CN112760323A - 一种直肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在制备检测制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够用于检测早期直肠癌组织的核酸适体及其在直肠癌临床诊断与治疗的应用。核酸适体的序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰或改造。本发明核酸适体具有与蛋白抗体相似甚至更加优越的特性，主要体现在其具有特异性和高亲和性，低毒性、低免疫原性，可体外合成与修饰，且保存运输便利等。利用本发明的核酸适体经荧光基团标记后进行早期直肠癌组织检测时，操作简单易行且检测结果更为直观。同时，本次发明的核酸适体为短链核酸序列，其体外合成成本较低，周期短，重现性好。

Description

一种直肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在制备检测制 剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于直肠癌细胞及早期临床直肠癌组织样本检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。

背景技术

结直肠癌已经成为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，其中直肠癌占所有确诊的结直肠癌的30%，且男性发病率略高于女性。与西方国家不同，中国的直肠癌的发病率高于结肠癌，2014年全国肿瘤登记地区直肠癌发病率为 13.64/10万，直肠癌发病年龄中位数在45岁左右，在青年人群体中发病率呈现升高的趋势。直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌，是消化道最常见的恶性肿瘤之一。尽管直肠癌在组织学上类似于在结肠其他部位发生的癌症，但鉴于直肠在具体功能、微生物群落、血液淋巴及神经系统方面以及直肠癌在癌变信号、侵入性生长方式、流行病学以及治疗方式均与结肠及结肠癌存在区别，因此直肠癌被认为是一个独特的实体。此外直肠癌周围的骨结构较为复杂，相比于结肠癌，直肠癌手术的操作难度较大。且手术效果相对较差，如手术病理标本切除质量较差，环周边缘阳性率较高等。

研究发现以饮用水污染为代表的环境因素与直肠癌的高发病率存在一定关联，饮酒与吸烟对直肠癌风险的影响比结肠癌更大。对脂肪和动物性食物的高摄入量、久坐和低运动量是公认的结肠癌危险因素，但这些生活方式对直肠癌发生率的关联性较弱。这也反映出各种致癌风险因素对结肠癌和直肠癌的发生影响并不相同。

早期直肠癌多数症状不明显，在生长到一定程度时出现排便习惯改变、血便、脓血便、便秘、腹泻等，大便逐渐变细，晚期则有排便梗阻、消瘦甚至恶病质。肿瘤侵犯膀胱、尿道、阴道等周围脏器时出现尿路刺激、阴道流出粪液、骶部及会阴部疼痛、下肢水肿等症状。但早中期直肠癌表现出来的一些症状与其他胃肠疾病如内痔出血、肠炎等较为相似，因此很容易被忽视和误诊。

目前对早期直肠癌的治疗效果较好，大多数早期直肠癌患者通过全直肠系膜切除术（TME）等操作即可有效降低局部复发率并提高长期生存率。同时以放疗和单独或联合使用的化学疗法为代表的新辅助放疗已被证明在根治性手术之前可有效减轻肿瘤负担。但是，晚期直肠癌由于发生转移和病人的免疫力和体质的急剧下降，难以进行手术移除，放化疗治疗效果也较差。因此，能够准确对直肠癌的早期筛查和诊断就显得尤为重要。

目前对于直肠癌的诊断以直肠指诊及直肠镜检等传统检测方法为主，此外还有CT、磁共振（MRI）、肿瘤标志物等检测方法。这些手段对于还未出现明显症状的早期直肠癌检测仍存在一定的不足。如果能找到一种能够较为简便快捷且对早期直肠癌有着较高特异性识别的方法，不仅能补充早期直肠癌诊断的一环，还可以通过与其他检测方法联合提高对直肠癌的筛查效率。

核酸适体又称为“化学抗体”，是通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，其本质是由一段单链DNA 或RNA通过分子内折叠形成特定的三维结构。正是由于核酸适体具有多样的结构，从而使得其具有高亲和性、强特异性以及靶标分子多样等特点。同时，相比传统抗体，适配体分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。从而使得核酸适体在体内分子成像、靶标探究及靶向药物开发、肿瘤筛查与治疗等方面展现了广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种高特异性、高稳定性且可用于人直肠癌细胞或早期临床直肠癌组织样本的核酸适体及其在制备检测试剂中的应用。

本发明主要通过Tissue-SELEX技术获得一种检测人直肠腺癌细胞的核酸适体，且不与人肠正常上皮细胞结合。核酸适体序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰或改造。而最优选是下述序列：

5’-AACACGACGCTCGTTCGGGGGACCCGGTTGGCAAGGTGGGC-3’（SEQ ID NO.1），该检测人直肠腺癌细胞的核酸适体，为41个碱基的短链核酸序列，主要通过对该核酸序列进行荧光基团标记，通过荧光强弱检测其与人直肠腺癌细胞细胞的结合能力。

此外还可在该核酸序列上连接放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记基团，推进该核酸适体在直肠癌诊断与治疗中的应用。将所述的核酸适体成为制备检测人直肠腺癌细胞的制剂。

本发明是基于Tissue-SELEX 技术，以临床直肠癌组织为正筛样本，直肠癌癌旁组织为负筛样本，进行正筛和负筛两轮筛选。从6组筛选结果序列中，通过实验组和对照组的测序结果对比，选取丰度前300名的核酸序列，并从中选取排名前8的候选序列，满足处于不同的进化树家族中的条件。后续验证实验进一步证明了其功能和效果，最终才得到本发明。

本发明中所提到的可特异性识别并结合直肠腺癌细胞的核酸适体，相对于蛋白抗体在一些方面具备更加优越的特性。其具有免疫原性低、毒性低、组织渗透性强、稳定性好、可体外制备且成本低等优势。本发明可发展为检测直肠癌的新型分子探针，为直肠癌的准确诊断、快速定位、靶向治疗和预后提供有效的工具。

附图说明

图1为通过MEGA7软件分析包括8条候选核酸序列在内的部分家族树图。

图2为8条候选序列与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的流式结合情况。其中（A）为8条候选序列、Library序列与人直肠腺癌细胞SW1463流式结合图，（B）为8条候选序列、Library序列与人肠正常上皮细胞FHs74Int流式结合图。

图3为OHL-1及Library序列与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的共聚焦结合情况。其中（A）为核酸适体OHL-1与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的共聚焦结合图，（B）为Library序列与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的共聚焦结合图。

图4为核酸适体OHL-1与人直肠腺癌细胞SW1463的解离平衡常数。

图5为核酸适体OHL-1的靶标类型的初步鉴定。

图6为流式检测所得核酸适体OHL-1与其它实体肿瘤癌细 胞的结合情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

本实验所用到的细胞系人直肠腺癌细胞SW1463、人肠正常上皮细胞FHs74Int、人直肠腺癌细胞HR8348、人结肠腺癌细胞RKO、人结肠癌细胞LOVO，HT29和SW480、人胃黏液腺癌细胞MGC-803、人膀胱癌细胞5637、人肾透明细胞腺癌细胞 786-0、人卵巢癌细胞Ovcar3、人B淋巴细胞瘤细胞 RAMOS、人胚胎肾细胞HEK293和人胃粘膜上皮细胞 GES-1均来源于中科院上海细胞库。直肠癌组织以及直肠癌癌旁组织来源于临床样本。

实施例1：临床直肠癌组织核酸适体筛选

基于Tissue-SELEX 技术，以临床直肠癌组织为正筛样本，直肠癌癌旁组织为负筛样本进行筛选。首先合成具有亲和基团修饰X-Aptamer 文库，随后将初始文库与直肠癌癌旁组织孵育，孵育后分离并保留与癌旁组织结合的核酸序列作为第一轮负筛文库。同时将不结合的核酸序列与临床直肠癌组织孵育，孵育后再分离并保留与直肠癌组织结合的核酸序列作为第一轮正筛文库。然后在第2轮筛选中，将上一轮中所保留的正筛、负筛文库分别分为三组依次与灭菌水（空白对照组），直肠癌组织（实验组）、直肠癌癌旁组织（实验对照组）再次孵育，得到6组核酸序列库分别为：1.负筛-空白组；2负筛-正筛组；3，负筛-负筛组；4正筛-空白组；5正筛-正筛组；6正筛-负筛组。孵育后分离纯化得到单链ssDNA，并进行PCR扩增富集核酸序列。随后将扩增后的 6 组核酸序列库进行二代测序以及对比分析。

其中5组为实验组共测出478566条序列，1、3、6组作为阴性对照组，2，4组作为阳性增强组，将获得的第5组序列选取丰度前300的序列，将该组序列与1、3、6组进行比对，选择在5组中丰度较高而在1、3、6组中未出现或丰度低的序列，然后将选择得到的序列库与2，4组进行比对，尽可能选择在2，4组中出现并丰度较高的序列。通过阴性对照组和阳性增强组间的相互比对能够进一步筛选得到对直肠癌组织更高识别而对癌旁组织的更低识别的序列组，同时能够并减少由于非特异性吸附导致的目标序列损失。如图1所示接下来将选择的序列库，通过MEGA7软件对序列进行同源性对比和构建进化树，将序列对比划分于不同的家族树中。最终挑选出8条候选核酸序列，这些序列满足只与临床直肠癌组织结合、且结合丰度值高、分布于不同的家族树中的挑选条件（见表1）（OHL-1至OHL-8序列分别与SEQIDNO.1至SEQIDNO.8所示序列相对应）。

表1 针对临床直肠癌组织核酸适体筛选所挑选的8条候选序列

Clone ID	Sequence of random region(5’ to 3’)
		OHL-1	AACACGACGCTCGTTCGGGGGACCCGGTTGGCAAGGTGGGC
OHL-2	AAGCCCACTTTCCTGTGGGAGTCACAGGGCGACACCGTGGGC
		OHL-3	AACACGACTCAGCTGTGGGTCTCACAGGGCGGGCCCGTCGTG
OHL-4	AAGCCCACACGAGTTCGAGGGACACAGGCCAGGGCTGTGGGC
		OHL-5	AACACGACCGCCGTTCGAGCAGCGAACTGCACCAACGTCGTG
OHL-6	AAGCCCACTGGGGTTCGGACATCACAGAACAATGGGGTCGTG
		OHL-7	AACACGACGAGCGTTCGGCGGACACAGAATGACAACGTGGGC
OHL-8	AAGCCCACTGGCCTGTGTAGGACACAGTCTGTGGGAGTCGTG

实施例2 ：确定与SW1463细胞系特异性结合能力最强的序列

首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时对SW1463细胞进行预处理。将SW1463用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（BindingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/LtRNA，1g/LBSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测。FHs74Int重复上述步骤，结果请参见图2，其中（A）为8条候选序列、Library序列和人直肠腺癌细胞SW1463流式结合图，（B）为8条候选序列、Library序列和人肠正常上皮细胞FHs74Int流式结合图。

首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时对SW1463细胞进行预处理。将SW1463用DPBS清洗2次，加入结合缓冲液（BindingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/LtRNA，1g/LBSA）和处理后的核酸适体序列及文库，再轻轻摇匀，置于4℃条件孵育1小时。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）清洗3次，通过激光共聚焦显微镜进行荧光检测。FHs74Int细胞重复上述步骤。结果见图3，其中（A）为核酸适体OHL-1与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的共聚焦结合图，（B）为Library序列与人直肠腺癌细胞SW1463和人肠正常上皮细胞FHs74Int的共聚焦结合图。

根据图2（A）的流式结果显示，直肠癌细胞SW1463在与核酸适体孵育后，呈现出荧光强度曲线不同程度的位移。通过对每组曲线偏移程度进行比较，得到结合较强的核酸适体序列OHL-1，而其他7条标记序列和文库序列与SW1463细胞结合较弱或不结合。根据图2（B）的流式结果显示，肠正常细胞FHs74Int在与核酸适体孵育后，荧光强度曲线基本无位移。8条标记序列和文库序列均与人肠正常上皮细胞FHs74Int结合较弱或不结合。

同时图3（A）的共聚焦结果表明，经过核酸适体序列OHL-1孵育后的直肠癌细胞SW1463，在细胞膜表面出现较强的绿色荧光现象。而文库序列处理后的直肠癌细胞SW1463，没有出现荧光标记现象。图3（B）经过核酸适体序列OHL-1和文库孵育后的肠正常细胞FHs74Int，均无绿色荧光信号。共聚焦结果与流式结果基本一致。

以上流式与共聚焦验证结果说明，核酸适体OHL-1对直肠癌细胞的结合能力最强，而不结合肠正常细胞。综上所述，核酸适体序列OHL-1可以特异性结合直肠癌细胞。

实施例3：核酸适体OHL-1与直肠癌细胞的结合亲和力强弱

以核酸适体OHL-1为例进一步研究其与直肠癌细胞的结合亲和力强弱。首先对OHL-1进行预处理。我们将OHL-1设置成不同的浓度梯度：0nM、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、1200nM、1400nM、1600nM。95℃高温变性5min，4℃复性10min，复性完后置于常温。其次，对SW1463细胞进行预处理。丢弃细胞培养皿中的原有培养基，加入DPBS润洗细胞2-3次。再用0.2%EDTA室温消化1min将贴壁状态的SW1463细胞从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）分别吹打细胞并收集到离心管中。最后，振荡混匀放置于4℃摇床孵育1h。孵育后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图4）。

根据通过流式得出不同浓度下的平均荧光强度，扣除非特异性的背景荧光，再根据Y=Bmax X/（Kd+X）公式，通过 GraphPad Prism 7.0 计算出核酸适体OHL-1与SW1463细胞的解离平衡常数，并以X 轴为核酸适体不同梯度浓度，Y 轴为平均荧光强度构建解离曲线图。如图4所示核酸适体OHL-1与 SW1463细胞的解离平衡常数为469.2±80.21nM，在纳摩尔级别，说明该核酸适体与直肠癌细胞的结合亲和力较高，是识别直肠癌的亲和分子。

实施例4：探究OHL-1是否结合在直肠癌细胞SW1463表面的膜蛋白上

首先，将SW1463细胞用0.2%EDTA从细胞培养皿上消化下来，用7个离心管收集。其中2管细胞分别加入胰酶和蛋白酶K，放置于37℃细胞培养箱中处理1.5min、4min和30second、3min。处理完毕之后用洗涤缓冲液（PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）离心洗涤，然后各加入250nM的OHL-1混匀。另外3管细胞直接用洗涤缓冲液离心洗涤后，取2管细胞分别加入250nM的OHL-1、随机文库混匀，剩下1管细胞不做任何处理。将5管细胞全部放置在4℃摇床中孵育1个小时。孵育完后用洗涤缓冲液离心洗涤两次，最后用流式细胞仪进行荧光信号检测。核酸适体OHL-1的靶标类型的初步鉴定结果请参见图5。

根据图5流式结果显示，经过不同时间的蛋白酶K处理之后，OHL-1与SW1463细胞的结合量均下降到几乎与文库重叠。经过不同时间的胰酶处理之后，OHL-1与SW1463细胞的结合量均下降至原来的1/3以下。说明OHL-1是基本是结合在SW1463细胞表面的膜蛋白上。

实施例5：以流式检测所得核酸适体OHL-1与其它实体肿瘤癌细胞的结合情况。

培养不同类型细胞24h使细胞密度达90％。首先对OHL-1以及对照文库链进行预处理。将OHL-1及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时对不同类型细胞进行预处理。将细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（BindingBuffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/LtRNA，1g/LBSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测。

结果请见图6，OHL-1对人直肠腺癌细胞HR8348、人结肠腺癌细胞RKO、人结肠癌细胞LOVO和SW480、人胃黏液腺癌细胞MGC-803和人膀胱癌细胞5637具有较高结合能力，对人结肠癌细胞HT29、人肾透明细胞腺癌细胞 786-0和人卵巢癌细胞Ovcar3具有较弱结合能力，对人B淋巴细胞瘤细胞 RAMOS、人胚胎肾细胞HEK293和人胃粘膜上皮细胞 GES-1的基本不结合。

<110> 湖南大学

<120>一种直肠癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在制备检测制剂中的应用

<160> 8

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<400> 1

AACACGACGCTCGTTCGGGGGACCCGGTTGGCAAGGTGGGC 41

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<400> 2

AAGCCCACTTTCCTGTGGGAGTCACAGGGCGACACCGTGGGC 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<400> 3

AACACGACTCAGCTGTGGGTCTCACAGGGCGGGCCCGTCGTG 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<400> 4

AAGCCCACACGAGTTCGAGGGACACAGGCCAGGGCTGTGGGC 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<400> 5

AACACGACCGCCGTTCGAGCAGCGAACTGCACCAACGTCGTG 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<400> 6

AAGCCCACTGGGGTTCGGACATCACAGAACAATGGGGTCGTG 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<400> 7

AACACGACGAGCGTTCGGCGGACACAGAATGACAACGTGGGC 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<400> 8

AAGCCCACTGGCCTGTGTAGGACACAGTCTGTGGGAGTCGTG 42

Claims (9)

1.一种检测人早期直肠癌的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的序列如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.8任一所示，或将其进行标记修饰或改造。

2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，其是如SEQ ID NO.1所示序列的核酸适体。

3.根据权利要求1或2所述的核酸适体，其特征在于，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。

4.根据权利要求3所述的核酸适体，其特征在于，所述标记修饰是指荧光标记。

5.权利要求1-4任一项所述的核酸适体在制备检测或诊断人直肠癌，尤其是早期直肠癌的制剂中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，将所述核酸适体与待测细胞样品摇床孵育，孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗，再通过流式细胞仪进行检测，优选所述检测是荧光检测。

7.一种检测或诊断人早期直肠癌的试剂盒，其特征在于，其含有如权利要求1-4任一项所述的核酸适体。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括结合缓冲液以及洗涤缓冲液。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液成分为：0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA，所述洗涤缓冲液含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁。

Images