CN102703508A - 靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体及其构建、筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术，针对GSK3β基因的不同靶序列，构建了两个能在SH-SY5Y细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体，该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养获得。本发明靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效特异性的抑制GSK3β基因表达，可用于制备治疗阿尔茨海默病GSK3β相关性基因药物。
Description
技术领域
本发明涉及靶向糖原合成激酶3β（glycogen synthesis kinase 3β，GSK3β）基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-GSK3β)及其构建制备，属于生物医药技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是以进行性认知功能障碍为特征的神经变性疾病，老年斑和神经元纤维缠结(NFT)是其特征的病理性损伤。异常磷酸化的tau蛋白（微管相关蛋白）构成NFT的核心，目前认为tau蛋白过磷酸化使微管稳定功能受损、螺旋状纤丝（PHF）形成及神经元丢失。因此阻断tau蛋白过磷酸化应是AD治疗的有效途径之一。GSK3β是一种丝／苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞内信号传导通路，是很多细胞功能的重要调节因子，参与细胞代谢、分化、增殖与运动等过程。有研究证明糖原合成激酶-3β（GSK-3β）是导致tau蛋白过磷酸化的重要激酶之一。
多项研究表明GSK-3β在阿尔茨海默病的发展中起关键作用。Takashima A及Balaraman Y等证实GSK-3β与几乎AD中所有的关键因素都有着直接或间接的联系，例如淀粉样变、神经元纤维缠结、早老素、神经元凋亡以及胰岛素抵抗等，参见Takashima A.GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer′s disease.J Alzheimers Dis.2006;9(3Suppl):309-17.及Balaraman Y，Limaye AR,Levey AI,et al.Glycogen synthase kinase 3beta and Alzheimer′s disease:pathophysiological and therapeutic significance.Cell Mol Life Sci.2006Jun;63(11):1226-35.。Leroy K发现GSK-3β在阿尔茨海默病中,活性异常升高。Rankin CA等发现GSK-3β与螺旋状纤丝（PHF）的形成及tau的过磷酸化有关。GSK-3β的激活是脑老化和AD级联损害反应的关键步骤，早于神经元纤维缠结和神经元死亡。参见Leroy K,Boutajangout A,Authelet M,et al.The active form of glycogen synthase kinase-3beta is associated with granulovacuolar degeneration in neurons in Alzheimer′s disease.Acta Neuropathol.2002Feb;103(2):91-9.及Rankin CA,Sun Q,Gamblin TC.Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology.Mol Neurodegener.2007Jun 28;2:12.。因此，针对靶向抑制GSK-3β的治疗或许会对AD这种灾难性疾病带来希望。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术能特异性降解mRNA，沉默靶基因，在转录后水平抑制基因的表达，从而可用来进行基因功能的研究和药物靶标的研究。RNA干扰机制研究表明，双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21～23个碱基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物。RNA干扰常用的技术包括化学合成、体外转录法以及表达载体转录法等。其中慢病毒载体是目前常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身 携带片断整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。该技术被广泛用于基因功能研究，在疾病的基因治疗上具有良好的前景。
阿尔茨海默病是多因素、多基因疾病，在基因治疗领域RNA干扰特别适合用于某个基因过度表达或由于体内突变基因表达所致的疾病。利用RNA干扰相关技术可以针对在疾病发病过程中发挥重要作用的tau、Aβ42（淀粉样蛋白）、早老素基因、凋亡相关基因、神经生长因子及其受体以及部分关键酶等，在不影响正常基因功能的前提下抑制突变基因表达或基因的过量表达，从而达到治疗阿尔茨海默病的目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种靶向GSK-3β基因的RNA干扰重组慢病毒载体构建、筛选及其用途。
术语说明：
GSK3β（glycogen synthesis kinase 3β）：糖原合成激酶3β。
SH-SY5Y：人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株。
本发明以利用RNA干扰技术为主，针对GSK3β基因的不同靶序列，构建了两个能在SH-SY5Y细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体GP-Supersilencing-shGSK-3β，该载体是自身失活的第三代慢病毒载体。其示意图谱见图1，能高效特异性的抑制GSK3β基因表达。
本发明的技术方案如下：
一种靶向GSK3β基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于阿尔茨海默病GSK3β基因相关性治疗性物质。该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养获得；其中，所述的GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体是在GP-Supersilencing载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是XhoI和HpaI；所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：
（1）GSK3β-homo-1292寡核苷酸序列1：
正义链:
5’-TGCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTTTTTTC-3’
反义链:
5’-TCGAGAAAAAAGCTAGATCACTGTAACATAGTTCTCTTGAAACTATGTTACAGTGATCTAGCA-3’
（2）GSK3β-homo-2169寡核苷酸序列2：
正义链:
5’-TGCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTTTTTTC-3’
反义链:
5’-TCGAGAAAAAAGCAGCGTCAGATGCTAATACTTCTCTTGAAAGTATTAGCATCTGACGCTGCA-3’
所述的GP-Supersilencing载体的多克隆位点，其酶切位点即是XhoI和HpaI。
根据本发明，所述的靶向GSK3β基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建方法，包括 步骤如下：
a.根据GSK3βmRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以上所述的GSK3β-homo-1292寡核苷酸序列1、GSK3β-homo-2169寡核苷酸序列2中的一种。
b.然后将所述的双链DNA片段连接到GP-Supersilencing载体的多克隆位点中构建成GP-Supersilencing-sh GSK3β重组载体；
c.再将所述的GP-Supersilencing-shGSK3β重组载体与pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养，获得目标产品，即靶向GSK3β基因RNA干扰的重组慢病毒载体。
作为优选，在所述的双链DNA片段末端引入XhoI和HpaI酶切位点。
作为优选，用XhoI和HpaI酶将GP-Supersilencing载体酶切，回收大片段后将其与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
为了对靶向GSK3β基因RNA干扰的重组慢病毒载体对GSK3β基因的抑制效果进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，RT－PCR法测定对GSK3βmRNA表达水平的抑制作用，Western blot测定抑制GSK3β后对GSK3β蛋白表达水平的影响。各步步骤如下：
1、总RNA的提取：
按照以下步骤进行总RNA提取:吸弃6孔板中的培养液，每孔加入1ml Trizol Reagent。用DEPC处理的枪头吹打使细胞完全裂解。将裂解液转移至1.5ml EP管中，室温放置10分钟。加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温放置10分钟。12000g 4°C离心10分钟，吸取上层清液至新离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10分钟。12000g 4°C离心15分钟，弃上清。沉淀用500μl 75%乙醇洗涤一次。12000g 4°C离心5分钟，回收沉淀，弃上清。常温倒置晾干10分钟。用20μl DEPC-H2O溶解沉淀，测定OD260、OD280，计算RNA浓度。琼脂糖电泳检查RNA的完整性。
2、RNA逆转录获得cDNA
逆转录反应体系
| 组分 | 终浓度 | 体积 |
| 5×反转录缓冲液 | 5× | 4μl |
| RT引物(1uM) | 50nM | 1.2μl |
| RNA模板 | - | 5μl |
| MMLV RTase(200U/μl) | 2U/μl | 0.2μl |
| DEPC ddH2O | 总体系20μl |
RNA逆转录获得cDNA
利用promega试剂盒（货号M1701），按照使用说明进行cDNA合成，主要步骤如下：
（1）在无菌EP管中配制如下体系：
总RNA：2ul
特异性反转录引物(GAPDH和AHR各1uM)：1.2ul
DEPC-H2O：11.5ul
（2）70°C温育混合物5分钟，冰上骤冷。
（3）再加入如下成分：
5×反转录缓冲液：4ul，
10mM dNTPs(每种10mM)：0.8ul，
反转录酶（MMLV RTase RnaseH：200U/ul，Promega）：100U(0.5ul)。
（4）42°C温育45min。
（5）85°C加热10分钟终止反应，冰上骤冷，反应液用作PCR模板。
3、Real-time PCR检测
1）采用软件设计Real-time PCR检测引物，引物序列信息如下，由上海吉玛制药技术有限公司合成。
2）按下表配制反应体系
| 组分 | 终浓度 | 体积 |
| 2×Real-time PCR Master Mix(上海吉玛) | 1× | 10μl |
| F Primer(20uM) | 0.1μM | 0.1μl |
| R Primer(20uM) | 0.1μM | 0.1μl |
| cDNA模板 | - | 2μl |
| rTaq DNA聚合酶(5U/μl)(TAKARA) | 2.5U/μl | 0.4μl |
| 双蒸水 | 至20μl |
3）利用Mx3000Real-time PCR仪(Stratagen)进行反应，反应条件：95°C，3分钟变性；95°C，30秒，62°C，40秒，共40个循环。
4、蛋白水平验证GSK-3β表达的变化
每个细胞样本加入100μl细胞裂解液,使组织完全裂解。裂解物移入离心管中。取5ul样本加入5ul 2×SDS-PAGE加样缓冲液，100°C加热处理5分钟，冰上冷却。12000g离心10分钟去除不溶性沉淀。样品使用10%SDS-PAGE分离，每孔上样量为20μl。电泳结束后，将PVDF膜在甲醇中浸泡1分钟，再使用转移缓冲液浸泡凝胶、滤纸和在甲醇中浸泡过的PVDF膜10分钟，然后制备转移三明治。使用半干细胞进行半干电泳转移，转移条件为30mA 60min。转移完毕后，用1×Ponseau S溶液染色并标记蛋白质Marker的条带位置。使用封闭缓冲液封闭转印膜2小时，然后用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。加入适当稀释的一抗，4°C温育过夜。用1×TBST洗涤3次，每次15分钟。加入适当稀释的二 抗，室温温育2小时。用1×TBST洗涤3次，每次15分钟。用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates进行化学发光检测，并对X光片曝光。经显影定影处理后，胶片用凝胶成像分析系统拍照，使用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。
本发明针对GSK3β基因构建的两种RNA干扰重组慢病毒载体，实验表明：GSK3β-homo-1292、GSK3β-homo-2169抑制SH-SY5Y细胞GSK3β表达的效率高，可在制备治疗阿尔茨海默病GSK3β相关性基因药物中应用。
本发明的优良效果是：
本发明提供的GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体最重要特点在于提供靶向GSK3β基因抑制效应，并用重组慢病毒载体作为载体，使得干扰效果得到持续性作用。整个制备过程全部使用质粒，避免传统方法腺病毒污染。本发明通过筛选最有效GSK3β干扰序列，设计合成了其双链DNA，连接到慢病毒骨架质粒载体中，与辅助质粒载体共转染工具细胞293T细胞，制备出GSK3β干扰重组慢病毒载体GP-Supersilencing-shGSK-3β。本发明所述GP-Supersilencing-shGSK-3β载体能有效转染细胞或组织后特异性降低GSK3β基因及蛋白的表达，从而可应用于基因治疗药物及基因功能研究。具体如下：
1、本发明采用的GP-Supersilencing载体能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA。同时该质粒能表达由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的加强型绿色荧光蛋白EGFP，方便病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper 1.0质粒载体中含有人类免疫缺陷病毒（HIV病毒）的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0质粒载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。将以上三种载体共转入293T细胞能高效组装自身失活的第三代慢病毒载体，增加了两个安全特性：其一构建了自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3’LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。第二个特点是去除了tat基因代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因，组中的9个基因在构建的HIV慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒载体系统更加安全。
2、本发明所采用的重组慢病毒载体RNA干扰技术能够在mRNA和蛋白水平上干扰基因的表达。本发明针对GSK3β靶基因设计出两个有效干扰序列，通过重组的慢病毒干扰载体系统构建包装获得GP-Supersilencing-sh GSK3β，通过检测靶细胞中GSK3β基因mRNA及蛋白表达水平，筛选出最有效干扰片段，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。与质粒载体及其他病毒载体相比，这种慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。为有关GSK3β基因的进一步研究奠定了良好实验基础，并能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
附图说明
图1为实施例中慢病毒表达载体GP-Supersilencing结构示意图。
图2插入片段基因测序图。
图3是慢病毒滴度鉴定结果：25个荧光细胞×4个视野×104×100稀释倍数=1×108TU/ml。图中，a、b、c、d分别为10-1、10-2、10-3、10-4稀释倍数下慢病毒侵染293T细胞GFP的表达。
图4－6为慢病毒侵染SH-SY5Y细胞72h（6孔板）图片（荧光、可见光）。其中，图4为C330侵染SH-SY5Y细胞后72h后图片（200×）；图5为C332侵染SH-SY5Y细胞后图片（200×）；图6为NC侵染SH-SY5Y细胞后图片（200×）。
图7为GP-Supersilencing-shGSK3β对SH-SY5Y细胞中GSK3β基因表达干扰效果图，横坐标是样品，纵坐标是GSK3βmRNA水平(以GAPDH为内参)。其中，B为未感染任何病毒的细胞组72h样本；NC为加阴性对照病毒感染的细胞组72h样本；1292为加GSK3β-homo-1292病毒感染的细胞组72h样本；2169为加GSK3β-homo-2169病毒感染的细胞组72h样本。
图8为PGP-Supersilencing-shGSK3β对SH-SY5Y细胞中GSK3β蛋白表达干扰效果图，横坐标是样品，纵坐标是GSK3β蛋白水平(以GAPDH为内参)；其中B为未感染任何病毒的细胞组72h样本；NC为加阴性对照病毒感染的细胞组72h样本；1292为加GSK3β-homo-1292病毒感染的细胞组72h样本；2169为加GSK3β-homo-2169病毒感染的细胞组72h样本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
一、主要材料：
人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株由协和医科大学基础医学细胞中心提供；
293T细胞株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；
感受态DH-5α大肠埃希菌和慢病毒表达载体GP-Supersilencing购于上海吉玛制药技术有限公司，含有人巨细胞病毒(CMV)启动子，编码加强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因；
T4DNA连接酶、dNTP(10×)、RTase、Taq DNA聚合酶、Oligo(dt)、PMSF均购于加拿大MBI Fermentas公司；
脂质体Lipo-fectamine 2000、Opti-MEMI培养液、Trizol RNA提取试剂购于美国Invitrogen公司；
SYBR Green I qRT-PCR Mixs购于上海生工生物工程技术服务有限公司；
GSK-3β的单克隆抗体GSK-3β(sc-53931)，GAPDH兔抗人多克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购于美国Santa Cruz公司；
Western blot免疫印迹试剂购于北京康为世纪有限公司。
胎牛血清（FBS）及1640培养液购于美国Gibco公司。
二、靶向基因GSK-3β的慢病毒载体构建
1、寡核苷酸的设计及合成
应用Invitrogen公司的在线RNAi设计服务软件BLOCK-iT RNAi Designer，设计靶向GSK-3β基因mRNA序列（(NM002093）的2个干扰靶序列（参见下表），并合成相应的双链DNA（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
| 序列代码 | 序列名称 | 靶序列 |
| C330 | GSK3β-homo-1292 | GCTAGATCACTGTAACATAGT |
| C332 | GSK3B-homo-2169 | GCAGCGTCAGATGCTAATACT |
shRNA模板寡核苷酸的3′末端是TTTTTT，作为RNA聚合酶Ⅲ型启动子H1的终止信号，其5′和3′末端分别是XhoI和Hpa I的限制性酶切位点。Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加了T，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了AGCT，与XhoI酶切后形成的粘端互补。
各自的双链DNA合成片段信息如下，后缀-S为正义链，后缀-AS为反义链：
（1）GSK3β-homo-1292：
GSK3β-homo-1292-S:
5’-TGCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTTTTTTC-3’
GSK3β-homo-1292-AS:
5’-TCGAGAAAAAAGCTAGATCACTGTAACATAGTTCTCTTGAAACTATGTTACAGTGATCTAGCA-3’
（2）GSK3β-homo-2169：
GSK3β-homo-2169-S:
5’-TGCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTTTTTTC-3’
GSK3β-homo-2169-AS:
5’-TCGAGAAAAAAGCAGCGTCAGATGCTAATACTTCTCTTGAAAGTATTAGCATCTGACGCTGCA-3’
具有上述序列的shDNA在体内经转录后可分别产生以下转录子，自身配对形成具有茎环（loop）结构的双链RNA，经特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为21～23nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNA)。
（1）GSK3β-homo--1292转录子：
GCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTT
（2）GSK3β-homo-2169转录子：
GCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTT
在效应阶段，siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC以ATP依赖性方式激活，RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶mRNA切断，从而达到阻断基因表达的效果。
2、Lentivirus-shDNA模板的退火
将合成的双链DNA片段分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正义链和反义链寡聚物溶液，按照如下配比配置退火反应体系。
| 组分 | 体积(μl) |
| 10XshDNA退火缓冲液 | 5 |
| 正义链(100uM) | 5 |
| 反义链(100uM) | 5 |
| 双蒸水 | 35 |
| 总体系 | 50 |
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95°C 5min;85°C 5min;75°C 5min;70°C 5min;4°C保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。
2、GP-Supersilencing载体的线性化
取10μg GP-Supersilencing载体，按照如下体系进行酶切处理：
| 组分 | 体积(μl) |
| 10×缓冲液R | 10 |
| XhoI | 5 |
| Hpa I | 2 |
| GP-Supersilencing | 10μg |
| 双蒸水 | 至100μl |
| 总体系 | 100 |
37°C酶切1小时，琼脂糖电泳，使用琼脂糖胶DNA纯化试剂盒（TaKaRa公司）回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/μl。
4、GP-Supersilencing-shGSK-3β载体的构建
按照如下体系进行载体的连接反应：
| 组分 | 体积(μl) |
| 10×T4连接缓冲液 | 2 |
| GP-Supersilencing(XhoI+Hpa I) | 1 |
| shDNA模板(100nM) | 1 |
| T4DNA连接酶(5weissU/μl) | 1g |
| 双蒸水 | 15 |
[0114]
| 总体系 | 20 |
22°C连接1hr，转化至JM 109感受态细胞。
每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养集中。摇出的菌液随机挑2个送去测序，测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提，所得质粒可以用于常规的分子生物学实验和细胞学实验。如果在用于细胞转染时细胞毒性较大，可重新转化至大肠杆菌DH5α中，然后用试剂盒或CsCl超速离心法制备更高纯度载体。本步骤得到的产物是GP-Supersilencing-shGSK-3β载体。
三、慢病毒包装及滴度测定：
吸取上一步骤制备好的高纯度无内毒素抽提的重组病毒载体GP-Supersilencing-shGSK-3β(20μg)，以及辅助载体pHelper 1.0(15μg)和pHelper 2.0(10μg)，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞。
转染后8h更换为完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。4℃，4000g离心10分钟除去细胞碎片后并以0.45μM滤器过滤上清液获得慢病毒备用，可满足一般细胞试验。若要获得较高浓度的慢病毒可对其进一步浓缩纯化后得到高滴度的慢病毒浓缩液，分装病毒浓缩液-80°C长期保存，取其中一支按以下步骤进行病毒生物学滴度测定。
1.293T细胞在6cm培养皿中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用3ml D-Hank’s溶液洗涤细胞两次。
2.加1ml Trypsin-EDTA（胰蛋白酶-乙二胺四乙酸）溶液,混匀后,小心吸去胰酶溶液,37°C放置3-5分钟。
3.在加入2ml含10%FBS的1640培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4.血球计数板计数，将细胞稀释至3×105细胞/ml。
5.按3×104细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37°C 5%CO2培养24h。
6.将慢病毒原液（10-20μl）,用10%FBS的1640培养液十倍稀释3-5个梯度（根据细胞状态，如有必要可加入终浓度为5μg/ml的Polybrene）。
7.吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37°C 5%CO2培养24h。
8.吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入150μl 10%FBS的1640培液，（根据细胞状态，如有必要可分出1/3-1/5）于37°C 5%CO2继续培养48h、72h。
9.通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。通过不同的检测方法，滴度会有各种原因有所差异，在试验过程中注意生物安全要求。
四、靶细胞侵染试验：
按以下步骤对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y进行病毒侵染实验：
1.SY5Y细胞在10cm培养皿中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用2ml DHank’s溶液洗涤细胞两次。
2.加入1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后，37°C放置2-3分钟。
3.小心吸去胰酶溶液，在加入2ml含10%FBS的1640培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
4.血球计数板计数，按10×105细胞/孔的浓度接种6孔板，混匀后37°C 5%CO2培养24小时。
5.将慢病毒原液200ul,用10%FBS的1640培养液五倍稀释（根据细胞状态及类型,如有必要可加入终浓度为5μg/ml的1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（Polybrene）。
6.吸去6孔板中的培养液，每孔加入上述1ml稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37°C 5%CO2培养24h。
7.吸弃6孔板中的稀释病毒液，每孔加入1.5ml 10%FBS的1640培液，（根据细胞状态，如有必要可分出1/3-1/5）于37°C 5%CO2继续培养72h，分别收样，所得细胞用于Real-time PCR(实时定量PCR)及Western blot(蛋白印迹)检测。
五、总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干扰效应的RT-PCR检测
1、总RNA的提取：
按照以下步骤进行总RNA提取:
（1）吸弃6孔板中的培养液，每孔加入1ml Trizol Reagent(Trizol试剂)。
（2）用二乙基焦磷酰胺（DEPC）处理的枪头吹打使细胞完全裂解。
（3）将裂解液转移至1.5ml EP管中，室温放置10分钟。
（4）加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温放置10分钟。
（5）12000g 4°C离心10分钟，吸取上层清液至新离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10分钟。
（6）12000g 4°C离心15分钟，弃上清。
（7）沉淀用500μl 75%乙醇洗涤一次。12000g 4°C离心5分钟，回收沉淀，弃上清。
（8）常温倒置晾干10分钟。
（9）用20μl DEPC-H2O溶解沉淀，测定OD260、OD280，计算RNA浓度。
（10）琼脂糖电泳检查RNA的完整性。
2、RNA逆转录获得cDNA
逆转录反应体系
| 组分 | 终浓度 | 体积 |
| 5×反转录缓冲液 | 5× | 4μl |
| RT引物(1uM) | 50nM | 1.2μl |
| RNA模板 | - | 5μl |
| MMLV RTase(200U/μl) | 2U/μl | 0.2μl |
| DEPC ddH2O | 总体系20μl |
RNA逆转录获得cDNA：
利用promega试剂盒（货号M1701），按照使用说明进行cDNA合成，主要步骤如下：
（1）在无菌EP管中配制如下体系：
总RNA：2ul
特异性反转录引物(GAPDH和AHR各1uM)：1.2ul
DEPC-H2O：11.5ul
（2）70°C温育混合物5分钟，冰上骤冷。
（3）再加入如下成分：
5×反转录缓冲液：4μl，
10mM dNTPs(每种10mM)：0.8ul，
反转录酶（MMLV RTase RnaseH：200U/μl，Promega）：100U(0.5μl)。
（4）42°C温育45min。
（5）85°C加热10分钟终止反应，冰上骤冷，反应液用作PCR模板。
3、Real-time PCR检测
1）采用软件设计Real-time PCR检测引物，引物序列信息如下，由上海吉玛制药技术有限公司合成。
2）按下表配制反应体系
| 组分 | 终浓度 | 体积 |
| 2×Real-time PCR Master Mix(上海吉玛) | 1× | 10μl |
| F Primer(20uM) | 0.1μM | 0.1μl |
| R Primer(20uM) | 0.1μM | 0.1μl |
| cDNA模板 | - | 2μl |
| rTaq DNA聚合酶(5U/μl)(TAKARA) | 2.5U/μl | 0.4μl |
| 双蒸水 | 至20μl |
3）利用Mx3000Real-time PCR仪(Stratagen)进行反应，反应条件：95°C，3分钟变性；95°C，30秒，62°C，40秒，共40个循环。
六、蛋白水平验证GSK-3β表达的变化
操作步骤：
1、每个细胞样本加入100μl细胞裂解液,使组织完全裂解。裂解物移入离心管中。
2、取5ul样本加入5ul 2×SDS-PAGE加样缓冲液，100°C加热处理5分钟，冰上冷却。12000g离心10分钟去除不溶性沉淀。
3、样品使用10%SDS-PAGE分离，每孔上样量为20μl。
4、电泳结束后，将PVDF膜在甲醇中浸泡1分钟，再使用转移缓冲液浸泡凝胶、滤纸和在甲醇中浸泡过的PVDF膜10分钟，然后制备转移三明治。
使用半干细胞进行半干电泳转移，转移条件为30mA 60min。
5、转移完毕后，用1×丽春红S（Ponceau S）液染色并标记蛋白质Marker的条带位置。
6、使用封闭缓冲液封闭转印膜2小时，然后用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。
7、加入适当稀释的一抗，4°C温育过夜。用1×TBST洗涤3次，每次15分钟。
8、加入适当稀释的二抗，室温温育2小时。用1×TBST洗涤3次，每次15分钟。
9、用SuperSignal West Pico Chemiluminent Substrates进行化学发光检测，并对X光片曝光。经显影定影处理后，胶片用凝胶成像分析系统拍照，使用Gel-Pro Analyzer软件分析处理。
七、结果
1．GP-Supersilencing-shGSK-3β重组慢病毒载体测序鉴定
设计GSK-3β基因shRNA的寡核苷酸序列，经退火形成双链DNA。
干扰靶点 退火双链
经与线性化的慢病毒穿梭载体连接，连接产物转化DH5α，每个连接反应挑取5个菌落，接种到含100μg/ml氨苄青霉素（Ampicillin）的LB培养集中。使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用Xba I和Nhe I进行双酶切鉴定分别酶切鉴定。
将酶切电泳鉴定克隆进行测序。测序结果表明，插入片段与设计的核苷酸序列完全一致；未发现有突变、缺失、插入等异常存在。表明已经成功地构建针对人源GSK-3β基因的重组慢病毒载体。如图2所示。
2．慢病毒载体的包装及滴度测定
提取GP-Supersilencing-shGSK-3β重组慢病毒载体及慢病毒包装系统2种辅助包装载体，共转染293T细胞，获得重组慢病毒。将浓缩病毒液取10μl用培养液10倍稀释侵染293T细胞，在荧光倒置显微镜下，观察各孔中GFP的表达量，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数，如图3所示。测定滴度为1×108TU/ml，说明质粒有效转入293T 细胞，病毒成功包装。
3重组慢病毒侵染SH-SY5Y细胞侵染率
将包装好的干扰病毒侵染SH-SY5Y细胞，侵染效率达到95%以上，侵染效果如图4－6所示。
4．RT-PCR结果侵染后72小时收样，通过采用实时荧光定量PCR的检测，以GAPDH基因作为内参，对各组慢病毒感染后GSK-3βmRNA含量结果进行处理，并计算其与阴性对照中GSK-3βmRNA的比例。结果表明，所设计的2个特异性干扰片段都能有效抑制GSK-3β基因的表达，GP-Supersilencing-shGSK-3β-1292和2169的干扰效率高，被感染的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞GSK-3βmRNA表达量仅为对照的39%和34%，即干扰率为61%和66%，如图7所示。。
5．Western blot结果转染后72小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western blot检测，GSK-3β和GAPDH的灰度比值显示，GSK-3β-homo-1292及GSK-3β-homo-2169的GSK-3β条带亮度都有所减弱，其中以GSK-3β-homo-1292更为明显，抑制率为96%，说明该质粒抑制GSK-3β的效率较高。如图8所示。
Claims (3)
1.一种靶向GSK3β基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于阿尔茨海默病GSK3β基因相关治疗性物质，该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养获得；其中，
所述的GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体是在GP-Supersilencing载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是XhoI和HpaI；所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：
（1）GSK3β-homo-1292寡核苷酸序列1：
正义链:
5’-TGCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTTTTTTC-3’
反义链:
5’-TCGAGAAAAAAGCTAGATCACTGTAACATAGTTCTCTTGAAACTATGTTACAGTGATCTAGCA-3’
（2）GSK3β-homo-2169寡核苷酸序列2：
正义链:
5’-TGCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTTTTTTC-3’
反义链:
5’-TCGAGAAAAAAGCAGCGTCAGATGCTAATACTTCTCTTGAAAGTATTAGCATCTGACGCTGCA-3’。
2.根据权利要求1所述的靶向GSK3β基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法，包括步骤如下：
a.根据GSK3βmRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的GSK3β-homo-1292寡核苷酸序列1、GSK3β-homo-2169寡核苷酸序列2中的一种。
b.然后将所述的双链DNA片段连接到GP-Supersilencing载体的多克隆位点中构建成GP-Supersilencing-sh GSK3β重组载体；
c.再将所述的GP-Supersilencing-shGSK3β重组载体与pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养，得靶向GSK3β基因RNA干扰的重组慢病毒载体。
3.权利要求1所述的靶向GSK3β基因的siRNA重组慢病毒表达载体在制备治疗阿尔茨海默病GSK3β相关性基因药物中的应用。
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- 2012-05-18 CN CN201210156759XA patent/CN102703508A/zh active Pending
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