS溶解,得到PBS溶液;将10mg实施例1中的山梨酸免疫用半抗原用1mL二乙二醇乙醚溶解,然后滴加到上述PBS溶液中,搅拌反应30min,加入氰基硼氢化钠,室温搅拌2天后用pH 7.4的PBS透析3天,离心分装冻存;其中,所述氰基硼氢化钠和山梨酸免疫用半抗原的物质的量之比为5:1。
实施例8
一种山梨酸包被抗原,其合成方法包括如下步骤:称取120mg 的OVA, 加入2mL水、80uL 1N NaOH、60uL 1,4-丁二醇二缩水甘油醚, 室温反应12小时,加入40ul 1N NaOH后反应12小时;反应结束后用生理盐水透析,透析后加入2.7mL水、1mL pH9.0 0.1M 硼酸缓冲液、和25mg实施例4中的山梨酸包被用半抗原,室温反应48h,用PBS透析3天,离心分装冻存。
实施例9
山梨酸抗体,其合成方法包括如下步骤:
使用实施例7中的山梨酸免疫抗原并鉴定后免疫10只8周龄BALB/C小鼠,加强免疫三次后,采血测效价,待血清效价不再上升,用两倍剂量的抗原不加佐剂免疫小鼠,三天后脱颈致死小鼠,在无菌条件下取脾脏制备脾细胞,与生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞按8:1的比例混合于50mL离心管,加入30mL无血清IPMI1640培养基,1100r/min离心5min弃上清,将细胞团轻轻振松,置于37℃水浴中。把 1mL50%PEG-4000缓缓加入细胞中,在1min内滴完,同时轻轻搅动底部沉淀,静置1min后,前30s沿管壁缓慢匀速加入无血清培养基 1mL,后30s加入2mL,然后快速加入27mL终止融合过程,1100r/min离心5min,弃上清,用HAT选择性培养基重悬后加到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中,37℃、体积分数5%的CO2条件下培养。7天后换成HT培养液,待孔内的杂交细胞数量达到300个以上时,用间接ELISA法筛选,选择强阳性、抑制效果好、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化,经3次以上的克隆培养和检测,均呈阳性的孔内细胞即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞扩大培养以备单克隆抗体的制备;
采用体内诱生腹水法生产抗山梨酸单克隆抗体。选4只经产昆明小鼠,腹腔注射液体石蜡油 0.5mL/只,7天后腹腔注射杂交瘤细胞3-5×106/只,10天后,待小鼠腹部明显膨大时收集腹水。用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水,经紫外测定山梨酸单克隆抗体的含量。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制,但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
2.如权利要求1所述山梨酸半抗原的合成方法,其特征在于,所述步骤S1包括如下步骤:在反应器中先加入二聚醋酸铑和呋喃,再在冰浴下缓慢滴加叠氮乙酸乙酯,滴加完毕之后,室温持续搅拌反应,反应结束后,加入水,用乙酸乙酯进行萃取,收集有机相,有机相经蒸干后用无水二氯甲烷复溶,再加入碘粒,超声溶解,室温下持续搅拌反应,反应结束后加入氧化剂,将分离出的有机相蒸干、过柱纯化,得到中间体1。
3.如权利要求1所述山梨酸半抗原的合成方法,其特征在于,所述步骤S2包括如下步骤:称取中间体1,用有机溶剂溶解后,加入碱性溶液,加热回流,进行水解反应;反应结束后蒸干有机溶剂,用盐酸调节pH至微酸性,再用乙酸乙酯萃取,有机相经蒸干、过柱纯化后得到所述山梨酸半抗原。
5.如权利要求4所述的山梨酸人工抗原,其特征在于,所述山梨酸免疫抗原的合成方法包括如下步骤:将60mg的BSA用3.34mL pH7.4的PBS溶解,得到PBS溶液;将10mg权利要求1中式(I)所示结构的山梨酸半抗原用1mL二乙二醇乙醚溶解,然后滴加到上述PBS溶液中,搅拌30min,加入氰基硼氢化钠,室温搅拌2天后用pH7.4的PBS透析3天,离心分装冻存;所述山梨酸包被抗原的合成方法,包括如下步骤:称取120mg的OVA,加入2mL水、80uL 1N NaOH、60uL1,4-丁二醇二缩水甘油醚,室温反应12小时,加入40ul 1N NaOH后反应12小时;反应结束后用生理盐水透析,透析后加入2.7mL水、1mL pH9.0 0.1M硼酸缓冲液、和25mg式(II)所示结构的山梨酸半抗原,室温反应48h,用PBS透析3天,离心分装冻存。
6.一种山梨酸抗体,其特征在于,它是由权利要求5所述的山梨酸免疫抗原经动物免疫得到。
7.一种权利要求6所述的山梨酸抗体在检测山梨酸残留中的应用。
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