CN117384295A - 小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于禽类免疫学技术领域，提供一种小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用。本发明通过免疫小鼠进行融合筛选后，获得两株特异性、稳定性好的单克隆抗体，并建立了基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术，可以检测鹅IgY含量。该方法借助了酶显色放大体系，其特异性好，灵敏度较高，可以检测鹅IgY含量较低的样本。

Description

小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于禽类免疫学技术领域，具体地说，涉及小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用。

背景技术

鹅是一种食草性动物，也是我国特色的朝阳产业，随着人们生活水平的不断提高，膳食结构也发生了显著的变化，人们对禽肉、特别是生态饲养的禽肉需求在稳步提升，近年来肉鹅产业得到了快速发展。鹅肉含有人体生长发育所必需的各种氨基酸，其组成接近人体所需氨基酸的比例，鹅肉是全价及优质蛋白质，鹅肉中的脂肪含量较低，品质较好，不饱和脂肪酸的含量高，特别是亚麻酸含量均超过其他肉类，对人体健康非常有利。鹅肉脂肪的熔点亦很低，质地柔软，容易被人体消化吸收。

IgY检测方法有很多种，常见的包括单项免疫扩散法、免疫比浊法等，但这些方法检测方法耗时时间长、准确度及重复性都比较差。化学发光法灵敏度比酶联免疫吸附测定法（ELISA）高，但需要检测的仪器设备比酶联免疫吸附测定法用的酶标仪贵，目前尚未大量推广使用，针对以上方法的缺陷，由于ELISA双抗体夹心法的灵敏度高、重复性好得到广泛应用。

目前市面上可见的ELISA试剂盒大多是针对人、大鼠、小鼠的IgG开发的ELISA试剂盒，但小种属的猪、牛、马、羊、兔、鸡等动物的IgG ELISA试剂盒开发较少，鹅IgY ELISA试剂盒更是稀少。目前国内市场上销售的一些鹅IgY检测试剂盒，由于鱼龙混杂，其检测灵敏度及结果准确性难以保证。

发明内容

本发明的目的是提供小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用。

本发明利用鼠单克隆抗体技术，对Balb/c小鼠免疫后进行融合筛选，得到两株特异性、稳定性良好的单克隆抗体，并进行了抗体配对，开发了双抗体夹心法ELISA试剂盒，其特点为特异性好，灵敏度高，操作简单。可应用于鹅IgY含量检测，弥补了原有其他方法的各种缺陷。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种小鼠抗鹅IgY单克隆抗体（2F2），所述抗体的重链3个CDR区分别为：SYGMS、TINSVGTYTHYVDSVKG和HADYVGFAY（SEQ ID NO:18-20），轻链3个CDR区分别为：KASQDVISAVA、SASYRYT和QQHYNTPYT（SEQ ID NO:15-17）。

进一步地，所述抗体的轻链可变区为：SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽；

所述抗体的重链可变区为：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

第二方面，本发明提供编码所述抗体的核酸分子。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供所述抗体在鹅IgY检测中的应用（含非疾病诊断目的）。

第五方面，本发明提供由所述抗体制备的鹅IgY检测试剂或试剂盒。

第六方面，本发明提供一种鹅IgY酶联免疫检测试剂盒，包括：所述抗体以及标记的小鼠抗鹅IgY单抗（2H6），所述试剂盒进一步包括底物显色液、封闭液或终止液等中的至少一种。

其中，所述小鼠抗鹅IgY单抗（2H6）的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQID NO:3、4所示。抗体2H6的重链3个CDR区分别为：DYYMK、DIIPNTGDTFFNRKFKD和SIVTAYRDY（SEQ ID NO:12-14），轻链3个CDR区分别为：KASRDIDQYLA、YTSTLQP和LQYDSLYT（SEQ ID NO:9-11）。

进一步地，所述抗体固定于固相载体上，所述固相载体可选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜等，优选酶标板。

进一步地，所述标记可以是酶标记、生物素标记或荧光素标记等，优选酶标记。

所述酶标记的酶可选自如下任一种：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等，优选辣根过氧化酶。

常用底物包括：邻苯二胺(O-phenylenediamine，OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]等，优选TMB。

进一步地，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液（1×PBST），成分如下：Na₂HPO₄8 mM、NaCl0.136M、KH₂PO₄2 mM、KCL 2.6 mM、Tween-20 0.05%v/v。

进一步地，用于包被酶标板的抗体浓度为1-10μg/mL。

进一步地，辣根过氧化酶标记的小鼠抗鹅IgY单抗浓度为0.5~20mg/mL。

进一步地，所述终止液为1.5-2.5M（优选2M）的硫酸溶液。

第七方面，本发明提供一种组合物，包括所述抗体（2H6）和所述小鼠抗鹅IgY单抗（2F2）。

第八方面，本发明提供由所述组合物制备的鹅IgY酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

第九方面，本发明提供所述抗体、或所述试剂盒或所述组合物在鹅IgY酶联免疫检测（包括定性和定量检测）中的应用（含非疾病诊断目的）。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明利用两种特异性强的单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA法，在鹅类肉质产品及血清、血浆及鹅类其他生物样本检测中，该方法灵敏度高，特异性强，准确度高，实验操作简单及时间短等优势。利用所述单克隆抗体构建的鹅IgY酶联免疫检测试剂盒的检测范围为0-40ng/ml，灵敏度为87pg/ml。

（二）对试剂盒进行37℃加速稳定性实验，13天内试剂盒没有显著变化，稳定性高。

（三）对试剂盒进行类似蛋白交叉实验，试剂盒表现出良好的特异性，不识别鸭IgY、鸡IgY、兔IgG、牛IgG、山羊IgG、猪IgG、人IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、鸭IgA、鹅IgA、鸭IgM、鹅IgM。

（四）该试剂盒可以方便准确地检测鹅肉中的IgY含量，反应时间/检测时间3h，仅需在室温静置即可反应，不需要恒温培养箱或震荡孵育器，不与鸭、鸡、猪、羊、牛等其他经济动物的肉品有交叉反应。与国外同品种抗体对相比测定准确度更高，可以代替国外该进口试剂盒。

附图说明

图1为本发明较佳实施例1中用SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定的结果。其中M:Marker；2:小鼠抗鹅IgY单克隆抗体2F2；3:小鼠抗鹅IgY单克隆抗体2H6。

图2为本发明较佳实施例2中双抗夹心ELISA方法的建立的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 抗鹅IgY单克隆抗体的制备

1.动物免疫

选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用纯化的鹅IgY与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。

2.细胞融合

采用断颈处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：

骨髓瘤（SP2/0）细胞活化：

解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液(RPMI-1640，添加小牛血清)中，置于37℃、5%CO₂条件下培养箱培养；3-5d后进行传代；收集细胞并悬浮于1640基础培养基中，计数后取0.5×10⁶~1×10⁶个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础培养基充分研磨后补加10 mL 1640基础培养基，静置2 min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL1640基础培养基，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mL 1640基础培养基中。于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 r/min离心15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640基础培养基清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640基础培养基中，计数后备用。

免疫脾细胞的制备：

取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。

饲养细胞的制备：

取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL 1640基础培养基，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%CO₂培养箱中待用。

融合：

将1×10⁷-2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min离心8 min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50% PEG 0.8 mL (sigma)，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液10ml。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250ul/孔，于37℃，5%CO₂培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。

3.杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。具体操作如下：

用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：

包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10μg/ml；向微孔中每孔加100μl，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃孵育1h；甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体）；洗涤3次，每次2～3分钟。

封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加200μl封闭液（5%的脱脂奶粉或0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样:将待测的杂交瘤每孔取50μl上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀。37℃孵育1h，洗涤，拍干。

加酶标抗抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μl，轻轻摇匀，置37℃ 1h；然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100μl，轻轻摇匀，37℃ 10min。终止反应：每孔加终止液（2M硫酸溶液）50μl。

判定结果：酶标仪OD₄₅₀下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。

杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)

克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到1个细胞/毫升；将细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μl/孔，使相应的每孔含1个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；

特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。

4.单克隆抗体2H6与2F2可变区序列测定

收集杂交瘤细胞数量大于10⁶：采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；按照索莱宝反转录试剂盒合成cDNA第一条链；送至擎科生物进行后续构建及测序，得到基因测序结果。

单克隆抗体2H6的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示，编码基因序列分别如SEQ ID NO:1、2所示。

单克隆抗体2F2的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8所示，编码基因序列分别如SEQ ID NO:5、6所示。

5.单克隆抗体2H6与2F2的大量制备

建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水。将收集的腹水进行低温离心：4000rpm，4^oC离心20分钟，收集上清。腹水上清用一次性0.45µm滤器过滤，经处理的腹水加入等体积平衡缓冲液稀释，0.5ml蛋白G装入层析柱，恢复至室温，开启蠕动泵，记录仪和检测器，层析柱用平衡缓冲液平衡，随后上样，收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，更换洗脱缓冲液，用含适量中和缓冲液的收集管收集洗脱峰。纯化抗体用过量0.1M PBS，pH7.4透析。透析的抗体进行超滤浓缩，浓度>1mg/ml。浓缩后抗体经10000rpm，4^oC离心10分钟去除沉淀。用一次性0.22µm滤器过滤除菌，紫外-可见分光光度计测定浓缩后抗体浓度。用SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定，结果见图1。

实施例2 双抗夹心ELISA检测方法的建立

1.相对亲和常数测定

用包被缓冲液将鹅IgY稀释至2μg/ml；向微孔中每孔加100μl，4℃冰箱过夜进行包被；甩掉孔内液体向微孔中每孔加200μl封闭液，轻轻摇匀，室温孵育2h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置1~2min，甩掉孔内液体，拍干；用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样:将待测的单克隆抗体稀释至饱和浓度，每孔取100μl加入酶标孔中，室温孵育2h。洗涤液洗板后依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、0mol/L的硫氰酸钠溶液60μl/孔，室温静置15min，洗涤缓冲液洗板3次。加HRP标记羊抗小鼠IgG，孵育后洗涤，拍干。加TMB显色液100μl/孔，室温显色10min。每孔加终止液50μl。用酶标仪450nm波长下测量OD值。结果判定：经洗脱后OD_450nm下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/l表示。表1结果表明所有单克隆抗体亲和力均较高（＞1.5mol/L）。

表1

2.单克隆抗体2F2的HRP标记

将单克隆抗体2F2加入到透析袋中，4℃浸入0.01M的CB缓冲液中过夜透析。取10mgHRP，溶于2ml水中。配制新鲜的NaIO₄溶液，0.1M，加入0.4ml 0.1M NaIO₄于2ml HRP溶液中，混匀，室温避光45min，浸入10mM的NaAc缓冲液中4℃过夜透析。取出过夜透析的抗体和HRP溶液加0.1ml，0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，调节pH。然后立即在HRP溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。称取0.04g NaBH₄溶于10ml水中，取0.4ml加入反应液中，混匀，置于4℃反应2小时。取出放于透析袋中，于0.01M PBS中透析，2小时后换一次液，4℃过夜透析。取出过夜透析的标记液，加入等体积甘油，放于-20℃保存。

3.单克隆抗体2H6酶标板的制备

使用96孔平底聚苯乙烯酶标板作为固相载体将Protein G亲和层析纯化的单克隆抗体2H6用抗体包被液稀释至2 μg/mL将稀释后的抗体加到酶标板的微孔中，100 μL/孔，用封板膜封板后置于4℃包被过夜将包被好的酶标板取出，弃去孔中液体，用ELISA洗涤液洗板3次后，加入封闭液，250 μL/孔，用封板膜封板后置于室温封闭2h弃去板孔中的液体，置于干房中烘干16~18h。放入含有干燥剂的铝箔袋中，真空密封，4℃保存。

4.双抗夹心ELISA方法的建立

实验前30 min，取出单克隆抗体2H6包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的鹅IgY标准品，稀释浓度为40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-2F2工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标（ng/ml），吸光度OD值为纵坐标（450 nm-630 nm），用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合）。结果表明，其检测范围为0.625-40ng/ml，R²为0.99998（图2）。

5.双抗夹心ELISA灵敏度检测

检测20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度，灵敏度为87 pg/ml（表2）。

表2

6.双抗夹心ELISA特异性检测

实验前30 min，取出单克隆抗体2H6包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释倍数的鹅IgY标准品或鹅IgY结构类似蛋白，包括鸭IgY、鸡IgY、兔IgG、牛IgG、山羊IgG、猪IgG、人IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、鸭IgA、鹅IgA、鸭IgM、鹅IgM。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-2F2工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值，并用450nm的OD测定值减去630nm的OD测定值。建立标准曲线，计算结果。结果显示，该抗体对不与其他类似蛋白反应（表3）。

表3

7.双抗夹心ELISA稳定性检测

a.通过37℃加速实验进行稳定性考察

将单克隆抗体2H6包被好的酶标板、HRP标记的单克隆抗体2F2、鹅IgY标准品放于37℃进行加速稳定性实验，放置13天（等同于4℃约19.5个月）。随后取出检测，检测方法为，取出酶标板洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的标准品，浓度为40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-2F2工作液至反应孔中，封板后于室温孵育45min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，在第10天，标准曲线的高点（40ng/ml处）OD值依然大于2.0，并且标曲OD值梯度良好，表明试剂盒稳定性良好（表4）。

表4

b.将试剂盒组份置于4℃/-20℃储存条件进行稳定性考核：

将单克隆抗体2H6包被好的酶标板及鹅IgY标准品放入4℃、HRP标记的单克隆抗体2F2放入-20℃，放置时间为25个月。随后取出检测，检测方法为取出酶标板洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的标准品，浓度为40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml并设空白对照。用封板膜封住反应孔，置室温孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-2F2工作液至反应孔中，用封板膜封住反应孔于室温孵育45min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，用封板膜封住反应孔于室温避光显色15 min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果显示，放置25个月标准曲线的高点（40ng/ml处）OD值依然大于2.0，并且标曲OD值梯度良好，表明试剂盒组份稳定性良好，货架效期可达两年（表4）。

实施例3 鹅血清中IgY含量测定以及检测鸡和鸭血清的交叉反应

实验前30 min，取出单克隆抗体2H6包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择鸡、鸭、鹅血清各4份，做不同稀释倍数的血清样本及标准品，每孔加入100μl。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加HRP-2F2工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。根据文献报道正常鸡血清中IgY含量范围为（5.29±1.35）mg/ml（根据年龄、个体不同含量不同），鹅的血清IgY含量与鸡相差不大。测定结果显示本试剂盒测定含量与报道一致，检测结果表明该方法能准确测定鹅血清IgY的含量。并且与鸡血清没有交叉反应；由于鸭与鹅的同源性较高，所以有交叉反应，但是本抗体对测得的交叉反应率很低（＜1%）（表5）。原鸡血清IgY和鸭血清IgY含量的数据来源于北京索莱宝科技有限公司生产的ELISA试剂盒（货号：SEKCN-0126，SEKD-0119）。

表5

实施例4 与国外某品牌抗体对测样本比较

选择国外A品牌(美国GENORISE公司)抗体对进行类比测试，按照各品牌最适的方式进行实验（完全按照其说明书进行操作）。通过测定样本含量，进行结果比对：随机选择34份鹅血清样本同时进行测定，正常鹅血清中IgY含量范围与鸡血清IgY（5.29±1.35）mg/ml含量相似。测定结果显示本试剂盒测定含量与文献资料一致，A品牌测出的含量偏低（表6）。

表6

实施例5 各肉品中鹅IgY含量测定

实验前30min，取出单克隆抗体2H6包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将不同稀释倍数的血清样本及不同处理的提取的肉类总蛋白，每孔加入100μl。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加HRP-2F2工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45min，洗板4次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15min，加入50μl终止液使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。从结果可以看出试剂盒可以特异性识别高度稀释的（500倍稀释）鹅组织中的IgY，而与其他物种的蛋白没有反应（表7）。

表7

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.小鼠抗鹅IgY单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链3个CDR区分别为：SYGMS、TINSVGTYTHYVDSVKG和HADYVGFAY，轻链3个CDR区分别为：KASQDVISAVA、SASYRYT和QQHYNTPYT。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区为：SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽；

所述抗体的重链可变区为：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

3.编码权利要求1或2所述抗体的核酸分子。

4.含有权利要求3所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

5.由权利要求1或2所述抗体制备的鹅IgY检测试剂或试剂盒。

6.鹅IgY酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述抗体以及标记的小鼠抗鹅IgY单抗；

其中，所述小鼠抗鹅IgY单抗的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括底物显色液、封闭液或终止液中的至少一种。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1或2所述抗体固定于固相载体上，所述固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；

所述标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；

所述酶标记的酶选自如下任一种：辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。

9.权利要求1或2所述抗体、或权利要求5-8任一项所述试剂盒在鹅IgY酶联免疫检测中的应用；

所述应用包括定性和定量检测，且所述应用为非疾病诊断目的。

10.鹅IgY双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，以权利要求1或2所述抗体作为第一抗体，小鼠抗鹅IgY单抗作为第二抗体；或者，

以小鼠抗鹅IgY单抗作为第一抗体，权利要求1或2所述抗体作为第二抗体；

其中，所述小鼠抗鹅IgY单抗的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。