CN111269319B - 一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。本发明提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19‑NT，且具有优异的有机溶剂耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高，对19‑NT的检测范围为0.34ng/mL～8.32ng/mL，IC50为1.14ng/mL，最低检测限为0.16ng/mL，检测灵敏度高，且操作简单、所耗时间较短；另外，该纳米抗体Nb2F7的制备方法简单，具有普遍适用性；因此，该纳米抗体Nb2F7在检测19‑去甲睾酮、制备19‑去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。

Description

一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。
背景技术
19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-NT)简称诺龙，是睾酮甾环结构上脱去第19位碳原子而形成的内源性和外源性蛋白同化激素，其具有很强的促蛋白质合成能力，能参与生长发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长，减少脂肪贮积。因此，许多国家和地区将19-NT用作畜禽生长促进剂，以改善生产性能，提高饲料报酬。临床主要用于治疗贫血老年性骨质疏松，还能促进人体肌肉的生长发育，增加训练耐力和训练负荷，运动员服用19-NT后，能增强肌肉力量，结合适度的锻炼和饮食，可提高比赛成绩。
但研究表明，19-NT及其代谢物残留可影响人的肝脏功能，损害心血管系统，还可造成生殖器官受损、肾上腺萎缩、情绪失控及内分泌失调等毒副作用。这就要求对食源性动物生产进行严格的激素滥用监测，以保护消费者的身心健康。因此，亟需一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对19-NT的快速检测。
现有常见的检测19-NT的方法有：薄层色谱法、气相色谱法(简称GC)、高效液相色谱法(简称HPLC)、气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法以及其他定量检测方法。但这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，不适合大批量市场检测和现场监控。而免疫学检测技术灵敏度高、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法。
目前，19-NT残留分析一般使用气相色谱法、高效液相色谱法及色谱质谱联用技术，这些方法灵敏、准确，但样品前处理复杂、繁琐费时，且需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，检测成本高，难以满足样品现场、批量、快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于兽药残留现场监控的分析方法具有重要意义。而基于抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)建立的免疫分析方法，虽然具有快速、灵敏、高通量的优势，但是在极端条件下抗体往往稳定性差，容易失活，且在实际样品检测前，对样品的前处理过程需要用到有机溶剂，而有机溶剂的残留使得以单克隆抗体和多克隆抗体为主的免疫学检测的灵敏度、准确度大大降低。因此，研发一种稳定性好、准确度高、灵敏度强的快速检测19-NT的方法，具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服上述现有技术的不足，提供一种19-NT特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。
本发明的目的是提供一种特异性纳米抗体Nb2F7。
本发明另一目的是提供一种编码所述纳米抗体Nb2F7的基因。
本发明又一目的是提供一种特异性纳米抗体Nb2F7表达载体。
本发明又一目的是提供一种重组细胞。
本发明又一目的是提供所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用。
本发明又一目的是提供所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用。
本发明再一目的是提供一种检测19-去甲睾酮的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述纳米抗体Nb2F7包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种编码所述纳米抗体Nb2F7的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7表达载体，所述表达载体包括所述基因的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞转染有所述表达载体。
本发明经过创造性的探索研究，通过用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了能与19-NT特异性结合的纳米抗体Nb2F7，该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19-NT，且具有优异的有机溶剂(甲醇、乙腈)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高。因此，所述纳米抗体Nb2F7、所述基因、所述表达载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮、制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
另外，本发明还提供了一种检测19-去甲睾酮的方法，用含有式(I)所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白偶联得到的19-去甲睾酮完全抗原作为包被原，用权利要求1所述的纳米抗体Nb2F7作为检测抗体进行检测。
优选地，所述19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002389154160000031
优选地，所述载体蛋白为卵清白蛋白。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用。本发明从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了一种特异性纳米抗体Nb2F7，该纳米抗体Nb2F7能够特异性识别19-NT，且具有优异的有机溶剂(甲醇、乙腈)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高，对19-NT的检测范围为0.34ng/mL～8.32ng/mL，IC50为1.14ng/mL，最低检测限为0.16ng/mL，检测灵敏度高，且操作简单、所耗时间较短；
另外，通过基因工程重组表达的方式即可大量制备该纳米抗体Nb2F7，制备方法简单，具有普遍适用性；因此，该纳米抗体Nb2F7在检测19-去甲睾酮、制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是特异性纳米抗体Nb2F7的氨基酸编号及结构域示意图。
图2是基于特异性纳米抗体Nb2F7建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
图3是不同比例甲醇/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图。
图4是不同比例乙腈/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1骆驼免疫抗体文库的构建
(1)完全抗原19-NT-KLH和19-NT-OVA的制备
把结构式如式(I)所示的19-去甲睾酮半抗原与卵清白蛋白(OVA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)通过活泼酯方法偶联，制备获得完全抗原19-NT-KLH和19-NT-OVA。
19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002389154160000041
(2)骆驼的免疫
用健康的骆驼作为实验动物，以19-NT-KLH作为免疫原，在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与免疫原乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5mL不完全弗氏佐剂与免疫原乳化后免疫，每次免疫间隔1～2周。
免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。当出现较好的免疫应答效果时，取血100mL外周血进行淋巴细胞的分离，用于构建纳米抗体文库。
(3)骆驼淋巴细胞的分离
取骆驼全血与等体积生理盐水混合成1:1稀释血液，常温放置。在无菌的50mL离心管中加入20mL的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入20mL的稀释血液。500g，离心30min。取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，2000g，4℃离心10min，弃上清。用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次2000g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，1mL一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用。
(4)总RNA的提取
总RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。具体方法如下：
将上述裂解液每1mL加入0.2mL的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5min。室温下12000rpm离心10min。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向GBC吸附柱中加入500μL Wash Buffer I离心1min，弃废液；向GBC吸附柱中加入600μL Wash Buffer II，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1min，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μL ddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心1min。收集管内液体，于-80℃保存。
(5)cDNA的合成
以RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：
A.按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；
表1 cDNA合成的第一步反应体系
Total RNA 3μg
Oligo(dT)<sub>18</sub>primer 1μL
RNase free ddH<sub>2</sub>O Up to12μL
Total 12μL
B.上述反应体系65℃孵育5min，冰浴冷却2min；
C.按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；
表2 cDNA合成的第二步反应体系
步骤A反应后的体系 12μL
5×Reaction Buffer 4μL
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL
10mM dNTP Mix 2μL
RevertAid M-MiLVRT(200U/μL) 1μL
Total 20μL
D.42℃孵育60min，70℃孵育5min。反转录产物cDNA于-80℃保存。
(6)纳米抗体VHH目的基因的扩增
第一轮PCR：将步骤(5)得到的反转录产物cDNA作为模板，利用引物Q1/Q2进行第一轮PCR反应，引物Q1/Q2的核苷酸序列如表5所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。
表3第一轮PCR的反应体系
Figure BDA0002389154160000061
第一轮PCR的反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 1min30cycle；72℃ 10min。
第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Q3/Q4进行第二轮PCR反应，引物Q3/Q4的核苷酸序列如表5所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。
表4第二轮PCR的反应体系
Figure BDA0002389154160000062
Figure BDA0002389154160000071
第二轮PCR的反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 1min30cycle；72℃ 10min。
表5纳米抗体VHH目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列
引物Q1 5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′
引物Q2 5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′
引物Q3 5′-ACTGGCCCAGGCGGCCGAGGTGCAGCTGSWGSAKTCKG-3′
引物Q4 5′-ACTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCWGGGTC-3′
(7)文库构建
A.VHH目的基因及载体的酶切
采用Sfi I酶对VHH目的基因及pComb3xss载体进行酶切。酶切条件：50℃水浴锅反应16h。
B.酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，于16℃连接反应16h后用试剂盒清洁回收。
C.电转化
取5μL连接产物加至50μL电转感受态E.coil TG1中，轻轻混匀后转入0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，立即向电转杯加入950μL SOC培养基，37℃，250rpm培养1h，将菌液涂布于LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。
(8)文库的救援
接种超过10倍库容量的细胞于200mL LB(Amp)中37℃，250rpm培养至OD600约0.4～0.6；加入辅助噬菌体M13K07(20:1感染复数)，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm 4℃ 15min离心，取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，冰浴2～3h。12000rpm 4℃ 15min离心，弃上清，沉淀用1mL TBS重悬，转移到2mL离心管，12000rpm 4℃ 5min离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。
实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
(1)纳米抗体的亲和淘选
首先，以19-NT-OVA作为包被原，用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至终浓度12μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入1％鱼胶蛋白37℃封闭2h。甩干孔内液体并拍干，每孔加入100μL噬菌体库(滴度约为1012cfu/mL)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次，PBS(pH 7.0)洗涤15次，加入Gly-HCl(0.2M，pH 2.2)37℃洗脱10min，立即用10μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染4mL生长至对数期的E.coil TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、三、四轮的淘选过程中，用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至终浓度分别为3μg/mL，0.75μg/mL，0.1875μg/mL，加入噬菌体孵育1h，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。其余步骤同上。药物洗脱浓度分别为1200ng/mL，300ng/mL，150ng/mL。
(2)阳性噬菌体克隆的鉴定
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：
A.包板：用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次。37℃烘干30min，用密封袋装于4℃待用。
B.从第三、四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选30个克隆于加有Amp抗性的LB培养基的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃培养过夜。第二天从96孔深孔板中取出10μL菌液加入到另一块96孔深孔板，37℃，180rpm培养2h，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。第三天4000rpm离心取上清100μL，加入到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性噬菌体克隆。
(3)特异性纳米抗体的鉴定
采用间接竞争ELISA的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：
用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的19-NT标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。
结果显示：获得一株能够特异性识别19-NT的纳米抗体，命名为特异性纳米抗体Nb2F7。
实施例3特异性纳米抗体Nb2F7编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
1、实验方法
将经过间接竞争ELISA鉴定获得的特异性纳米抗体Nb2F7的菌株送到测序公司进行测序，获得特异性纳米抗体Nb2F7的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得特异性纳米抗体Nb2F7的氨基酸序列。
2、实验结果
特异性纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性纳米抗体Nb2F7的氨基酸编号及结构域示意图如图1所示，可以看出，该特异性纳米抗体Nb2F7包括4个框架区(Framework region,FR)和3个互补决定区(Complementarity-determiningregion,CDR)；框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5；互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8。
其中，第1-26位氨基酸序列为FR1，其氨基酸如SEQ ID NO.2所示；第27-38位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸如SEQ ID NO.6所示；第39-55位氨基酸序列为FR2，其氨基酸如SEQID NO.3所示；第56-65位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸如SEQ ID NO.7所示；第66-104位氨基酸序列为FR3，其氨基酸如SEQ ID NO.4所示；第105-120位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸如SEQ ID NO.8所示；第121-129位氨基酸序列为FR4，其氨基酸如SEQ ID NO.5所示。
特异性纳米抗体Nb2F7的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例4特异性纳米抗体Nb2F7的大量制备
以蛋白表达的形式进行制备特异性纳米抗体Nb2F7，具体方法为：
将所获得的特异性纳米抗体Nb2F7的菌株，用试剂盒提取其质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coil BL21(DE3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于100mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD600约为0.4-0.6时，加入IPTG(1:1000比例,v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体Nb2F7。
实施例5特异性纳米抗体Nb2F7的应用
1、包被及封闭
用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次。37℃烘干30min，用密封袋装于4℃待用。
2、标准曲线的建立
(1)实验方法
用包被液将19-NT-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗两次。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的19-NT标准品，37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以19-NT标准品浓度对横坐标，B/B0(加入19-NT的孔的OD450/未加入19-NT的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于特异性纳米抗体Nb2F7建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图2所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，检测范围为0.34ng/mL～8.32ng/mL，IC50为1.14ng/mL，最低检测限(LOD)为0.16ng/mL，检测灵敏度高。
3、特异性纳米抗体Nb2F7的有机耐受性分析
(1)实验方法
用不同浓度(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)的甲醇和乙腈作为稀释液，将特异性纳米抗体Nb2F7稀释至同一工作浓度，以测定抗体与抗原的结合能力，未加有机溶剂稀释液稀释的抗体与抗原结合能力作为100％，评价纳米抗体对不同有机溶剂、同一有机溶剂不同浓度时的耐受能力。
具体方法为：
将50μL的特异性纳米抗体Nb2F7和50μL的PBS加入到已包好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2MH2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。
(2)实验结果
不同比例甲醇/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图如图3所示，可以看出，特异性纳米抗体Nb2F7在60％的甲醇下仍具有100％的活性，在80％的甲醇下仍具有64％的活性。不同比例乙腈/PBS作为稀释液时特异性纳米抗体Nb2F7的活性曲线图如图4所示，可以看出，特异性纳米抗体Nb2F7在60％的乙腈下仍具有99％的活性，在80％的乙腈下仍具有37％的活性。
以上结果说明：特异性纳米抗体Nb2F7具有优异的有机溶剂(甲醇、乙腈)耐受性，不会受到在实际样品检测前处理过程中加入的有机溶剂的影响，检测结果准确度高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种特异性纳米抗体Nb2F7及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Ser Gly Arg Asn Tyr
20 25 30
Arg Ser Gly Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Glu Val Ala Leu Phe Tyr Ala Gly Ser Glu Ile Ile Tyr Tyr Gly
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ser Gln Asp Asn Asn Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asp Ile Arg Thr Ser Val Cys Arg Ser Leu Arg Ala
100 105 110
Asp Gln Phe Tyr Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
20 25
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala Leu Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ser Gln Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
20 25 30
Cys Ala Ala Asp Ile Arg Thr
35
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Ser Gly Arg Asn Tyr Arg Ser Gly Cys Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Gly Ser Glu Ile Ile Tyr Tyr Gly Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Val Cys Arg Ser Leu Arg Ala Asp Gln Phe Tyr Leu Trp Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcagcagt ctgggggagg ctcggtgcag gctggaggct ctctgagact ctcctgtaca 60
gcctctggag tctctgggcg caactacagg agcggttgca tgggctggtt tcgccagact 120
ccagggaagg agcgcgagga ggtcgcactt ttttatgctg ggagtgagat catatattat 180
ggcgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acaacaagaa cacgctctat 240
ctgcagatga acaacctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgc ggcagacatt 300
cgtactagcg tctgccgctc acttagagcc gatcaatttt atttatgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378

Claims (8)

1.一种特异性纳米抗体Nb2F7，其特征在于，所述纳米抗体Nb2F7的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体Nb2F7，其特征在于，所述纳米抗体Nb2F7包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；其中，所述FR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
3.一种编码权利要求1所述纳米抗体Nb2F7的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种特异性纳米抗体Nb2F7表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求3所述基因的核苷酸序列。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞转染有权利要求4所述表达载体。
6.权利要求1所述纳米抗体Nb2F7、权利要求3所述基因、权利要求4所述表达载体或权利要求5所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用。
7.权利要求1所述纳米抗体Nb2F7、权利要求3所述基因、权利要求4所述表达载体或权利要求5所述重组细胞在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用。
8.一种检测19-去甲睾酮的方法，其特征在于，用含有19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白偶联得到的19-去甲睾酮完全抗原做包被原，用权利要求1所述的纳米抗体Nb2F7作为检测抗体进行检测；所述19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003249601350000011
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