CN102307593A - 轴突变性的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及神经病症和神经系统损伤的治疗。本发明尤其提供使用特定靶蛋白质的调节剂调节神经元或其部分，如轴突的变性的方法。

Description

轴突变性的调节
发明领域
本发明一般涉及神经病症和神经系统损伤的治疗。本发明尤其涉及特定靶蛋白和过程的调节剂在抑制神经元和轴突变性的方法中的用途。
发明背景
神经元或轴突变性在神经系统的正确发育中起关键作用，并且是许多神经变性疾病的标志，所述神经变性疾病包括例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默氏病、和帕金森氏病，以及脑和脊髓的挫伤。这些疾病和损伤对患者和看护者具有破坏性，并还产生极大的经济负担，目前仅在美国年度费用就超过几千亿美元。用于这些疾病和状况最近的治疗是不足够的。增加这些疾病产生的问题紧急性的是这样的事实，许多此类疾病与年龄相关，因此它们的发病率随人口统计学改变而快速升高。极其需要开发有效的方法来治疗神经变性疾病和神经系统损伤。
发明概述
本发明提供用于抑制神经元或其部分(例如，神经元细胞体、轴突，或树突)变性的方法。所述方法包括向神经元或其部分施用这样的试剂，其调节：(i)神经元或其部分中靶蛋白的活性或表达，或(ii)神经元或其部分中的过程。
可在本发明方法中靶向的蛋白质的实例包括携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、β-联蛋白、转录因子4(TCF4)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，或β-联蛋白，而可靶向的过程的实例是转录和蛋白质合成。
神经元或其部分可由选自以下的神经元组成或可以在选自以下的神经元内：小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮层神经元、交感神经元，和海马神经元。
试剂可以是例如，靶蛋白或过程的抑制剂。此外，所述试剂例如可以选自抗体、多肽、肽、肽体(peptibodies)、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子，和多糖。在抗体的情况下，抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体，或抗体片段(例如，Fv、Fab、Fab′或F(ab′)2片段)。在小分子的情况下，所述试剂例如可以选自MG132、SB 415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、SB 202190、SB 239063、SB239069、SB 203580、SB 203580HCl、AG 556、AG 555、AG 494、PD168393、Tyrphostin B44、Tyrphostin B42(AG 490)、LY 294022、茴香霉素、放线菌酮、Roscovitine、毛喉素、NKH 477、放线菌素D、SP600125、Bax通道阻断剂、ZD7288、STO-609、bortezomid、双硫仑、pamapimod、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼二甲苯磺酸盐、盐酸去甲金霉素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素，及其药学上可接受的盐。
神经元或其部分可存在于受试者，如人受试者中。所述受试者可以例如患有或处于发生疾病或状况的风险中，所述疾病或状况选自(i)神经系统的病症，(ii)在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗继发的神经系统状况，(iii)由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关的神经变性，(vi)记忆丧失，和(vii)精神疾病。
神经系统病症的实例包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝耳氏麻痹、重症肌无力、肌肉萎缩症、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征(invertebrate disk syndrome)、颈椎病、网状组织病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉症、阿尔茨海默氏病、亨延顿舞蹈病、帕金森病、帕金森氏阳性病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、卢伊体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病、吉-巴综合征、多发性硬化、沙-马-图病、朊病毒病、克-雅病、吉斯特曼-斯召斯列综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)、牛海绵样脑病、神经鞘磷脂沉积病、癫痫、和艾滋病痴呆综合征。
疼痛的实例包括慢性痛、纤维肌痛、脊柱痛、腕管综合征、来自癌症、关节炎、坐骨神经痛、头痛的疼痛、来自手术、肌肉痉挛、背痛、内脏痛的疼痛、来自损伤、牙痛、神经痛的疼痛，如神经源性疼痛或神经性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、突出盘、韧带撕裂和糖尿病。
继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统状况的实例包括由糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎、肾功能异常、科罗拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、肉状瘤病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮和淀粉状蛋白病引起的外周神经病或神经痛。
由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤的实例包括由暴露在毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化学治疗剂、氨苯砜、HIV药物、降低胆固醇的药物、心脏或血压药物、和甲硝唑引起的神经损伤。额外的实例包括烧伤、创伤、手术、意外伤害、局部缺血、对冷温度的延长暴露、中风、颅内出血、和大脑出血。
精神疾病的实例包括精神分裂症、妄想性障碍、情感分裂性精神障碍、精神分裂症(schizopheniform)、分享性精神障碍、精神病、偏执型人格障碍、精神分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、自恋性人格障碍、强制性障碍、妄想、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社会恐怖、创伤后应激障碍、焦虑障碍、和冲动控制障碍。
眼相关神经变性的实例包括青光眼、网络状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、与湿或干AMD相关的光受体变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病、和视神经炎。青光眼的实例包括原发性青光眼、低眼压性青光眼、原发性闭角型青光眼、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角闭角型青光眼、色素性青光眼、脱落性青光眼、发育性青光眼、继发性青光眼、晶状体溶解性青光眼、眼内出血继发的青光眼、外伤性青光眼、新生血管性青光眼、药物诱导的青光眼、中毒青光眼、和眼内瘤相关性青光眼、视网膜脱离、眼睛的严重化学灼伤、和虹膜萎缩。
根据本发明的方法将神经元或其部分与试剂接触可包括向受试者施用包括所述试剂的药物组合物。例如可通过静脉内输注；通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内或损伤内途径注射；或通过局部或眼睛应用进行施用。此外，本发明的方法可包括向受试者施用一种或多种额外的药物试剂。
在其它实例中，根据本发明的方法治疗的神经元或其部分是离体或体外的(例如神经移植物或神经移植体)。
本发明还包括鉴定试剂的方法，所述试剂用于抑制神经元或其部分的变性。这些方法包括使神经元或其部分与候选试剂在轴突或神经元变性的测定中(例如，抗神经生长因子(NGF)抗体、血清剥夺/KCl减少、和/或鱼藤酮治疗)进行接触。在候选试剂存在下对神经元或其部分相对于对照的减少变性的检测表明，对用于抑制神经元或其部分变性的试剂的鉴定。所述候选试剂例如可以选自抗体、多肽、肽、肽体、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子，和多糖。
本发明还包括药物组合物和试剂盒，其含有如上述用于抑制神经元或其部分变性的一种或多种试剂。所述药物组合物和试剂盒可包括例如选自以下的一种或多种试剂：MG132、SB 415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、SB 202190、SB 239063、SB 239069、SB 203580、SB 203580HCl、AG 556、AG 555、AG 494、PD168393、Tyrphostin B44、Tyrphostin B42(AG 490)、LY294022、茴香霉素、放线菌酮、Roscovitine、毛喉素、NKH 477、放线菌素D、SP600125、Bax通道阻断剂、zD7288、STO-609、bortezomid、双硫仑、pamapimod、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼二甲苯磺酸盐、盐酸去甲金霉素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素，及其药学上可接受的盐。所述药物组合物和药盒可任选地包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。此外，所述药物组合物和药盒可任选地包括在抑制神经元或其部分变性的方法中使用所述药物组合物和药盒的说明书。
在本发明的任何方法、组合物和药盒中，所述试剂可以是DLK信号转导抑制剂(例如，靶向DLK的siRNA分子，其包含例如想要的
GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ ID NO：1)、
GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、
GGACATCGCCTCCGCTGA TTT(SEQ ID NO：3)、或
ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、或
GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQ ID NO：5)、
TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、
GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)、或
TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列；抗体，如抗体317、抗体318、抗体319、抗体320、抗体321、抗体322、靶向TTGGATGAAGCCATTAGACTA(SEQ ID NO：9)的JNK1序列的siRNA分子、靶向ACCTTTAATGGACA ACATTAA(SEQ ID NO：10)或AAGGATTAGCTTTGTATCATA(SEQ ID NO：11)的JNK2序列的siRNA分子、靶向CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(SEQ ID NO：12)的JNK3序列的siRNA分子、SP600125、JNKV抑制剂、JNKVIII抑制剂、SC-202673、SY-CCMO1、SP600125、As601245、XG-102、杨梅黄酮、T278ADLK、S281A DLK、S152A DLK、和DLK的亮氨酸拉链结构域)、GSK3β抑制剂(例如，SB415287、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、和氯化锂)、EGFR途径抑制剂(例如埃罗替尼、Tyrphostin B44、Tyrphostin B42/AG490、AG555、AG494、PD168393、SB203580、SB239063、SB202190、SB239069、STO-609和SP600125)，或G-蛋白抑制剂(例如SCG292676和百日咳毒素)。
在任何上述方法中，施用试剂导致以下疾病的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)症状减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗继发的神经系统病症；由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。这些症状的非限制性实例包括震颤、运动缓慢、运动失调、平衡缺失、抑郁、降低的认知功能、短期记忆丧失、长期记忆丧失、意识错乱、人格改变、语言困难、感知觉丧失、对触觉灵敏、四肢麻木、肌无力、肌肉麻痹、肌肉痛性痉挛、肌痉挛、食习惯的明显改变、过度恐惧或忧愁、失眠、妄想、幻觉、疲劳、背痛、胸痛、消化问题、头痛、快速的心率、头晕、视力模糊、视力区域的阴影或缺失、视物变形症、色觉损伤、暴露在强光后视觉功能的降低恢复，和视觉对比敏感性丧失。
在任何上述方法中，与不施用所述试剂的受试者的对照群体相比，施用导致患以下疾病的可能性降低至少10％(例如，降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗继发的神经系统状况；由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。
本发明还提供用于激活神经元或其部分变性的方法。这些方法包括向神经元或其部分施用试剂，所述试剂调节：(i)神经元或其部分中靶蛋白的活性，或(ii)神经元或其部分中的过程。靶蛋白例如可以选自携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，或β-联蛋白，而所述过程可以是例如转录或蛋白质合成。此外，所述试剂例如可以是靶蛋白或过程的激活剂(在上文列出的靶标情况下，排除腺苷酸环化酶)。在激活上述神经元或其部分变性的方法中，靶蛋白的调节可以是GSK3β的活性或表达升高、β-联蛋白的活性或表达降低、和/或TCF4的活性或表达丧失。
本发明还提供特异性结合DLK磷酸化形式的纯化的抗体(例如，抗体318、抗体319、抗体320、抗体321、或抗体322)，和抑制性核酸(例如siRNA)，其包含期望的GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ IDNO：1)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(SEQ ID NO：3)、或ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、或GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQ ID NO：5)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)、或TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列，所述序列介导DLK表达的降低。
附图简述
图1显示利用抗NGF抗体治疗神经元20小时，导致轴突变性。上排中的两个图像显示在利用和不利用抗NGF抗体治疗20小时的情况下，利用Tuj1(神经元特异的β-微管蛋白)抗体显示的神经元。下排的两个图像显示与或不与(对照)50μg/ml抗NGF抗体温育的情况下，利用肌动蛋白抗体显示的神经元。
图2显示用抗NGF抗体培养1、3、6、9、12或16小时的神经元中的膨体形式。
图3显示用抗NGF抗体培养16小时的轴突缺少伸长的线粒体，并在膨体中显示线粒体累积。
图4显示，在用抗NGF抗体培养0到48小时的轴突中，微管网络在肌动蛋白或神经丝网络前不进行分解。
图5阐明了华勒氏变性，其在从神经元细胞体分离的轴突中发生(上图；Raff等，Science 296(5569)：868-871，2002)，并且显示与对照(下图；Araki等，Science 305(5686)：1010-1013，2004)相比，缓慢华勒氏变性(WIdS)突变体中损伤后的轴突变性的显著延迟。
图6A-6D显示在基于抗NGF抗体的NGF撤除测定中蛋白酶体抑制剂和GSK抑制剂防止轴突变性。
图7A-7D显示在基于抗NGF抗体的NGF撤除测定中p38MAPK抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂防止轴突变性。
图8A-8D显示在基于抗NGF抗体的NGF撤除测定中转录抑制剂和EGFR激酶抑制剂防止轴突变性。
图9A-9D显示在基于抗NGF抗体的NGF撤除测定中JNK抑制剂和Bax通道阻断剂防止轴突变性。
图10A-10D显示在基于抗NGF抗体的NGF撤除测定中Ih通道阻断剂和CAMKK抑制剂防止轴突变性。
图11是这样的图像，其显示当在NGF撤除(t＝0)或在NGF撤除后3、6、9或12小时加入时，GSK3(30μM SB415286)、EGFR激酶(10μMAG555)、p38MAPK(30μM SB239063)、CAMKK(15μM STO-609)和JNK(10μM SP600125)的抑制剂活性。
图12阐明Campenot室，其中体环境(细胞体)与轴突环境是分开的。
图13显示轴突变性在Campenot室研究中定位并且无细胞凋亡的情况下进行，在所述Campenot室研究中NGF撤除在含轴突的室中发生。通过微管蛋白免疫荧光显示变性。
图14显示在图13阐明的基于Campenot室的测定中细胞体区室中没有变性迹象。
图15显示在存在30μM SB415(GSK抑制剂；GSKi)或15μM Act D(转录抑制剂；TXNi)的情况下，细胞体(左图)而非轴突(右图)受到保护免于局部变性。
图16显示在存在10μM AG555(EGFR抑制剂；EGFRi)或30μMSB239(p38抑制剂；p38i)的情况下，暴露在抗NGF抗体中的轴突(右图)而非细胞体(左图)受到保护免于局部变性。
图17是这样的图像，其显示Campenot室中轴突变性的定量，其中在轴突(轴突)或体环境(细胞)中存在或缺少(DMSO)15μM放线菌素D(ActD)、30μM SB415286(SB415)、10μM AG555或30μM SB239063(SB239)的情况下向轴突环境中加入抗NGF抗体。
图18是基于来自此处描述的筛选的数据的模型。
图19显示，当在Campenot室中从轴突区室去除NGF时，细胞体显得更小。
图20显示轴突区室中NGF被剥夺的许多神经元具有增加的胱天蛋白酶-3切割，并显示核凝缩。(神经元健康可能受膜染料DiI的影响)。
图21是这样的图，其显示在细胞体或轴突区室中NGF撤除开始(t＝0)和NGF撤除1、3、6、9和12小时后GSK3的活性(通过磷酸化GSK3β的降低水平测定)。
图22是这样的图，其显示在细胞体或轴突区室中NGF撤除开始(t＝0)和NGF撤除1、3、6、9和12小时后JNK的活性(通过磷酸化JNK的增加水平测定)。
图23显示当向细胞体区室中加入细胞体抑制剂(30μM SB415(GSKi)和15μM Act D(TXNi))时，观察到具有膨体的大量轴突，以及片段化的轴突。向轴突区室中加入轴突抑制剂(10μM AG555(EGFRi)和30μM SB239(p38i))显示较少的膨体，并且所述轴突似乎直接进行片段化。
图24显示在用GSK、EGFR和p38抑制剂处理的NGF剥夺神经元中可能具有更多的功能线粒体，但仍然没有伸长的线粒体。
图25显示GSK抑制剂SB415可在损伤后延迟轴突变性。
图26显示，整体NGF撤除后，10μM或25μM GSK抑制剂阻断轴突变性，但不阻断细胞死亡。
图27显示与非转基因对照(NTG；左图)相比，EGFR表达在用抗EGFR抗体(右图)染色的SOD1小鼠(Tg)脊髓切片中增加。
图28显示EGFR通常在神经元(运动神经元)中表达，并且与非转基因对照(Non-Tg)相比，磷酸化的EGFR(pEGFR)的水平在ALS SOD1小鼠模型(SOD1-Tg)中增加。
图29显示与非转基因对照(Non-Tg)相比，轴突数量在ALS SOD1小鼠模型(SOD1-Tg)中减少，并且ALS SOD1小鼠模型中磷酸化的EGFR(pEGFR)与轴突部分共定位。
图30显示JNK(5μM SP600125)、CaMKK(5μM STO-609)、EGFR(1μM或10μM AG555)、p38(5μM SB239063)和GSK(10μM SB415286)的小分子抑制剂保护小脑颗粒神经元免于血清剥夺/KCl减少。
图31显示EGFR、GSK、CaMKK、JNK和p38的小分子抑制剂保护海马神经元免于10μM鱼藤酮损害。
图32显示EGFR、GSK、CaMKK、JNK和p38的小分子抑制剂保护皮层神经元免于10μM鱼藤酮损害。
图33显示使用对EGFR(左上图)、Her2(右上图)、Her3(左下图)和Her4(右下图)特异的抗体，通过免疫细胞化学检测背根神经节神经元中轴突上的ErbB受体。
图34显示使用免疫细胞化学，EGFR在背根神经节神经元中轴突中表达。
图35显示当加入到背根神经节神经元时100μg/mL EGF不诱导轴突变性，而在处理的神经元中加入100μg/mL EGF诱导ERK的磷酸化。
图36显示在背根神经节神经元中EGFR胞外域(50μg/mL)不阻断NGF撤除诱导的轴突变性。
图37显示在背部脊髓外植体中3.4μM、11.1μM、33.3μM和100μM
Figure BDA0000069844070000101
(埃罗替尼)阻断变性。
图38显示在轴突变性中携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)在JNK上游起作用。与对照质粒或编码激酶死亡的DLK(DLK-KD)的质粒假转染的细胞相比，293细胞中编码野生型DLK的质粒的转染导致JNK激活(如通过磷酸化的JNK的升高水平测定)。背根神经节神经元中通过siRNA击倒DLK表达保护轴突免于NGF撤除诱导的变性。使用定量PCR证实了与对照siRNA(右下图)相比，使用DLK siRNA对DLK表达的击倒。
图39显示DLK信号转导的siRNA击倒延迟了局部轴突变性。
图40A和40B描述了这样的实验结果，其使用相差显微术观察神经元来评估DLK击倒对NGF撤除诱导的交感神经元变性的影响。
图41显示与对照siRNA(NT)处理的神经元相比，使用DLK siRNA(DLK)击倒DLK表达保护交感神经元免于喜树碱和长春新碱诱导的细胞凋亡。
图42显示与用编码野生型DLK(DLK)的质粒转染的神经元相比，编码激酶死亡DLK(KD)的质粒转染交感神经元保护神经元免于NGF撤除诱导的细胞凋亡。
图43A-43D显示这样的实验结果，其评估实施例1SA中描述的抗pDLK抗体的结合特异性。图43A显示在显性失活DLK和对照激酶MLK3存在下，此处描述的每一抗pDLK抗体与DLK的结合的蛋白质印迹分析。图43B显示抗pDLK抗体318和319与培养的293T细胞的结合的免疫荧光显微图像，所述293T细胞转化有DLK(上面两个图像)或对照激酶MLK3(下面两个图像)。图43C和43D显示使用JNK和磷酸JNK抗体的蛋白质印迹。
图44A和44B显示在野生型和SOD1突变体小鼠中疾病末期(图43A)和症状发作(图44B)时抗pDLK抗体(抗体318)与脊髓切片的结合。图44C描述了在人阿尔茨海默氏病患者皮层样品中pDLK、pJNK和pcJUN水平的蛋白质印迹分析。
图45A和45B描述了这样的实验结果，其评估响应交感神经元和背根神经节神经元中的NGF撤除胁迫；和皮层神经元中的长春新碱诱导的胁迫，DLK沉默对JNK磷酸化的影响，如实施例15C和实施例14B中所述。
图46显示JNK抑制剂对经受NGF撤除胁迫的DRG外植体的保护效果，如实施例15C中所述。
图47描述了这样的实验结果，其评估DRG神经元中分别沉默JNK1、JNK2、JNK3，和沉默JNK2与JNK3一起对NGF撤除胁迫后观察到的轴突变性的影响，如实施例15C中所述。
图48A显示DLK siRNA和对照siRNA对皮层神经元存活的影响。图48B显示DLK siRNA和对照siRNA对交感神经元存活的影响。
图49是一组免疫显微照片，其显示G偶联蛋白受体的抑制剂(SCH202676；10μM或100μM)在DRGs中防止NGF撤除诱导的变性的能力。
图50是一组免疫显微照片，其显示SCH 202676(0.1μM或1μM)在DRGs中防止NGF撤除诱导的变性的能力。
图51是一组免疫显微照片，其显示0.01μg/mL、0.1μg/mL或1μg/mL百日咳毒素(G蛋白信号转导的抑制剂)在DRGs中防止NGF撤除诱导的变性的能力。
图52是大鼠海马神经元的一组免疫显微照片，其显示活性突变体GSK(GSK3S9A)、野生型TCF4，和突变体失活的TCF4的表达对变性的影响。
发明详述
A.定义
术语“靶标”用于此处指蛋白质和过程，当受影响其活性的试剂调节时，抑制或降低轴突变性。当与抑制其活性的试剂接触时，此处描述的大多数靶标抑制或降低轴突变性，但本发明的靶标还包括当激活时抑制或降低轴突变性的蛋白质和过程。本发明的示例性靶标如下：携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，或β-联蛋白、转录和蛋白质合成。在表1中列出了对若干这些靶标的一组通用备选命名。所述靶标包括天然的人序列，和来自猴子、小鼠、大鼠和其它非人哺乳动物的这些序列的同源物，包括所有天然发生的变体，如可变剪接的和等位变体与同种型，及其可溶形式。在表1中还提供了示例性的非限制性序列参考。也可认为额外的序列，包括多种靶标同种型、变体、同源物和片段的序列是本发明的靶标。
表1
Figure BDA0000069844070000131
Figure BDA0000069844070000141
Figure BDA0000069844070000151
Figure BDA0000069844070000161
Figure BDA0000069844070000171
当用于描述此处公开的多种蛋白质时，“分离的”表示已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的蛋白质。其天然环境的污染物组分是干扰蛋白质用途(例如在治疗或抗体制备中的用途)的物质，并可包括酶、激素、和其它蛋白质性质的或非蛋白质性质的溶质。在多个实施方案中，将蛋白质纯化至(i)足以通过使用旋杯式顺序分析仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，和/或(ii)使用考马斯兰或银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE得到的同质性，和/或(iii)通过质谱或肽谱技术得到的同质性。分离的蛋白质包括重组细胞内原位蛋白质，因为将不存在正在讨论的蛋白质的天然环境中的至少一种组分。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。此处描述的分离的靶蛋白(或其片段)可用于针对所述靶蛋白制备如此处所示的抗体。
“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，其在所讨论的核酸的天然来源中通常结合所述至少一种污染物核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现的形式或背景的形式或背景。分离的核酸分子因此与天然细胞中存在的核酸分子区分开。然而，分离的核酸分子包括在通常表达该核酸分子的细胞中含有的核酸分子，其中例如所述核酸分子处于不同于天然细胞的染色体位置中。分离的核酸分子的实例是缺少在天然环境中与其邻近的5′和/或3′侧翼序列的核酸分子。
如此处所用，术语“拮抗剂”和“抑制剂”指这样的试剂，其能够阻断、中和、抑制、取消、降低和/或干扰靶标的一种或多种活性和/或降低如此处所述一个或更多靶蛋白的表达(或编码一个或更多靶蛋白的核酸的表达)。它们包括例如，抗体、多肽、肽、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)和其它抑制性RNAs、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、适体和肽体。如此处所述特定靶标(即除腺苷酸环化酶以外的靶标)的拮抗剂或抑制剂一般抑制或降低轴突变性(例如与未用抑制剂处理的对照相比，降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)，如此处所述。与未用抑制剂处理的靶蛋白的表达和/或活性相比，抑制剂可降低靶蛋白的活性和/或表达至少10％(例如降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或甚至100％)。“DLK信号转导抑制剂”是这样的试剂，其能够降低DLK蛋白质(或编码DLK蛋白质的核酸)的活性(例如激酶活性)或表达，和/或降低参与DLK信号转导途径的一个或更多蛋白质(例如JNK1、JNK2、JNK3、cJun(例如，cJun-63和cJun-73)、MKK4和MKK7)的活性和/或表达。DLK信号转导抑制剂的实例包括siRNA分子，其降低编码以下的核酸的表达：DLK(例如，期望的，GCACTGAATTGGACAACTCTT(SEQ ID NO：1)、GAGTTGTCCAATTCAGTGCTT(SEQ ID NO：2)、GGACATCGCCTCCGCTGATTT(SEQ ID NO：3)、或ATCAGCGGAGGCGATGTCCTT(SEQ ID NO：4)、或GCAAGACCCGTCACCGAAATT(SEQ ID NO：5)、TTTCGGTGACGGGTCTTGCTT(SEQ ID NO：6)、GCGGTGTCCTGGTCTACTATT(SEQ ID NO：7)、或TAGTAGACCAGGACACCGCTT(SEQ ID NO：8)的序列)、JNK1(例如靶向TTGGATGAAGCCATTAGACTA(SEQ ID NO：9)的JNK1序列的序列)、JNK2(例如靶向ACCTTTAATGGACA ACATTAA(SEQ ID NO：10)或AAGGATTAGCTTTGTATCATA(SEQ ID NO：11)的JNK2序列的序列)、JNK3(例如靶向CCCGCATGTGTCTGTATTCAA(SEQ ID NO：12)的JNK3序列的序列)、cJun(例如cJun-63和cJun-73)、MKK4和MKK7。DLK抑制剂的额外实例包括结合DLK蛋白(例如，识别非磷酸化或磷酸化DLK的抗体，如此处描述的317、318、319、320、321和322抗体)、JNK1、JNK2、JNK3、cJun(例如cJun-63和cJun-73)、MKK4和/或MKK7的抗体、JNK活性的抑制剂(例如SC-202673、SY-CC-401、SP600125、JNKV抑制剂、JNKVIII抑制剂、AS601245和XG-102，以及来自EMDBiosciences的目录号420119、420130、420131、420123、420116、420118、420136、420129、420135、420134、420133、420140和420128)；MKK4活性的抑制剂(例如，WO 04/058764中描述的杨梅黄酮和抑制剂)，和MKK活性的抑制剂(例如美国专利号7,195,894和WO 04/002532中描述的抑制剂)。DLK抑制剂还可以是DLK蛋白质的显性失活形式或激酶死亡形式(例如编码DLK蛋白质的显性失活形式或激酶死亡形式的核酸)，如T278A DLK、S281A DLK、S152A DLK和DLK的亮氨酸拉链结构域。
抑制剂的另一实例是“GSK3β抑制剂”。GSK3β抑制剂指这样的试剂，其能够降低GSK3β(或编码GSK3β的核酸)的活性和/或表达，和/或降低一个或更多蛋白质(或编码一个或更多蛋白质的核酸)的活性和/或表达，所述一个或更多蛋白质激活GSK3β或GSK3β的一个或更多底物的表达或活性。GSK3β抑制剂的非限制性实例包括SB415286、GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII和氯化锂。
抑制剂的额外实例是“G蛋白抑制剂”。G蛋白抑制剂指这样的试剂，其能够降低一个或更多G蛋白或G蛋白偶联受体(GPCRs)的活性和/或表达(或编码G蛋白或GPCR的一个或更多核酸的表达)，和/或降低G蛋白或GPCR下游一个或更多蛋白质的活性和/或表达。G蛋白抑制剂的非限制性实例包括降低编码G蛋白或GPCR的核酸表达水平的siRNA分子、结合G蛋白或GPCR的抗体或肽体，或抑制G蛋白或GPCR活性的小分子或肽(例如SCH202676和百日咳毒素)。
抑制剂的另一实例是“EGFR途径抑制剂”。EGFR途径抑制剂指这样的试剂，其能够降低EGFR蛋白质(或编码EGFR的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中EGFR下游起功能的一个或更多蛋白质(例如，p38MAPK、CAMKK和JNK)的活性和/或表达。EGFR途径抑制剂的非限制性实例包括EGFR的抑制剂(例如，埃罗替尼、Tyrphostin B44、Tyrphostin B42/AG490、AG555、AG494和PD168393)、p38MAPK的抑制剂(例如，SB203580、SB239063、SB202190和SB239069)、CAMK的抑制剂(例如，STO-609)，和JNK的抑制剂(例如，SP600125)。EGFR途径抑制剂的额外实例包括结合EGFR、p38MAPK、CAMKK和/或JNK的抗体和肽体；和降低一个或更多核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码在细胞中EGFR下游起功能的蛋白质(例如，EGFR、p38MAPK、CAMKK和/或JNK)。
抑制剂的额外实例是“CAMKβ抑制剂”。CAMKβ抑制剂指这样的试剂，其能够降低CAMKβ蛋白质(或编码CAMKβ的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中CAMKβ下游起功能的一个或更多蛋白质的活性和/或表达。CAMKβ抑制剂的非限制性实例包括特异性结合CAMKβ的抗体和肽体，和降低一个或更多核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码在CAMKβ下游起功能的CAMKβ或蛋白质。
抑制剂的另一实例是“cdk5抑制剂”。cdk5抑制剂指这样的试剂，其能够降低cdk5蛋白质(或编码cdk5的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中cdk5下游起功能的一个或更多蛋白质的活性和/或表达。cdk5抑制剂的非限制性实例包括特异性结合cdk5的抗体和肽体，和降低一个或更多核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码在cdk5下游起功能的cdk5或蛋白质。
抑制剂的额外实例是“TCF4抑制剂”。TCF4抑制剂指这样的试剂，其能够降低TCF4蛋白质(或编码TCF4的核酸)的活性和/或表达，和/或降低受TCF4蛋白质调节的基因的活性和/或表达。TCF4抑制剂的非限制性实例包括特异性结合TCF4或受TCF4调节的基因编码的蛋白质的抗体和肽体，和降低编码TCF4的一个或更多核酸表达或降低受TCF4调节的基因编码的mRNA表达的siRNA分子。
抑制剂的额外实例是“β联蛋白抑制剂”。β联蛋白抑制剂指这样的试剂，其能够降低β联蛋白(或编码β联蛋白的核酸)的活性和/或表达，和/或降低受β联蛋白调节的基因的活性和/或表达。β联蛋白抑制剂的非限制性实例包括特异性结合β联蛋白或受β联蛋白调节的基因编码的蛋白质的抗体和肽体，和降低编码β联蛋白的一个或更多核酸表达或降低受β联蛋白调节的基因编码的mRNA表达的siRNA分子。
抑制剂的另一实例是“腺苷酸环化酶抑制剂”。腺苷酸环化酶抑制剂指这样的试剂，其能够降低腺苷酸环化酶蛋白质(或编码腺苷酸环化酶的核酸)的活性和/或表达，和/或降低在细胞中腺苷酸环化酶下游起功能的一个或更多蛋白质的活性和/或表达。腺苷酸环化酶抑制剂的非限制性实例包括特异性结合腺苷酸环化酶的抗体和肽体，和降低一个或更多核酸的表达的siRNA分子，所述核酸编码在腺苷酸环化酶下游起功能的腺苷酸环化酶或蛋白质。腺苷酸环化酶抑制剂的额外实例包括抑制腺苷酸环化酶活性的小分子(例如，forksolin和NKH 477)。
术语“激动剂”或“激活剂”此处用于指这样的试剂，其能够提高或激活此处所述靶标的一种或多种活性，并包括例如，抗体、多肽、肽、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)或其它抑制性RNAs、小分子(例如，小的无机分子)、多糖、多核苷酸、适体和肽体。如此处所述腺苷酸环化酶的激动剂或激活剂一般抑制或降低轴突变性，而认为此处所述其它特定靶标的激动剂或激活剂可以激活轴突变性。
此处术语“抗体”在本领域理解的最广泛意义上使用，并特异地涵盖例如，完整抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段(条件是它们显示希望的生物学活性)，和胞内抗体。
如此处所用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群中获得的抗体，即包含在所述群体的各抗体除少量存在的可能天然发生的突变外，是相同的。单克隆抗体是高度特异的，其指向单抗原位点或表位。此外，与多克隆抗体制剂(其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)不同，每一单克隆抗体指向抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体是有利的，因为可以合成它们，从而它们不受其它抗体的污染。修饰词“单克隆的”表示从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可通过Kohler等，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或通过重组DNA方法(参阅例如，美国专利号4,816,567)制备根据本发明使用的单克隆抗体。例如也可使用Clackson等，Nature 352：624-628，1991，和Marks等，J.Mol Biol.222：581-597，1991中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
抗体特异性地包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的抗体中对应序列相同或同源，或属于特定抗体种类或亚类，而链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体对应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示想要的生物学活性(例如，美国专利号4,816,567和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855，1984)。此处的目的嵌合抗体包括灵长类抗体，其包含来自非人灵长类(例如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，如其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；和单链抗体分子。
术语“多特异性抗体”在最广泛意义上使用，并特异地涵盖包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的抗体，其中VH-VL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个或更多生物分子上的超过一个不同表位)。如果所述多特异性抗体结合两个表位，其可命名为“双特异性抗体”。多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体、具有两个或更多VL和VH结构域的抗体、抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶标上两个或更多不同表位的能力。
“完整”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。在一个实例中，所述完整抗体具有一种或多种效应功能。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替代，所述人源化抗体具有想要的特异性和亲和力。在一些情况中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。可进行这些修饰，以进一步精炼抗体性能。一般而言，所述人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，并通常两个可变域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)，其中所有的或基本上所有的高变环对应非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有的或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的那些FRs。所述人源化抗体任选地还包含至少部分免疫球蛋白恒定域(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定域。对于其它细节，参阅例如Jones等，Nature 321：522-525，1986；Riechmann等，Nature 332：323-329，1988；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596，1992。
当用于此处时，术语“高变区”指抗体可变域的区域，其在序列上是高变的和/或形成结构上确定的环。所述高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的24-34、50-56和89-97位残基和重链可变域中的31-35、50-65和95-102位残基；Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变域中的26-32、50-52和91-96位残基和重链可变域中的26-32、53-55和96-101位残基；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917，1987)。在两种情况下，如下文更详细讨论，根据Kabat等，上文编号可变域残基。“构架”或“FR”残基是除此处定义的高变区中的残基外的那些可变域残基。
“亲本抗体”或“野生型”抗体是与此处公开的抗体变体相比，包含缺少一个或更多氨基酸序列改变的氨基酸序列的抗体。因此，所述亲本抗体一般具有至少一个高变区，其在氨基酸序列上不同于抗体变体的相应高变区的氨基酸序列。所述亲本多肽可包含天然序列(即，天然发生的)抗体(包括天然发生的等位变体)，或天然发生的序列的具有预先存在的氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其它改变)的抗体。术语“野生型”、“WT”、“wt”和“亲本”或“亲本的”抗体可互换使用。
如此处所用，“抗体变体”或“变体抗体”指具有不同于亲本抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。在一个实例中，所述抗体变体包含重链可变域或轻链可变域，其具有在自然界中没有发现的氨基酸序列。此类变体与亲本抗体必定具有低于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，所述抗体变体具有这样的氨基酸序列，其与亲本抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有约75％至低于100％，例如约80％至低于100％、约85％至低于100％、约90％至低于100％、或约95％至低于100％的氨基酸序列同一性或相似性。所述抗体变体一般是在其一个或更多高变区中或其附近包含一个或更多氨基酸改变的抗体变体。
“氨基酸改变”指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。示例性改变包括插入、替代和缺失。“氨基酸替代”指预定氨基酸序列中现有的氨基酸残基替换成另一个不同的氨基酸残基。
“替换”氨基酸残基指在氨基酸序列中替换或替代另一氨基酸残基的氨基酸残基。所述替换残基可以是天然发生的或非天然发生的氨基酸残基。
“氨基酸插入”指向预定氨基酸序列中引入一个或更多氨基酸残基。所述氨基酸插入可包含“肽插入”，在所述情况下向预定氨基酸序列中引入包含肽键连接的一个或更多氨基酸残基的肽。其中所述氨基酸插入包括插入肽，可通过随机诱变产生插入的肽，从而其具有在自然界中不存在的氨基酸序列。“邻近高变区”的氨基酸改变指在高变区的N末端和/或C末端引入或替代一个或更多氨基酸残基，从而至少一个插入的或替换氨基酸残基与正在讨论的高变区的N末端或C末端氨基酸残基形成肽键。
“天然发生的氨基酸残基”是一般选自以下的遗传密码编码的氨基酸残基：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。
“非天然发生的氨基酸残基”此处指除上文列出的那些天然发生的氨基酸残基外的氨基酸残基，其能够共价结合多肽链中邻近的氨基酸残基。非天然发生的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如在Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336，1991中描述的那些。为了产生此类非天然发生的氨基酸残基，可使用Noren等，Science 244：182，1989，和Ellman等，上文的方法。简言之，那些方法包括利用非天然发生的氨基酸残基化学激活抑制型tRNA，接着进行RNA的体外转录和翻译。
在整个公开内容中，参考Kabat，E.A.，等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)的编号系统。在这些一览表中，Kabat列出了每一亚类抗体的许多氨基酸序列，并列出了该亚类中每一残基位置上最常出现的氨基酸。Kabat使用向列出的序列中每一氨基酸分配残基编号的方法，并且用于分配残基编号的这种方法在本领域中成为了标准。在该说明书中遵循所述Kabat编号方案。为了本发明的目的，向Kabat一览表中不包括的候选抗体氨基酸序列分配残基编号，遵循以下步骤。一般而言，所述候选序列与Kabat中的任何免疫球蛋白序列或任何共有序列比对。可通过手动或计算机使用通常接受的计算机程序，如Align 2程序完成比对。可通过使用大多数Fab序列常见的一些氨基酸残基方便比对。例如，轻链和重链各自通常具有两个半胱氨酸，其具有相同的残基编号；在VL结构域中，两个半胱氨酸通常在残基编号23和88上，而在VH结构域中，两个半胱氨酸通常在编号22和92上。构架残基一般，但不总是具有大概相同数量的残基，然而CDRs的大小将是变化的。例如，在来自候选序列的CDR(其比与其比对的Kabat序列中的CDR长)的情况下，通常向残基编号添加后缀，以表示额外残基的插入。对于例如与Kabat序列比对残基34和36，但在它们之间没有残基来与残基35比对的候选序列中，编号35简单地不分配给残基。
如此处所用，具有“高亲和力”的抗体是具有纳摩尔(nM)范围或更高范围的KD，或解离常数的抗体。“纳摩尔范围或更高”的KD可表示为XnM，其中X是低于约10的数字。
术语“丝状噬菌体”指能够在其表面上展示异源多肽的病毒颗粒，并包括但不限于fl、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可含有选择标记，如四环素(例如，“fd-tet”)。多种丝状噬菌体展示系统为本领域技术人员所熟知(参阅例如，Zacher等，Gene 9：127-140，1980，Smith等，Science 228：1315-1317，1985；和Parmley等，Gene 73：305-318，1988)。
术语“淘选”用于指多轮筛选过程，其用于鉴定和分离携带化合物(如对靶标具有高亲和力和特异性的抗体)的噬菌体。
术语“短的干扰RNA(siRNA)”指干扰基因表达的小的双链RNAs。siRNA是RNA干扰的介质，通过所述过程双链RNA沉默同源基因。siRNA通常由长度为约15-25个核苷酸的两条单链RNAs(其形成双链体)组成，其可包括单链突出端。酶促复合体，例如聚合酶对双链RNA的加工导致切割双链RNA，产生siRNAs。RNA干扰(RNAi)沉默复合体使用siRNA的反义链来指导mRNA切割，由此促进mRNA降解。例如在哺乳动物细胞中，为了使用siRNAs沉默特异基因，选择碱基配对区来避免与不相关mRNA的偶然互补。在本领域中，例如Fire等，Nature 391：806-811，1998，和McManus等，Nat.Rev.Genet.3(10)：737-747，2002已经鉴定了RNAi沉默复合体。
术语“干扰RNA(RNAi)”此处用于指双链RNA，其导致特异mRNAs的催化降解，并因此可用于抑制/降低特定基因的表达。
如此处所用，术语“病症”一般指得益于本发明的试剂或抑制剂治疗的任何状况，包括此处所述靶标的有效量的抑制剂(或激活剂，在腺苷酸环化酶的情况下)治疗的任何疾病或病症。待于此处治疗的病症的非限制性实例包括在下文本申请E部分中列出的那些。
术语“治疗”、和“疗法”用于此处指治愈性治疗、预防性治疗，和预防性治疗。连续治疗或施用指在至少每日基础上的治疗，在治疗中不中断一天或更多天。间歇治疗或施用，或间断方式的治疗或施用指不连续，但自然循环的治疗。本发明方法的治疗可导致疾病或病症的完全缓解或治愈，或疾病或病症的一种或多种症状的部分改善，并且可以是暂时性的或永久性的。
短语“预防轴突变性”、“预防神经元变性”、“抑制轴突变性”或“抑制神经元变性”用于此处包括(i)在新诊断患有神经变性疾病或处于发生新的神经变性疾病的风险中的患者中抑制或防止轴突或神经元变性的能力，和(ii)在早已患有，或具有神经变性疾病症状的患者中抑制或防止其它轴突或神经元变性的能力。防止轴突或神经元变性包括降低或抑制轴突或神经元变性，其特征在于轴突或神经元变性的完全或部分抑制。这可通过例如神经系统功能的分析来评估。上文列出的术语也包括体外和离体方法。此外，短语“防止神经元变性”和“抑制神经元变性”包括完整神经元或其部分，如神经元细胞体、轴突和树突方面的这种抑制。施用此处描述的一种或多种试剂可导致受试者或群体与不接受此处描述的一种或多种试剂的对照受试者或群体相比，以下疾病的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9)症状减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统状况；由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病(例如，震颤、运动缓慢、运动失调、平衡缺失、抑郁、降低的认知功能、短期记忆丧失、长期记忆丧失、意识错乱、人格改变、语言困难、感知觉丧失、对触觉灵敏、四肢麻木、肌无力、肌肉麻痹、肌肉痛性痉挛、肌痉挛、食习惯的明显改变、过度恐惧或忧愁、失眠、妄想、幻觉、疲劳、背痛、胸痛、消化问题、头痛、快速的心率、头晕、视力模糊、视力区域的阴影或缺失、视物变形症、色觉损伤、暴露在强光后视觉功能的降低恢复，和视觉对比敏感性丧失)。与不施用此处描述的一种或多种试剂的神经元群体或受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量相比，施用此处描述的一种或多种试剂可导致神经元群体或受试者中变性的神经元(或其神经元体、轴突或树突)的数量减少至少10％(例如，减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)。与不用此处描述的一种或多种试剂治疗的对照受试者或群体相比，施用此处描述的一种或多种试剂可导致受试者或受试者群体中发生以下疾病的可能性降低至少10％(例如，降低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)：神经系统病症；继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统状况；由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病。
术语“施用”用于此处指使神经元或其部分与此处描述的抑制剂接触。这包括向存在神经元或其部分的受试者中施用抑制剂，以及向培养神经元或其部分的培养基中引入抑制剂。
术语“神经元”用于此处表示神经系统细胞，其包括中央细胞体或体细胞，和两种类型的伸展或突出：树突，大多数神经元信号一般通过所述树突传递到细胞体，和轴突，大多数神经元信号一般通过所述轴突从细胞体传递到效应细胞，如靶神经元或肌肉。神经元可将信息从组织和器官传递到中枢神经系统(传入神经元或感觉神经元)，并将信号从中枢神经系统传递到效应细胞(传入神经元或运动神经元)。命名为中间神经元的其它神经元连接中枢神经系统(大脑和脊柱)内的神经元。经受本发明治疗的神经元类型的某些特定实例包括小脑颗粒神经元、背根神经节神经元，和皮层神经元。
术语“哺乳动物”此处用于指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、高等非人灵长类、啮齿类，和家畜及耕畜，如奶牛、马、狗和猫。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(同时发生)和以任何顺序连续施用。
“有效量”是足以实现有益的或想要的治疗(包括预防)结果的量。可以一次或多次施用来施用有效量。
如此处所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用，并且所有这些命名包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来自其的培养物，而不考虑传代的次数。也应理解，因为刻意或无意突变，所有后代在DNA含量上不精确地相同。术语“后代”指最初转化的细胞或细胞系随后的每一代的任何和所有后代。包括突变体后代，其具有在最初转化的细胞中筛选的相同功能或生物学活性。
此处定义“小分子”以具有低于约1000道尔顿，例如低于约500道尔顿的分子量。小分子可以是有机分子或无机分子，并例如可以从化合物库或天然来源中分离，或可以通过已知化合物的衍生获得。
“适体”是形成特异性结合靶分子，如此处描述的靶标的三级结构的核酸分子。在本领域中很好地确定了适体的产生和治疗用途(参阅例如，美国专利号5,475,096)。用于本发明的适体可包括修饰的核苷酸(例如，核酸类似物或衍生物)，其在体内是稳定的而不被降解。至少，设计核酸分子在体内足够稳定充分长的时间，以允许在降解和/或消除前发生治疗作用。非限制性实例，如核苷酸类似物可选自硫代磷酸酯、boranophosphate、膦酸甲酯、和2′-O-甲基类似物，及其类似物。作为特定实例，所述类似物可以是2′-脱氧-2′-氟代-RNA(2′-F-RNA)。
“肽体”是连接编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列的肽序列。所述肽序列可来自通过任何方法选择的用于特异性结合的随机化序列，所述方法包括不但限于，噬菌体展示技术。在一个实施方案中，所选择的多肽可连接编码免疫球蛋白Fc部分的氨基酸序列。特异性结合并调节此处描述的靶标的肽体(导致对神经元变性的抑制)也可用于本发明的方法中。
术语“药学上可接受的盐”用于此处指那些盐，其在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织接触，而没有过分的毒性、刺激、变态反应等，并且与合理的益处和/风险比例相当。可药用盐是本领域公知的。例如，Berge等在J Pharm.Sci.66：1-19，1977中详细描述了可药用盐。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备或者通过用合适的有机酸与游离碱基反应分离。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、camphersulfonate、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、磷酸甘油、半硫酸盐、heptonate、己酸盐、氢溴酸盐、氢氯化物、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、pectinate、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵、和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
B.筛选测定用于鉴定并表征神经元变性的抑制剂
本发明部分基于这样的发现，上文A部分中表1列出的靶蛋白和活性(携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PISK)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)、β-联蛋白、转录和蛋白质合成)的某些调节剂是神经元(如轴突)变性的有效抑制剂。所述调节剂作为靶蛋白和活性的抑制剂起作用，除腺苷酸环化酶的调节剂外，其为激活剂。神经元或轴突变性的抑制剂此处称为“抑制剂”，不管它们对其各自靶标的影响，因为它们是神经元或轴突变性的抑制剂。此处它们还称为“试剂”，其调节靶蛋白的活性或神经元或轴突中的活性，导致对神经元或轴突变性的抑制。
本发明包括通过使用此处描述的抑制剂抑制神经元或轴突变性的方法。如下文进一步详细描述，可在体内，如在神经病症或神经系统损伤的治疗中进行所述方法。所述方法还可以在体外或离体进行，如在神经元功能的实验室研究和神经移植物或移植体的治疗中进行。描述了用于鉴定并检测用于本发明的抑制剂后，在下文进一步描述了这些方法。
可用于本发明的抑制剂包括在表2(C部分，下文)中列出的那些(已经在此处描述的测定中显示其防止神经元或轴突变性)，以及此处所述靶标的额外已知抑制剂(参阅例如，表3)。可使用对每一靶标特异的标准筛选方法鉴定用于本发明的额外抑制剂，如下文概述。这些测定也可用于验证发现具有想要活性的化合物的衍生物的活性，可根据标准的药物化学方法设计所述测定。抑制剂(或激活剂，在腺苷酸环化酶的情况下)被验证为对特定靶标有活性后，可在如此处描述的神经元或轴突变性模型以及适当的动物模型系统中检测所述抑制剂。
如下简单描述了用于鉴定表1列出的靶标的抑制剂，以及用于鉴定并表征神经元或轴突变性的额外抑制剂(其可用于本发明的方法中)的示例性测定。
i)用于神经元或轴突变性的抑制剂的基于细胞的和体外测定
在下文实施例中详细描述，并如下简单概述了这样的测定，其用于验证此处所述靶标的抑制剂也抑制神经元或轴突变性，还用于鉴定神经元或轴突变性的额外抑制剂。这些测定包括(i)抗神经生长因子(抗-NGF)抗体测定，(ii)血清剥夺/氯化钾(KCl)还原测定，(iii)鱼藤酮变性测定，和(iv)长春新碱变性测定。本领域已知的用于评估神经元或轴突变性的额外测定也可用于本发明中。
NGF是参与靶神经元分化和存活的小的分泌蛋白质。利用NGF处理培养的神经元导致轴突增殖，而利用抗NGF抗体处理这些神经元导致轴突变性。利用抗NGF抗体处理神经元也导致若干不同的形态变化，其可通过显微镜检测到，并且可监测所述变化以观察候选抑制剂的效果。在实施例1中进一步描述和例如在图1-4中阐明的这些变化包括膨体形成、伸长的线粒体丢失、膨体中线粒体的累积、细胞骨架分解和轴突片段化。认为对抗抗NGF抗体诱导的任何形态变化的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，需要时，可以在额外系统，如此处描述的那些系统中检测所述试剂。
血清剥夺/KCl减少测定基于使用从小鼠(例如，P7小鼠)脑中分离的小脑颗粒神经元(CGN)的培养物。在该测定中，在包含KCl的培养基中培养所述神经元，然后转换到含有更少KCl的培养基中(包含5mM KCl的Eagle基本培养基)，其诱导神经元变性。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂在KCl撤除后阻断或降低神经元变性(例如可通过神经元标记(例如，抗类型III β-微管蛋白)染色的固定神经元的图像分析检测所述KCl撤除后神经元变性的阻断或降低)，需要时，可以在额外系统，如此处描述的那些系统中检测所述试剂。
神经元或轴突变性的另一模型包括将培养的神经元与鱼藤酮(2R，6aS，12aS)-1，2，6，6a，12，12a-六氢-2-异丙烯基-8，9-二甲氧基苯并吡喃[3，4-b]糠酰(2，3-h)苯并吡喃-6-酮)接触，所述鱼藤酮是在若干植物的根和茎中天然存在的灭害剂和杀虫剂，当注射到大鼠中时，其干扰线粒体电子传递，并引起帕金森病样症状。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂阻断或降低在鱼藤酮存在下培养的神经元变性，例如可通过例如神经元特异的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像分析检测鱼藤酮存在下培养的神经元变性的阻断或降低，需要时，可以在额外系统，如此处描述的那些系统中检测所述试剂。
神经元或轴突变性的额外模型包括将培养的神经元与长春新碱接触，所述长春新碱是结合微管蛋白二聚体并防止微管结构装配的生物碱。认为这样的试剂是神经元或轴突变性的候选抑制剂，发现所述试剂阻断或降低在长春新碱存在下培养的神经元变性，例如可通过例如针对神经元特异的βIII微管蛋白的抗体染色的固定神经元的图像分析检测长春新碱存在下培养的神经元变性的阻断或降低，需要时，可以在额外系统，如此处描述的那些系统中检测所述试剂。
除了上文描述的测定(其读出是神经元或轴突变性的抑制)，本发明还使用针对检测表1中列出的靶标的抑制剂的测定，其读出是例如靶结合或靶活性。因此，本发明包括使用用于表1中列出的靶标的抑制剂的筛选测定，可设计所述测定来鉴定结合靶标或与靶标形成复合体，或以其他方式干扰其活性的化合物。所述筛选测定包括易于高通量筛选化学文库的测定，使得它们适合用于鉴定小的分子药物候选物。一般地，使用结合测定和活性测定。可以多种形式，包括但不限于激酶测定、生物化学筛选测定、免疫测定，和基于细胞的测定，如测定为合适的基于主题靶标进行所述测定。
在结合测定中，相互作用是结合，并且可在反应混合物中分离或检测形成的复合体。在特定实施方案中，靶多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着一般通过用多肽溶液包被固体表面并干燥来完成。或者，固定的抗体，例如对待固定的靶多肽特异的单克隆抗体可用于将其锚定到固体表面上。通过向固定组分，例如含有锚定组分的包被表面加入未固定组分进行测定，可通过可检测的标记来标记所述未固定组分。当反应完成时，例如通过洗涤去除不反应的组分，并检测锚定在固体表面上的复合体。当最初未固定的组分携带可检测标记时，对固定在表面上的标记的检测表明形成了复合体。当最初未固定的组分不携带标记时，例如可通过使用特异性结合固定复合体的标记抗体检测复合体形成。
如果候选化合物是与靶标相互作用但不结合靶标的多肽，可通过众所周知用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法测定所述靶标与各多肽之间的相互作用。此类测定包括常规方法，如交联、共免疫沉淀，和通过梯度或层析柱的共纯化。此外，可通过使用Chevray等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：5789-5793，1991公开的Fields及其同事(Fields等，Nature(London)340：245-246，1989；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9578-9582，1991)描述的基于酵母的遗传系统监测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活子，如酵母GAL4由两个物理上分离的模块结构域组成，一个作为DNA结合域起作用，另一个作为转录激活域行使功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(一般称为“双杂交系统”)利用该性质优势，并使用两个杂合蛋白质，其中一个靶蛋白融合到GAL4的DNA结合域上，另一个候选物激活蛋白质融合到激活域上。GAL1-lacZ报告基因在GAL4-激活启动子控制下的表达依赖于GAL4活性通过蛋白质-蛋白质相互作用的重建。利用β-半乳糖苷酶的生色底物检测含有相互作用多肽的菌落。可通过商业途径从Clontech获得使用双杂交技术鉴定两个特异蛋白质之间蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)。该系统还可延伸到定位涉及特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域并精确找到对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。
可如下检测干扰靶标与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物。一般在允许两种产物相互作用的条件下和时间里制备含有靶标与细胞内或细胞外组分的反应混合物。为了检测候选化合物抑制靶标相互作用的能力，在缺少和存在测试化合物的情况下进行反应。此外，可向第三种反应混合物中加入安慰剂，以作为阳性对照。
用于测量候选抑制剂对蛋白激酶活性的影响的测定为本领域所知，并包括直接磷酸化测定，通常通过放射性标记的磷酸盐、针对底物的磷酸化特异性抗体和测量激酶活性下游影响(例如报告基因的激活)的基于细胞的测定解释。除基于荧光偏振的备选测定外，这些主要的策略中的两个可用于以小规模或高通量形式鉴定、验证或表征抑制剂(参阅例如，Favata等，J.Biol.Chem.273：18623-18632，1998；Parker等，J.Biomol.Screening5：77-99，2000；Singh等，Comb.Chem.High Throughput Screen 8：319-325，2005；Garton等，Meth.Enz.439：491-500，2008；和Kupchko等，Anal.Biochem.317：210-217，2003)。
此处特别讨论的筛选测定仅为阐明目的。可根据筛选的拮抗剂候选物的特定靶标和类型(例如，抗体、多肽、肽、非肽有机小分子、核酸分子等)选择的多种其它测定为本领域技术人员所熟知，并也可以用于本发明中。
此处描述的测定可用于筛选化合物文库，其包括但不限于化学文库、天然产物文库(例如，微生物、动物、植物等的集合)，以及由随机肽、寡核苷酸或有机小分子组成的组合文库。在特定的实施方案中，此处的测定用于筛选抗体文库，其包括但不限于天然人的、重组的、合成的和半合成的抗体文库。所述抗体文库例如可以是噬菌体展示文库，包括单价文库，其在每个噬菌体颗粒上展示平均一个单链抗体或抗体片段，和多价文库，其在每个病毒颗粒上展示平均两个或更多抗体或抗体片段。然而，待根据本发明筛选的抗体文库不限于噬菌体展示文库。其它展示技术包括例如，核糖体或mRNA展示(Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：9022-9026，1994；Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：4937-4942，1997)、微生物细胞展示，如细菌展示(Georgiou等，Nature Biotech.15：29-34，1997)，或酵母细胞展示(Kieke等，Protein Eng.10：1303-1310，1997)、哺乳动物细胞上的展示、孢子展示、病毒展示，如逆转录病毒展示(Urban等，Nucleic Acids Res.33：e35，2005)、基于蛋白质-DNA连接的展示(Odegrip等，Proc.Acad.Natl.Sci.U.S.A.101：2806-2810，2004；Reiersen等，Nucleic Acids Res.33：e1O，2005)，和微珠展示(Sepp等，FEBS Lett.532：455-458，2002)。
可在轴突变性的体外和/或体内测定中证实此处初级结合/相互作用测定中获得的结果。或者，轴突变性的体外和/或体内测定可用作初级测定来鉴定如此处所述的抑制剂和拮抗剂。
ii)神经元或轴突变性的动物模型
用于本发明的体内测定包括多种神经变性疾病的动物模型，如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默氏病、帕金森病，和多发性硬化(例如，小鼠中的实验性自身免疫性脑炎(EAE))的动物模型。此外，可使用脊髓和外伤性脑损伤模型。如下描述了可用于表征用于本发明的抑制剂的体内测定的非限制性实例。
在肌萎缩性侧索硬化(ALS)的情况下，表达突变形式的超氧化物歧化酶1(SOD1)的转基因小鼠概括了ALS的表型和病理学(Rosen等，Nature362(6415)：59-62，1993)。除SOD1小鼠外，已经开发了肌萎缩性侧索硬化(ALS)的若干小鼠模型并且其可用于本发明中。这些包括运动神经元变性(Mnd)、进行性运动神经病(pmn)、摇晃者(wobbler)(Bird等，ActaNeuropathologica 19(1)：39-50，1971)，和TDP-43突变体转基因小鼠(Wegorzewska等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，先前于200年10月15日发表)。此外，已经产生了犬模型并且其可用于本发明中(犬遗传性脊髓性肌萎缩(HCSMA))。
刺激帕金森病的病原性、组织学、生物化学、和临床特征的动物模型(可用于表征用于本发明方法的抑制剂)包括利血平(兔；Carlsson等，Nature 180：1200，1957)；甲基苯丙胺(啮齿类和非人灵长类；Seiden等，DrugAlcohol Depend 1：215-219，1975)；6-OHDA(大鼠；Perese等，Brain Res.494：285-293，1989)；MPTP(小鼠和非人灵长类；Langston等，Ann.Neurol.46：598-605，1999)；百草枯/代森锰(小鼠；Brooks等，Brain Res.823：1-10，1999和Takahashi等，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.66：167-170，1989)；鱼藤酮(大鼠；Betarbet等，Nat Neurosci.3：1301-1306，2000)；3-硝基酪氨酸(小鼠；Mihm等，J Neurosci.21：RC149，2001)；和突变的α-突触核蛋白(小鼠和果蝇；Polymeropoulos等，Science276：2045-2047，1997)模型。
遗传修饰的动物，包括小鼠、苍蝇、鱼和蠕虫已经用于研究阿尔茨海默氏病背后的致病机制。例如，对β-淀粉状蛋白转基因的小鼠发生了与阿尔茨海默氏病一致的记忆缺陷(
Figure BDA0000069844070000381
等，Mol.Psychiatry 9：664-683，2004)。这些模型可用于表征抑制剂。
本领域使用若干动物模型来研究中风，包括小鼠、大鼠、沙鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪和猴子。大多数局部脑缺血模型涉及一条主要的大脑血管(如大脑中动脉)阻塞(参阅例如，Garcia，Stroke 15：5-14，1984和Bose等，Brain Res.311：385-391，1984)。任何这些模型也可用于本发明中。
C.神经元或轴突变性的抑制剂
如下文实施例中进一步描述，下文表2中列出的化合物鉴定为神经元或轴突变性的抑制剂。抑制(或激活，在腺苷酸环化酶的情况下)表2中列出的靶标和过程的这些化合物以及其它试剂(参阅例如，表3)可用于本发明抑制神经元或轴突变性的方法中。
表2
Figure BDA0000069844070000391
Figure BDA0000069844070000401
Figure BDA0000069844070000411
Figure BDA0000069844070000421
表3
Figure BDA0000069844070000422
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Figure BDA0000069844070000441
D.制备神经元或轴突变性的抗体抑制剂
可通过本领域已知的方法(包括重组DNA技术)产生通过本发明的结合和活性测定鉴定的抗体。
(i)抗原制备
任选地缀合其它分子的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，如受体，这些分子的片段(例如，受体的胞外域)可用作免疫原。或者，表达所述跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可来自天然来源(例如，癌细胞系)或可以是已经通过重组技术转化以表达所述跨膜分子的细胞。在表1中涉及到本发明的靶标的示例性序列，并且其可用于抗原的制备中，用于制备用于本发明的抗体。用于制备抗体的其它抗原及其形式对本领域技术人员而言是显而易见的。
(ii)多克隆抗体
通常在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生多克隆抗体。可使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原缀合到蛋白质上，所述蛋白质在待免疫的物种中是具有免疫原性的，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合并在多个位点经皮内注射溶液来将动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。1个月后，利用弗氏完全佐剂中1/5到1/10初始量的肽或缀合物在多个位点经皮下注射加强动物。7至14天后，将动物放血并测定血清的抗体效价。对动物进行加强，直至效价达到平台。用相同抗原的缀合物(但缀合到不同的蛋白质和/或通过不同的交联试剂)对动物进行加强。缀合物也可在重组细胞培养物中制备为蛋白质融合物。同样，凝集剂(如明矾)适合用于增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
使用Kohler等，Nature 256：495，1975首次描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参阅例如，美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)，以引发淋巴细胞，其产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页，AcademicPress，1986)。
在含有一种或多种物质的合适培养基中接种并培养因此制备的杂交瘤细胞，所述物质抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT缺失细胞的生长。
示例性骨髓瘤细胞是通过所选抗体产生细胞有效融合、支持稳定高水平抗体产生，并对培养基如HAT培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。其中，认为使用的特定骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，如来自从Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，CA，USA可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，Manassas，VA，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系，用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001，1984；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，51-63页，MarcelDekker，Inc.，New York，1987)。
测定其中生长杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
鉴定杂交瘤细胞后，可通过有限稀释方法亚克隆所述克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页，Academic Press，1986)，所述杂交瘤细胞产生具有想要的特异性、亲和力和/或活性的抗体。用于该目的的合适培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为动物中的腹水肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如，A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基、腹水或血清中适当分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规方法(例如通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因)容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞作为该DNA的来源。一旦分离，将DNA置于表达载体中，其然后转移到宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。在下文更详细地描述抗体的重组产生。
在其它实施方案中，可从使用例如McCafferty等，Nature 348：552-554，1990中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。
Clackson等，Nature 352：624-628，1991和Marks等，J.MoL Biol.222：581-597，1991描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类和人类抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783，1992)，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nucl.Acids.Res.21：2265-2266，1993)来产生高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选。
例如也可通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替换同源鼠类序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，1984)，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。
通常，此类非免疫球蛋白多肽替换成抗体的恒定域，或它们替换成抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合的二价抗体，其包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或更多氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。可基本根据Winter及其同事(Jones等，Nature 321：522-525，1986；Riechmann等，Nature 332：323-327，1988；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536，1988)的方法，通过将啮齿类CDRs或CDR序列替换为人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变域已经被替换成非人物种的相应序列。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基替换为啮齿类抗体中类似位点上的残基。
待用于制备人源化抗体中的人轻链和重链可变域的选择对降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变域序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变域的序列。然后接受与啮齿类序列最接近的人序列作为用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296，1993；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901，1987)。另一方法使用特定的构架，其来自轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Set U.S.A.89：4285，1992；Presta等，J.Immnol.151：2623，1993)。
更重要的是，抗体进行人源化，对抗原保持高的亲和力和其它有用的生物学性质。为了实现该目标，根据示例性方法，通过分析亲本序列和多种概念上的人源化产物的过程，使用亲本和人源化序列的三维模型制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，并且其为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其阐明并展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现想要的抗体特征，如对靶抗原提高的亲和力。一般而言，CDR残基直接并最实质地参与影响抗原结合。
或者，目前可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在缺少内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已经描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。该种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因排列的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体。参阅例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2551，1993；Jakobovits等，Nature362：255-258，1993；Bruggermann等，Year in Immunol.7：33，1993；和Duchosal等，Nature 355：258，1992。人抗体也可来自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.MoL Biol.227：381，1991；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597，1991；Vaughan等，Nature Biotech.14：309，1996)。在下文中进一步描述了从抗体噬菌体文库产生人抗体。
(V)抗体片段
已经开发了多种技术用于产生抗体片段。通常，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化得到(参阅例如，Morimoto等，J Biochem.Biophys.Meth.24：107-117，1992和Brennan等，Science 229：81，1985)。然而，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，并经化学偶联形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167，1992)。在下文实施例中描述的另一实施方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的装配来形成F(ab′)2。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。用于产生抗体片段的其它技术对技术人员而言是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参阅WO 93/16185)。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两个不同表位具有结合特异性，其中所述表位一般来自不同的抗原。尽管此类分子通常仅结合两个不同表位(即，双特异性抗体，BsAbs)，用于此处时具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体也包括在该表述中。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域所知。全长双特异性抗体的常规制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305：537-539，1983)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混和物，其中仅一个具有正确的双特异性结构。一般通过亲和层析步骤完成正确分子的纯化是非常繁琐的，并且产物产量也低。在WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659，1991中公开了类似的方法。根据不同的方法，具有想要的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变域融合到免疫球蛋白恒定域序列上。融合可以是与免疫球蛋白重链恒定域，其包含至少部分铰链、CH2和CH3区。在至少一个融合中存在第一个重链恒定区(CH1)，其含有轻链结合必需的位点。编码免疫球蛋白重链融合和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当用于构建的不等比例的三条多肽链提供最佳产量时，这在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例中提供极大的灵活性。然而，当等比例的至少两条多肽链表达导致高产量或当比例没有特别重要性时，可以在一个表达载体中插入两条或所有三条多肽链的编码序列。
在该方法的一个实例中，双特异抗体由在一条臂中具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现该不对称结构促进想要的双特异性化合物从不想要的免疫球蛋白链组合中分离，因为仅一半双特异性分子中免疫球蛋白轻链的存在提供容易的分离方式。在WO 94/04690中公开了该方法。对于产生双特异性抗体的其它详细信息，参阅例如Suresh等，Methods Enzymol.121：210，1986。
根据WO 96/27011中描述的另一方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比达到最大。所述界面可包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，来自第一个抗体分子的界面的一条或更多小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链来在第二个抗体分子的界面上产生与所述大侧链相同或相似大小的互补“腔”。这为相对于其它不想要的终产物(如同源二聚体)提高异源二聚体的产量提供了机理。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的抗体之一可偶联抗生物素蛋白，另一个偶联生物素。例如已经提议此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360和WO 92/200373)。可使用任何便利的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂为本领域所熟知，并与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
已经在文献中描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81，1985描述了这样的方法，其中将完整抗体经蛋白水解切割产生F(ab′)2片段。在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠下将这些片段还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键形成。所产生的Fab′片段然后转化成硫代亚硝基苯甲酸盐(thionitrobenzoate(TNB))衍生物。Fab′-TNB衍生物之一然后通过巯基乙胺还原转化成Fab′-硫醇并与等摩尔量的另一Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定化酶的试剂。
Fab′-SH片段也可以直接从大肠杆菌中回收，并可进行化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J Exp.Med.175：217-225，1992描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的制备。每一Fab′片段分别从大肠杆菌分泌并在体外进行直接化学偶联，以形成所述双特异性抗体。
也已经描述了直接从重组细胞培养物中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体(Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553，1992)。来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接两个不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区进行还原形成单体，然后被重新氧化形成抗体异源二聚体。也可利用该方法产生抗体同源二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448，1993描述的“双抗体”技术已经为制备双特异性抗体片段提供了备选机制。所述片段包含通过接头连接轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)，所述接头太短以至于不能在同一条链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。也已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略(参阅Gruber等，J.Immunol.152：5368，1994)。
设想多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tuft等，J.Immunol.147：60，1991)。
(vii)效应功能改造
期望修饰用于本发明的抗体的效应功能，以增强抗体的有效性。例如，可在Fc区引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域中形成链间二硫键。因此产生的同源二聚体抗体可能具有提高的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC；参阅Caron等，J.Exp.Med176：1191-1195，1992和Shopes，J.Immunol.148：2918-2922，1992)。也可使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565，1993中描述的异双功能交联剂制备具有提高的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。或者，可改造抗体，其具有二元Fc区并由此具有增强的补体裂解和ADCC能力(参阅Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230，1989)。
(viii)抗体-补救受体结合表位融合
在本发明的某些实施方案中，期望使用抗体片段，而不是完整抗体，例如来提高血脑屏障穿透。在该情况下，期望修饰所述抗体片段，以提高其血清半衰期。这例如可通过向抗体片段中掺入补救受体结合表位(例如通过在抗体片段中适当区域的突变或通过向肽标签中掺入表位，然后例如通过DNA或肽合成将所述肽标签在任一末端或中间融合到所述抗体片段上)来实现。
所述补救受体结合表位可构成这样的区域，其中来自Fc结构域的一个或更多环的任何一个或更多氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置中。在另一实例中，转移来自Fc结构域的一个或两个环的三个或更多氨基酸残基，而在其它实例中，从(例如IgG的)Fc区的CH2结构域获取表位，并转移到抗体的CH1、CH3或VH区，或多于一个这样的区域中。或者，可从Fc区的CH2结构域获取表位，并转移到抗体片段的CL区或VL区，或两个区域中。
(ix)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。它们可通过化学合成或通过酶促或化学切割抗体(如果适用)来产生。通过使抗体的靶定氨基酸残基与有机衍生试剂反应来向分子中引入抗体的其它类型的共价修饰，所述有机衍生试剂能够与所选的侧链或N或C末端残基反应。共价修饰的实例描述于美国专利号5,534,615中，其明确引入作为参考。抗体的一种类型共价修饰的一个实例包括以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中阐明的方式将抗体连接到多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇，或聚氧化烯。
(x)从合成的抗体噬菌体文库产生抗体
在其它实施方案中，本发明可使用这样的方法，其使用噬菌体展示方法产生并选择新的抗体。所述方法包括基于单个构架模板产生合成的抗体噬菌体文库、在可变域内设计足够的多样性、展示具有多元化可变域的多肽、选择对靶向抗原具有高亲和力的候选抗体，并分离所选的抗体。
噬菌体展示方法的细节例如可见于WO 03/102157中，其完整公开内容明确引入作为参考。
在一个实例中，可通过在抗体可变域的至少一个CDR中突变溶剂易接近的和/或高度不同的位置来产生用于本发明的抗体文库。可使用此处提供的方法突变一些或所有CDRs。在一些实施方案中，可通过突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单一文库、或通过突变CDRL3和CDRH3中的位置形成单一文库、或通过突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置形成单一文库来产生不同的抗体文库。
例如可产生抗体可变域的文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3的溶剂易接近和/或高度不同的位置中具有突变。可产生另一文库，其在CDRL1、CDRL2和CDRL3中具有突变。这些文库也可用于彼此结合来产生具有期望亲和力的结合子。例如，一轮或更多轮选择重链文库对靶抗原的结合后，轻链文库可替换到重链结合子的群体中，用于其他轮的筛选，以提高结合子的亲和力。
可通过用重链序列的可变区的CDRH3区中的变体氨基酸替代原始氨基酸来产生文库。所得文库可含有多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区域中。
在一个实例中，在人源化抗体4D5序列，或人源化抗体4D5序列的构架氨基酸序列的背景中产生文库。可通过用具有DVK密码子组编码的氨基酸替换重链的至少95-100a位残基来产生文库，其中DVK密码子组用于编码每一个这些位置的一组变体氨基酸。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)7。在一些实施方案中，通过用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸替代95-100a位残基来产生文库。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)6(NNK)。在另一实施方案中，通过用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸替代至少95-100a位残基来产生文库。用于产生这些替代的寡核苷酸组的实例包含序列(DVK)5(NNK)。用于产生这些替代的寡核苷酸组的另一实例包含序列(NNK)6。可通过本领域技术人员根据此处描述的标准确定合适寡核苷酸序列的其它实例。
在另一实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力的结合子并分离多种表位的结合子。在该文库中产生的CDRH3的长度范围在11到13个氨基酸，尽管也可产生不同于该长度范围的长度。可通过使用NNK、DVK和NVK密码子组，以及N和/或C末端的更多有限多样性扩展H3多样性。
也可在CDRH1和CDRH2中产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循靶向模拟如此处所述具有修饰的天然抗体所有组成成分的策略，所述设计与先前的设计相比将多样性聚焦在更密切匹配天然多样性上。
对于CDRH3中的多样性，可分别构建具有不同长度H3的多个文库，然后进行组合以选择靶抗原的结合子。可使用先前和下文描述的固相支持体选择和溶液分选方法混和并分选多个文库。可使用多种分选策略。例如，一种变型包括在结合固体的靶标上分选，然后分选在融合多肽上存在的标签(例如，抗-gD标签)，并且随后在结合固体的靶标上进行另一次分选。或者，可在结合固体表面的靶标上第一次分选文库，然后使用结合降低浓度的靶抗原的溶液相分选洗脱的结合子。利用不同分选方法的组合提供了使仅高度表达序列选择的最小化，并提供选择大量不同的高亲和力克隆。
可从文库中分离靶抗原的高亲和力结合子。H1/H2区域中的有限多样性降低简并性约104到105倍，并且允许更多的H3多样性提供更高亲和力的结合子。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(例如利用DVK或NVT)提供分离结合子，其可结合靶抗原的不同表位。
在从如上所述合并文库分离的结合子中，已经发现可通过在轻链中提高有限的多样性进一步提高亲和力。在该实施方案中如下产生轻链多样性，在CDRL1中：28位氨基酸由RDT编码；29位氨基酸由RKT编码；30位氨基酸由RVW编码；31位氨基酸由ANW编码；32位氨基酸由THT编码；任选地，33位氨基酸由CTG编码；在CDRL2中：50位氨基酸由KBG编码；53位氨基酸由AVC编码；任选地，55位氨基酸由GMA编码；在CDRL3中：91位氨基酸由TMT或SRT或两者编码；92位氨基酸由DMC编码；93位氨基酸由RVT编码；94位氨基酸由NHT编码；并且96位氨基酸由TWT或YKG或两者编码。
在另一实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3区域中具有多样性的文库或多个文库。在该实施方案中，使用多种长度的H3区和使用最初密码子组XKZ和NNK或NNS产生CDRH3中的多样性。可使用各寡核苷酸形成文库并混和，或者可混和寡核苷酸以形成文库亚组。可针对结合固体的靶标分选该实施方案的文库。可使用ELISA测定筛选从多次分选分离的克隆的特异性和亲和力。对于特异性，可针对想要的靶抗原以及其它非靶抗原筛选克隆。然后在溶液结合竞争ELISA测定或点竞争测定中筛选靶抗原的那些结合子的亲和力。可利用如上文描述制备的XYZ密码子组从文库中分离高亲和力结合子。这些结合子可在细胞培养中容易地产生为高产量的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，期望产生CDRH3区域长度中具有更大多样性的文库。例如，期望产生CDRH3区在约7到19个氨基酸之间变化的文库。
在细菌和真核细胞培养物中以高产量容易地产生从这些实施方案的文库中分离的高亲和力结合子。可设计载体，以容易地去除序列，如gD标签、病毒外壳蛋白组成序列，和/或在恒定区序列中添加以提供全长抗体或抗原结合片段的高产量产生。
在CDRH3中具有突变的文库可与含有变体形式的其它CDRs，例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，CDRH3文库与在人源化4D5抗体序列的背景中使用预定密码子组产生的CDRL3文库组合，所述人源化4D5抗体序列在位置28、29、30、31和/或32上具有变体氨基酸。在另一实施方案中，CDRH3具有突变的文库可与包含变体CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，利用在位置28、30、31、32和33上具有变体氨基酸的人源化抗体4D5序列产生CDRH1文库。使用预定密码子组，利用在位置50、52、53、54、56和58上具有变体氨基酸的人源化抗体4D5的序列产生CDRH2文库。
(xi)抗体突变体
可进一步修饰从噬菌体文库产生的抗体，以产生具有优于亲本抗体的提高的物理、化学、和/或生物学性质的抗体突变体。其中所用的测定是生物学活性测定时，在所选的测定中抗体突变体可具有这样的生物学活性，其比该测定中亲本抗体的生物学活性高至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、有时候至少约100倍或200倍。例如，抗-靶标抗体突变体可对靶标具有这样的结合亲和力，其比亲本抗体的结合亲和力强至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、有时候至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，可在亲本抗体的一个或更多高变区中引入一个或更多氨基酸改变(例如替代)。或者，或此外，可在亲本抗体中引入构架区残基的一个或更多改变(例如替代)，其中这些改变导致抗体突变体对来自第二种哺乳动物物种的抗原的结合亲和力提高。待修饰的构架区残基的实例包括直接非共价结合抗原(Amit等，Science 233：747-753，1986)；与CDR的构象相互作用/影响CDR的构象(Chothia等，J Mol.Biol.196：901-917，1987)；和/或参与VL-VH界面(EP 239 400B1)的那些。在某些实施方案中，一种或多种此类构架区残基的修饰导致抗体对来自第二种哺乳动物物种的抗原的结合亲和力增强。例如，在本发明的该实施方案中可改变约1到约5个构架残基。有时候，这足以产生适合于临床前试验的抗体突变体，即使其中没有高变区残基被改变。然而通常，抗体突变体将包含额外的高变区改变。
可随机改变经改变的高变区残基，尤其是其中亲本抗体的初始结合亲和力是使得可容易地筛选此类随机产生的抗体突变体。
用于产生此抗体突变体的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham等，Science 244：1081-1085，1989)。此处，用丙氨酸或聚丙氨酸残基替换一个或更多高变区残基，以影响氨基酸与第二种哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在替换位点上引入进一步的或其它突变改进对替换显示功能敏感性的那些高变区残基。因此，尽管预定了用于引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质不需要预定。筛选如此产生的丙氨酸突变体的如此处所述的生物学活性。
通常以保守替代，如在下面标题“优选替代”下显示的那些保守替代开始。如果此类替代导致生物学活性(例如，结合亲和力)的改变，那么引入更实质性改变(表4中命名为“示例性替代”或下文参考氨基酸类别进一步描述)并筛选产物。
表4
通过选择替代完成抗体生物学性质的甚至更多实质性修饰，所述替代在其维持以下的效果上显著不同：(a)替代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点上分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。根据共有的侧链性质，天然发生的残基划分为以下组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将使得这些类别之一的成员交换成另一类别的成员。
在另一实施方案中，使用噬菌体展示使选择用于修饰的位点变成亲和力成熟的(参阅上文)。
通过本领域已知的多种方法制备编码氨基酸序列突变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于寡核苷酸介导(或定点)诱变(参阅例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1985))、PCR诱变，和表达盒诱变早期制备突变体或非突变体形式的亲本抗体。
在某些实施方案中，抗体突变体将仅具有替代的单个高变区残基。在其它实施方案中，亲本抗体的两个或更多高变区残基已经被例如约2到约10个高变区替代所替代。
通常，具有提高的生物学性质的抗体突变体将具有这样的氨基酸序列，其与亲本抗体的重链或轻链可变域的氨基酸序列具有至少75％的氨基酸序列同一性或相似性，例如至少80％、至少85％、至少90％，或至少95％的序列同一性或相似性。该序列的同一性或相似性此处定义为，比对序列并在需要时引入空位以实现最大百分比序列同一性后，相同(即，相同残基)或相似(即，基于共有侧链性质的相同组的氨基酸残基，参阅上文)的候选序列中氨基酸残基与亲本抗体残基的百分比。可变域外抗体序列的N末端、C末端或中间延伸、缺失或插入都不理解为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上指出，这涉及测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选其对抗原或其片段的结合亲和力。从该初次筛选中选择的一个或更多抗体突变体任选地经受一种或多种其它生物学活性测定，以证实具有增强的结合亲和力的抗体突变体对于例如临床前研究的确有用。
通常根据抗体的期望用途，对如此选择的抗体突变体可进行进一步的修饰。此类修饰可包括氨基酸序列的进一步改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰，如下文详细说明的那些。对于氨基酸序列改变，上文详细说明了示例性修饰。例如，不参与维持抗体突变体正确构象的任何半胱氨酸残基一般也被丝氨酸所替代，以提高分子的氧化稳定性并防止异常的交联。相反地，可向抗体添加半胱氨酸键以提高其稳定性(特别是其中所述抗体是抗体片段，如Fv片段时)。另一类型的氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过缺失在抗体中发现的一个或更多糖类部分，和/或添加在抗体中不存在的一个或更多糖基化位点来实现。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接指糖类部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是糖类部分经酶促附着到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列任一个的存在产生了可能的糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着到羟氨基酸上，最常见地附着到丝氨酸或苏氨酸上，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。方便地通过改变氨基酸序列完成糖基化位点向抗体的添加，使得其含有一个或更多上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)。也可通过向原始抗体的序列中添加或替换一个或更多丝氨酸或苏氨酸残基进行改变(对于O连接的糖基化位点)。
(xii)抗体的重组产生
对于抗体的重组产生，分离编码抗体的核酸并将其插入复制载体中用于进一步的克隆(扩增DNA)或用于表达。可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括，但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或更多标记基因、增强子元件、启动子，和转录终止序列(例如，在美国专利号5,534,615中描述的，其明确引入作为参考)。
用于克隆或表达此处载体中的DNA的合适的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratiamarcescans，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一个示例性大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株，如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株是此处通常可获得并且有用的，如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotolerans和K.marxianus；耶罗威亚酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium和曲霉(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于糖基化抗体表达的合适的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经从宿主，如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(果蝇)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，和家蚕(Bombyx mori)中鉴定了许多杆状病毒菌株和变体，以及相应的许可性昆虫宿主细胞。可公开获得用于转染的多种病毒菌株，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且此类病毒可用作此处本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，并且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为了常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4216，1980)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-25，1980)；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W1 38，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals KY.Acad.Sci.383：44-68，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于抗体产生，并且在适当时改良的常规营养培养基中进行培养用于诱导启动子、选择转化体，或扩增编码想要的序列的基因。
可在多种培养基中培养用于产生本发明使用的抗体的宿主细胞。市售培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPM1-1640(Sigma)和Ducbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44，1979，Barnes等，Anal.Biochem.102：255，1980，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利号Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。必要时，可用激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM)、微量元素(定义为一般以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等同能源补充任一这些培养基。也包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需补充物。培养条件，如温度、pH等是选择用于表达的宿主细胞使用的那些条件，并对本领域技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可在细胞内、周质空间内产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去特定的细胞碎片(宿主细胞或裂解的细胞)。当抗体分泌到培养基中时，一般首先使用市售蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置来浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂如PMSF，以抑制蛋白质水解，并且可包括抗生素，以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。A蛋白可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J Immunol.Meth.62：1-13，1983)。推荐G蛋白用于全部小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575，1986)。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但也可获得其它基质。与使用琼脂糖可实现的相比，机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。其中抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)用于纯化。根据待回收的抗体，也可获得用于蛋白质纯化的其它技术，如在离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。
E.神经元或轴突变性的抑制剂的用途
此处描述的靶标的抑制剂，如在此处描述的筛选测定中鉴定或表征的抑制剂(例如，上文描述的特定抑制剂)可用于抑制神经元或轴突变性的方法中。所述抑制剂因此用于以下的治疗中，例如(i)神经系统的病症(例如，神经变性疾病)，(ii)继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统状况，(iii)由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关的神经变性，(vi)记忆丧失，和(vii)精神疾病。下文提供了一些这些疾病、状况和损伤的非限制性实例。
可根据本发明预防或治疗的神经变性疾病和状况的实例包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔麻痹、重症肌无力、肌肉萎缩症、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、进行性延髓性麻痹、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征(例如，脱肠的、破裂的和脱垂的圆盘综合征)、颈椎病、网状组织病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉症、轻度认知缺损、阿尔茨海默氏病、亨延顿舞蹈病、帕金森病、帕金森氏阳性病(例如，多系统萎缩、进行性核上性麻痹和皮质基底变性)、卢伊体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病(例如吉-巴综合征和多发性硬化)、沙-马-图病(CMT；也称为遗传性运动和感觉神经病(HMSN)、遗传性感觉运动神经病(HSMN)和腓侧肌萎缩)、朊病毒病(例如，克-雅病、吉斯特曼-斯召斯列综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)和牛海绵样脑病(BSE，通常称为疯牛病))、神经鞘磷脂沉积病、癫痫、和艾滋病痴呆综合征(也称为HIV痴呆、HIV脑病和HIV伴发的痴呆)。
本发明的方法也可用于预防和治疗眼相关神经变性和相关疾病和状况，如青光眼、网络状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、与湿或干AMD相关的光感受器变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病、和视神经炎。可根据本发明的方法预防或治疗的不同类型的青光眼的非限制性实例包括原发性青光眼(也称为原发性开角型青光眼、慢性开角型青光眼、慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼)、低眼压性青光眼、原发性闭角型青光眼(也称为原发性闭角型青光眼、狭角性青光眼、瞳孔阻滞青光眼和急性充血性青光眼)、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角闭角型青光眼、色素性青光眼、脱落性青光眼(也称为假性脱落性青光眼或囊膜性青光眼)、发育性青光眼(例如，原发性先天性青光眼和婴儿青光眼)、继发性青光眼(例如，炎性青光眼(例如，眼色素层炎和Fuchs异色性虹膜睫状体炎))、晶状体溶解性青光眼(例如，具有成熟白内障的闭角型青光眼、继晶状体囊破裂后的晶状体过敏性青光眼、因对晶状体有毒的网眼阻塞引起的晶状体溶解性青光眼和晶状体不全脱位)、眼内出血继发的青光眼(例如，眼前房出血和溶血性青光眼，也称为红细胞破碎青光眼)、外伤性青光眼(例如，房角退缩性青光眼、前房角上的外伤性萎缩、术后青光眼、无晶状体性瞳孔阻滞和睫状体阻滞性青光眼)、新生血管性青光眼、药物诱导的青光眼(例如，皮质类固醇诱导的青光眼和α-糜蛋白酶青光眼)、中毒青光眼、和眼内瘤相关性青光眼、视网膜脱离、眼睛的严重化学灼伤、和虹膜萎缩。
可根据本发明的方法治疗的疼痛类型的实例包括与以下状况相关的那些：慢性痛、纤维肌痛、脊柱痛、腕管综合征、来自癌症、关节炎、坐骨神经痛、头痛的疼痛、来自手术、肌肉痉挛、背痛、内脏痛的疼痛、来自损伤、牙痛、神经痛的疼痛，如神经源性疼痛或神经性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、突出盘、韧带撕裂和糖尿病。
在神经系统外具有主要效果的某些疾病和状况可导致对神经系统的损伤，可根据本发明的方法治疗所述损伤。此类状况的实例包括例如由糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎、肾功能异常、科罗拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、肉状瘤病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮和淀粉状蛋白病引起的外周神经病和神经痛。
此外，本发明的方法可用于治疗神经损伤，如外周神经病，其由暴露在有毒化合物引起，所述有毒化合物包括重金属(例如，铅、砷和汞)和工业溶剂，以及药物，包括化学治疗剂(例如长春新碱和顺铂)、氨苯砜、HIV药物(例如，齐多夫定、地达诺新、司他夫定、扎西他宾、利托那韦和安泼那韦)、降胆固醇药(例如，洛伐它丁、吲达帕胺和吉非贝齐)、心脏或血压药物(例如胺碘酮、肼苯哒嗪、哌克昔林)和甲硝唑。
本发明的方法也可用于治疗由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤。因此，所述方法可用于治疗由物理损伤(与例如烧伤、创伤、手术和意外伤害相关的)、局部缺血、冷温度的延长暴露(例如，冻伤)引起的外周神经损伤，以及因例如中风或颅内出血(如大脑出血)对中枢神经系统的损伤。
此外，本发明的方法可用于预防或治疗记忆丧失，例如年龄相关性记忆丧失。受丧失影响并因此根据本发明治疗的记忆类型包括情节记忆、语义记忆、短时记忆和长时性记忆。可根据本发明治疗的与记忆丧失相关的疾病和状况包括轻度认知缺损、阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨延顿舞蹈病、化学疗法、胁迫、中风和外伤性脑损伤(例如，震荡)。
本发明的方法也可用于治疗精神病症，包括例如，精神分裂症、妄想性障碍、情感分裂性精神障碍、精神分裂症、分享性精神障碍、精神病、偏执型人格障碍、精神分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、自恋性人格障碍、强制性障碍、妄想、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社会恐怖、创伤后应激障碍、焦虑障碍、和冲动控制障碍(例如，偷窃狂、病理性赌博、放火狂和拔毛发狂)。
除了上文描述的体内方法，本发明的方法可用于离体治疗神经，其可在神经移植物或神经移植体的背景中有用。因此，此处描述的抑制剂可用作培养基的成分，用于在体外培养神经细胞。
通过将具有想要程度的纯度的抑制剂(如小分子或抗体)与任选的冻干饼或水溶液形式的生理学上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂混和(参阅例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(18版)，编辑A.Gennaro，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，来制备此处描述的抑制剂的治疗制剂用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度上对接受者无毒，并可包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、BHA和BHT；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；盐形成平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如Tween、Pluronics或PEG。
待用于体内施用的抑制剂必须无菌，其可在冻干和重建之前或之后通过无菌过滤膜进行过滤来完成。可将治疗组合物置于具有无菌存取口的容器中，例如，静脉内溶液包或小瓶，其具有可用皮下注射针头刺穿的塞子。
抑制剂可任选地彼此或与已知用于治疗相关疾病或状况的其它试剂组合或施用。因此，在治疗ALS中，例如，抑制剂可与利鲁唑(力如太)、米诺环素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和/或甲基钴胺素组合施用。在另一实例中，在治疗帕金森病中，抑制剂可与L-多巴、多巴胺激动剂(例如，溴麦角环肽、培高利特、普拉克索、罗平尼咯、卡麦角林、阿扑吗啡和利舒脲)、多巴脱羧酶抑制剂(例如，左旋多巴、苄丝肼和卡比多巴)，和/或MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰和雷沙吉兰)施用。在其它实例中，在治疗阿尔茨海默氏病中，抑制剂可与乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、加兰他敏和利凡斯的明)和/或NMDA受体拮抗剂(例如，美金刚)施用。组合治疗可包括同时或连续施用，通过相同或不同途径，如本领域技术人员确定为合适的。本发明还包括药物组合物和药盒，其包括此处描述的组合。
除了上文指出的组合，本发明中包括的其它组合是不同神经元区变性的抑制剂的组合。因此，本发明包括这样的试剂的组合，其(i)抑制神经元细胞体的变性，和(ii)抑制轴突变性。如下文进一步描述，发现GSK和转录的抑制剂防止神经元细胞体变性，而EGFR和p38MAPK的抑制剂防止轴突变性。因此，本发明包括GSK和EGFR(和/或p38MAPK)的抑制剂的组合、转录抑制剂和EGFR(和/或p38MAPK)的组合，和带有二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38MAPK、EGFF、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、In通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，和β-联蛋白的抑制剂的其它组合。用于这些组合的抑制剂可以是此处描述的那些抑制剂的任一种，或这些靶标的其它抑制剂。
根据已知方法选择施用抑制剂的途径，例如通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内或损伤内途径注射或输注、局部施用，或通过如下描述的缓释系统。
对于大脑内使用，可通过向CNS的流体贮器中输注来连续施用化合物，尽管快速浓注也可以接受。可向脑室中施用抑制剂或向CNS或脊髓液中引入抑制剂。可通过使用留置导管和连续施用工具(如泵)来进行施用，或其可以通过植入，例如大脑内植入缓释的载体来施用。更尤其是，可通过长期植入的插管或在渗透微泵的帮助下长期输注来注射抑制剂。可获得皮下泵，其通过小的管道向脑室中递送蛋白质。高度复杂的泵可通过皮肤重新填入，并且可在没有外科手术的情况下设置其递送速率。合适的施用方案和递送系统的实例是用于向如Harbaugh，J Neural Transm.Suppl.24：271，1987；和DeYebenes等，Mov.Disord.2：143，1987描述的阿尔茨海默氏病患者和帕金森病的动物模型施用多巴胺、多巴胺激动剂和胆碱能激动剂的那些，所述实施方案和递送系统涉及皮下泵装置或通过全植入递药系统连续脑室内输注。
缓释制剂的合适实例包括成形物品形式的半透性聚合物基质，例如膜或微囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919；EP58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers22：547，1983)、聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167，1981；Langer，Chem.Tech.12：98，1982)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer，等，Id)或聚-D-(-)-羟基丁酸(EP 133,988A)。缓释组合物也包括脂质体包被的化合物，其可通过本身已知的方法制备(Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4030，1980；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324A)。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单室类型，其中脂含量高于约30摩尔％胆固醇，调整所选比例用于最佳治疗。
治疗上使用的活性化合物的有效量将取决于例如，治疗目标、施用途径、和患者的状况。因此，如需要获得最佳的治疗效果，治疗学家必须滴定剂量并改进施用途径。取决于上文提及的因素，典型的每日剂量可在例如约1μg/kg到100mg/kg或更高范围内(例如，约1μg/kg到1mg/kg、约1μg/kg到约5mg/kg、约1mg/kg到10mg/kg、约5mg/kg到约200mg/kg、约50mg/kg到约150mg/ug、约100mg/kg到约500mg/kg、约100mg/kg到约400mg/kg，和约200mg/kg到约400mg/kg)。通常，临床医师将施用活性抑制剂，直至达到这样的剂量，其导致治疗的疾病或状况的一种或多种症状改善，或最好消除。可通过常规测定容易地监测该治疗的进程。此处提供的一种或多种试剂可一起施用或在不同时间施用(在施用第二种试剂之前施用一种试剂)。使用不同技术向受试者施用一种或多种试剂(例如经口施用一种试剂，而经过肌内注射或鼻内施用第二种试剂)。可施用一种或多种试剂，从而所述一种或多种试剂同时对受试者具有药理学效果。或者，可施用一种或多种试剂，从而在施用一种或多种种第二次施用的试剂(例如，1、2、3或4种第二次施用的试剂)之前，第一次施用的试剂的药理学活性失效。
可通过任何合适的手段，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内，和需要时用于局部治疗的损伤内施用来施用本发明的抗体(和辅助治疗剂)。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下施用。此外，可通过脉冲输注，尤其是以减少剂量的抗体施用所述抗体。可通过任何合适途径，例如部分根据施用是暂时的还是长期的，通过注射，如静脉内或皮下注射进行给药。
可在制备和施用抗体的过程中考虑用于本发明的抗体结合靶标的定位。当所述结合靶标是细胞内分子时，本发明的某些实施方案提供待引入细胞中的抗体或其抗原结合片段，所述结合靶标位于所述细胞中。在一个实施方案中，本发明的抗体可在细胞内表达为胞内抗体。如此处所用，术语“胞内抗体”指这样的抗体或其抗原结合部分，其在细胞内表达并能够选择性结合靶分子，如在Marasco，Gene Therapy 4：11-15，1997；Kontermann，Methods 34：163-170，2004；美国专利号6,004,940和6,329,173；美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO 03/077945中所述。可通过向靶细胞中引入核酸来实现胞内抗体的细胞内表达，所述核酸编码想要的抗体或其抗原结合部分(缺少与编码该抗体或抗原结合片段的基因正常结合的野生型前导序列和分泌信号)。可使用向细胞中引入核酸的任何标准方法，其包括但不限于，显微注射、轰击注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体，和利用反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和携带目的核酸的疫苗载体进行的转染。
在另一实施方案中，提供中和抗体。抗体可具有某些特征，其增强向细胞中递送抗体，或可以进行修饰以具有此类特征。用于实现此的技术为本领域所知。例如，已知抗体的阳离子化促进其吸收到细胞中(参阅例如，美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可用于向细胞递送抗体。使用抗体片段时，特异性结合靶蛋白的结合域的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计肽分子，其保留结合靶蛋白序列的能力。可化学合成和/或通过重组DNA技术产生此类肽(参阅例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：7889-7893，1993)。
可通过本领域已知的方法增强调节剂多肽向靶细胞的进入。例如，某些序列，如来自HIV Tat或Antennapedia同源结构域蛋白的那些序列能够指导异源蛋白质通过细胞膜的有效吸收(参阅例如，Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：4325-4329，1999)。
当结合靶标定位在脑中时，本发明的某些实施方案提供抗体或其抗原结合片段穿过血脑屏障。某些神经变性疾病与血脑屏障的渗透性增加相关，从而所述抗体或其抗原结合片段可容易地被引入脑中。当所述血脑屏障保持完整时，存在几种技术领域已知的方法用于转运分子通过所述血脑屏障，其包括但不限于物理方法、基于脂类的方法，和基于受体和通道的方法。
转运抗体或其抗原结合片段通过血脑屏障的物理方法包括，但不限于完全包围所述血脑屏障，或通过在所述血脑屏障中产生开口。包围方法包括，但不限于向脑直接注射(参阅例如，Papanastassiou等，Gene Therapy9：398-406，2002)、间隙输注/对流增强递送(参阅例如，Bobo等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：2076-2080，1994)，和在脑中植入递送装置(参阅例如，Gill等，Nature Med.9：589-595，2003；和Gliadel WafersTM，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括，但不限于超声(参阅例如，美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高渗甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and itsManipulation，1卷和2卷，Plenum Press，N.Y.，1989))、通过例如缓激肽或透化剂A-7的透化(参阅例如，美国专利号5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)，和利用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨立血脑屏障的神经元(参阅例如，美国专利公开号2003/0083299)。
转运抗体或抗原结合片段穿过血脑屏障的基于脂类的方法包括，但不限于在偶联抗原结合片段的脂质体中包装抗体或抗原结合片段，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参阅例如，美国专利申请公开号2002/0025313)，和在低密度脂蛋白颗粒中包被抗体或抗原结合片段(参阅例如，美国专利申请公开号2004/0204354)或载脂蛋白E(参阅例如，美国专利申请公开号2004/0131692)。
转运抗体或抗原结合片段穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括，但不限于使用糖皮质类固醇阻断剂以增加血脑屏障的渗透性(参阅例如，美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾离子通道(参阅例如，美国专利申请公开号2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参阅例如，美国专利申请公开号2003/0073713)；利用转铁蛋白包被抗体和调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参阅例如，美国专利申请公开号2003/0129186)，并使抗体阳离子化(参阅例如，美国专利号5,004,697)。
以与良好学实践一致的方式配制、给药和施用用于本发明方法的抗体组合物。在该上下文中考虑的因素包括被治疗特定病症、治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送位点、施用方法、施用的安排、和医学从业者已知的其它因素。抗体不需要是，但任选地以目前用于预防或治疗正在讨论的病症的一种或多种试剂配制。此类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的本发明的抗体的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常以相同剂量、此处所述的施用途径、或此处描述的约1到99％的剂量、或以任何剂量和通过经验/临床测定为合适的任何途径使用。
对于疾病的预防或治疗，抗体(当单独使用或与其它试剂组合使用时)的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程、施用抗体用于预防目的还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答，和主治医师的考虑。一次性地或在系列治疗过程中适当地向患者施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg到500mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或更多次单独施用，或通过连续输注。一次典型的日剂量根据上文提及的因素从约1μg/kg到100mg/kg或更高范围内变化。对于在若干天或更长时间里的重复施用，根据状况，一般维持治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。抗体的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或更多剂量。可间歇地，例如每周或每三周(例如，从而所述患者接受约两份至约二十份，例如约六份剂量的抗体)施用此类剂量。可施用初始较高的负荷剂量，然后是一份或更多份较低的剂量。示例性剂量方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，然后是约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。可通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。
F.神经元或轴突变性的激活
本发明还包括用于激活或增强神经元或轴突变性的方法。这可通过使用上文表2中列出的一种或多种试剂的激活剂或激动剂来完成(除腺苷酸环化酶外，所述抑制剂可用于激活神经元或轴突变性)。因此，携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)的激动剂可用于激活或增强轴突变性的方法中。可在如此处描述的轴突变性的测定中鉴定或表征此类激动剂。因此，例如，候选激动剂可存在于这样的培养基中，其中在存在神经生长因子下培养神经元并评估其对变性的影响。神经元或轴突变性的激动剂可用于预防和治疗疾病或状况(包括癫痫和自闭症)，以及可通过轴突修剪和变性的自然过程的失败表征的任何疾病或状况。可配制激动剂，并使用如上文E部分中描述的那些方法向需要该治疗的受试者施用。
G.制成品
在本发明的另一方面，提供制成品(例如，药物组合物或药盒)，其含有用于治疗或预防上文描述的病症和状况的材料。所述制成品包括容器和容器上面或结合容器的标签或包装插页。合适的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器等。可从多种材料如玻璃或塑料制造容器。所述容器装有组合物，其自身或当与另一组合物组合时对治疗或预防所述状况有效，并可具有无菌存取口(例如，该容器可以是静脉内溶液包或小瓶，其具有可用皮下注射针头刺穿的塞子)。所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的抑制剂。所述标签或包装插页说明所述组合物用于治疗所选择的状况。此外，所述制成品可包括(a)其中含有组合物的第一个容器，其中所述组合物包括本发明的抑制剂；和(b)其中含有组合物的第二个容器，其中所述组合物包括另一治疗剂。本发明该实施方案中的制成品还可包括包装插页，其说明所述组合物可用于治疗特定状况。或者，或此外，所述制成品还可包括第二个(或第三个)容器，其包括药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。其还包括从商业和用户角度希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
通过以下非限制性实施例阐明了本发明的其它细节。
H.实施例
如上讨论，神经元或轴突变性是许多神经退行性疾病的常见特征并且还作为神经系统损伤或创伤的结果而发生。然而，才刚开始了解调节该活动过程的机制。根据使用不同的神经元或轴突变性模型的研究，似乎依赖于病症或损伤的本质，不同机制可能参与了该过程。为了进一步对调节神经元或轴突变性的事件进行表征，筛选了靶向于神经元或轴突变性模型中已知的信号途径的小分子化合物的文库。鉴定到了多种信号途径对于神经元或轴突变性是必需的。值得注意的是，鉴定到大量激酶是神经元或轴突变性的介质，并且进一步的机制研究将不同激酶的功能定位到轴突或胞体区室上。在其它变性范例中研究这些途径也得到了相似的结果，说明共同的分子机制导致了神经元或轴突的自破坏。在以下实施例中描述了这些实验。
实施例1
神经元或轴突变性模型
在下文描述的实验(包括抗NGF抗体、血清剥夺/KCl减少和鱼藤酮处理测定)中使用此处描述的神经元或轴突变性的三个模型，在上文中引入所述模型与测定的描述相结合，所述测定可用于鉴定并表征神经元或轴突变性的抑制剂。
如上描述，用NGF处理培养的神经导致轴突增殖，而用抗NGF抗体处理此类神经导致轴突变性(图1)。用抗NGF抗体处理神经元导致可通过显微镜检测到的若干不同形态变化。例如，在轴突片段化之前，在与抗NGF抗体一起培养的神经中形成膨体，并且，在某些情况下会出现破裂(图2)。在另一实例中，与抗NGF抗体一起培养的轴突缺少伸长的线粒体并且在膨体中显示线粒体累积，提示轴突运输受到阻断。在轴突片段化的数小时中显著数目的线粒体仍具活性(图3)。其它实例涉及细胞支架分解。轴突切断术后，微管网络在肌动蛋白和神经微丝网络解体前发生解体。相反，在NGF撤除模型中，微管网络在肌动蛋白或神经微丝网络前不发生解体(图4)。
轴突变性的另一模型为Wallerian变性，其由轴突中损伤的发生诱导，该损伤发生将轴突与细胞体分开(图5)(参阅例如Raff等，Science296(5569)：868-871，2002)。与野生型对照相比，在缓慢Wallerian变性(Wlds)突变体中，轴突变性显著延迟(图5；Araki等，Science305(5686)：1010-1013，2004)。Wlds突变体的效应是轴突自毁机制存在的证据，该机制在Wlds突变体中被削弱。Wlds在NGF撤除后保护轴突，但不阻止细胞凋亡。
在实施例2-4(抗NGF抗体)、实施例7(血清剥夺/KCL减少)和实施例8和9中(鱼藤酮处理)提供关于抗NGF抗体、血清剥夺/KCL减少和鱼藤酮处理测定的额外信息。
实施例2
筛选神经元或轴突变性的抑制剂
在神经元或轴突变性的抑制剂的筛选中使用上文实施例1中描述的抗NGF抗体模型。检测超过400个小分子的文库(Tocris Bioscience)，来观察哪一个(如果有的话)调节在抗NGF抗体存在下观察到的变性。
方法和材料
解剖小鼠E13.5胚并将其置于L15培养基(Invitrogen)中。从胚上切下附着DRGs的脊髓。将附着DRGs的脊髓置于冰上L15培养基+5％山羊血清(Gibco)中。用钨针取出DRGs并去除剩余的脊髓。用加有25ng/mlNGF(Roche)的N3-F12溶液(3ml Ham′s F12、1ml N3补充物和1ml 1M葡萄糖)填充八孔载玻片。(通过稀释N3100X浓缩液制备N3补充物，通过如下顺序混合以下成分来制备浓缩液：5.0ml Hank′s缓冲盐溶液(HBSS；无Ca、Mg；Invitrogen)、1.0ml牛血清白蛋白(10mg/ml于HBSS中＝150μm)、2.0ml转铁蛋白(T1147-1G，人，HBSS中100mg/ml＝1.1mM)、1.0ml亚硒酸钠(S9133-1MG，0.01mg/ml于HBSS中＝58μM)、0.4ml二盐酸腐胺(P5780-5G，80mg/ml于HBSS中＝500mM)、0.2ml孕酮(P8783-5G，0.125mg/ml于无水乙醇中＝400μM)、0.02ml皮质酮(C2505-500MG，2mg/ml于无水乙醇中＝5.8mM)、0.1ml triiodothyonine，钠盐(T6397-100MG，0.2mg/ml于0.01N NaOH中＝300μM)、0.4ml胰岛素(I6634-250MG，牛胰脏，241U/mg，25mg/ml于20mM HCl中＝4.4mM)，总体积为10.02ml(可储存于-20℃中)。将以下混合来制备N3补充物贮存液：10ml Pen/Strep(100X，Gibco)、10ml谷氨酰胺(200mM，Gibco)、10ml MEM维生素(100X，Gibco)、10ml N3浓缩液(100X，见上文)，总体积为40ml。使用0.22μm滤器将混合物过滤除菌，并将1-2ml等分试样储存于-20℃中)。
将DRGs切成半片，并放置在8室载玻片(BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃，Becton Dickinson)的每个孔中心。室温下允许DRGs附着到载玻片上5-10分钟，随后在37℃过夜温育。加入抗NGF抗体之前，以100μM(上排)或10μM(下排)的浓度加入所选的抑制剂。将抗NGF抗体以25μg/ml的浓度加入到载玻片的右半边(4个孔)。37℃温育20小时后，用30％蔗糖/8％多聚甲醛(PFA)通过将250μl的固定溶液直接加入到250μl的培养基中来固定载玻片。(为了制备30％蔗糖/8％PFA溶液，将以下成分加入到包括搅拌棒的600ml烧杯中：250ml 16％PFA(cat#15710-S，Electron Microscopy Sciences)、50ml10X PBS pH 7.4和150g蔗糖。低热下混合溶液直至溶解，随后加入6-8滴1M NaOH使pH值为7.4。在刻度量筒中用水将体积补充为500ml。充分混合溶液，以等分试样放置并冰冻。)固定载玻片30分钟，随后用PBS洗涤一次。在室温下用0.1％Triton和1％山羊血清中的肌动蛋白染料(缀合鬼笔环肽的Alexa-568；1：40；Invitrogen)、膜染料(DiO；1：200；Invitrogen)和DNA染料(Hoechst 33258；1∶10,000；Invitrogen)标记所有细胞2小时。去除染色液并用PBS洗涤载玻片一次，并用130μl封固剂(Fluoromount G；ElectronMicroscopy Sciences)和24x 60mm no.1盖玻片(VWR)封片。
结果
在这些实验中，NGF撤除后对照神经元(如肌动蛋白染色所见)经历显著变性。相反，在某些小分子存在下，NGF撤除后仍维持轴突的完整性。图6-10显示了对蛋白酶体抑制剂和GSK抑制剂(图6)、p38MAPK抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂(图7)、转录抑制剂和EGFR激酶抑制剂(图8)、JNK抑制剂和Bax通道阻断剂(图9)、和Ih通道阻断剂和CaMKK抑制剂(图10)的这些研究结果。在图5中显示了发现保护免于神经变性的特定化合物和相应靶标的实例，其与上文表2相似，只是它还包括对关于一些化合物进行的观察结果的评论列。
表5
Figure BDA0000069844070000771
Figure BDA0000069844070000781
实施例3
生长因子撤除后对抑制剂添加时间的表征
进行研究来评估在NGF撤除后多个时间点添加时抑制剂的活性。具体而言，进行实验来确定开始NGF剥夺后的最后一个时间点，在所述时间点上候选激酶可被抑制以终止轴突变性。
方法和材料
本研究中使用的原代细胞为Charles River CD-1 E1 3背根神经节(DRG)。在N3/F12(+25ng/ml NGF)培养基(Ham′s F12(23ml)、N3补充物(1ml)、葡萄糖(1ml的1M葡萄糖贮存液)、25ng/ml神经生长因子2.5S、小鼠(Roche 11362348001)于Ham′s F12中(贮存液：50μg/ml-80℃)，使用前过滤除菌)中维持细胞。所述实验也使用BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃8孔室的载玻片(BD 354688)和24x 60mm No.1盖玻片(VWR48393106)。
在L15培养基中解剖胚(解剖工具浸泡于70％的异丙醇中，并且将盘放置于冰上：10cm盘(每盘四个胚)及一个6cm盘用于脊髓)。将E 13.5脊髓取出到DMEM+10％FBS中。从脊髓上分离下＞128个DRGs并用钨针将其对半切开。用250μl N3/F12(25ng/ml NGF)填充8孔载玻片。将切开的DRGs置于5μl体积中(约每孔4个)。室温下允许附着～10分钟，并随后将DRGs于37℃温育过夜。使用以下条件检测抑制剂。在22小时时加入25μg/ml的抗NGF抗体。在加入抗NGF后T＝0、1、3、6、9和12小时加入抑制剂(加入1.25μl抑制剂；来自总混合物的5μl等分试样至-20℃；12μl DMSO中18μl；24μl DMSO中6μl；12μl DMSO中18μl；21μl DMSO中9μl；24μl DMSO中6μl)。通过加入抑制剂并轻轻摇动来进行混合。对照为+/-抗NGF(+1.25μl DMSO)，并且一式两份进行实验。
25小时后，向250μl培养基中加入250μl 30％蔗糖/8％PFA保持30分钟。用1x PBS洗涤载玻片(终止：4℃)。如下进行免疫荧光检测。首先，室温下在5％BSA/0.2％Triton中进行封闭30分钟。4℃下在2％BSA中一级抗体(Tuj 1(1∶1,000))与载玻片温育过夜。用1x PBS洗涤载玻片并加入二级抗体(山羊抗小鼠488；1∶200)。室温下黑暗中载玻片与二级抗体温育1小时。用PBS中1∶10,000的Hoescht洗涤载玻片10分钟，在玻璃Copland中PBS洗涤5分钟，在毛巾上敲打至中度干燥，用200μl的fluoromount G封片，并保存于4℃。在相同设置(即曝光时间)下拍照。也基于轴突从细胞体上脱离来评估变性速率。
结果
这些研究显示即使在NGF撤除后几小时(3、6、9和12小时)内加入，抑制剂依然具有保护作用(图11)。轴突得分为从1至10刻度上的轴突健康得分(0＝看起来像抗NGF对照；10＝看起来像NGF对照；5＝看起来像0小时时加入激酶抑制剂)。这些研究中使用的抑制剂列于表6中。
表6
Figure BDA0000069844070000791
实施例4
化合物关于定位变性的表征
使用Campenot室进一步分析在实施例2中鉴定为抑制轴突变性的化合物。Campenot室允许体环境和轴突环境分开，并允许诱导定位变性(见图12和，例如Zweifel等，Nat.Rev.Neurosci.6(8)：615-625，2005)。在此室中，轴突变性定位并进行，而没有细胞凋亡(图13和图14)。
材料和方法
通过在水中洗涤来清洁Teflon分隔器(Tyler Research)并擦拭干净不残留任何油脂。随后在Nochromix(Godax Laboratories)/硫酸中将分隔器浸润过夜，在高压灭菌的蒸馏水(SQ水)中冲洗5次，煮沸30分钟，并随后在使用前风干。
将小鼠层粘连蛋白(5μg/ml于无菌过滤水中；Invitrogen)加入到PDL包被的35mm盘(BD Biosciences)中并将它们在37℃温育1小时，随后在SQ水中冲洗两次。将盘真空干燥并随后在层流通风橱中风干15分钟。随后用pin rake(Tyler Research)在准备好的盘上刻痕。应用含NGF的50微升NBM+MC溶液穿过所得的计分刻痕(如下制备溶液：将1750mg的甲基纤维素与480ml Neurobasal(Invitrogen)组合，向其加入4.5ml青霉素/链霉素、7.5ml L-谷氨酰胺、10ml B-27无血清补充物(Invitrogen)；室温下固定溶液1小时，4℃过夜，并在室温下再一小时；随后将溶液过滤除菌，并在使用前加入50ng/ml NGF(Roche))。在解剖范围下向每一Teflon分隔器中添加高真空油脂(VWR)。将层粘连蛋白包被的PDL盘反转并滴到Teflon分隔器上，并通过在不含刻痕区中使用牙签来增加额外压力。盘在37℃下温育1小时。向每一侧室中加入500微升NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液，并在中心细胞槽前添加油脂屏障。
从小鼠胚解剖游离的E1 3.5脊髓并置于NBM+MC(25ng/ml NGF)溶液中。用钨针从脊髓上剥离DRGs。使用NBM+MC润滑的P200移液器将DGRs转移到1.5ml管中。用台式离心机离心30秒沉淀DRGs。丢弃上清液并加入0.05％胰蛋白酶/EDTA(冷的)。用移液器将沉淀再溶解并在37℃恒定震荡(650RPM)下温育15分钟。再次对样品离心并丢弃上清液。用温热的NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液将沉淀重悬浮并用烧过的玻璃吸管研磨20次，随后用火焰烧孔的玻璃吸管再研磨20次。再次对样品离心并在0.5ml NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液中重悬浮所得沉淀。将细胞稀释至终浓度为2.5x 106个细胞/ml。将细胞悬浮液装到具有22号针的1ml注射器中。使用注射器填充Campenot分隔器的中心槽(至体积至少50μl)。Campenot室在37℃过夜温育。向中心室中加入2.5ml NGF+MC(50ng/ml NGF)溶液并去除油脂门。三天后用2.5ml NBM+MC培养基(含25ng/ml NGF)置换外周培养基(细胞体区室)。培养五天后，用温热的NBM+MC(无NGF)溶液洗涤一个远端区室三次。第三次洗涤后，将500μl NBM+MC(无NGF)溶液与0.5％DMSO或抑制剂的组合加入到轴突区室中。用含0.5％DMSO或抑制剂的2.5ml NBM+MC培养基置换细胞体区室。
抗NGF抗体处理28小时后，以1∶1稀释直接向培养基中加入8％PFA/30％蔗糖溶液(见上文)并温育30分钟。首次添加15分钟去除Teflon分隔器。在免疫染色之前用2.5ml PBS洗涤系统一次。用PBS中的5％BSA/0.2％triton封闭神经元30分钟。将一级抗体Tuj1(Covance)在含2％BSA的PBS中加入至最终稀释1∶1000并在4℃温育过夜。用PBS洗涤盘一次。以PBS中2％BSA中1∶200的最终稀释度加入二级抗体(Alexa488山羊抗小鼠抗体(Invitrogen))并在室温温育一小时。用PBS洗涤盘两次，并添加22x 22mm盖玻片(VWR)和350μl fluoromount G(ElectronMicroscopy Sciences)。使用荧光显微镜使神经元可见。
结果
如上所述，分离E1 3.5DRGs并在Campenot室中生长5天。向实验轴突区室中加入50μg/ml的抗NGF，并将抑制剂加入到轴突区室(与NGF抗体一起)，或细胞体区室中，并允许轴突变性28小时。在NGF中维持另一轴突区室作为对照。如图15和图16中所示，当细胞体暴露于SB415(GSKi)或Act D(转录抑制剂)时，或当轴突暴露于AG555(EGFRi)或SB239(p38i)时，剥夺NGF的轴突不变性。相反，NGF剥夺的轴突区室中的SB415(GSKi)或Act D(转录抑制剂)处理，或细胞体区室中的AG555(EGFRi)或SB239(p38i)处理不能防止变性，提示局部轴突退化中的信号不局限于正在消失的轴突区段；当应用到细胞体，其它抑制剂应用到轴突时，一些抑制剂是最有效的。这些结果的定量显示于图17中。表7提供了来自Campenot室的轴突变性数据汇总。
表7
Figure BDA0000069844070000811
Figure BDA0000069844070000821
(注：表7中的IC50信息来自发表来源并且用非神经元细胞类型产生一些值)
a-Cross等，J.Neurochem.77(1)：94-1 02，2001；小脑颗粒神经元中通过体外肽测定的总GSK-3活性。
b-Fry等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(20)：12022-12027，1998；MDA-MB-453细胞中酪氨酸磷酸化诱导的神经生长因子。
c-Bose等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(26)：9773-9778，2006；3T3-Her2细胞中的蛋白质酪氨酸磷酸化。
d-Barone等，J.Pharmacol.Exp.Ther.296(2)：312-321，2001；人单核细胞中LPS-诱导的TNF-α产生。
e-Tokumitsu等，J Biol.Chem.277(18)：15813-15818，2002；转染的HeLa细胞中离子霉素刺激后CaMKK的活性。
基于来自上文所述筛选的数据的模型显示于图18中。初步研究表明当从轴突区室中去除NGF时，细胞体显得更小(图19)，并且许多局部剥夺NGF的神经元为胱天蛋白酶-3阳性切割并且显示细胞核凝聚(图20)。其它研究显示GSK3(图21)和JNK(图22)活性在NGF撤除后6小时达到峰值。
实施例5
关于神经元变性特定表型表征化合物
当上文鉴定为细胞体抑制剂(SB415(GSKi)和Act D(转录抑制剂))的化合物应用于细胞体时，并且鉴定为轴突抑制剂(AG555(EGFRi)和SB239(p38i))的化合物应用于轴突时，使用上文描述的Campenot室测定观察局部剥夺的轴突的膨体形成。使用细胞体抑制剂观察到大量具有膨体的轴突以及片段化的轴突(图23)。轴突抑制剂显示出更少的膨体，并且用这些抑制剂处理后轴突看起来继续直接发生片段化(图23)。这些观察说明EGFR和p38可能处于膨体形成的上游。用GSK、EGFR和p38抑制剂研究了线粒体功能障碍和轴突运输的阻断。如图24中所示，观察到有功能的线粒体，但没有线粒体伸长。
还研究了轴突变性范例中的抑制性GSK，其中不发生经细胞体的信号转导。损伤后50μM SB415轻微延迟了变性，因此抑制性GSK3最可能是经轴突微管网络的稳定来对轴突具有直接作用。该效应可能促进整体NGF撤除后所观察到的轴突变性的延迟，但GSK3b在细胞体中的作用看起来更为显著(图25)。此外，由于GSK抑制剂阻断了轴突变性但不阻断细胞死亡，因此整体NGF撤除后轴突的保护似乎不依赖于GSK在神经元死亡中的作用(图26)。
实施例6
针对患者中外周神经病的保护
Figure BDA0000069844070000831
(埃罗替尼)是EGFR激酶抑制剂。已知使用紫杉醇和其它化学治疗剂治疗患者导致外周神经病(在Wilkes，Semin.Oncol.Nurs.23(3)：162-173，2007中进行了综述)。与使用安慰剂+紫杉醇组相比，使用
Figure BDA0000069844070000832
和紫杉醇的组合治疗的患者显示明显更少的外周神经病(p＝0.012；Fisher′s exact)(16.3％的患者相比于26.4％的患者；登记了最初的400名患者；普通有害事件的分析)。
实施例7
肌萎缩侧索硬化(ALS)模型中EGFR激酶水平的分析
肌萎缩侧索硬化(“ALS”)是严重使人虚弱并致死的神经变性疾病，其病理学的特征在于缺少运动神经元。在含有超氧化物歧化酶(“SOD”)基因突变的ALS小鼠模型(SOD(G93A))中发生相似的病理。EGF受体的磷酸化与轴突变性相关。EGFR水平在SOD(G93A)小鼠中发生改变，并且进行了实验来测定磷酸化EGFR水平在SOD(G93A)小鼠中是否也发生改变。
将来自处死后的SOD(G93A)和非转基因的同窝小鼠的脊髓冰冻切片(20μm厚)至载玻片上并保存于-80℃。将载玻片解冻至室温，并在PBS中水化两次，每次冲洗5分钟。在过氧化氢(PBS中0.3％浓度)中封闭载玻片5分钟，并随后在PBS中冲洗两次，每次冲洗5分钟。在PBS-T(含0.1％Triton X100的PBS)中洗涤载玻片两次，每次冲洗10分钟。室温下在含5％BSA和0.3％Triton X100的PBS中封闭载玻片约1小时。在含1％BSA和0.3％Triton X100的PBS中按1∶500稀释兔单克隆抗磷酸化EGFR一级抗体(Novus Biologicals)并在4℃与载玻片温育过夜。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤10分钟。在含1％BSA和0.3％TritonX100的PBS中按1∶300稀释生物素化的山羊抗兔二级抗体(Vector Labs)并与载玻片温育30分钟-1小时。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤5分钟。室温下将洗涤后的载玻片在抗生物素蛋白-生物素复合物溶液(Vector Laboratories)中温育30分钟。在PBS-T中洗涤载玻片四次，每次洗涤5分钟。随后将载玻片与过氧化物酶底物(Diaminobenzidinc(DAB)；Sigma)温育直至显现出所希望的强度。在水中冲洗载玻片，封片并观察。
如图27和图28中所示(其显示用EGFR抗体染色的脊髓切片)，与对照小鼠相比，在SOD小鼠中磷酸化的EGFR水平升高。该观察结果显示EGFR激酶抑制可能在体内ALS的治疗中有益。
还进行了SOD1样品的免疫组织化学研究。将载玻片加热至室温，用ImmEdge笔画出轮廓，室温下在PBS中两次10分钟洗涤进行水化，并在室温下在PBSTx中洗涤10分钟，两次。室温下进行抗体封闭1-2小时(5％BSA、PBS中0.3％Tx；(500ml PBS中25mg BSA+1.5ml 10％Tx))。在含1％BSA和0.3％Tx的PBS中将样品与一级抗体(NF(小鼠，Millipore)1∶200；SMI32(小鼠，Covance)1∶300))在4℃下温育过夜。一级抗体温育后，在室温下PBSTx(0.1％)中洗涤样品4x10分钟。应用二级抗体(MolecularProbes，Alexa缀合的；驴抗小鼠Alexa-488；在含1％BSA，0.3％Tx的PBS中按1∶500稀释)，并在室温下温育样品2小时。二级抗体温育后，在PBSTx中洗涤样品2x10分钟，并在PBS中洗涤2x10分钟。任选地，在第二次洗涤过程中通过应用在PBS中按1∶10,000稀释的DAPI进行细胞核复染。用Vectashield封固剂(Vector Labs)进行封片。
图29显示在SOD ALS模型中pEGFR保留在轴突上。如图中所示，在SOD1-tg脊髓中轴突数目下降，并且在SOD1-tg动物中pEGFR与轴突部分共定位。因此，相比于非转基因对照，在SOD1转基因小鼠中轴突损失，并且许多残留的轴突对pEGFR具有免疫反应。
实施例8
保护小脑颗粒神经元免于血清剥夺/KCl减少诱导的变性
检测在血清剥夺/KCl减少后激酶抑制剂(GSK3、JNK、EGFR、p38和CaMKK的抑制剂)保护培养的小脑颗粒神经元(CGNs)的能力。简言之，从P7小鼠脑中分离的CGNs在37℃下于PDL和层粘连蛋白包被的96孔组织培养皿上含血清和钾的培养基中(包括29mM KCl和10％FBS的Eagle基本培养基)培养。培养24小时后，将细胞单独或与表8中显示的多种小分子抑制剂组合转到“剥夺”培养基中(含5mM KCl的Eagle基本培养基)。培养24小时后，用4％多聚甲醛固定神经元并用神经元标记(抗III类β微管蛋白，Covance)染色。使用ImageXpress自动成像系统(Molecular Devices)获取图像。在表8中总结了所用的平板设置。
表8
Figure BDA0000069844070000861
JNK抑制剂＝SP600125
CAMKK抑制剂＝STO-609
EGFR抑制剂＝AG 555
P38抑制剂＝SB 239063
GSK3抑制剂＝SB 415286
1-6列：细胞密度＝5x104/孔
7-12列：细胞密度＝2.5x104/孔
如图30中所示，发现激酶抑制剂对保护CGNs免于变性有效，这与实施例2和实施例3中对DRGs的发现类似。
实施例9
保护海马神经元免于鱼藤酮诱导的变性
检测激酶抑制剂(GSK3、JNK、EGFR、p38和CaMKK的抑制剂)保护海马神经元免于鱼藤酮依赖性变性的能力。如下进行测定。首先，解剖海马神经元。简言之，从麻醉的怀孕大鼠中取出E18-E19胚，置于含冷HBSS的培养皿中(见上文)，并在新鲜冷的HBSS中洗涤。使用标准技术从其囊中取出胚，置于新鲜冷的HBSS中，并分离脑，置于新鲜冷的HBSS中。从每一个胚中分离海马和皮层，并将脑矢向切成两半来分离脑半球。去除残留的小脑/脑干、嗅球、组织下的腹侧非皮层、以及脑脊膜。从残留组织中取出海马并转移到冰上的1.5ml管中。将皮层组织移到冰上单独的1.5ml管中。尽可能多地去除HBSS，并向每管中剩余的组织中加入HBSS中的1％胰蛋白酶(Hyclone)/0.1％DNA酶(Sigma)。使用烧边移液管将组织分别打碎。组织在37℃温育10分钟，并每两分钟轻敲管一次。尽可能多地从组织中去除溶液，并用0.05％DNA酶(Sigma)溶液洗涤每一组织。用以下中的一个在0.05％DNA酶(Sigma)中研磨样品约20次(1)2/3内径处烧边的移液管和(2)在1/3内径下烧边的移液管。允许样品放置5分钟，随后收集上清液(碎片沉淀下去并用移液管去除上清液)，并在血细胞计数器上对细胞计数。
在分离的海马神经元上进行核转染(nucleofection)。简言之，通过离心分离所需数目的细胞(每次核转染0.5-1x106个细胞)。尽可能多地去除上清液并在20μl室温的核转染溶液(Amaxa)重悬浮每管中沉淀的细胞。将每一重悬液加入预等分的β-肌动蛋白-GFP″pCAGGS-AFP″DNA(每次400ng)并轻轻敲打。将混合物转移到96孔穿梭板的核比色杯(nucleocuvette)孔中，并将板插入到核转染设备中。使用预设的Amaxa程序CU110核转染神经元。核转染后立即加入100μl预热的CNBM(10mlB27(无血清补充物；Invitrogen)、5mls 100X Pen-Strep、5mls 100XGlutamax、480mls NBM(neurobasal培养基；Invitrogen))，并随后将细胞以70,000细胞/孔的密度接种在8孔PDL包被的室载玻片中。加入鱼藤酮之前使神经元生长5-14天，每3-5天更换培养基。
在存在或不存在载体或实验化合物的情况下向神经元加入10μM的鱼藤酮(重悬于DMSO中；VWR)。加入鱼藤酮17-18小时后，在室温下4％多聚甲醛/15％蔗糖溶液中固定神经元40分钟。用PBS洗涤神经元一次并以1∶1000稀释度(于PBS中，0.1％Triton X-100、2％山羊血清)加入小鼠抗Tuj1抗体(Covance)，在4℃温育过夜。用PBS洗涤神经元4次并以1∶200稀释度(于PBS中，2％山羊血清)加入缀合Alexa-568的山羊抗小鼠抗体(Alexa)30分钟。再次用PBS洗涤神经元4次，并在载玻片上在Vectashield封固剂(Vector Labs)中封片。利用Tuj 1使所有神经元可见，用GFP使个别神经元可见。
如图31中所示，发现激酶抑制剂可以保护海马神经元免于鱼藤酮依赖性变性。用皮层神经元进行了类似的研究，并显示皮层神经元也受激酶抑制剂保护而免于鱼藤酮依赖性变性(图32)。
实施例10
轴突上ErbB受体显影
为了在轴突上使ErbB受体表达可见，如上文为筛选所述来培养DRGs。生长24小时后，通过向培养基中加入1∶1比例的8％PFA/30％蔗糖30分钟对细胞进行固定，并用PBS洗涤1次。固定的细胞在含5％BSA和0.2％Triton X100的PBS中温育30分钟，并随后在4℃含2％BSA的PBS中与以下抗体温育过夜：(1)50μg/ml的抗EGFR(D1-5，Genentech)，(2)1∶500抗ErbB2(Abeam)，(3)24μg/ml的抗ErbB3(57.88，Genentech)和(4)1∶500ErbB4(Abeam)。用PBS洗涤细胞1次，随后与荧光缀合的二级抗体(1∶200，Invitrogen)在室温下温育30分钟，用含Hoechst 33258(1μg/ml，Invitrogen)的PBS洗涤一次，随后是最后一次PBS洗涤，并用250μl Fluoromount G(Electron Microscopy Sciences)盖片。如图33中所示，通过免疫组织化学在轴突上检测ErbBs。
实施例11
使用EGFR配体对轴突上表达的EGFR进行表征
进行实验以评估通过配体(包括EGF)的EGFR激活的作用。
材料和方法
如下制备背根神经节(DRG)免疫印迹。实验中使用的原代细胞为Charles River CD-1E13背根神经节(DRG)。在N3/F12(+25ng/ml NGF)培养基(Ham′s F1 2(23ml)、N3补充物(1ml)、葡萄糖(1ml1M葡萄糖贮存液)、Ham′s F12(贮存液：50μg/ml-80℃)中的25ng/ml神经生长因子2.5S，小鼠(Roche 11362348001)，其用前过滤除菌)中维持细胞。该实验还使用Triton裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、0.1％Triton-X100、100x磷酸酶抑制剂混合物I(新鲜加入)、100x磷酸酶抑制剂混和物II(新鲜加入)、1片剂/10ml蛋白酶抑制剂片剂(新鲜加入))。
在第0天制备DRG外植体。在L15培养基中进行胚胎解剖(解剖工具浸润于70％异戊醇中，并在冰上准备盘：10cm盘(每盘4个胚胎)和一个6cm盘用于脊髓)。提取E13.5脊髓至DMEM+10％FBS中。从脊髓上分离下5x 20DRG。用250μl N3/F12(25ng/ml NGF)+7μM阿糖胞苷填充8孔载玻片。每孔中放置约20个DRG(总计五孔)，并允许在室温下贴壁约10分钟。在第2天，将培养基更换为N3/F12+25ng/ml NGF。第3天，加入ErbB配体30分钟至1小时(1000x；100μg/ml；按1∶10稀释于SQ水中)(SQ水(对照)；EGF(ErbB1)；神经调节蛋白-1(ErbB3)；β动物纤维素(ErbB 1/4)；Epiregulin(ErbB 1/4)；抗NGF(25μg/ml))，并轻柔摇动载玻片。
利用移液器吸头抽吸培养基，用冰冷无菌的PBS洗涤两次，并使用具有移液器吸头的抽吸器或Kimwipes纸巾去除所有PBS来进行免疫印迹。在冰上用40μl Triton裂解缓冲液裂解细胞。收集裂解物，4℃旋转30分钟，最高速旋转5分钟，并保存上清液(终止：-80℃)。装载约20μl样品。通过加入1x SDS样品缓冲液和NuPAGE还原剂(10X)制备样品，并将裂解物煮沸。通过10％SDS-PAGE(于120伏特)(用于两张膜的电泳)利用标准物(1μl MWM；1μl和2μl脊髓裂解物)分级分离样品。使用iBlot程序3(Nitrocellulose)对凝胶印迹，并在98kDa处切下印迹。在含5％BSA的TBST中封闭顶膜1小时。将一级抗体置于含5％BSA的2mlTBST中1小时(Calbiochem抗P酪氨酸HRP缀合物(PY20)1∶10,000)。用TBST洗涤印迹3x5分钟，并用ECL显影。在含5％奶的PBS中封闭底膜一小时。将一级抗体置于真空袋中含5％BSA的2ml TBST中，在4℃下放置两天。所用抗体为CS抗P-Erk兔(42/44kDa)1∶1000；C抗-TUJ1兔(55kDa)1∶5000(在单独的膜上)，和SC抗Erk1兔(42/44kDa)1∶1000(在单独的膜上)。在TBST中洗涤印迹3x5分钟。按1∶5000将二级抗体加入到10ml含5％奶的TBST中，室温下温育1小时(Red(680)抗兔)。用TBST洗涤印迹3x5分钟，并用Odyssey在PBS中扫描。通过选择背景法和将负/违反直觉的值最小化的标准条带进行定量，所述值即上/下，右/左，用户定义(用户定义)。浓度标准品的强度越低，负值越小。
结果
这些实验的目标是观察通过EGF激活EGFR是否足以驱动变性。如图34中所示，EGFR在轴突上表达。图35显示向维持于NGF中的神经元加入EGF不引起变性。为了确保EGF能够激活在这些测定中使用的神经元培养物中的EGFR/ErbBs，评估了ERK激活作用(ERF是EGFR的下游靶标)。如图35中图所示，加入EGF提高了ERK活性，如通过蛋白质印迹测定。这些数据显示激活EGFR不足以驱动变性。
实施例12
使用EGFR胞外域对轴突上表达的EGFR进行表征
进行实验以评估EGFR胞外域对EGFR激活的影响。
材料和方法
这些研究中使用的材料包括BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被的玻璃8孔室载玻片(BD 354688)；L15培养基(Invitrogen 11415114)；来自牛血清的白蛋白(BSA)(Sigma A7906-500g)；胎牛血清(Sigma F2442-100ml)；N3补充物(见上文)；Fluoromount G(Electron Microscopy Sciences17984-25)；24x 60mm No.1盖玻片(VWR 48393106)；单克隆抗神经元III型β微管蛋白(Covance MMS-435P)；Ham′s F12中的神经生长因子2.5S，小鼠(Roche 11362348001)；和Triton X-100(Sigma T8787-100ml)。这些实验中使用的溶液包括25ml N3/F12培养基(23ml的Ham′s F12；1ml的N3补充物；1ml的1M葡萄糖；25ng/ml的NGF)和30％蔗糖/8％PFA(见上文)。
在无菌过滤的含0.1％BSA的PBS中将胞外域(R&D Systems)重悬浮至1mg/ml。解剖小鼠E13.5胚胎并将其置于L15培养基中。用镊子打开胚胎的腹侧区，去除器官，切掉肋骨，切割附着DRG的脊髓。将附着DRG的脊髓置于冰上的L15培养基+5％山羊血清中。用钨针取出DRG并去除剩余的脊髓。用N3-F12加25ng/ml NGF填充8孔载玻片。将DRG对半切开。切开的DRG置于8室载玻片的每一孔的中央并允许DRG在室温下附着5-10分钟。在上排中加入胞外域至终浓度为50μg/ml。将载玻片置于37℃培养箱中过夜。将胞外域加入到下排中至终浓度为50μg/ml。以25μg/ml的浓度向孔中加入抗NGF抗体。以10μM浓度加入EGFR抑制剂AG555作为阳性对照。
抗NGF抗体处理24小时后，直接向培养基中加入1∶1稀释的8％PFA/30％蔗糖30分钟。在最初15分钟后除去Teflon分隔器，并用PBS洗涤载玻片一次。
用5％BSA/0.2％Triton封闭载玻片30分钟，并与2％BSA中的一级抗体(Tuj 1(1∶1,000))温育过夜。用PBS洗涤载玻片一次并加入二级抗体(山羊抗小鼠488；1∶200)。室温下温育载玻片1小时，用PBS洗涤两次，用250μl的fluoromount G封片，并在4℃保存。
结果
除了EGF，还有可以激活EGFR的许多配体。为了检测变性过程中EGFR激活是否是配体依赖性的，以50μg/ml的浓度加入来自R&DSystems的EGFR胞外域，其应该足以结合可能激活EGFR的任何自由配体。在加入抗NGF前24小时或同时加入的EGFR胞外域不能阻止变性。这提示变性过程中的EGFR激活可能独立于配体。
实施例13
背脊髓(DSC)外植体是神经变性的另一种模型。经过一些天DSC从轴突上生长出来，但如果不通过加入存活因子来拯救它们，它们最终将变性。如图37中所示，
Figure BDA0000069844070000921
(埃罗替尼)可以延迟该变性程序。
实施例14
A.抑制携带二元亮氨酸拉链的激酶
材料和方法
293细胞系中的DLK转染
将293细胞以30％汇合接种于6孔板上的3个孔中。用任一以下的转染细胞：对照质粒DNA、表达野生型DLK的DNA构建体、或两种质粒，一种表达野生型DLK而另一种表达277位苏氨酸已突变为丙氨酸(T278A)的DLK(其产生了不具有活性的蛋白质形式(Fugene 6，Roche))。转染24小时后，用PBS洗涤细胞，从每一板上刮下细胞，并转移至eppendorf管中。随后将细胞旋转下并去除过量的培养基。在20mM Tris、150mMNaCl、0.1％Triton X-100中裂解沉淀细胞，并置于4℃下30分钟。随后旋转样品来去除不可溶的颗粒并在双金鸡宁酸(BCA)测定(Promega)中检测蛋白质浓度。
样品在10％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上电泳并使用iBlot装置(Invitrogen)按生产商说明书进行转移。在含5％牛血清白蛋白(BSA)的TBST(Tris缓冲盐溶液+1％Tween 20)中封闭印迹1小时。封闭后，印迹在TBST+1％BSA中用针对JNK的一级抗体(Cell SignalingTechnologies)或针对JNK磷酸化形式的一级抗体(Cell SignalingTechnologies)温育过夜。温育后，用TBST洗涤印迹3次并随后与HRP缀合的抗兔二级抗体在室温下温育1小时。再次洗涤印迹三次并随后与ECL(Promega)温育1分钟。随后在胶片上曝光印迹并分析。
DLK siRNA后DRG变性
解剖小鼠E13.5胚胎并将其置于L15培养基(Invitrogen)中。从胚胎上切下附着DRG的脊髓。将附着DRG的脊髓置于冰上的L15培养基+5％山羊血清(Gibco)中。用钨针取出DRG并去除剩余的脊髓。用N3-F12溶液(23ml的Ham′s F12、1ml的N3补充物和1ml的1M葡萄糖)填充8孔载玻片，并向其加入25ng/ml NGF(Roche)。(通过稀释N3100X浓缩液制备N3补充物，其通过将以下组分以以下顺序混合来制备：5.0mlHank’s缓冲盐溶液(HBSS；无Ca、Mg；Invitrogen)、1.0ml牛血清白蛋白(10mg/ml于HBSS中＝150μm)、2.0ml转铁蛋白(T1 147-1G，人，100mg/ml于HBSS中＝1.1mM)、1.0ml亚硒酸钠(S9133-1MG，0.01mg/ml于HBSS中＝58μM)、0.4ml腐胺二盐酸盐(P5780-5G，80mg/ml于HBSS中＝500mM)、0.2ml孕酮(P8783-5G，0.125mg/ml于无水乙醇中＝400μM)、0.02ml皮质酮(C2505-500MG，2mg/ml于无水乙醇中＝5.8mM)、0.1ml triiodothyonine，钠盐(T6397-100MG，0.2mg/ml于0.01N NaOH中＝300μM)、0.4ml胰岛素(I6634-250MG，牛胰腺，241U/mg，25mg/ml于20mM HCl中＝4.4mM)，总体积为10.02ml(可储存于-20℃))。通过将以下进行组合来制备N3补充物贮存液：10ml Pen/Strep(100X，Gibco)、10ml谷氨酰胺(200mM，Gibco)、10ml MEM维生素(100X，Gibco)、10mlN3浓缩液(100X，见上文)，总体积为40ml。使用0.22μm滤膜将混合物过滤除菌，并将1-2ml等分试样储存于-20℃。
使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)在37℃下将神经元进行胰蛋白酶处理30分钟、沉降并计数。使用Amaxa 96孔核转染器用400ng DLKsiRNA对照(程序DC100)电穿孔二十万个细胞，随后等分至8室载玻片(BD Biocoat PDL/层粘连蛋白包被玻璃，Becton Dickinson)的两个孔中。允许神经元在室温下附着到载玻片上5-10分钟，随后在37℃温育3天。以25μg/ml的浓度加入抗NGF抗体至载玻片(4孔)的右半部分。在37℃温育20小时后，通过向250μl培养基中直接加入250μl固定液，利用30％蔗糖/8％多聚甲醛(PFA)固定载玻片。(为了制备30％蔗糖/8％PFA溶液，将以下成分加入至包括搅拌棒的600ml烧杯中：250ml 16％PFA(cat#15710-S，Electron Microscopy Sciences)、50ml10X PBS pH 7.4和150g蔗糖。低热下混合溶液直至溶解。随后加入6-8滴1M NaOH使pH值为7.4。随后在刻度量筒中用水将体积补充至500ml。充分混合溶液，以等分试样放置并冻存)。
固定载玻片30分钟，随后用PBS洗涤三次。用神经元特异的β-微管蛋白抗体(Tuj 1(1∶1000)于2％BSA，0.1％Triton)在4℃过夜标记所有细胞。去除一级抗体并用PBS洗涤载玻片三次。载玻片与山羊Alexa 488抗兔二级抗体(1∶500)温育1小时，随后用PBS洗涤三次，并随后用130μl封固剂(Fluoromount G；Electron Microscopy Sciences)和24x 60mm No.1盖玻片(VWR盖片。
DLK的定量PCR(qPCR)
切开E13.5DRG，用对照siRNA或针对DLK的siRNA电穿孔，并如上文描述培养五天时间。随后通过Qiagen RNeasy Mini试剂盒按照生产商说明书使用Purify Total RNA从神经元分离RNA。在定量PCR实验(Qiagen Quantifect SYBR Green RT-PCR)中使用对DLK和GAPDH(对照)特异的DNA引物(CATCATCTGGGTGTGGGAAG(正向引物)和AGTTGCAGCATGAGGGCATTC(反向引物)；SEQ ID NOs：16和17)以一式三份电泳来自对照和DLK siRNA处理的细胞的10ng总RNA。分析扩增曲线并计算每一样品相对于对照的相对RNA浓度。
结果
这些实验的结果显示于图38中。用编码野生型DLK的质粒瞬时转染293细胞导致JNK的磷酸化和激活，显示在信号级联中DLK是处于JNK上游的激酶。共转染编码激酶死亡DLK的质粒降低了JNK磷酸化水平。DLK表达通过siRNA的击倒导致保护神经元免于变性，如下游激酶JNK的抑制那样。在使用转染有针对DLK(Dharmicon)的siRNA的培养神经元的实验中，用对照siRNA转染的神经元(如通过肌动蛋白染色可见)在NGF撤除后进行了明显变性，如通过TuJI染色可见(图38和图39)。相反，在转染有靶向DLK的siRNA的神经元中，在NGF撤除后仍保持轴突的完整性。使用对DLK特异的引物进行定量PCR，证实了这些实验中DLK表达的击倒。
B.DLK击倒保护免于毒素诱导的神经元细胞死亡
进行实验以评估以上观察到的DLK抑制的保护效果是否更一般地保护免于其它损伤，如毒素暴露引起的轴突变性/神经元细胞凋亡。分离的神经元在对DLK特异的siRNA存在或缺失下暴露在有丝分裂抑制剂长春新碱中。
使用以下程序分离皮层神经元。将缺少脑脊膜的大鼠E18皮层解剖到冰冷的neurobasal培养基(Invitrogen)中。皮层在0.1％胰蛋白酶/PBS(Worthington)终浓度中37℃下解离30分钟。向管中加入终浓度0.1％DNA酶(Roche)，并将组织在室温下温育1分钟。用温热的neurobasal培养基洗涤组织一次，并在加入1mL含有2％B27补充物(Invitrogen)的neurobasal培养基之前允许所述组织在管中沉降。通过P1000移液管(Rainin)研磨来解离组织。对细胞计数，并且对于一些实验，使用Biosystem96-孔核转染器(Amaxa)利用siRNAs进行转染。
对于siRNA实验，分别以2x 106细胞/孔、1.25-2x 105细胞/孔或1x104细胞/孔的细胞密度(所述密度允许通常与电穿孔过程相关的一些细胞死亡)将细胞接种在6或8孔室内或96孔聚-D-赖氨酸包被的盘中(BDBiosciences)。神经元与20μL的核转染溶液(Amaxa)和600ng的siRNA(Qiagen或Dharmacon)混和。在接种后3-4天通过定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定基因沉默。简言之，使用Rneasy mini试剂盒(Qiagen)从转染的神经元中分离RNA。使用Quantifect SYBR GreenRT-PCR试剂盒(Qiagen)，利用DLK-、JNK1-、JNK2-或JNK3特异引物一式三份进行含有10ng RNA的各反应。持家基因GAPDH的引物用作对照(从Qiagen购买所有引物)。使用ΔCT分析扩增曲线的用于各样品中的相对RNA浓度。
利用300nM长春新碱(微管去稳定剂)处理平板接种3-4天的皮层神经元6-72小时。在最终处理后4-36小时之间测定NGF撤除诱导的细胞凋亡和变性。使用MTT测定和乳酸脱氢酶测定来测定细胞凋亡和变性。所述MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)测定基于线粒体功能测量细胞活力。向各孔中加入总共1/10培养体积的MTT，并利用5％CO2在37℃下温育90-120分钟。吸走含有MTT的培养基，并将细胞重悬浮于等体积的增溶溶液中(10％triton X-100，1滴HCl，50mL异丙醇)。使用分光光度计读取吸光度(570和690nm)。使用CytoTox非放射性LDH测定试剂盒(Promega)测定乳酸脱氢酶(LDH)水平，以评估测定中细胞死亡的量。根据制造商的说明书使用来自不同处理条件的50μL培养基。对于MTT和LDH测定，将细胞存活/细胞死亡对阳性对照进行归一化。
在表9中显示了结果。如先前在上述DLK击倒、NGF撤除实验中观察到的，在两个不同测定系统中，DLK表达的击倒也保护免于长春新碱诱导的皮层神经元死亡。该发现表明在许多不同神经元类型中，DLK击倒一般也保护免于胁迫诱导的神经元细胞死亡。
表9：如LDH测定测量，在长春新碱攻击后DLK击倒对皮层神经元存活的影响
  条件   ％细胞死亡(归一化)
  对照(未处理)   0
  20小时长春新碱处理   100
  DLK siRNA(未处理)   0
  DLK siRNA(20小时长春新碱)   11
  条件   ％存活(归一化的)
  对照(未处理)   100
  12小时长春新碱处理   77
  DLK siRNA(12小时长春新碱)   95
C.交感神经元中DLK调节的效果
上述分析证明，在皮层神经元和背根神经节神经元中，DLK抑制保护免于毒素诱导的或生长因子饥饿诱导的轴突变性/细胞凋亡。进行其它实验，以评估DLK抑制保护交感神经元免于这些攻击通常诱导的细胞凋亡的能力。
从出生后1天的Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs)中切下交感颈神经节，并收集在含有Ultraculture培养基(Lonza)与5％胎牛血清(Invitrogen)的盘子中。用无血清Ultraculture培养基洗涤神经节两次，加入终浓度0.1％的胰蛋白酶(Worthington)并在37℃下与组织温育30分钟。向所述神经节中加入PBS中百分之一的DNA酶(Roche)溶液，并在室温下温育1-2分钟。用Ultraculture洗涤神经节并允许沉降到管底。去除所有的洗涤培养基，并向管中加入含有Ultraculture、5％大鼠血清、1％青霉素-链霉素、1％glutamax、7μM阿糖胞苷(Sigma)和50ng/mL神经生长因子(2.5S，Cedarlane Laboratory)的1mL平板培养基。使用移液管(Rainin)通过研磨解离神经节。在0.45μm细胞过滤网(Falcon)上过滤细胞浆液，并对细胞数量计数。以5000-7500细胞/孔(96-孔盘)、200,000细胞/孔(6-孔板)或100,000细胞/孔(8-孔室载玻片)的密度平板接种交感神经元，并在37℃下5％CO2中培养4-5天。
每隔一天，用含有5-10ng/mL NGF的新鲜平板培养基饲喂神经元。
如实施例14A中所述进行NGF撤除测定。如实施例14B中所述进行长春新碱处理、MTT测定和LDH测定。
使用两个慢病毒载体：GCMV-MCS-IRES-eGFP和GCMV-MCS-IRES-dsRed进行慢病毒实验。两个载体都是HIV1株，其缺少结构病毒基因gag、pol、env、rev、tat、vpr、vif、vpu和nef。此外，3′LTR内的启动子/增强子序列具有部分缺失，其使得整合后5′LTR/启动子自身灭活。为两个载体反向提供的基因是结构病毒蛋白质Gag、Pol、Rev和Tat(通过质粒Delta8.9)和包膜蛋白VSV-G。通过共转染将这些质粒引入HEK293-T细胞中，并瞬时表达产生病毒颗粒所需的不同病毒蛋白质。产生野生型或致病慢病毒的可能性是极低的，因为其需要三个质粒之间进行多次重组事件。此外，已经从两个载体中完全去除了致病因子(vpr、vif、vpu和nef)。
通过向含有5μg/mL1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的细胞培养基中加入病毒在平板接种后立即感染神经元或平板接种后3-5天感染神经元。第二天，去除含有病毒的培养基，并用新鲜的培养基替换。允许细胞在实验前表达病毒48小时。
与DLK击倒对皮层神经元和DRG的保护效果类似，DLK的击倒保护交感神经元免于NGF撤除诱导的细胞凋亡(图40A-40B和表10)和毒素诱导的细胞凋亡(图41和表11)。
表10：DLK击倒保护交感神经元免于NGF撤除胁迫(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化的)
  对照(具有NGF)   100
  NGF去除的24小时   46
  DLK siRNA对照   133
  DLK siRNA NGF去除   93
表11：DLK击倒保护交感神经元免于毒素诱导的变性(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化的)
  对照(未处理的)   100
  24小时长春新碱处理   28
  24小时喜树碱处理   79
  DLK siRNA(24小时长春新碱)   47
  DLK siRNA(24小时喜树碱)   106
值得注意的是，在交感神经元中引入过量的激酶死亡DLK类似地保护免于NGF撤除诱导的细胞凋亡(图42和表12)。
表12：在交感神经元中显性失活DLK保护免于NGF撤除诱导的变性(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化的)
  GFP病毒对照(具有NGF)   77
  GFP病毒-NGF去除   36
  DLK病毒对照(具有NGF)   62
  DLK病毒-NGF去除   22
  DLK DN病毒对照(具有NGF)   104
  DLK DN病毒-NGF去除   60
该发现与实施例15中的发现一致，即引入293细胞中的激酶死亡的DLK抑制这些细胞中的JNK磷酸化。一种非限制性可能性是，激酶死亡的DLK可防止正常的DLK二聚体化和自身磷酸化。该发现提示，通过降低DLK表达或通过引入缺少激酶活性的DLK变体抑制DKL的JNK磷酸化能力保护许多类型的神经元免于响应毒素暴露或生长因子撤除的轴突变性和细胞凋亡。
实施例15
已经测定DLK的RNA沉默及激酶死亡的DLK的引入各自针对NGF撤除触发或毒素诱导的培养神经元变性具有保护性，进行其它实验以鉴定DLK在神经元变性途径中的作用。DLK是多谱系激酶(MLK)家族的MAP激酶激酶激酶。与MLK家族的其它成员相反，DLK的表达限制在神经系统中(Gallo等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.3(9)：663-672，2002；Bisson等，CellCycle 7(7)：909-916，2008；Holzman等，J.Bio.Chem.269(49)：30808-30817，1994)。DLK是激活JNK 1-3和cJun的信号转导途径的成员，激活JNK 1-3和cJun在某些情况下导致细胞凋亡/炎症。已经通过检查患者样品或疾病动物模型中的实验将增加的JNK/cJun活性与多种神经病症相联系，所述病症包括帕金森病、青光眼、阿尔茨海默氏病、ALS、中风和亨延顿舞蹈病(Oo等，J.Neurochem.72(2)：557-564，1999；Ries等，J.Neurochem.107(6)：1578-1588，2008；Vlug等，Eur.J.Neurosci.22(8)：1881-1894，2005；Morfini等，Nat.Newosci.12(7)：864-781，2009；Perrin等，Exp.Neurol.215(1)：191-200，2009；Levkovitch-Verbin等，Eye Res.80(5)：663-670，2005；Tezel等，Brain Res.996(2)：202-212，2004；Kuan等，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.100(25)：15184-15189，2003；Yang等，Nature 389(6653)：865-870，1997；Hunot等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(2)：665-670，2004；Thakur等，J.Neurosci.Res.85(8)：1668-1673，2007)。研究了DLK与神经病症之间的可能相关性以及一个或更多JNK/cJun激活途径的参与。
A.对磷酸化DLK特异的抗体
DLK是MAP激酶，并且像其它MAP激酶，其在激活状态的激活环内被磷酸化。为了能够容易地区分激活的和静息的(未激活的)DLK，产生对磷酸化形式的DLK(″p-DLK″)特异的抗体。为此，将活性位点中的特异残基突变成丙氨酸，其不能被磷酸化。然后使用实施例14，A部分(上文)中描述的相同方案将这些构建体转染到293细胞中，并检测其磷酸化下游激酶JNK的能力(图43C)。该分析证实苏氨酸278(T278)和丝氨酸281(S281)为活性所需。使用标准的体内免疫技术在兔中针对含有这些残基的DLK蛋白质活化环中的肽产生抗体。对于抗体317和318，用于免疫的肽序列是CKELSDKSpTKMpSFAG(SEQ ID NO：13)，对于抗体319和320是KMpSFAGTVAWMAKKC(SEQ ID NO：14)，对于抗体321和322是CGTSKELSDKSpTKM(SEQ ID NO：15)。使用“p-位点”方案，在Yenzym进行程序，所述方案包括在磷酸化和非磷酸化肽的柱子上纯化，以产生选择性。分离来自六只免疫兔子的多克隆抗体，并筛选其与DLK和p-DLK的结合。
将六种获得的多克隆抗体进行蛋白质印迹和免疫组织化学分析，以测定其检测p-DLK的能力，并将其与非磷酸化的DLK或其它磷酸化激酶和磷酸化MLK3区分开。对于培养的细胞，去除培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞一次。将细胞刮到冷PBS中并转移到冰上的eppendorf管中。快速沉淀细胞，并去除过量的缓冲液。沉淀在干冰上快速冰冻并储存在-80℃，或立即在新鲜的裂解缓冲液中(20mM Tris，150mM NaCl，0.1％TritonX-100)裂解，所述裂解缓冲液含有磷酸酶(Sigma P5726和P2850)和蛋白酶抑制剂(Roche 11836153001)。使用BCA测定(Pierce)测定蛋白质浓度。
蛋白质裂解物与样品缓冲液(Invitrogen)混和，煮沸5分钟，然后装载到变性的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上。将样品转移到硝基纤维素(Invitrogen)上，并在5％奶/TBST封闭液(Tris-缓冲盐水+0.05％TritonX-100)中封闭1小时。印迹与含5％BSA的TBST中1∶1000稀释的磷酸DLK抗体在振荡平台上4℃温育过夜。用TBST洗涤印迹三次5分钟，并与兔二级辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体(Jackson Labs，1∶5000)在室温下温育1-2小时。膜在TBST中洗涤三次，并用Westdura化学发光底物(Pierce)显色。
将293T细胞平铺到12-孔培养皿中含有的盖玻片上用于免疫染色。然后如前描述利用mDLK或mMLK3转染所述细胞，然后在转染后利用4％PFA，30％蔗糖固定24小时。利用5％BSA，0.3％Triton X-100封闭并透化细胞1小时，然后将其与1％BSA中1∶500浓度的一级抗体温育过夜。然后，用PBS轻轻地冲洗细胞三次，并用Alexa488抗兔二级抗体缀合1小时。该步骤后是三次PBS洗涤，最后一次洗涤含有DAPI(1∶5000)来染色细胞核。然后小心地将盖玻片从培养物上抬起，装到载玻片上，其中具有细胞的表面朝向载玻片，并使用荧光显微镜观察所述载玻片。
抗体318、319、320、321和322各自检测p-DLK和p-DLK/DN-DLK不结合(抗体318和319)或非常有限地结合(抗体320、321和322)磷酸化的MLK3(图43A)。相反，抗体317识别所有的三种蛋白质。抗体318和319显示与p-DLK的最强结合，与最小p-MLK3结合偶联，因此用于进一步的分析。
如通过免疫组织化学所测定，抗体在细胞的背景中也能够特异性结合p-DLK。抗体318和319染色DLK转染的293T细胞，其中在MLK3转染的293T细胞中观察到显著降低的结合(图43B)。该结合在已经转染了DLK突变体的293细胞中显著降低，所述DLK突变体具有导致激酶活性近乎完全缺失的突变(图43C)。像其它混和谱激酶一样，因为当在异源系统中转染时认为DLK二聚体化并自磷酸化，这些数据进一步证实这些抗体的确识别磷酸化形式的DLK。
B.长春新碱诱导的皮层神经元变性期间DLK的激活
然后检测如上所述产生的抗体，以评估在已经受长春新碱胁迫的皮层神经元中DLK的磷酸化和活性是否增加。这是可以期望的，因为DLK活性的击倒促进存活。当如上所述培养并用长春新碱处理1小时时，通过蛋白质印迹(如上所述的相同方案)，使用抗体318、319和320分析，磷酸化的DLK的水平与对照培养物相比提高了(图43D)。这提供了进一步的验证，即磷酸化的DLK的水平与活性相关，并在神经元胁迫条件下升高。
C.神经元疾病模型中DLK的表达和活性
如下进行免疫组织化学测定。用4％多聚甲醛灌注SOD1转基因动物，小心地从脊柱中取出脊髓，并在4℃固定后过夜。然后在OCT中包埋用于冷冻切片之前将所述脊髓在30％蔗糖/PBS中进行平衡。切割冠状切片(20μm厚)，封固在冷的载玻片上，并保持在-80℃。切片在PBS中水化并用H2O2(PBS中0.3％)封闭内源过氧化物酶活性10分钟，随后用PBST(0.1％Triton X-100)冲洗2次。切片在PBS中5％BSA，0.3％Triton X-100中封闭1小时，然后与含1％BSA，0.3％Triton X-100的PBS中p-DLK中的一级抗体在4℃温育过夜。在PBST中洗涤载玻片三次，然后用含1％BSA，0.3％Triton X-100的PBS中的生物素化的二级抗体(1∶300)标记1小时。用PBST冲洗所述载玻片，然后与含有ABS试剂(Vector labs)的抗生物素蛋白DH温育30分钟，最后在黑暗中过氧化物酶底物(10mM Tris，150mMNaCl，pH 7.6中0.05％二氨基联苯胺，使用前向其中加入30％H2O2)中温育10-15分钟。通过用水冲洗终止反应，并在载玻片和盖玻片上封固切片。从US Biological购买阿尔茨海默氏病患者组织。来自阿尔茨海默氏病患者和年龄匹配对照的海马组织裂解物用于该分析中。通过蛋白质印迹使用与上述方案相同的方案进行分析。
图44A中的结果证明ALS的SOD1小鼠中磷酸化DLK(p-DLK)的水平相对于疾病晚期的野生型小鼠升高了。p-DLK的证据早在14周前在组织样品中就是明显的(图44B)，其先于这些动物中ALS样症状的发作。
在人阿尔茨海默氏病患者样品中观察到了类似结果。阿尔茨海默氏病患者皮层样品中p-DLK的水平相对于对照样品升高了(图44C)。磷酸化JNK和磷酸化cJun63水平在阿尔茨海默氏病患者中相对于对照样品也升高了(图44C)。因此，在症状发作之前和疾病末期，DLK在ALS的公认小鼠模型中被激活，并也在来自人阿尔茨海默氏病患者的皮层样品中被激活。
D.促进观察到的DLK抑制效果的信号转导
1.DLK沉默的分子效应
如上文实施例14中证明，DLK沉默保护神经元免于响应毒素暴露或生长因子撤除的降解，并且DLK激酶活性直接或间接参与JNK磷酸化。进行实验以评估NGF撤除胁迫和毒素依赖性胁迫条件下JNK和cJun的表达和活性。用于降低DLK(siRNA)的表达和用于免疫印迹的实验方案与上文描述的那些相同。
DLK沉默没有改变DRGs或皮层神经元中基线JNK蛋白质水平或JNK活性(图45)。然而在皮层神经元、DRGs和交感神经节神经元中NGF撤除或长春新碱依赖性胁迫后，DLK击倒降低了p-cJun的水平(图45)。在皮层神经元和DRG中NGF撤除或长春新碱依赖性胁迫后，DLK击倒也降低了p-JNK的水平(图45)。应指出，p-JNK抗体识别各磷酸化形式的JNK1、JNK2和JNK3。JNK1磷酸化与胁迫诱导或cJun的磷酸化不相关。DLK击倒沉默了JNK2和JNK3的胁迫诱导的磷酸化。在这些数据中观察到的对照样品的背景信号可能是由于基线磷酸化的JNK1。结果显示，DLK沉默或其它抑制不引起JNK或cJun的降解，但导致哪些分子的胁迫诱导的磷酸化的程度更低(并因此缺少激活)。
如果DLK抑制通过限制JNK2和JNK3的磷酸化而保护神经元免于变性，那么JNK2或JNK3的抑制剂应该也保护神经元免于细胞死亡和轴突变性。还评估了直接JNK抑制保护神经元免于NGF撤除依赖性变性的能力。在上述NGF撤除测定中进行评估之前，用抗NGF和任一pan-JNK抑制剂或JNKV或JNKVIII处理DRG外植体。两种抑制剂都能够保护DRG外植体免于NGF依赖性变性(图46)：JNKV(Calbiochem)在5μM浓度处最具保护性，而JNKVIII(Calbiochem)在4μM浓度处最具保护性。
为了鉴定哪个JNK参与观察到的保护效果，使用上文描述的相同方法进行进一步击倒实验。单独沉默对JNK1特异的RNAs不能复制利用pan-JNK抑制剂观察到的效果(图47)。JNK2或JNK3的抑制性RNAs(siRNAs)不能单独在NGF撤除后保护DRG免于轴突变性(图47)。在JNK2和JNK3两者均沉默存在时观察到最有效的保护，尽管该保护与siDLK单独程度不相同(图47)。
JNK1是组成型活性分子，已知负责轴突维持和突触成熟，而已知JNK2和JNK3是胁迫诱导的并参与cJun激活和细胞凋亡/轴突变性(Coffey等，J.Neurosci.22(11)：4335-4345，2002；Coffey等，J.Neurosci.20(20)：7602-7613，2000)。DLK抑制比JNK 1/2/3抑制导致更大的神经保护作用的事实强烈提示，DLK除了在JNK/cJUN途径中的作用外，对神经元生长和/或存活的一种或多种机制是抑制性的。
E.DLK的营养效果
先前的研究已经提示，显性失活激酶死亡的突变体形式的DLK(K152A)在黑质密部的多巴胺能神经元中引起营养效果，而仅含有亮氨酸拉链结构域的显性失活形式的DLK不引起此类效果(Chen等，J.Neurosci.28(3)：672-680，2008)。然而值得注意的是，通过DLK(K152A)感染的神经元(其表达特定标记)的增加数量，而不是感染的和未感染的神经元之间的任何功能或形态差异来定义该研究中的营养作用。因此在皮层神经元和DRGs中研究DLK沉默的影响。用于这些研究的方案与上文描述的那些方案相同。
显示DLK击倒对皮层神经元和交感神经元具有显著的营养效果(观察到的细胞数量的增加)(图48A和48B)。尤其是，当用针对DLK的siRNA处理时，DRG、皮层和交感神经元在培养物中显示提高的生长/存活(观察到的生长的增加(表13)。
表13：DLK击倒后培养物中多种类型神经元的增加的生长(MTT测定)
  条件   ％存活(归一化的)
  皮层神经元对照   100
  皮层神经元+DLK siRNA   137
  交感神经元对照   100
  交感神经元+DLK siRNA   139
  DRG神经元   100
  DRG神经元+DLK siRNA   147
为了进一步检查DLK在神经元生长中的作用，测定MAP2的水平，所述MAP2是特别定位在树突上的微管结合蛋白。培养的神经元中MAP2的表达反映了神经元成熟和表达，并在前生长条件下经常增加。在神经元中使用显性失活亮氨酸拉链形式的DLK或显性失活激酶死亡形式的DLK对DLK活性的抑制导致对MAP2蛋白质产生的诱导。MAP2表达的诱导表明发生了神经元生长和成熟，并进一步证实DLK击倒的确对神经元具有功能营养效果。
实施例16
此处描述的测定鉴定了G蛋白和G蛋白偶联受体(GPCRs)的若干抑制剂，其降低神经元中的变性。在DRGs中进行实验，来证实G蛋白和GPCRs在变性途径中的作用。用于这些实验的实验方案与实施例14中描述的那些方案相同。从Tocris Bioscience购买百日咳毒素和SCH 202676。
数据证明，SCH 202676(其为抑制结合G蛋白偶联受体的激动剂和拮抗剂的巯基反应化合物)在DRGs中降低NGF撤除诱导的变性(图49和50)。G蛋白信号转导的另一抑制剂百日咳毒素在NGF撤除后也降低神经元中的变性(图51)。这些数据表明，G蛋白和G蛋白偶联受体在神经元变性中起作用。
实施例17
在此处所述测定中鉴定并在变性途径中起作用的额外细胞靶标是β-联蛋白信号转导途径及其下游靶标(例如转录因子4，TCF4)的成员。在海马神经元中进行实验，以证实β-联蛋白和TCF4在神经元变性中的作用。用于这些实验的实验方案与实施例14中描述的那些方案相同。
数据显示，组成型活性GSK3的表达(其可导致β-联蛋白丢失)介导神经元活力的降低(图52；右上图)。显性失活形式的TCF4的表达也介导神经元活力的降低(图52；右下图)。这些数据表明，β-联蛋白信号途径对神经元活力的维持是重要的。靶向β-联蛋白信号途径的抑制剂可用于促进神经元变性(例如，β-联蛋白表达的抑制剂和TCF4活性的抑制剂)。相反，激活剂或β-联蛋白和TCF4信号转导可防止轴突变性和神经元细胞死亡。
其它实施方案
该说明书中引用的所有出版物和专利此处引用作为参考，就如同每一单个出版物或专利被明确和单独地指出被引用作为参考一样。此处单数形式的使用，如″一个″和″这个″不排除对应的复数形式，除非上下文指出相反。尽管已经通过阐明和实施例为清楚理解目的详细描述了本发明，对本领域技术人员显而易见的是，按照本发明教导，可对其进行某些改变和修改，而不背离所附权利要求的精神或范围。
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Claims (31)

1.用于抑制神经元或其部分变性的方法，所述方法包括向神经元或其部分施用试剂，所述试剂调节：(i)在神经元或其部分中靶蛋白的活性或表达，或(ii)所述神经元或其部分中的过程。
2.权利要求1的方法，其中所述受抑制的变性位于神经元的轴突或细胞体中。
3.权利要求1的方法，其中所述神经元或其部分是或包含在神经元内，所述神经元选自小脑颗粒神经元、背根神经节神经元、皮层神经元、交感神经元，和海马神经元。
4.权利要求1的方法，其中所述施用导致与神经元的对照群体相比，神经元群体中神经元群体变性降低至少10％，或神经元群体中轴突或细胞体变性降低至少10％。
5.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白选自携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的X蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，和β-联蛋白；或
所述过程是转录或蛋白质合成。
6.权利要求1或5的方法，其中所述试剂是靶蛋白或过程的抑制剂。
7.权利要求1或6的方法，其中所述试剂选自抗体、多肽、肽、肽体、核酸分子、短的干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子和多糖。
8.权利要求7的方法，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab′片段、和F(ab′)2片段；或
所述小分子选自GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、Tyrphostin B44、TyrphostinB42(AG 490)、茴香霉素、放线菌酮、Roscovitine、毛喉素、放线菌素D、Bax通道阻断剂、bortezomid、双硫仑、pamapimod、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼二甲苯磺酸盐、盐酸去甲金霉素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素，及其药学上可接受的盐。
9.权利要求6的方法，其中所述抑制剂是DLK信号转导抑制剂、GSK3β抑制剂、EGFR途径抑制剂或G蛋白抑制剂。
10.权利要求9的方法，其中所述抑制剂是：
(i)DLK信号转导抑制剂，其选自靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、T278A DLK、S281A DLK、K152A DLK，和DLK的亮氨酸拉链结构域；
(ii)GSK3β抑制剂，其选自GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII和氯化锂；
(iii)EGFR途径抑制剂，其选自埃罗替尼、Tyrphostin B44、TyrphostinB42/AG490和小分子；或
(iv)所述G蛋白抑制剂是百日咳毒素或小分子。
11.权利要求1的方法，其中所述神经元或其部分存在于人受试者中、神经移植物或神经移植体中，或为离体的或体外的。
12.权利要求11的方法，其中所述受试者，或待向其中引入神经移植物或神经移植体的受试者患有或处于发生疾病或状况的风险中，所述疾病或状况选自(i)神经系统的病症，(ii)继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统状况，(iii)由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤，(iv)疼痛，(v)眼相关的神经变性，(vi)记忆丧失，和(vii)精神疾病。
13.权利要求12的方法，其中所述施用导致所述神经系统病症；继在神经系统外具有主要效果的疾病、状况或治疗之后的神经系统的状况；由物理、机械，或化学损伤引起的神经系统损伤；疼痛；眼相关的神经变性；记忆丧失；或精神疾病的一种或多种症状或发生这些疾病的可能性降低至少10％。
14.权利要求13的方法，其中所述一种或多种症状选自震颤、运动缓慢、运动失调、平衡缺失、抑郁、降低的认知功能、短期记忆丧失、长期记忆丧失、意识错乱、人格改变、语言困难、感知觉丧失、对触觉灵敏、四肢麻木、肌无力、肌肉麻痹、肌肉痛性痉挛、肌痉挛、食习惯的明显改变、过度恐惧或忧愁、失眠、妄想、幻觉、疲劳、背痛、胸痛、消化问题、头痛、快速的心率、头晕、视力模糊、视力区域的阴影或缺失、视物变形症、色觉损伤、暴露在强光后视觉功能的降低恢复，和视觉对比敏感性丧失。
15.权利要求12的方法，其中所述疾病或状况是：
(i)神经系统病症，其选自肌萎缩性侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔麻痹、重症肌无力、肌肉萎缩症、进行性肌萎缩、原发性侧索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、遗传性肌萎缩、椎间盘综合征、颈椎病、网状组织病症、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉症、阿尔茨海默氏病、亨延顿舞蹈病、帕金森病、帕金森氏阳性病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、卢伊体痴呆、额颞痴呆、脱髓鞘病、吉-巴综合征、多发性硬化、沙-马-图病、朊病毒病、克-雅病、吉斯特曼-斯召斯列综合征(GSS)、致命性家族性失眠症(FFI)、牛海绵样脑病、神经鞘磷脂沉积病、癫痫、和艾滋病痴呆综合征；
(ii)与状况相关的疼痛，其选自慢性痛、纤维肌痛、脊柱痛、腕管综合征、来自癌症、关节炎、坐骨神经痛、头痛的疼痛、来自手术、肌肉痉挛、背痛、内脏痛的疼痛、来自损伤、牙痛、神经痛的疼痛，如神经源性疼痛或神经性疼痛、神经炎症或损伤、带状疱疹、突出盘、韧带撕裂和糖尿病；
(ii)外周神经病或神经痛，其由糖尿病、癌症、艾滋病、肝炎、肾功能异常、科罗拉多蜱传热、白喉、HIV感染、麻风病、莱姆病、结节性多动脉炎、类风湿性关节炎、肉状瘤病、舍格伦综合征、梅毒、系统性红斑狼疮或淀粉状蛋白病引起；
(iii)神经损伤，其由暴露在毒性化合物、重金属、工业溶剂、药物、化学治疗剂、氨苯砜、HIV药物治疗、胆固醇降低药物、心脏或血压药物治疗、或甲硝唑引起；
(iv)神经系统损伤，其由物理、机械，或化学损伤引起；
(v)神经病病症，其选自精神分裂症、妄想性障碍、情感分裂性精神障碍、精神分裂症、分享性精神障碍、精神病、偏执型人格障碍、精神分裂样人格障碍、边缘型人格障碍、反社会性人格障碍、自恋性人格障碍、强制性障碍、谵妄、痴呆、心境障碍、双相性精神障碍、抑郁、应激障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社会恐怖、创伤后应激障碍、焦虑障碍、和冲动控制障碍；或
(vi)眼相关神经变性，其选自青光眼、网络状营养不良、色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、与湿或干AMD相关的光感受器变性、其它视网膜变性、视神经脉络膜小疣、视神经病、和视神经炎。
16.权利要求15的方法，其中所述神经系统损伤选自烧伤、创伤、手术、意外伤害、局部缺血、对冷温度的延长暴露、中风、颅内出血、和大脑出血，或
所述青光眼选自原发性青光眼、低眼压性青光眼、原发性闭角型青光眼、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、间歇性闭角型青光眼、慢性开角闭角型青光眼、色素性青光眼、脱落性青光眼、发育性青光眼、继发性青光眼、晶状体溶解性青光眼、眼内出血继发的青光眼、外伤性青光眼、新生血管性青光眼、药物诱导的青光眼、中毒青光眼、和眼内瘤相关性青光眼、视网膜脱离、眼睛的严重化学灼伤、和虹膜萎缩。
17.权利要求12的方法，其中所述神经元或其部分与试剂的接触包括向受试者施用包含所述试剂的药物组合物。
18.权利要求17的方法，其中通过静脉内输注；通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内或损伤内途径注射；或通过局部或眼睛应用进行所述施用。
19.权利要求17或18的方法，其还包括向受试者施用一种或多种额外的药学试剂。
20.鉴定用于抑制神经元或其部分变性的试剂的方法，所述方法包括将神经元或其部分与候选试剂在轴突或神经元变性的测定中接触，其中在候选试剂存在下神经元或其部分相对于对照减少的变性的检测表明鉴定了用于抑制神经元或其部分变性的试剂。
21.权利要求20的方法，其中轴突或神经元变性的测定选自抗神经生长因子(NGF)抗体、血清剥夺/KCl减少，和鱼藤酮处理。
22.权利要求20或21的方法，其中所述候选试剂选自抗体、多肽、肽、肽体、核酸分子、短干扰RNAs(siRNAs)、多核苷酸、适体、小分子和多糖。
23.药物组合物或药盒，其包含可用于抑制神经元或其部分变性的一种或多种试剂。
24.权利要求23的药物组合物或药盒，其中所述一种或多种试剂是DLK信号转导抑制剂、GSK3β抑制剂、EGFR途径抑制剂，或G蛋白抑制剂。
25.权利要求23或24的药物组合物或药盒，其中所述一种或多种试剂选自GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII、氯化锂、Tyrphostin B44、Tyrphostin B42(AG 490)、茴香霉素、放线菌酮、Roscovitine、毛喉素、放线菌素D、Bax通道阻断剂、bortezomid、双硫仑、pamapimod、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼二甲苯磺酸盐、盐酸去甲金霉素、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸巴龙霉素，及其药学上可接受的盐。
26.权利要求24的药物组合物或药盒，其中所述一种或多种试剂是：
(i)DLK信号转导抑制剂，其选自靶向DLK的siRNA分子、靶向JNK1的siRNA分子、靶向JNK2的siRNA分子、靶向JNK3的siRNA分子、小分子、T278A DLK、S281A DLK、K152A DLK，和DLK的亮氨酸拉链结构域；
(ii)GSK3β抑制剂，其选自GSK3β抑制剂I、GSK3β抑制剂VII、GSK3β抑制剂VIII、GSK3β抑制剂XII和氯化锂；
(iii)EGFR途径抑制剂，其选自埃罗替尼、Tyrphostin B44、TyrphostinB42/AG490和小分子；或
(iv)所述G蛋白抑制剂是百日咳毒素或小分子。
27.权利要求23的药物组合物或药盒，其还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或在抑制神经元或其部分变性的方法中使用所述组合物或药盒的说明书。
28.用于激活神经元或其部分变性的方法，所述方法包括向神经元或其部分施用试剂，所述试剂调节：(i)在神经元或其部分中靶蛋白的活性或表达，或(ii)所述神经元或其部分中的过程。
29.权利要求29的方法，其中所述靶蛋白选自携带二元亮氨酸拉链的激酶(DLK)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)、腺苷酸环化酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)、BCL2-结合的x蛋白(Bax)、Ih通道、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)、G-蛋白、G-蛋白偶联受体、转录因子4(TCF4)，和β-联蛋白；或
所述过程是转录或蛋白质合成。
30.权利要求28的方法，其中所述试剂是靶蛋白或过程的激活剂。
31.权利要求28的方法，其中靶蛋白的所述调节是GSK3β活性或表达的增加、β-联蛋白活性或表达的降低，和/或TCF4活性或表达的降低。
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