CN112961073B - 一种泰妙菌素半抗原tmlh、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种泰妙菌素半抗原tmlh、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种泰妙菌素半抗原TMLH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种泰妙菌素半抗原TMLH，进一步利用该泰妙菌素半抗原与载体蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，制备得到泰妙菌素单克隆抗体。本发明制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对泰妙菌素的最低检测限为0.16ng/mL，IC50为1.75ng/mL，线性范围为0.47～6.52ng/mL；具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在泰妙菌素的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种泰妙菌素半抗原TMLH、人工抗原、抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域。更具体地，涉及一种泰妙菌素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
泰妙菌素(Tiamulin，TML)别名泰妙灵、支原净、泰牧菌素，是一种新型的半合成的双萜烯类动物专用抗生素，是一种常用的兽药添加剂，用于治疗鸡的慢性呼吸道感染以及在猪体内由支原体引起的肺炎和猪螺旋体引起的疟疾等疾病。其对细菌、霉形体及螺旋体，如猪滑液霉形体、猪肺炎霉形体、鸡败血霉形体、放线杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、猪痢疾密螺旋体及结肠菌毛样螺旋体等都有良好的抗菌活性。对支原体有极强活性，是治疗动物支原体疾病的首选药物。泰妙菌素是第一个上市的截短侧耳素类抗生素，是一种较新型抗生素。1951年澳大利亚首次提出了泰妙菌素，20世纪60年代开始对其广泛研究。泰妙菌素在动物体内吸收迅速，血药浓度高，体内分布广泛，且残留量低，对支原体引起的畜禽疾病有良好疗效，还有促生长作用，因而作为兽药抗生素和饲料添加剂被广泛使用。目前泰妙菌素为主要成分的兽药制剂主要用于的动物有猪、马和鸡，用于治疗动物支原体疾病。目前世界多国规定了食源性动物中TML的最大残留限量，泰妙菌素的不当使用及残留会危害到人类的健康，因此加强对动物产品中泰妙菌素的检测监控十分重要。
目前在动物源性食品中TML的检测分析方法多种多样，常用的以色谱检测为主，比如GC、HPLC、UPLC-MS/MS和LC-MS/MS等。除此之外，免疫学检测方法如ELISA和免疫层析试纸技术等在近些年也迅速发展起来。色谱检测其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。公开号为CN108330102的专利公开了一株泰妙菌素单克隆抗体杂交瘤细胞株，此细胞株分泌的单克隆抗体对泰妙菌素的检测IC50值仅为0.73ng/mL，并不能满足对泰妙菌素灵敏、准确的检测。因此，提供一种抗原结构稳定，制备出对高特异性抗体，能够快速、灵敏、准确的检测泰妙菌素的方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有泰妙菌素检测方法的缺陷和不足，提供一种泰妙菌素半抗原TMLH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明制备出的泰妙菌素半抗原TMLH的合成方法利用8α-羟基妙林的羰基与肼进行脱水缩合反应，再用丁二酸酐对肼基的-NH2进行酰化反应生成，使其末端具有活性基团-羧基。
本发明的第一个目的是提供一种泰妙菌素半抗原TMLH。
本发明的第二个目的是提供所述泰妙菌素半抗原TMLH的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述泰妙菌素半抗原TMLH在制备泰妙菌素人工抗原中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种泰妙菌素人工抗原。
本发明的第五个目的是提供所述泰妙菌素人工抗原在制备泰妙菌素抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种泰妙菌素抗体。
本发明的第七个目的是提供一种酶联免疫检测泰妙菌素的免疫原与包被原的组合物。
本发明的第八个目的是提供所述泰妙菌素半抗原TMLH、泰妙菌素人工抗原或所述免疫原与包被原的组合物在检测泰妙菌素或制备泰妙菌素检测试剂盒中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种泰妙菌素半抗原TMLH，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002941290460000021
所述泰妙菌素半抗原TMLH与泰妙菌素分子骨架结构重叠度高，有利产生针泰妙菌素骨架特征结构特异性免疫诱导，实现泰乐菌素特异性识别。
本发明还提供了所述泰妙菌素半抗原TMLH的制备方法，是将8α-羟基妙林的羰基与肼进行脱水缩合反应，生成中间体1，再用丁二酸酐对中间体1上的-NH2进行酰化反应得到。
所述泰妙菌素半抗原TMLH的制备过程，其反应式如下所示：
Figure BDA0002941290460000031
优选地，所述泰妙菌素半抗原的制备方法具体包括如下步骤：
将8α-羟基妙林溶解于甲醇中，加入水合肼，室温下反应2h，然后加入丁二酸酐，继续反应，去除有机溶剂后，将所得固体经硅胶柱层析分离纯化后，即获得泰妙菌素半抗原TMLH。
优选地，8α-羟基妙林和水合肼的摩尔比为1：1～1.5；8α-羟基妙林和丁二酸酐的摩尔比为1：1～1.5。
更优选地，8α-羟基妙林和水合肼的摩尔比为1：1；8α-羟基妙林和丁二酸酐的摩尔比为1：1。
本发明还提供了一种泰妙菌素人工抗原，其结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002941290460000032
优选地，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白或刀豆球蛋白。
所述泰妙菌素半抗原TMLH与载体蛋白偶联时，泰妙菌素半抗原TMLH的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的抗体奠定了基础。
所述泰妙菌素人工抗原的制备方法为采用活泼酯法将所述半抗原TMLH与载体蛋白偶联制备得到，具体步骤如下：
S1.将泰妙菌素半抗原TMLH溶于DMF中，然后加入NHS和EDC，在4℃下反应；
S2.将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中；
S3.将步骤S1的溶液逐滴加入到步骤S2的溶液中，于4℃下反应8h，将反应液于4℃下透析3天，每天换2次透析液，即制得泰妙菌素人工抗原。
优选地，步骤S1所述泰妙菌素半抗原TMLH、NHS和EDC的摩尔比为1：1～2：1～2。
更优选地，步骤S1所述泰妙菌素半抗原TMLH、NHS和EDC的摩尔比为1：1.5：1.5。
优选地，载体蛋白与泰妙菌素半抗原TMLH的摩尔比为1：60。
本发明要求保护所述泰妙菌素人工抗原在制备泰妙菌素抗体中的应用。
优选地，所述泰妙菌素抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。
本发明还要求保护一种泰妙菌素抗体，是以所述泰妙菌素人工抗原为免疫原制备得到。
优选地，所述泰妙菌素抗体为单克隆抗体。
优选地，所述免疫原为半抗原TMLH与血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、乳铁蛋白LF、刀豆球蛋白ConA或鸡卵清白蛋白OVA其中一种偶联得到的人工抗原。
优选地，所述泰妙菌素单克隆抗体的制备方法如下：
将上述泰妙菌素抗原TMLH-OVA、TMLH-KLH、TMLH-BSA、TMLH-LF、或TTMLH-ConA作为免疫原免疫小鼠，用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性的抗泰妙菌素单克隆抗体。
本发明要求保护一种酶联免疫检测泰妙菌素的免疫原与包被原的组合物，所述免疫原为所述泰妙菌素半抗原TMLH与乳铁蛋白的偶联物，所述包被原为所述泰妙菌素半抗原TMLH与鸡卵清白蛋白的偶联物。
所述泰妙菌素半抗原TMLH、所述泰妙菌素人工抗原或所述免疫原与包被原的组合物在检测泰妙菌素或制备泰妙菌素检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种泰妙菌素半抗原TMLH，该泰妙菌素半抗原TMLH与待测物泰妙菌素的骨架结构重叠度高，有效地提高了泰妙菌素半抗原TMLH的免疫原性；进一步利用该泰妙菌素半抗原TMLH与载体蛋白KLH、BSA、LF、ConA偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合得到杂交瘤细胞，通过体内接种杂交瘤细胞制备腹水，纯化后制备得到泰妙菌素单克隆抗体。本发明制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对泰妙菌素的最低检测限为0.16ng/mL，IC50为1.75ng/mL，线性范围为0.47～6.52ng/mL；具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在泰妙菌素的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1是基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1泰妙菌素半抗原TMLH的制备
一、实验方法
称取4.05mmol的8α-羟基妙林溶于5～10mL甲醇中，在搅拌下加入4.05mmol的水合肼，室温搅拌2小时后，加入4.05mmol的丁二酸酐，室温搅拌反应过夜，蒸除有机溶剂后的残余固体物，经200～300目硅胶柱层析分离(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，点板收集产物点组分，旋蒸除掉有机试剂后得到产物，即泰妙菌素半抗原TMLH。反应式如下所示：
Figure BDA0002941290460000051
二、实验结果
泰妙菌素半抗原TMLH的质谱与NMR数据如下：ESI-MS(m/z):435.30[M+H]+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.79–5.69(m,1H),5.11(dd,J＝16.9,2.4Hz,1H),5.04(dd,J＝9.9,2.4Hz,1H),3.61(tq,J＝7.0,1.5Hz,1H),3.50(dh,J＝6.4,1.6Hz,1H),2.60(td,J＝7.1,1.1Hz,2H),2.55–2.48(m,3H),2.38(td,J＝7.1,2.2Hz,2H),1.91(p,J＝7.0Hz,1H),1.79–1.54(m,6H),1.51–1.41(m,1H),1.35(dq,J＝12.3,7.1Hz,1H),1.06–0.97(m,10H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ177.91,174.13,170.84,141.91,114.38,79.18,73.53,56.69,47.67,46.78,41.78,39.65,39.14,36.33,33.68,32.29,30.14,29.76,28.56,27.56,21.40,16.99,16.54,13.46.由质谱可以看出，435.30为半抗原TMLH的正离子分子峰，与实际的相对分子质量相符；另外，所有核磁波谱峰的位移与分裂均能与目标结构一一归属，说明成功制备得到了泰妙菌素半抗原TMLH。泰妙菌素半抗原TMLH半抗原的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002941290460000061
实施例2泰妙菌素人工抗原的制备
将实施例1制备得到的泰妙菌素半抗原TMLH，通过活泼酯法偶联鸡卵清白蛋白OVA(albumin)、血蓝蛋白KLH(keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白BSA(Bovinealbumin)、乳铁蛋白LF(lactoferrin)和刀豆球蛋白ConA(concanavalin A)。具体步骤如下：
将泰妙菌素半抗原TMLH溶于DMF中，添加1.5倍(摩尔比)NHS和EDC(摩尔比TMLH：NHS：EDC＝1：1.5：1.5)于溶液中在4℃反应过夜，记为A液；将A液逐滴加入到载体蛋白的PBS缓冲溶液中，于4℃下继续反应8h；将反应液于4℃下透析3天，每天换两次透析液，共透析6次，收集透析袋中的溶液，即得泰妙菌素人工抗原(泰妙菌素完全抗原TMLH-OVA、TMLH-KLH、TMLH-BSA、TMLH-LF、TMLH-ConA)。其泰妙菌素人工抗原的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002941290460000071
其中，载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白、刀豆球蛋白或鸡卵清白蛋白。
实施例3泰妙菌素人工抗原免疫及抗血清效果评价
一、实验方法
1、动物免疫
用健康的6周龄的Balb/c雌鼠作为实验动物，以完全抗原TMLH-KLH、TMLH-BSA、TMLH-LF、TMLH-ConA作为免疫原，在小鼠颈背部和腹腔进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每每隔2周免疫一次，期间尾巴静脉取少量血进行抗体质量鉴定，待抗体稳定后，选择性能最佳的老鼠进行细胞融合，细胞融合前3天，直接注射0.5mg免疫原小鼠腹腔内追加免疫一次。
2、抗血清效果评价
以实施例2制备得到的泰妙菌素完全抗原TMLH-OVA作为包被原，取上述采集的的小鼠血清为检测抗体，采用间接竞争ELISA法测定小鼠血清的抗血清效价与抑制率，综合考虑各抗血清的效价、抑制率，对其进行评价。具体操作步骤如下：
(1)包板：将泰妙菌素完全抗原TMLH-OVA用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6)稀释至1000ng/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。
(2)血清效价与抑制检测：将步骤(1)包好的酶标板，效价列：每孔分别加入50μLPBS和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K)的血清；抑制列：每孔加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(泰妙菌素)和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K)的血清，做2组平行。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1：5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。
二、实验结果
免疫Balb/c雌鼠所获得的抗血清均产生免疫应答反应，但TMLH-KLH、TMLH-BSA、TMLH-ConA的效价均未超过8k，效果较差，不适合用于进一步制备抗体，而TMLH-LF的5个平行动物免疫均具有良好的免疫应答效果，其中2号小鼠抗血清效价和抑制率最佳(表1)，说明抗原TMLH-LF免疫应答有效性良好，可被用于后续泰妙菌素单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体等抗体的制备以及免疫检测方法的建立。
表1抗血清的效价与抑制率
Figure BDA0002941290460000081
实施例4泰妙菌素单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和纳米抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
细胞融合和阳性杂交瘤的筛选：取实施例3中免疫后产生特异性抗体的2号Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，筛选出能稳定分泌均一抗体单个细胞，扩大培养，具体步骤如下：
(1)复苏骨髓瘤细胞:将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻，融化后l000r/min离心7min，在超净工作台中倒掉上清液，并在细胞沉淀中加入完全培养液约lmL，吹散细胞，用移液枪取出和完全培养基混均后放入9cm培养皿中，并扩大至5～6皿，其间需换液1～2次，当每个培养皿的细胞铺满底部时，可用于细胞融合。
(2)饲养细胞制备：在细胞融合前1天对昆明鼠进行摘眼球处死，经75％酒精浸泡5min后移入超净工作台进行解剖。剪开腹部，剥离腹部皮肤，暴露腹肌，然后用小镊子挑起腹膜，在小鼠腹膜上开一个小口，注入3mL HAT完全培养基，用移液枪反复抽吸冲洗，并用移液枪将包含饲养层细胞的培养液取出，重复操作2～3次，以保证得到足够的饲养层细胞。
(3)脾细胞制备：将免疫的2号Balb/c小鼠眼眶放血，收集血清，后在75％酒精浸泡5min消毒，移入超净工作台进行解剖。无菌取出脾脏，用PPMI-1640基础培养基冲洗后于培养皿中待用。用一次性注射器吸取培养基，左手用镊子夹住取下的脾脏，右于将注射器插入脾脏，缓慢注入培养基，以将脾脏里的细胞洗出。反复进行且至脾脏由深红色转为无色透明状，弃脾脏。将混合的培养基收集到，50mL离心管中，封口后离心，转速l000r/min共8min。离心后弃去上淸液，待用。
(4)细胞融合：将离心去上清液的骨髄瘤细胞和免疫脾细胞按1：5左右混合于离心管内，加入25mL的基础培养基，封口后离心，转速1000r/min共8min。离心后弃上清待用。将经离心混合的骨髄瘤细胞和免疫脾细胞弃上清，离心管口朝下用枪吸掉的多余的培养基。将沉淀的细胞用手指弹松，把离心管置于37℃温水中，用枪头吸取预热至37℃的PEG0.8mL，在1min内将PEG缓慢加入到沉淀的细胞中，每加一滴PEG就用枪头轻柔搅拌一下以混均，静置于1min，预热好完全培养基，在2min内加入10mL，伴随轻轻搅拌，沿壁加入，使PEG分开。离心管封口1000r/min离心10min，例掉上清，加入HAT培养基，用弯头吸管轻轻吸液放液，轻柔搅拌，取出离心管中的HAT培养基和大约75mL左右HAT新鲜培养基混合，均匀加入到前一天准备的10块含有饲养细胞的96孔培养板中。保持每孔中添加饲养细胞的HAT培养基和含有融合细胞的HAT培养基体积相同，每板共使用HAT培养基大约24mL左右。
(5)阳性杂交瘤的筛选：融合后7～10天内使用HAT培养基，再使用HT培养基换液，14天后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时(一般细胞融合12天左右即可)，抽取多孔培养板中里的上清，用间接ELISA检测培养液中的特异性抗体，选择效价高和对药物抑制强的阳性杂交瘤细胞，筛选出融合效果最好的阳性孔，做好标记。无菌条件下，用显微镜挑取阳性孔中团簇生长的细胞，移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，icELISA检测,同样以效价和抑制率做为衡量指标，取呈阳性强者利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3～4轮(注意每轮挑出的阳性孔细胞需扩大培养，后冻存备用)，直至每板每个孔都为阳性且经检测效价和抑制相近，至此杂交瘤细胞系建立成功，得到能稳定分泌均一抗体的杂交瘤细胞系。挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或细胞培养皿中扩大培养，及时冻存。
(6)单克隆抗体的大量制备：在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克降后，通常以体外培养法和动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单克隆抗体。常规的做法是：提前在十多只8周龄以上的Balb/c小鼠的腹腔内注射液体石碏，剂量为0.5mL/只，1～2两周后在小鼠的腹腔注射杂交瘤细胞。接种细胞后每天观察小鼠状态，特别是从第七天开始，小鼠的腹腔会胀大，在小鼠死亡前用一次性注射器无菌采取腹水，将采集的腹水12000r/min离心10min,去除上层脂肪和下层纤维蛋白，收集中间层，用icELlSA法测定其效价和抑制率，纯化后在-20℃保存备用。
2、多克隆抗体的制备
将实施例2制备的免疫原TMLH-LF与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫体重为2.5～3kg的新西兰大白兔，每种免疫原对应注射两只。第一次免疫间隔四周后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫一周后耳缘静脉取血，并利用间接ELISA测定血清效价，当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃、12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存使用。
3、单链抗体的制备
提取TML单克隆细胞或经TML免疫原免疫后的小鼠脾脏细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，插入表达质粒TCI菌株，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化得到基因工程抗体，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。
(4)纳米抗体的制备
动物免疫：将实例3制备的四种免疫原分别与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，对骆驼进行间隔免疫，间隔免疫分析检测并得到骆驼的外周血用于后续构建纳米抗体文库。
纳米抗体的制备与纯化：从外周血分离出淋巴细胞，提取出RNA,反转录为cDNA,利用nested-PCR技术对VHH基因进行扩增，与pComb3XSS载体连接后转入电转感受态Ecoli.TG1构建VHH基因文库，经辅助噬菌体M13K07救援后得到噬菌体展示纳米抗体文库，利用固相亲和淘筛技术得到抗泰妙菌素的纳米抗体。
实施例5基于单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立
1、包被及封闭
以实施例2中制备的TMLH-OVA人工抗原为包被原，用包被液将TML-OVA包被原稀释至62.5ng/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。
2、标准曲线的建立
(1)实验方法
向包好的酶标板中每孔加入50μL浓度为3.5ug/mL抗泰妙菌素单克隆抗体和一系列不同浓度的50μL的泰妙菌素标准品，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1：5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以泰妙菌素标准品浓度对横坐标，B/B0(加入泰妙菌素的孔的OD450/未加入泰妙菌素的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图1所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，对泰妙菌素的最低检测限为0.16ng/mL，IC50为1.75ng/mL，线性范围为0.47～6.52ng/mL，检测灵敏度高，线性范围广。
实施例6泰妙菌素单克隆抗体的特异性检测
1、实验方法
采用实施例4制备的泰妙菌素单克隆抗体对罗红霉素、卡那霉素、氨苯砷酸、恩诺沙星、氧氟沙星、克拉霉素、沙拉沙星、氟罗沙星和沙丁胺醇进行检测，具体方法同实施例5。
2、实验结果
具体实验结果如下表2所示，结果表明采用实施例4制备的泰妙菌素单克隆抗体对罗红霉素、卡那霉素、氨苯砷酸、恩诺沙星、氧氟沙星、克拉霉素、沙拉沙星、氟罗沙星和沙丁胺醇均无交叉(小于0.1％)，说明采用实施例4制备的泰妙菌素单克隆抗体特异性良好，不易造成假阳性。
表2泰妙菌素结构及功能类似物交叉反应结果
Figure BDA0002941290460000121
Figure BDA0002941290460000131
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种泰妙菌素半抗原TMLH，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003412296770000011
2.权利要求1所述泰妙菌素半抗原TMLH的制备方法，其特征在于，是将8α-羟基妙林的羰基与肼进行脱水缩合反应，生成中间体1，再用丁二酸酐对中间体1上的-NH2进行酰化反应得到，其反应式如下所示：
Figure FDA0003412296770000012
3.权利要求1所述泰乐菌素半抗原TMLH在制备泰乐菌素人工抗原中的应用。
4.一种泰妙菌素人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述泰妙菌素半抗原TMLH与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(II)所示：
Figure FDA0003412296770000013
所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白或刀豆球蛋白。
5.权利要求4所述泰妙菌素人工抗原在制备泰妙菌素抗体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。
7.一种酶联免疫检测泰妙菌素的免疫原与包被原的组合物，其特征在于，所述免疫原和包被原为权利要求4所述人工抗原；所述免疫原上的载体蛋白为乳铁蛋白，所述包被原上的载体蛋白为鸡卵清白蛋白。
8.权利要求1所述泰妙菌素半抗原TMLH、权利要求4所述泰妙菌素人工抗原或权利要求7所述免疫原与包被原的组合物在检测泰妙菌素或制备泰妙菌素检测试剂盒中的应用。
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