WO2004002532A1

WO2004002532A1 - Ｍｋｋ７活性化阻害剤

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Publication number: WO2004002532A1
Application number: PCT/JP2003/008179
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Doi; Shinya Hosogi; Naoya Wada
Original assignee: Celestar Lexico-Sciences,Inc.; Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2004-01-08
Also published as: JPWO2004002532A1; US20070148150A1; AU2003246091A8; US20060172360A1; US7195894B2; AU2003246091A1

Abstract

ＭＫＫ７と結合してこれを直接リン酸化する蛋白質ＰＡＫ４およびＪＩＫを見出し、ＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合およびＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化の少なくとも１つを阻害することを特徴とするＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化阻害剤およびリン酸化阻害方法、ＪＮＫ３によるｃ−Ｊｕｎリン酸化に基づく疾患の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法を提供した。さらにＰＡＫ４とＭＫＫ７の結合、ＰＡＫ４によるＭＫＫ７のリン酸化、ＪＩＫとＭＫＫ７の結合またはＪＩＫによるＭＫＫ７のリン酸化を阻害する化合物の同定方法および該同定方法で得られた化合物を提供した。また、上記化合物および上記阻害剤のうち少なくとも１種を有効量含有してなる医薬組成物を提供した。

Description

MKK7活性化阻害剤技術分野

本発明は、 MAPキナーゼキナーゼ 7 (MKK 7 ) の活性化を阻害することを特徴とする c一 J u n N末端キナーゼ 3 (JNK3)による c— J unリン酸化の阻害、 JNK3による c_J unリン酸化に基づく疾患の改善、並びに神経変性疾患の改善に関する。より詳しくは、 MKK7と p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) の相互作用および Zまたは MKK7と J NK/S APK—インヒビトリーキナーゼ（ J I K) の相互作用を阻害すること、すなわち、 PAK4が MKK7に結合して直接 MKK7 をリン酸化することにより引き起こされる MKK 7の活性化および Zまたは J I Kが MKK 7に結合して直接 MKK 7をリン酸ィヒすることにより引き起こされる MKK 7 の活性化を阻害することを特徴とする JNK3による c— J unリン酸化の阻害剤および阻害方法に関する。また、力かる特徴を有する J NK 3による c一 J unリン酸化に基づく疾患の防止剤およぴ Zまたは阻害剤並びに防止方法および/または阻害方法、さらに神経変性の防止剤および/または阻害剤並びに防止方法およぴ Zまたは阻害方法に関する。さらに、 P AK4と MKK 7の結合、 PAK4による MKK7のリン酸化、 J I Kと MKK 7の結合または J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法および該同定方法で得られた化合物に関する。背景技術

c一 J un N末端キナーゼ（以下、 J NKと略称する。）は、 MAPキナーゼ（以下、 MAPKと略称する。）ファミリーに属する蛋白質リン酸化酵素である。哺乳類では 3つの J NK遺伝子（JNK1、】1^1：2ぉょぴ】 1：3) が見出されている。これらのうち J NK 3は脳神経系などに特異的に発現している。

JNK3は、古典的 MAP Kとは異なり、増殖刺激ではほとんど活性化しない。 J NK 3の活性ィヒは、細胞に対するストレス（DNA損傷、紫外線、熱、高浸透圧、小胞体ストレス、活性酸素など。）や炎症性サイトカイン〔腫瘍壊死因子（TNF)、ィンターロイキン一 1 (I L—1) など。〕により引き起こされる。活性化された J NK は、細胞質から核内へ移行し、 c一 J u nなどの転写因子のリン酸化を介して標的遺伝子の発現を制御すると考えられている。

J NKの活性化は、各種ストレス刺激により引き起こされるアポトーシスに関与している。例えば、神経成長因子（NGF) 除去による神経細胞死において J NKが活性化すること（非特許文献 1 )、 N G F除去による神経細胞死が c一 J unのドミナン卜ネガティフ変異体 (d om i n a n t n e g a t i v e mu t a n t; の発現により抑制されることが報告されている（非特許文献 2)。さらに、 JNK3のノックァゥトマウスでは、カイニン酸投与による興奮性神経死が抑制されることが報告されている（非特許文献 3)。これらから、 J NK 3の活性化が神経細胞死に関与していることが示唆されている。

J NKを活性化させる MAPKキナーゼ'（以下、 MAPKKと略称する。）として、 MKK4と MKK7が知られている。 MKK7は、 MAPKK7、 MAP 2K7、 J NKK2とも呼ばれ、 J NKを特異的にリン酸ィ匕して活性ィ匕させる（非特許文献 4おょぴ 5)。一方、 MKK4は、 J NKをリン酸化して活性化させるだけではなく、同じく MAPKフアミリーの一員である ERK2や p 38もリン酸化して活性化させる。 MKK 4遺伝子を破壊した胚性幹細胞（ES細胞）においても浸透圧刺激または紫外線による J NK活性ィ匕が認められることから（非特許文献 6)、 MKK7は、 MKK4 と独立して J NKの活性化に働いていると考えられている。

J NKの活性化はまた、低分子量 G TP蛋白質の 1つである c d c 42からのシグナルによって引き起こされる (非特許文献 7)。 c d c 42に結合してそのシグナルを伝達するキナーゼとして、 P 21活性化キナーゼ（p 21— a c t i v a t e d k i n a s e ； PAK) が知られている。実際、 ΡΑΚファミリーの一員である Ρ ΑΚ 1、 PAK2、 PAK 3または PAK 4の過剰発現により、 J NKのシグナル伝達経路が活性ィ匕することが報告されている（それぞれ非特許文献 8、 9、 7および 10)。しかし、 P AKと J NK活性化との間の詳細なシグナル伝達経路の機構、例えば直接的なのかあるいは間接的なのかについては明らかにされていない。

c d c 42が神経細胞死に関与していることを示唆する知見がいくつ力報告されている。例えば、神経細胞への活性化型 c d c 42の強制発現は神経細胞死を誘導し、また、 c d c 42のドミナントネガティブ変異体は N G F除去による神経細胞死を抑制する（非特許文献 1 1)。また、活性ィ匕型 c d c 42により、 JNKと同様、 MKK 7も活性化することが報告されている（非特許文献 12)。よって、 c d c 42から M KK 7を介して J NKへと伝わるシグナル伝達経路が神経細胞死に関与している可能性が考えられる。

J NK 3活性化の原因となる各種ストレスの 1つとして、小胞体ストレス（以下、 ERストレスと略称する。）が挙げられる。 ERストレスは、各種刺激（グルコース枯渴、カルシウム濃度恒常性の変化、活性酸素など。）により、小胞体（以下、 ERと略称することもある。）における蛋白質のフォールデイング（f o l d i n g) の過程に異常が起こり、 ER内に異常蛋白質が蓄積することにより生じる。 ERストレスが生じると、小胞体内分子シャペロンの発現が誘導され（un f o l d e d p r o t e i n r e s p o n s e : UPR)、フォーノレディング異常 (m i s f o 1 d i n g ) の解消へと向かう。この過程において ERストレスのセンサー蛋白質として働いているものとして、 I RE 1が知られている（非特許文献 1 3)。

ERストレスの負荷による J NK活性化の過程に、 I RE 1および TRAF 2が関与していることが報告されている（非特許文献 14および 15)。すなわち、 I RE 1 破壊細胞株では E Rストレスの負荷による J N K活性ィ匕が抑制され、また、 I R E 1 の過剰発現により J NKが活十生ィ匕する。さらに、 I RE 1は TRAF 2と結合し、また、 TRAF 2のドミナントネガティブ変異体は I RE 1による J NKの活性化を阻害する。

ERストレスの負荷による J NK活性ィ匕の過程に関与する蛋白質として、その他に J I K (DPKとも呼ぶ。）が知られている。 J I Kは、 I RE 1および TRAF 2と結合し、 ERストレスの負荷による J NK活性化に関与していると考えられている。例えば、 J I Kの過剰発現は ERストレスの負荷による J NK活性化を増強し、 J I Kの活性部位欠失変異体は E Rストレスの負荷による J NK活性ィヒを抑制する（非特許文献 15)。

J I Kは、ィースト S t e 20 p蛋白質のヒト相同体である STE 20に関連したセリン /スレオニンキナーゼ (STE20— r e l a t e d s e r i n e/t h r e on i n e k i n a s e) の一つである。 J I Kについては上記作用の他に、例えば、上皮増殖因子（EGF) 刺激による J ΝΚ活性ィ匕を阻害し、その際 J I K自身の活性も抑制される（非特許文献 16) こと、また、 J I Kの過剰発現が J NKの活性ィ匕を引き起こす（非特許文献 17) ことが報告されている。

一方、 ERストレスの過剰負荷により、アポトーシスが誘導されることが知られている。虚血またはポリグルタミンやアミロイド |3 (以下、 A/3と略称する。）などの異常蛋白質の蓄積は、 ERストレスを生じさせると考えられることから、 ERストレスの負荷による神経細胞死と神経変性疾患との関わりが指摘されている。

ERストレスの負荷によるアポトーシスが、 MKK4および MKK7の各々のドミナントネガティブ変異体により抑制されたことから（非特許文献 18 )、 E Rストレスの負荷によるアポトーシス誘導に、 MKK4または MKK7を介した J NK活性ィ匕が関与している可能性がある。

以下に、本明細書で引用した文献を列記する。

特許文献 1 ：国際公開第 WO 01/67299号公報。

非特許文献 l : E i l e r s A. e t a l .， J. Ne u r o s c i. (1 998) 18 ： 1713— 1724。

非特許文献 2 : Ham J. e t a l ., Ne u r o n (1995) 14 : 927- 939。

非特許文献 3 ： Ya n g D. e t a l ., Na t u r e (1 997) 389 : 86 5— 870。

非特許文献 4 : Mo r i g u c h i T. e t a l ., EMBO J. (1997) 16 ： 7045— 7053。非特許文献 5 : F o l t z L e t a l., J. B i o l . Ch em. (1998) 273 ： 9344— 9351。

非特許文献 6 :Ya n g D. e t a l . , P r o c. Na t l . Ac a d. S c i. U. S. A. (1997) 94 : 3004— 3009。

非特許文献 7 : B a g r o d i a S. e t a l ., J. B i o l . Ch em. (1 995) 270 : 27995— 27998。

非特許文献 8 : B r own J. e t a l ., Cu r r. B i o l . (1996) 6 ： 598— 605。

非特許文献 9 : F r o s t J. e t a l.' Mo l . Ce l l . B i o l . (1 9 96) 16 : 3707— 3713。

非特許文献 10 : Ab o A. e t a 1., EMBO J . (1998) 1 7 : 65 27— 6540。

非特許文献 l l :B a z e n e t C. e t a l ., P r o c. Na t l. Ac a d. S c i . U. S. A. (1998) 95 : 3984— 3989。

非特許文献 12 : F o l t z L e t a l ., J. B i o l . Ch em. (199

8) 273 : 9344— 9351。

非特許文献 13 : Ur a n o F. e t a 1., J. C e l l S c i. (2000) 1 13 ： 3697— 3702。

非特許文献 14 :Ur a n o F. e t a l ., S c i e n c e (2000) 287 : 664— 666。

非特許文献 15 : Yo n e d a T. e t a 1 J. B i o l . Ch em. (20 01) 276 : 1 3935— 13940。

非特許文献 16 : Ta s s i E. e t a l ., J. B i o l . Ch em. (199

9) 274 : 33287— 33295。

非特許文献 17 : Zh a n g W. e t a l ., B i o c h em. B i o p h y s . Re s. C ommu n. (2000) 274 : 872— 879。

非特許文献 18 : Zh a n g C. e t a 1., B i o c h em. B i o p h y s . R e s . C ommu n. (2 0 0 1) 2 8 9 : 7 1 8— 7 24。

非特許文献 1 9 ：細胞工学、 20 0 1年、第 2 0卷、第 1 1号、特集：神経変性疾患の発症メカニズムと治療への展望。発明の開示

このような現状を鑑みると、各種ストレスによる J NK活性化機構のいずれかの段階を阻害することは、 J N Kの活性化によって引き起こされるアポトーシスに基づく疾患、具体的には神経変性疾患などの解明並びに防止および/または治療を可能にすると考えられる。その一例として、 MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質を見出して、 MKK 7の活性化を阻害することは J NKの活性化を阻害することとなる。本発明者らは、 MKK 7が PAK4または J I Kと相互作用することをインシリコ ( i n s i 1 i c o) で予測して、実験的に証明し、該相互作用の結果、 PAK4 または J I Kにより MKK 7がリン酸化されて J NK 3シグナル伝達経路を活性化することを見出して、本発明を完成した。

本発明の一態様は、下記 i ) 力、ら iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、 J N K3による c— J u nリン酸ィ匕の阻害剤に関する；

i ) PAK 4と MKK 7の結合阻害、

ii) PAK 4による MKK 7のリン酸ィ匕の阻害、 - iii) J I Kと MKK 7の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害。

また本発明の一態様は、前記 i ) から）のうちの少なくとも 1っを特 ^ [敫とする、 J NK 3にょる c _ J u nリン酸ィ匕の阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記 i )から iv)のうちの少なくとも 1つを特徴とする、】1^1^ 3にょる。ー₁1 1₁1リン酸ィ匕に基づく疾患の防止剤および/または治療剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記 i ) から iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、神経変性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

また本発明の一態様は、前記 i ) から iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、 JNK3にょる_C— J unリン酸化に基づく疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記 i )から iv)のうちの少なくとも 1つを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 P AK4と MKK 7の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 PAK4と MKK 7とが結合する条件下で、 PAK4およぴまたは MKK 7を被検化合物と接触させ、次いで、 PAK4と MKK7との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変ィヒを検出することにより、被検化合物が PAK4 と MKK 7との結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。また本発明の一態様は、 J I Kと MKK 7の結合を阻害するィ匕合物の同定方法であつて、 J I Kと MKK7とが結合する条件下で、 J I Kおよび/または MKK 7を被検化合物と接触させ、次いで、 J I Kと MKK 7との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が J I Kと MKK 7との結合を阻害する力否かを決定することを含む同定方法に関する。

さらに本発明の一態様は、 P AK4による MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、 PAK 4および/または MKK 7と被検化合物を接触させ、 MK K 7のリン酸ィヒを検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が PAK4による MKK7のリン酸ィ匕を阻害するか否かを決定する同定方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 J I Kによる MKK7のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、 J I Kおよび Zまたは MKK 7と被検化合物を接触させ、 MK K 7のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が J I Kによる MKK 7のリン酸化を阻害するか否かを決定する同定方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの同定方法によって得られたィ匕合物に関する。さらに本発明の一態様は、 PAK4と MKK7の結合を阻害する化合物に関する。さらにまた本発明の一態様は、 J I Kと MKK 7の結合を阻害する化合物に関する。また本発明の一態様は、 PAK 4による MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物に関する。

さらに本発明の一態様は、 J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 P AK 4と MKK 7の結合阻害剤に関する。

また本発明の一態様は、 J I Kと MKK7の結合阻害剤に関する。

さらに本発明の一態様は、 PAK4による MKK7のリン酸化阻害剤に関する。さらにまた本発明の一態様は、 J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕阻害剤に関する。また本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも 1種以上を有効量含有してなる医薬組成物に関する。

' さらに本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも 1種以上を有効量含有してなる、 J NK 3による c— J u nリン酸ィ匕に基づく疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも 1種以上を有効量含有してなる、神経変性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

また本発明の一態様は、神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、 L ewy小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、 p i c k病、ファミリアルフリティッシュァメンチァ (f am i l i a l B r i t i s h d eme n t i a)、クロイツフエノレトーヤコブ (C r e u t z f e l d t— J a k o b)病、ゲノレストマン一ストランスラー (G e r s tma nn— S t r a n s s 1 e r ) 候群、狂牛病（ゥシ海綿状脳症）（B SE)、またはニューロセルピン（n e u r o s e r p i n ) 封入体を伴う家族性痴呆症である前記神経変性疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

さらに本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも 1種以上を使用することを特徴とする、】 !^3にょる。ー unリン酸化に基づく疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記化合物および前記阻害剤の少なくとも 1種以上を使用することを特 ί敷とする、神経変性疾患の防止方法および Ζまたは治療方法に関する。

また本発明の一態様は、神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、 L ewy小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、 p i c k病、ファミリアルプリティッシュデメンチア（f ami l i a l B r i t i s h d eme n t i a)、クロイツフエノレトーヤコブ（C r e u t z f e l d t— J a k o b)病、ゲノレストマンーストランスラー (Ge r s tma nn— S t r a n s s 1 e r ) 症候群、狂牛病（ゥシ海綿状脳症）（B SE)、またはニューロセルピン（n e u r o s e r p i n) 封入体を伴う家族性痴呆症である前記神経変性疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらに本発明の一態様は、 PAK4、 J I K、 ΡΑΚ4をコードするポリヌクレオチド、 J I Κをコードするポリヌクレオチド、 PAK4をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび J I Kをコードするポリヌクレオチドを含有するべクタ一から選ばれる少なくとも 1つと、 MKK7、 MKK7をコードするポリヌクレオチドおよび MKK 7をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記同定方法に用いる試薬キットであって、 PAK 4、 J I K：、 PAK4をコードするポリヌクレオチド、 J I Kをコードするポリヌクレオチド、 PAK4をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび J I K をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つと、 MKK7、 MKK7をコードするポリヌクレオチドおよび MKK 7をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

図面の簡単な説明

第 1図は、 MKK 7と P AK 4との相互作用をィンシリコで予測した結果を示す。 MKK7と PAK4の口一力ルァライメントを行レ、、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列および下の配列はそれぞれ、 MKK 7の部分配列おょぴ P AK4の部分配列である。

第 2図は、 PAK 4がインビトロで MKK 7をリン酸ィ匕したことを示す。 GST— MKK7は FLAG— PAK4存在下でリン酸化された（レーン 4) FLAG— PAK4非存在下（レーン 3) ではリン酸化されなかった。一方、 GSTは FLAG 一 PAK 4存在下（レーン 2)でも非存在下（レーン 1)でもリン酸ィ匕されなかった。図の左側に示した数値は分子量を示す。

第 3図は、 PAK4と MKK7が細胞内で結合したことを示す。図中の下段は、免疫沈降試験（I P) において、 HA— MKK 7と F LAG— PAK4とを共発現させた細胞の細胞溶解物（c e l l l y s a t e) (レーン 2) では HA—MKK 7と F LAG-P AK4を含む免疫共沈降物が検出されたが、 HA—MKK 7のみを発現させた細胞の細胞溶解物（レーン 1) においてはかかる免疫共沈降物が検出されなかつたことを示す。また、上段および中段はそれぞれ、各細胞溶角军物における FLAG— PAK 4および HA—MKK 7の発現を確認した結果を示す。免疫共沈降物の検出および発現の確認はウェスタンプロット法（WB) で行った。

第 4図は、 PAK4の一過性発現により JNK3による c— J unリン酸ィヒが PA K 4の発現量に依存して増強されたことを示す。図中の下段は、キナーゼアツセィ（k i n a s e a s s a y) において、 HA— PAK 4と F L AG— J NK 3とを共発現させた細胞の細胞溶解物（レーン 2— 4) により GST— c一 J un (1-79) がリン酸化されたが、 F LAG— J NK3のみ発現させた細胞の細胞溶解物（レーン 1) では GS T— c— J u n (1 - 7 9) はリン酸ィ匕されなかったことを示す。レーン 2、レーン 3およびレーン 4はそれぞれ、 HA— PAK4発現ベクター（p c DN A-HA-P AK4) を 0. l /z g、 0. 5 μ g、および 2. O ^ gトランスフエクシヨンした結果を示す。また、上段および中段はそれぞれ、 F LAG— J NK 3およぴ HA— PAK4の発現を確認した結果を示す。発現の確認はウェスタンブロット法 (WB) で行った。

第 5図は、 MKK 7と J I Kとの相互作用をィンシリコで予測した結果を示す。 M KK 7と J I Kのローカルァライメントを行い、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列おょぴ下の配列はそれぞれ、 MKK 7の部分配列おょぴ J I Kの部分配列である。

第 6図は、 J I Kがインビトロで MKK7をリン酸化したことを示す。 GST— M KK 7は HA— J I K存在下でリン酸化された (レーン 2) が、 HA— J I K非存在下（レーン 1) ではリン酸ィ匕されなかった。一方、 GS T1¾HA— J I K存在下（レーン 3) でリン酸ィ匕されなかった。図の左側に示した数値は分子量を示す。

第 7図は、 J I Kと MKK 7が細胞内で結合したことを示す。図中の下段は、免疫沈降試験（I P) において、 FLAG— MKK 7と HA— J I Kとを共発現させた細胞の細胞溶解物（c e l l 1 y s a t e) (レーン 2) では F L AG—MKK 7と H A— J I Kを含む免疫共沈降物が検出されたが、 F LAG— MKK 7のみを発現させた細胞の細胞溶解物（レーン 1) においてはかかる免疫共沈降物が検出されなかったことを示す。また、上段および中段はそれぞれ、各細胞溶解物における HA— J I K および F LAG—MKK 7の発現を確認した結果を示す。免疫共沈降物の検出おょぴ発現の確認はウェスタンプロット法（WB) で行った。

第 8図は、 J I Kの一過性発現により J NK 3による c— J u nリン酸化が増強されたことを示す。 HA— J I Kおよび F LAG— J NK 3のいずれも非発現の細胞の細胞溶解物（レーン 1) 並びに F LAG— J NK 3のみ発現させた細胞の細胞溶解物 (レーン 2) では G ST— c— J u n (1 - 7 9) がほとんどリン酸ィヒされなかったのに対し、 HA— J I Kと F LAG— J NK3を共発現させた細胞の細胞溶解物ーン 3) では GST—c_J un (1-79) のリン酸化が認められた。発明を実施するための最良の形態

本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第 2002 - 190909号およぴ同第 2002-190910号からの優先権を請求するものである。

本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。

以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではなレ、。本発明においては、 MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質を国際公開第 W〇 01/67299号公報（特許文献 1) 記載の方法に従って予測し、その結果 2つの蛋白質を見出した。これら蛋白質は、 p 21活性化キナーゼ 4 (以下、 PAK4と略称する。）および STE 20に関連したセリン Zスレオニンキナーゼの一つである J I Kである。そして、実験的に、 PAK4および J I Kがそれぞれ MKK7と結合すること、さらに PAK 4および J I Kがそれぞれ直接 MKK 7をリン酸化することを初めて見出した。また、 PAK4または J I Kの発現により、 c— J un N末端キナーゼ 3 (以下、 JNK3と略称する。）が活性ィ匕されて c— J unがリン酸ィ匕されることを明らカこした。これら力ら、 PAK4および J I Kがそれぞれ MKK7を直接リン酸化することにより JNK3シグナル伝達経路が活性ィヒされることが判明した。本明細書において MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質とは、 MKK7と特異的に作用し合う蛋白質、具体的には例えばその機能の 1つとして特異的に MKK 7 と結合する蛋白質を意味する。より具体的には、その機能の 1つとして MKK 7をリン酸化し得る蛋白質を意味する。本明細書においてはアミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

PAK 4についてはこれまでに、低分子量 GTP蛋白質の 1つである c d c 42により活性化されること（非特許文献 10) が知られている。また、活性化型 c d c 4 2が神経細胞死を誘導すること（非特許文献 1 1)、および活性化型 c d c 42または P AK 4が J NKシグナル伝達経路を活性ィ匕することが報告されている（非特許文献 7および 10)。

本発明において明らかにした知見およびこれら公知の知見から、 c d c 42が PA K 4を活性ィ匕し、活性ィヒされた P A K 4が MK K 7に結合して直接リン酸ィヒしてこれを活性化させ、その結果 J NK3が活性ィ匕して c _ J u nをリン酸ィ匕し、最終的に何らかの生理機能が発現するというシグナル伝達経路が存在すると考えた。該生理機能としては、例えばアポトーシスの誘導など、より具体的には神経細胞死の誘導などが例示できる。このことから、 PAK4と MKK7の結合および'/または PAK4による MKK 7のリン酸ィ匕を阻害することにより、 J NK3の活性化による c一 J u nのリン酸ィヒを阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することが可能である。さらに、 J NK 3シグナル伝達経路の活性化により引き起こされる疾患、例えば c d c 42が介在する J NK 3シグナル伝達経路の活性化に基づく疾患の防止および Zまたは治療が可能である。

J I Kは、 ERストレスの負荷による J NK¾†生ィ匕に関与していると考えられている。例えば、 J I Kの過剰発現が ERストレスの負荷による J NK活性ィヒを増強すること、また J I Kの活性部位欠失変異体が E Rストレスの負荷による J N K活性化を抑制したことが報告されている（非特許文献 15)。

本発明において明らかにした知見おょぴこれら公知の知見から、 ERストレスの負荷による生理機能の発現には、 ERストレスの負荷により J I Kが活性化され、活性化された J I Kが MKK 7に結合して直接リン酸ィ匕してこれを活性ィ匕させ、その結果 J NK3が活性化して c一 J u nをリン酸化するというシグナル伝達経路が存在していると考えた。該生理機能としては、例えばアポトーシスの誘導など、より具体的には神経細胞死の誘導などが例示できる。このことから、 J I Kと MKK7の結合および Zまたは J I Kによる MK'K 7のリン酸化を阻害することにより、 JNK3の活性化による c— J unのリン酸ィヒを阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することが可能である。さらに、 J NK 3シグナノレ伝達経路の活' I"生ィ匕により引き起こされる疾患、例えば c d c 42が介在する J N K 3シグナル伝達経路の活性ィヒに基づく疾患の防止および Zまたは治療が可能である。 '

JNK3シグナノレ伝達経路の活性化によって引き起こされる疾患としては、例えばアポトーシスに基づく疾患、具体的には、神経変性疾患などが挙げられる。神経変性疾患としては、次に挙げる例に限定されるものではないが、ポリグルタミン病（例えばハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、および歯状核赤核淡蒼球ルィ体萎縮症など）、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、 L ewy小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、 p i c k病、ファミリアルプリティッシュデメンチァ（ f am i 1 i a 1 B r i t i s h d eme n t i a)、クロイツフエ/レト一ヤコブ (C r e u t z f e l d t— J a k o b) 病、ゲルストマン一ストランスラー（Ge r s tma nn_S t r a n s s 1 e r) 症候群、狂牛病（ゥシ海綿状脳症）（BSE)、およぴニユーロセルピン（n e u r o s e r p i n) 封入体を伴う家族性痴呆症などを挙げることができる（非特許文献 19)。またこの他に、 ERストレスの負荷が関与している虚血ゃ再灌流による神経細胞死の防止および Zまたは治療が可能である。

本発明においては、下記 i ) から）のうちの少なくとも 1つを特徴とする、 JN K3による c— J unリン酸化の阻害剤、 JNK3による c一 J unリン酸化の阻害方法、さらには JNK3による c— J unのリン酸化に基づく疾患、例えば神経変性疾患などの防止剤および/または治療剤並びに防止方法および/または治療方法を提供可能である； i) PAK4と MKK7の結合阻害； ii) PAK4による MKK7のリン酸化の阻害； iii) J I Kと MKK7の結合阻害；および iv) J I Kによる MKK 7のリン酸の阻害。

本発明においては、上記知見に基づいて、 PAK4と MKK7の結合および Zまたは PAK 4による MKK 7のリン酸化を阻害する化合物、あるいは J I Kと MKK7 の結合および 7または J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法を提供する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。化合物の同定に使用する PAK 4、 J I Kおよ.び MKK7は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該 - 細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、 PAK4または J I Kと MKK7との結合およびこれら蛋白質の機能、例えばキナーゼ活性が阻害されなければ、 N末端側や C末端側に別の蛋白質ゃぺプチドなどを直接的にまたはリンカーぺプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付カ卩することにより標識ィ匕したものであってもよい。あるいは、化学修飾物質により標識化したものであってもよい。好ましくは、それらの基本的な性質が阻害されないような標識ィ匕が望ましい。付加する蛋白質ゃぺプチドなどとしては、例えばダルタチオン S-トランスフェラーゼ、 β—ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ ·パーォキシダーゼまたはアル力リホスファターゼなどの酵素類、 H i s— t a g、 My c— t a g、 HA- t a g、 FLAG- t a gまたは Xp r e s s 一 t a gなどのタグペプチド類、マルトース結合蛋白質、および免疫グロブリンの F c断片などが挙げられる。また、標識化に用いる化学修飾物質としては、グリーン蛍光蛋白質、フルォレセィンィソチオシァネート（f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e) またはフィコエリスリン（phy c o e r y t h r i n) などの蛍光物質類、ピオチン、あるいは放射性同位元素などを例示できる。標識化するとき、これら蛋白質ゃぺプチドなどは単独で付カ卩してもよいし複数を組み合わせて付加することもできる。これら標識ィヒに用いた蛋白質またはべプチドなどの物質自体、またはその機能を測定することにより、例えば PAK4若しくは J I Kと MKK 7との結合を検出することが可能になる。被検化合物としては、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、または PAK4、 J I Kおよび MKK 7の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。

例えば、 PAK 4と MKK 7との結合を可能にする条件を選択し、該条件下で P A K4、 MKK 7および被検化合物を接触させ、次いで、 PAK4と MKK7との結合を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、. このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在、不存在、またはその変化を検出することにより、 PAK 4と MKK 7の結合を阻害する化合物を同定可能である。例えば PA Kと MKK 7との結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカーが、被検化合物を P A K 4およぴ MK K 7と接触させたときに消失あるいは低減するなどの変化を示した場合、当該被検化合物は PAKと MKK 7との結合を阻害するものであると判定できる。かかる同定方法において、被検化合物を PAK4および/または MKK7と予め接触させ、その後に PAK 4と MKK 7の結合反応を行うことも可能である。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子など、または検出用のェピトープタグ、例えば 6 XH i s - t a gなど、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。

具体的には、例えば P AK4または MKK 7の一方を固相化し、他方をシグナルで標識化して用いて結合反応を行い、標識シグナルを定量的に測定するといつた当業者に知られた一般的なインビトロ（i n v i t r o) における結合実験系に、被検化合物を加えて評価することにより、 PAK4と MKK7の結合を阻害する化合物を得ることができる。

あるいは、 PAK4により MKK7がリン酸ィヒされる条件を選択し、該条件下で P AK4および MKK7と被検化合物とを接触させ、 MKK 7のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおょぴ Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変ィ匕を検出することにより、 PA K 4による MKK 7のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。例えば P AKによる MKK 7のリン酸化により生じるシグナルまたは該リン酸化のマーカーが、被検化合物を P A K 4および MK K 7と接触させたときに消失あるいは低減するなどの変化を示した場合、当該被検化合物は ΡΑΚによる ΜΚΚ 7のリン酸化を阻害するものであると判定できる。かかる同定方法において、被検ィヒ合物を ΡΑΚ 4および/または Μ ΚΚ 7と予め接触させ、その後に ΡΑΚ4による ΜΚΚ7のリン酸ィヒ反応を行うことも可能である。蛋白質リン酸化試験およびリン酸化蛋白質の定量は、自体公知の方法により実施可能である。簡便には、例えば後述する実施例に記載したように ΡΑΚ 4 と ΜΚΚ7とを放射性同位体（³²Ρ) で標識したアデノシン三リン酸（ΑΤΡ) の存在下でィンビトロで反応させ、反応後に SDS— PAGEにより蛋白質の分離を行レ、、得られた蛋白質のバンドを染色して検出し、リン酸ィヒされた ΜΚΚ 7に相当するバンドの放射活性を測定することにより蛋白質リン酸化試験およびリン酸化蛋白質の定量を実施できる。

または、 P A Κ 4および MK K 7を共発現させた細胞を用レ、、該細胞と被検化合物とを接触させ、 PAK4と MKK7の結合または PAK4による MKK7のリン酸化を検出することのできるシグナルおよび/またはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、 PAK4と MKK7の結合おょぴ Zまたは PAK4による MKK7のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。

上記細胞を使用した同定方法は、上記ィンビトロでの同定方法と組み合わせて使用できる。当該ィンビト口の同定方法により得られた P AK 4と MKK 7の結合および Zまたは PAK4による MKK7のリン酸ィ匕を阻害する化合物を、細胞を使用した上記同定方法で再度試験することにより、有用な化合物をさらに選択し得る。

上記同定方法において、 PAK4の代わりに J I Kを用いることにより同様に、 J I Kと MKK 7の結合および/または J I Kによる MKK 7のリン酸化を阻害する化合物を同定可能である。

本発明にかかる同定方法においては、 PAK 4と MKK 7の結合を阻害する化合物、 J I Kと MKK 7の結合を阻害する化合物、 PAK4による MKK7のリン酸化を阻害する化合物、および J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する化合物を得ることができる。これら化合物もまた、本発明の範囲に包含される。これら化合物は、 PA K4と MKK7の結合阻害剤、 PAK4による MKK7のリン酸ィ匕の阻害剤、 J I K と MKK 7の結合阻害剤、または J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害剤として利用可能である。このような化合物としては、両蛋白質が相互作用する部位、例えば結合部位のァミノ酸配列からなるぺプチドまたはォリゴぺプチドを例示できる。このようなぺプチドまたはォリゴぺプチドは、 P AK 4または MKK 7のァミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法によって合成し、上記同定方法において PAK 4 と MKK7の結合、 PAK4による MKK7のリン酸化、 J I Kと MKK7の結合、または J I Kによる MKK 7のリン酸ィヒを阻害する力否かを試験することにより同定可能である。また、 PAK4と MKK 7の結合を阻害し得る抗体または J I Kと MK K 7の結合を阻害し得る抗体も上記化合物の 1つとして例示できる。かかる抗体は、 PAK4、 J I Kまたは MKK 7に対する抗体を作成し、得られた抗体から PAK4 と MKK 7の結合または J I Kと MKK 7の結合を阻害し得るものを選択することにより取得可能である。抗体の作製は、抗原として例えば、 PAK4、 J I Kおよび M KK7の各蛋白質自体、または PAK4と MKK7若しくは J IKと MKK7が相互作用する部位のァミノ酸配列を含むぺプチド若しくはオリゴぺプチドを用いて、自体公知の抗体作製法により行うことができる。

上記選別された化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸ィ匕阻害剤は、さらに生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、 PAK4と MKK7 の結合、 J I Kと MKK7の結合、 PAK4による MKK7のリン酸化、または J I Kによる MKK7のリン酸ィ匕を阻害することに基づく医薬の有効成分として有用である。 PAK4および J I Kはいずれも、 MKK7に結合すると直接 MKK7をリン酸化してこれを活性ィ匕し、その結果 J N K 3が活性ィ匕して c_J unがリン酸ィ匕される。従って、上記化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤は、 JNK3による c一 J u nリン酸ィヒに基づく医薬、例えばァポトーシスに基づく疾患、具体的には神経変性疾患などに対する医薬の有効成分として用いることができる。

本発明に係る医薬は、上記選別された化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸ィ匕阻害剤のうちの少なくとも 1つを有効む医薬となしてもよいが、通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体または賦形剤を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。かかる担体としては、生理食塩水、緩揮 ί化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限らなレ、。

必要な用量範囲は、上記化合物、上記結合阻害剤および上記リン酸化阻害剤の有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重 1 k gあたり 0 . 1 z gないし l O O ^i gの範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は 1日 1〜4回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

処方は投与形態に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られたものを用いればよい。また、処方するときには、これらを単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよレ、。例えば、 c— J u n リン酸化阻害剤または神経変性疾患の防止剤および/または治療剤などの有効成分を配合してもよい。

投与形態は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与形態を選択する。例えば、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などに投与することもできる。腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与若しくは経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態での投与であつてもよい。

製剤化にあたっては、その投与形態あるいは有効成分の物性に応じて適切な製剤用添加物を用いることができ、常法に従って製剤化することができる。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソ一ム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。散斉 |J、丸剤、カプセル剤おょぴ錠剤は、ラタトース、グルコース、シユークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。

懸濁剤は、水、シユークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。

注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。

リボソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロ口ホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振盪、超音波処理および遠心分離した後、上清を濾過処理して回収することにより行い得る。

脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、ォリーブ油などの植物油、 MC Tなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化 ·均質ィヒ処理して行い得る。また、これを凍結乾燥ィ匕することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添カ卩してもよく、乳ィ匕助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿を濾過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン (ひ、 β γ型）を適宜選択すればよい。

本発明は、試薬キットであって、 P AK 4、 J I Κ：、 P AK 4をコードするポリヌクレオチド、 J I Kをコードするポリヌクレオチド、 PAK4をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび】 I Kをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つと、 MKK7、 MKK 7をコードするポリヌクレオチドおよび MKK 7をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つとを含んでなる試薬を提供する。本発明にかかる試薬キットは、上記同定方法に使用することができる。 J I K、 ΡΑΚ4および ΜΚΚ7は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよレ、。また、 J I Κまたは ΡΑΚ4と ΜΚΚ7の結合おょぴこれら蛋白質の機能、例えばキナーゼ活性が阻害されなければ、 N末端側や C末端側に別の蛋白質ゃぺプチドなどを直接的にまたはリンカーぺプチドなどを介して間接的に遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識ィヒしたものであってもよい。あるいは、化学修飾物質により標識ィ匕したものであってもよい。好ましくは、それらの基本的な性質が阻害されないような標識ィ匕が望ましい。付加する蛋白質ゃぺプチドなどとしては、例えばグノレタチオン S—トランスフェラーゼ、 β—ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ ·パーォキシダーゼまたはアル力リホスファターゼなどの酵素類、 H i s_t a g、 My c— t a g、 HA- t a g, FLAG- t a gまたは X p r e s s — t a gなどのタグペプチド類、マルトース結合蛋白質、および免疫グロブリンの F c断片などが挙げられる。また、標識化に用いる化学修飾物質としては、グリーン蛍光蛋白質、フノレオレセィンィソチオシァネートまたはフィコエリスリンなどの蛍光物質類、ピオチン、あるいは放射性同位元素などを例示できる。標識化するとき、これら蛋白質ゃぺプチドなどは単独で付加してもよいし複数を組み合わせて付加することもできる。 PAK4、 J I Kまたは MKK 7のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、ヒト c DNAライブラリ一から自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。 PAK4、 J I Kまたは MKK7のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター DNA、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。これらは試薬であるとき、 PAK4または J I Kと MKK7の結合や PAK4または J I Kによる MKK7のリン酸化を検出するためのシグナルおよび / またはマーカー、バッファー、並びに塩など、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤およびノまたは防腐剤などの物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよレ、。実施例

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。実施例 1 (MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの操索）

MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第 WO01/67299 号公報に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、 MKK 7のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのァミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質と MKK7との間でローカルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの高いものを MK K 7と相互作用すると予測した。

角军祈の結果、 MKK7由来の 7ァミノ酸残基または 6ァミノ酸残基からなるオリゴペプチド DVWSLG I (配列番号 1) および PPARPR (配列番号 2) と相同性あるオリゴペプチド D I WS LG I (配列番号 3)および PPARAR (配列番号 4) が、 PAK 4のアミノ酸配列中に存在することが分かった。第 1図に、 MKK7と P AK4とのローカルァライメントの結果を示した。この結果から、 PAK4は MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質であると予測された。実施例 2 (PAK4による MKK7リン酸化の解析）

PAK 4による MKK 7の相互作用を実験的に確認するために、免疫複合体リン酸化法を用いたインビトロにおけるリン酸化試験を実施した。ぐ材料 >

PAK 4発現プラスミドを次のように構築した。まず、ヒト PAK4 cDNAを、ヒト脳由来 p o 1 y (A) +RNA (C 1 o n t e c h社）から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PCR) により取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、 p cDN A3. 1 (+ ) ( I n V i t r o g e n社）組込んだ。そのとき、 5 '側に？ G— t a g ド配列または HA— t a g ド配列を挿入し、動物細胞用 N末端 F LAG— t a g付加型 PAK 4発現プラスミド（p c D N A— F L AG— P AK 4 ) および動物細胞用 N末端 HA— t a g付加型 PAK 4発現プラスミド（p cDNA— HA— PAK 4) をそれぞれ構築した。

試験には、下記組成からなる各バッファーを用いた。

細胞溶解バッファー（Ce l l l y s i s b u f f e r ) : 20 mM T r i s — HC 1 pH7. 4 150 mM NaC l , 1 mM エチレンジァミン四酢酸（E DTA), ImM エチレングリコールビス四酢酸（EGTA), 1 % Tr i t o n X- 100, 2. 5mM ピロリン酸ナトリウム（Na— p y r o p h o s p h a t e), ImM —ク、、リセ口ホスフェート g l y c e r o p h o s p h a t e), 1 mM Na ₃V〇₄, プロテアーゼ阻害剤カクテル（p r o t e a s e i nh i b i t o r c o c k t a i l) Ce l l S i g n a l i n g Te c hn o l o g y 社。

キナーゼバッファー（K i n a s e bu f f e r): 25 mM T r i s—HC l , p H 7. 5, 5mM ]3—グリセ口ホスフエ一ト， 2 mM ジチォスレイトール， 0.. 1 mM N a ₃V0₄, 10 mM Mg C l ₂ C e l l S i g n a l i n g T e c h n o 1 o g y社。

SDS サンプルバッファー（SD S s amp l e b u f f e r) : 4% SD S, 125mM Tr i s一 HC 1 , pH6. 8, 20% グリセロール， 0. 01% ブロムフエノーノレブ一（B PB), 10% j8—メルカプトエタノール（me r c a p t o e t h a n o l)。

ぐ方法 > 細胞数 5 X 1 0⁵の H EK 2 9 3細胞を 3 7 ° (、 5 % C O ₂の条件下 φ 6 0 mmのシヤーレ中で一晩培養した後、 5 /2 gの p c DNA—FLAG— PAK4を、 1 5 μ 1 の F u GENE 6 トランスフエクション試薬 (F uGENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t、 R o c h e ¾) を用いてトランスフエクシヨンした。陰性コントロールとして p c DNA 3. 1 (+) を用い、同様にトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（一） CP B S (一）〕で洗浄して回収し、 5 0 0 μ 1の細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で 1 0分間放置した。ついで 4°Cにて 1 4， 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物（c e l l l y s a t e) とした。次に、 5 0 0 μ 1の細胞溶解物に、ァガロースこ結合した正常マウス I g G (A g a r o s e— c o n j u g a t e d n o r ma 1 mo u s e I g G、 S i gma社） 2 0 μ 1を加え、 4 °Cにて 3 0分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 ^ 1の抗 F LAG M 2ァフィニティーゲノレ（a n t i — F LAG M2 a f f i n i t y g e l , S i gma社）を加え、 4 °Cにて 2時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにこのビーズを 5 0 0 μ 1の細胞溶解パッファ一で 2回、 5 0 0 μ 1のキナーゼバッファーで 2回洗浄した。次に、ビーズに 1 μ gの基質と 1 0 の ATPおよぴ 5 μ C iの [γ— ³²P] ATP (3， 0 00 C i /mm o 1、 P e r k i n E l me r社）を含む 2 5 μ 1のキナーゼバッファーを加え、 30°Cにて 3 0 分間リン酸化反応を行つた。反応後、 2 5 1の 2 X SD Sサンプルバッファーを加え、 5分間煮沸後、上清を SD S— PAGEにより分離し、 BAS 2 0 0 0 (F u j i f i l m社）を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸ィ匕蛋白質を検出した。なお、基質は、 GS T— MKK 7の不活性体（u n a c t i v e G S T— MKK 7、 U p s t a t e社)、または、陰性コントロールとして GSTをそれぞれ使用した。

ロ Tp:

第 2図に示したように、 PAK4による GS T— MKK 7のリン酸ィヒが認められた。また、このリン酸化は PAK4非存在では認められなかったことから、 G S T—MK K 7のリン酸ィ匕は自己リン酸ィ匕ではなく、 PAK 4によるものであることが明らかとなった。なお、陰性コントロール用の基質として用いた GSTでは、リン酸ィ匕は認められなかった。実施例 3 (MK K 7と P A K 4の結合解析）

PAK4と MKK 7の結合を実験的に確認するために、細胞内共発現/免疫共沈降法による結合試験を実施した。

ぐ材料 >

PAK4発現プラスミドは、実施例 2で構築したものを用いた。

MKK 7発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒト MKK7 cDNAを、ヒト骨格筋由来 p o 1 y (A) +RNA (C 1 o n t e c h社）から RT— PCRにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、 p cDNA3. 1 (+ ) (I n V i t r o g e n社）へ組込んだ。その際、 5 側に HA— t a gコード配列を挿入し、動物細胞用 N末端 HA— t a g付加型 MKK 7発現プラスミド、 p cDNA_HA— MK K 7を構築した。

試験に用いた各バッファーの組成は、実施例 2に記載のものと同じである。

<方法 >

細胞数 4 X 10⁵の HE Κ 293 T細胞を 37°C, 5%。〇₂の条件下<|) 6 Ommシヤーレ中で一晚培養した後、 2 μ gの p c DNA—FLAG_PAK4を2 μ gの p cDNA—HA—MKK7と共に、 FuGENE6 Tr a n s f e c t i o n R e a g e n t (Ro c h e社）を用いてトランスフエクシヨンした。陰性コントロールとして p cDNA3. 1 (+) を用い、同様にトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を氷冷した PBS (—）で洗浄して回収し、 500 1の細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で 10分間放置した。ついで、 4°Cにて 14, O O O r pmで 10分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、 500 μ 1の細包溶角物に 20 1の A g a r o s e-c on j u g a t e d n o rma l mo u s e I gG (S i gma社）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 μ 1の a n t i— FLAG M2 a f f i n i t y g e l (S i gma社）を加え、 4 °Cにてー晚転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを 500 μ 1の細胞溶解バッファーで 3回、次いで 500 μ 1のトリス緩衝生理食塩水 (TB S ： 25 mM T r i s _H C 1 , pH7. 5, 1 50 mM N a C 1 ) で 1回洗浄した後、 20 μ 1の 2X SDSサンプルバッファーを加え、 5分間加熱後、上清を 5— 20%の SDS— PAGEにより分離した。その後、抗 HA抗体（Y— 1 1、 S a n t a C r u z社）を用いたウェスタンプロット法により結合蛋白質を検出した。なお、検出は EC Lウェスタンブロッティング検出キット（ECL we s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i t；、 Am e r s h am p h a rma c i a b i o t e c h社) を使用した。

<結果 >

第 3図に示したように、抗 FLAG抗体を用いて F LAG— PAK4の免疫沈降を実施した結果、 F LAG—PAK4と HA— MKK7とを共発現させた細胞においては HA—MKK 7の共沈降が認められた。一方、 FLAG— PAK4非発現細胞では H A— MKK 7の共沈降は認められなかったことから、この共沈降はァガロースビーズへの非特異的結合ではなく、 FLAG— PAK4と H A— MKK 7の結合を示すものであることが明らかとなった。これら力ら、 PAK4と MKK7が細胞内で結合することが判明した。実施例 4 (PAK4による JNK3シグナル伝達経路の活性化）

P AK 4による J NK 3シグナル伝達経路の活性ィ匕を実験的に確認するために、ィンビトロにおける J NK 3リン酸化試験を、免疫複合体リン酸化法を用いて実施した。ぐ材料 >

PAK4発現プラスミドは、実施例 2で構築したものを用いた。

J NK 3発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒト JNK3 cDNAを、ヒト海馬 cDNAライブラリーから RT— PCRにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、 p _CDNA3. 1 (+ ) ( I n V i t r o g e n社）へ組込んだ。その際、 5 '側に F LAG— t a gコード配列を挿入し、動物細胞用 N末端 F LAG— t a g 付加型 J NK 3発現プラスミド、 p cDNA—FLAG— J NK3を構築した。また、 c一 J u n (1 -7 9) (c— J u nの N末端 7 9アミノ酸領域であり、 J N Kによるリン酸ィ匕部位を含む）を、 N末端に G ST (G l u t a t h i o n e S— t r a n s f e r a s e) を付カ卩した融合蛋白質〔以下、 GST— c— J u n (1— 79)〕として大腸菌にて発現後、ダルタチオンセファロース 4 B (G l u t a t h i o n e s e p h a r o s e 4 B Am e r s h a m P h a r ma c i a b i o t e c h¾) で精製し、使用した。

試験に用いた各溶液の組成は、実施例 2に記載のものと同じである。

<方法 >

細胞数 6 X 1 0⁵の HEK29 3細胞を 3 7°C、 5%C〇₂の条件下 φ 6 Ommのシヤーレ中で一晚培養した後、 p c DNA— F LAG— J NK 3 (2 μ g) と p cDN A-HA-PAK4 (0、 0. 1、 0. 5、または 2 μ _§) を 1 2 μ 1の FuGEN E 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (R o c h e社) を用レヽてトフンスフエクシヨンした。なお、 DNAの総量は p c DNA3. 1 (+ ) を用いて全て 4 μ _§に調整した。 2日間培養後、細胞を氷冷した PB S (—）で洗浄して回収後、 5 00 μ 1の細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で 1 0分間放置した。ついで、 4°Cにて 14, 000 r pmで 1 0分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、 500 μ 1の細胞溶角军物に 20 μ 1の A g a r o s e— c o n j u g a t e d n o rma l mo u s e I gG (S i gma社）を加え、 4 °Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 μ 1の a n t i — FLAG M2 a f f i n i t y g e l (S i gma社）をカ卩え、 4°Cにて 2 時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにビーズを 500 ^ 1の細胞溶解バッファ一で 2回、 500 1のキナーゼバッファ一で 2回洗浄した。次に、ビーズに基質として 2 μ gの GST— c— J un (1— 79) と 1 0 μΜ ATPおよび 5 μ C iの —³² P] ATP (3, 000 C i /mm o 1、 P e r k i n E 1 me r社）を含む 25 μ 1のキナーゼバッファーを加え、 30 °Cにて 30分間リン酸化反応を行った。反応後、 25 μ 1の 2 X SD Sサンプルバッファーを加え、 100。C にて 5分間処理後、上清を 5— 20 % S D S— P AG Eにより分離し、 B A S 20 00 (Fu. j i f.i l m社）を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸ィ匕された GST— c— J un (1-79) を検出した。なお、各蛋白質の発現は、抗 FLA G M 2モノクローナル抗体（S i gma社）または抗 HA抗体（Y—1 1、 S a n t a C r u z社）を用いたウェスタンブロット法により確認した。

ぐ結果 >

第 4図に示すように、 HA_ P AK 4と FLAG—JNK3を共発現させた細胞の溶解物を用いたキナーゼアツセィにおいて、 HA—PAK4の発現量に依存して、リン酸化 c— J u nが増加した。すなわち、 HA— PAK4の発現により、 JNK3の c一 J u nリン酸化活性が上昇することが明らかになった。 F L AG— J NK 3の発現量には大きな変動がないことから、】 3活性の上昇は!1 一？ 4の発現によるものと考えられる。

実施例 2、 3および 4で得られた結果から、 PAK4が MKK7に結合してこれを直接リン酸ィ匕することにより、 JNK 3が活性ィ匕されて c一 J unがリン酸ィ匕されること、すなわち J NK 3シグナル伝達経路が活性ィ匕されることが判明した。実施例 5 (MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）

MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質を、実施例 1と同様の方法で予測した。その結果、 MKK7由来の 6アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、 WSLG I S (酉己列番号 5)および LEAKLK (配列番号 6)、と相同性のあるオリゴペプチド、 WS LG I T (配列番号 7) および LENKLK (配列番号 8) 、 J I Kのアミノ酸配列中に存在することが分かった。第 5図に、 MKK 7と J I Kとのローカルァライメントの結果を示した。この結果から、 J I Kは MKK 7と相互作用する機能を有する蛋白質であると予測'された。実施例 6 (J I Kによる MKK7リン酸ィ匕の解析） J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を実験的に確認するために、免疫複合体リン酸ィ匕法を用いたインビト口におけるリン酸化試験を実施した。

ぐ材料 >

J I K発現プラスミドを次のように構築した。まず、ヒト J I K cDNAを、ヒト腎臓由来 p o 1 y (A) +RNA (C 1 o n t e c h社）から RT— P CRにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、 p c DNA3. 1 (+) (I n V i t r o g e n社）へ組込んだ。そのとき、 5 '側に HA— t a gコード配列を揷入し、動物細胞用 N末端 HA— t a g付加型 J I K発現プラスミド、 p c DNA— HA— J I Kを構築した。なお、クローユングした J I K c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NCB I (N a t 1 o n a 1 Ce n t e r l o r B i o t e c hn o l o gy i n f o rma t i o n) の蛋白質データベースに開示されたァクセッション番号 XP— 045006 (登録遺伝子名： J I K) のものと同一である。

試験に用いた各バッファ一の組成は、実施例 2に記載のものと同じである。

<方法 >

細胞数 4 X 10⁵の HEK293T細胞を 37° (：、 5 %C〇 ₂.の条件下 φ 60 mmのシャーレ中で一晚培養した後、 5 μ gの p c DNA— HA— J I Kを、 1 5 1の u G E NE 6 Tr a n s f e c t i o n Re a g e n t (Ro c h e社) を用いてトランスフエクシヨンした。陰性コントロールとして p c DNA3. 1 (+ ) を用レ、、同様にトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を永冷した PBS (-) で洗浄して回収し、 500 μ 1の細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で 10分間放置した。ついで 4°Cにて 14, 000 r ！11で1◦分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、 500 μ 1の細胞溶解物に、 Ag a r o s e— c o n j u g a t e d n o rma l mo u s e I g G (S i gma社) 20 μ 1をカロ、 4 °Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 μ 1の抗 HAァフィ二ティ一マトリックス（a n t i—HA a f f i n i t y ma t r i x、 Ro c h e社）を加え、 4 °Cにて 2時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにこのビーズを 500 μ 1の細胞溶解バッファ一で 2 回、 500 μ 1のキナーゼバッファーで 2回洗浄した。次に、ビーズに 1 μ gの基質と 10 μΜの ATPおよび 5 C iの [γ— ³² P] ATP (3， O O OC i /mm o l、 P e r k i nE lme r社）を含む 25 μ 1のキナーゼバッファーを加え、 3〇°C にて 30分間リン酸ィ匕反応を行つた。反応後、 25 1の 2 XSDSサンプルバッファーを加え、 5分間煮沸後、上清を SDS— PAGEにより分離し、 BAS 2000 (Fu j i f i lm社）を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸ィヒ蛋白質を検出した。なお、基質は、 GST— MKK7の不活性体（un a c t i v e GST —MKK 7、 Up s t a t e社）、または、陰性コントロールとして G S Tをそれぞれ使用した。

<結果>

第 6図に示したように、 J I Kによる GST— MKK 7のリン酸化が認められた。また、このリン酸化は J I K非存在下では認められなかったことから、 GST— MK K 7のリン酸ィ匕は自己リン酸ィヒではなく、 J I Kによるものであることが明らかとな ,つた。なお、陰性コントロール用の基質として用いた G S Tでは、リン酸化は認められなかった。実施例 7 (MKK 7と J I Kの結合解析）

J I Kと MKK 7の結合を実験的に確認するために、細胞内共発現 Z免疫共沈降法による結合試験を実施した。

<材料〉 '

J I K発現プラスミドは、実施例 6で構築したものを用いた。

MKK 7発現プラスミドは次のように構築した。まず、ヒト MKK7 cDNAを、ヒト骨格筋由来 p o 1 y (A) +RNA (C 1 o n t e c h社）から RT— P CRにより取得し、次いで動物細胞用発現ベクター、 p cDNA3. 1 (+) (I n V i t r o g e n社）へ組込んだ。その際、 5 '側に F L AG— t a gコード配列を挿入し、動物細胞用 N末端 F LAG— t a g付加型 MKK 7発現プラスミド、 p cDNA— F LAG— MK K 7を構築した。試験に用レヽた各バッファ一の組成は、実施例 2に記載のものと同じである。

<方法 >

細胞数 4X 10⁵の HEK293 T細胞を 37°C、 5%C〇₂の条件下 ψ 6 Ommシヤーレ中で一晚培養した後、 2 μ gの p c DNA-HA- J I Kを 2 μ gの ρ c DN A— FLAG— MKK7と共に、 FuGENE 6 Tr a n s f e c t i o n Re a g e n t (Ro c h e社）を用いてトランスフエクシヨンした。陰性コントロールとして p cDNA3. 1 (+ ) を用いて、同様にトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を氷冷した PBS (―) で洗浄して回収し、 500 μ 1の細胞溶解バッファ一に懸濁し、氷上で 10分間放置した。ついで 4 °Cにて 14 , 000 r p mで 1 0分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、 500 μ 1の細胞溶角军物に 20 μ 1の Ag a r o s e— c o n j u g a t e d n o rma 1 m o u s e I gG (S i gma社）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 μ 1の a n t i—HA a f f i n i t y ma t r i x (Ro c h e社）を加え、 4 °Cにてー晚転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収した。ビーズを 500 μ 1の細胞溶解バッファ一で 3回、次いで 500 μ 1の TBS (25 mM T r i s_HC l， pH 7. 5， 150 mM N a C 1 ) で 1回洗浄した後、 20 μ 1の 2 XSDSサンプルバッファーを加え、 5分間加熱後、上清を 5— 20%の SDS— PAGEにより分離した。その後、抗 FLA G M2抗体（S i gma社）を用いたウェスタンブロット法により結合蛋白質を検出した。なお、検出は ECLウェスタンブロッテイング検出キットを使用した。く結果〉

第 7図に示したように、抗 HA抗体を用いて HA_ J I Kの免疫沈降を実施した結果、 HA— J I Κと FLAG—MKK7とを共発現させた細胞においては、 FLAG 一 MKK 7の共沈降が認められた。一方、 HA— J I K非発現細胞では F LAG— M KK7の共沈降は認められなかったことから、この共沈降はァガロースビーズへの非特異的結合ではなく、 HA— J I Kと FLAG— MKK 7の結合を示すものであることが明らかとなった。これらから、 J I Kと MKK 7が細胞内で結合することが判明した。実施例 8 (】 110こょる】1^1：3シグナル伝達経路の活性化）

J I Kによる JNK3シグナル伝達経路の活性ィヒを実験的に確認するために、ィンビトロにおける J NK 3リン酸ィ匕試験を、免疫複合体リン酸化法を用いて実施した。ぐ材料 >

J NK 3発現プラスミドは、実施例 4で構築したものを用いた。

J I K発現プラスミドは、実施例 6で構築したものを用いた。

GST-c- J un (1-79) は実施例 4と同様に調製した。

<方法〉

細胞数 4 X 10⁵の HEK293 T細胞を 37°C、 5%C0₂の条件下 φ 6 Ommのシャーレ中でー晚培養した後、 2 μ gの p cDNA— HA— J IKを、 2 _§の。 DNA— F LAG— J NK 3と共に、 FuGENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (R o c h e社）を用いてトランスフエクシヨンした。陰性コント口ールとして p cDNA3. 1 (+ ) を用いて同様にトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を氷冷した PBS (—）で洗浄して回収後、 500 ^ 1の細胞溶解バッファーに懸濁し、氷上で 10分間放置した。ついで 4°Cにて 14， 000 r pmで 10分間遠心処理してその上清を回収し、細胞溶解物とした。次に、 500 ^ 1の細胞溶角军物に 20 μ 1の A g a r o s e— c o n j u g a t e d n o rma 1 mo u s e I gG (S i gma社）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理してその上清を回収した。回収した上清に 20 ^ 1の a n t i—F LAG M2 a f f i n i t y g e l (S i gma社）を加え、 4 °Cにて 2時間転倒混和した後、遠心処理によりビーズを回収し、さらにビーズを 500 /^ 1の細胞溶解バッファーで 2回、 500 μ 1のキナーゼバッファーで 2回洗浄した。次に、ビーズに基質として 2 μ gの GST—c— J un (1-79) と 10μΜ AT Ρおよぴ 5 C iの [y — 32 p ] ATP (3000 C i /mmo 1、 P e r k i nE l me r社）を含む 25 μ 1のキナーゼバッファーを加え、 30°Cにて 30分間リン酸ィヒ反応を行った。反応後、 25 μ 1の 2 X SDSサンプルバッファーを加え、 100 °Cにて 5分間処理後、上清を 5— 20% SDS— PAGEにより分離し、 BAS 2000 (Fu j i f i lm社）を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸ィ匕された GST— c一 J u n (1-79) を検出した。

ぐ結果 >

第 8図に示すように、 HA— J I Kと FLAG— J NK 3を共発現させた細胞の溶解物を用いたキナーゼァッセィにおいて、 FLAG— J NK 3のみを発現させた細胞の溶解物と比較してリン酸ィ匕 c一 J u nが増加した。すなわち、 HA— J I Kの発現により、 JNK 3の c— J unリン酸ィ匕活 ¾Ξが上昇することが明らかになった。

実施例 6、 7および 8で得られた結果から、 J I Κが ΜΚΚ7に結合してこれを直接リン酸ィ匕することにより、 JNK3が活性化されて c_ J unがリン酸ィ匕されること、すなわち J NK 3シグナル伝達経路が活性化されることが判明した。産業上の利用可能性

本発明においては、 PAK4および J I Kがそれぞれ MKK7と結合すること、さらに、 PAK4および J I Kのいずれも MKK7を直接リン酸化すること、その結果 J NK 3シグナル伝達経路が活性されることを初めて見出した。

P AK 4が J NKシグナル伝達経路を活性ィヒすることは従来知られていたが、その機構は不明であった。 PAK4は c d c 42によって活性ィ匕されるが、 c d c 42の活性化は J NKシグナル伝達経路の活性化を介して神経細胞死を引き起こす。よって、 J NK3シグナル伝達経路活性化による神経細胞死において、 P AK 4による MK K 7のリン酸ィ匕が関与していると考えられる。

J I Kが ERストレスの負荷による J NK活'性ィ匕に関与していることは今までに報告されているが、その機構は不明であった。 ERストレスは J NKシグナル伝達経路の活性化を介して、神経細胞死を引き起こす。よって、 ERストレスの負荷による J NK 3シグナル伝達経路の活性化による神経細胞死において、 J I Kによる MKK 7 のリン酸ィヒが関与していると考えられる。

したがって、 PAK4または J I Kと MKK 7の結合、あるいは PAK4または J I Kによる MKK 7のリン酸化を阻害することにより、 J NK 3シグナル伝達経路の活性ィ匕によって引き起こされる c_ J unのリン酸ィ匕を阻害することができ、ひいては神経細胞死を阻害することができる。

PAK4および J I Kがいずれも MKK 7を直接的にリン酸ィ匕することから、これらは異なった経路で MKK 7をリン酸化することにより JNK3シグナル伝達経路の活性ィ匕に関与していると考えられる。よって、 PAK4による MKK7のリン酸ィ匕および J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の両方を阻害することにより、どちらか一方による MKKのリン酸化を阻害するよりも、 c— J u nのリン酸化の阻害においてより高い効果が得られると考える。

本発明はこのように、 J NK 3シグナル伝達経路の活性化によって引き起こされる疾患、例えば神経細胞死に基づく疾患、具体的には、神経変性疾患の予防 ·治療のために、また、神経変性疾患や J NKシグナル伝達機構の研究のために、非常に有用でめる。配列表フリーテキスト

配列番号 1 ： P A K 4の部分配列（配列番号 3 ) と高レ、相同性を有する、 MK K 7の部分配列。

配列番号 2 ： PAK4の部分配列（配列番号 4) と高い相同性を有する、 MKK7の部分配列。

配列番号 3 ： MKK7の部分配列（配列番号 1 ) と高レ、相同性を有する、 P A K 4の部分配列。

配列番号 4 ： MKK7の部分配列（配列番号 2 ) と高い相同性を有する、 P A K 4の部分配列。

配列番号 5 ： J I Kの部分配列（配列番号 7) と高い相同性を有する、 MKK7の部分配列。配列番号 6 ： J IKの部分配列（配列番号 8) と高い相同性を有する、 MKK7の部分配列。

配列番号 7 ： MKK 7の部分配列（配列番号 5) と高い相同性を有する、 J I Kの部分配列。

配列番号 8 ： MKK 7の部分配列（配列番号 6) と高い相同性を有する、 J I Kの部分配列。

配列番号 9 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 10 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した PAK4の部分配列。

配列番号 1 1 ： MKK7、 PAK4および J I Kの配列において一致する部分配列。配列番号 12 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 13 ： MKK 7と P AK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した PAK4の部分配列。

配列番号 14 ： MKK 7と P AK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 15 ： MKK 7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A K 4の部分配列。

配列番号 16 ： MKK 7と P AK 4の配列において一致する部分配列。

配列番号 1 7 ： MKK 7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 18 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A K 4の部分配列。

配列番号 19 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 20 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A K 4の部分配列。

配列番号 21 ： ΜΚΚ7と ΡΑΚ4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した ΜΚΚ 7の部分配列。

配列番号 22 ： ΜΚΚ7と ΡΑΚ4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した ΡΑΚ4の部分配列。

配列番号 23 ： ΜΚΚ7と Ρ ΑΚ4とのローカルァライメントにおいて髙ぃスコアを示した ΜΚΚ 7の部分配列。

配列番号 24 ： ΜΚΚ7と ΡΑΚ4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A Κ 4の部分配列。

配列番号 25 ： MKK7ど PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 26 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A K 4の部分配列。

配列番号 27 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 28 ： MKK7と PAK4とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した P A K 4の部分配列。

配列番号 29 ： MKK7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK7の部分配列。

配列番号 30 ： MKK7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 31 ： MKK7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 32 ： MKK7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 33 ： MKK7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。配列番号 3 4 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 3 5 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 3 6 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 3 7 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 3 8 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 3 9 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 4 0 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 4 1 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 4 2 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 4 3 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 4 4 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

配列番号 4 5 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した MKK 7の部分配列。

配列番号 4 6 ： MKK 7と J I Kとのローカルァライメントにおいて高いスコアを示した J I Kの部分配列。

Claims

請求の範囲

1. 下記 i) から iv) のうちの少なくとも 1っを特とする、 c一 J un N末端キナーゼ 3による c一 J unリン酸ィ匕の阻害剤；

i ) p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK

7) の結合阻害、

ϋ) ΡΑΚ 4による MKK 7のリン酸化の阻害、

iii) J NK/SAPK—インヒビトリーキナーゼ（ J NK/S A P K— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸化の阻害。

2. 下記 i) から iv) のうちの少なくとも 1っを特 ¹ [敷とする、 c一 J un N末端キナーゼ 3による c一 J unリン酸化の阻害方法；

i ) p 21活性化キナーゼ 4 (P AK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK

7) の結合阻害、

ϋ) ΡΑΚ 4による MKK 7のリン酸化の阻害、

iii) JNK/SAPK—インヒビトリーキナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害。

3. 下記 i) から iv) のうちの少なくとも 1っを特敷とする、 c一 J un N末端キナーゼ 3による c一 J unリン酸化に基づく疾患の防止剤および/または治療剤；

i ) p 21活性化キナーゼ 4 (P AK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK 7) の結合阻害、 ϋ) PAK4による MKK7のリン酸化の阻害、

iii) J NKZS APK—インヒビトリーキナーゼ ( J NK/S APK— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MAPキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK7のリン酸ィ匕の阻害。

4. 下記 i ) から iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、神経変性疾患の防止剤おょぴ Zまたは治療剤；

i ) p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK 7) の結合阻害、

ii) PAK 4による MKK 7のリン酸ィ匕の阻害、

iii) J NK/S APK—インヒビトリーキナーゼ（ J NK ^S APK— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MAPキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害。

5. 下記 i ) から iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、 c— J un N末端キナーゼ 3による c一 J u nリン酸化に基づく疾患の防止方法および/または治療方法；

i ) p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK

7) の結合阻害、

ii) PAK 4による MKK 7のリン酸ィ匕の阻害、

iii) J NK/S APK—インヒビトリーキナーゼ（ J NK/S APK— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害。

6. 下記 i ) から iv) のうちの少なくとも 1つを特徴とする、神経変性疾患の防止方法および/または治療方法；

ϋ) ΡΑΚ 4による MKK 7のリン酸化の阻害、

iii) JNK/SAPK—インヒビトリーキナーゼ（JNK/SAPK— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害、

および

iv) J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕の阻害。

7. p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK 7) の結合を阻害するィヒ合物の同定方法であって、 PAK4と MKK7とが結合する条件下で、 PAK4および Zまたは MKK7を被検化合物と接触させ、次いで、 PAK4と MKK7との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が PAK 4と MKK 7との結合を阻害するか否カを決定することを含む同定方法。

8. J NK/S APK—インヒビトリーキナーゼ（ J NKZS APK— i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK 7) の結合を阻害する化合物の同定方法であって、 J I Kと MKK 7とが結合する条件下で、 J I Kおよび Zまたは MKK 7を被検化合物と接触させ、次いで、 J I

Kと MKK 7との結合により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が J I Kと MKK 7との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

9. p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) による MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、 PAK4および Zまたは MKK 7と被検化合物を接触させ、 MKK 7のリン酸ィ匕を検出することのできるシグナルおよび/またはマーカ一を使用する系を導入し、このシグナルおよび /またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が PAK4による MKK7のリン酸ィヒを阻害する力否かを決定する同定方法。

10. JNK/SAPK—インヒビトリ一キナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) による MAPキナーゼキナーゼ 7 (M KK7) のリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、：！ェぉょぴまたは MKK 7と被検化合物を接触させ、 MKK 7のリン酸ィ匕を検出することのできるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を導入し、このシグナルおよぴ /またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、被検化合物が J I Kによる MKK 7のリン酸ィ匕を阻害する力否かを決定する同定方法。

1 1. 請求の範囲第 7項から第 10項のいずれか 1項に記載の方法によって得られた化合物。

12. p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合を阻害する化合物。

1 3. J NK/SAPK—インヒビトリーキナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ； J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK

7) の結合を阻害する化合物。

14. p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4) による M A Pキナーゼキナーゼ 7 (M KK7) のリン酸化を阻害する化合物。

15. J NK/S APK—インヒビトリ一キナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ； J I K) による MA Pキナーゼキナーゼ 7 (M

KK7) のリン酸ィヒを阻害する化合物。

16. p 21活性化キナーゼ 4 (P AK4) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MK K7) の結合阻害剤。

17. J NK/S APK—インヒビトリ一キナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) と MA Pキナーゼキナーゼ 7 (MKK

7) の結合阻害剤。

18. p 21活十生化キナーゼ 4 (P AK4) による MA Pキナーゼキナーゼ 7 (M KK7) のリン酸化阻害剤。

19. J NK/SAPK—インヒビトリ一キナーゼ ( J NK/S APK- i n h i b i t o r y k i n a s e ; J I K) による MA Pキナーゼキナーゼ 7 (M KK7) のリン酸化阻害剤。

20. 請求の範囲第 1 1項力ら第 15項に記載の化合物およぴ請求の範囲第 16 項から第 19項に記載の阻害剤の少なくとも 1種以上を有効有してなる医薬組成物。

21. 請求の範囲第 1 1項から第 1 5項に記載の化合物および請求の範囲第 16 項から第 19項に記載の阻害剤の少なくとも 1種以上を有効 4 ^有してなる、 c - J u n N末端キナーゼ 3による c_J unリン酸ィ匕に基づく疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

22. 請求の範囲第 1 1項から第 15項に記載の化合物および請求の範囲第 16 項から第 19項に記載の阻害剤の少なくとも 1種以上を有効量含有してなる、神経変性疾患の防止剤および/または治療剤。

23. 神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、 L ewy小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、 p i c k病、ファミリアルブリテイツシュデメンチア (f am i l i a l B r i t i s h d eme n t i a)、クロイツフエノレト一ヤコブ（C r e u t z f e l d t— J a k o b)病、ケノレストマン一ストランスラー G e r s tma nn— S t r a n s s 1 e r ) 症候群、狂牛病（ゥシ海綿状脳症）（BSE)、またはニューロセルピン（n e u r o s e r p i n) 封入体を伴う家族性痴呆症である請求の範囲第 5項若しくは第 22項に記載の防止剤および/または治療剤。

24. 請求の範囲第 1 1項から第 1 5項に記載の化合物および請求の範囲第 16 項から第 1 9項に記載の阻害剤の少なくとも 1種以上を使用することを特徴とする、 c_J un N末端キナーゼ 3による c一 J unリン酸ィ匕に基づく疾患の P方止方法および Zまたは治療方法。

25. 請求の範囲第 11項から第 1 5項に記載の化合物および請求の範囲第 16 項から第 1 9項に記載の阻害剤の少なくとも 1種以上を使用することを特徴とする、神経変性疾患の防止方法およぴ Zまたは治療方法。

26. 神経変性疾患が、ポリグルタミン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、パーキンソン病、 L ewy小体型痴呆症、多系統萎縮症、家族性筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、 p i c k病、ファミリアルブリティッシュテメンチア (f am i l i a l B r i t i s h d eme n t i a)、クロイツフエノレトーヤコブ（C r e u t z f e l d t— J a k o b) 病、ゲノレストマンーストランスラー (Ge r s tma nn— S t r a u s s 1 e r ) 症候群、狂牛病（ゥシ海綿状脳症）（BSE)、またはニューロセルピン（n e u r o s e r p i n) 封入体を伴う家族性痴呆症である請求の範囲第 6項若しくは第 25項に記載の防止方法およびまたは治療方法。

27. p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4)、 J NK/SAPK—インヒビトリ一キナーゼ（ J NK/S APK— i nh i b i t o r y k i n a s e ; J I K)、 PAK 4をコードするポリヌクレオチド、 J I Kをコードするポヌクレオチド、 P AK4をコ.一ドするポリヌクレオチドを含有するベクターおよび J I Kをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つと、 MAPキナーゼキナーゼ 7 (MKK7)、 MKK7をコードするポリヌクレオチドおよび MKK 7をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つとを含んでなる試薬キット。

28. 請求の範囲第 7項から第 10項のいずれか 1項に記載の同定方法に用いる試薬キットであって、 p 21活性化キナーゼ 4 (PAK4)、 JNK/SAPK —インヒビトリ一キナーゼ（ J NK/S APK— i n h i b i t o r y k i n a s e ； J I K)、 PAK 4をコードするポリヌクレオチド、 J I Kをコードするポリヌクレオチド、 PAK4をコードするポリヌクレオチドを含有するべクタ一および J I Kをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つと、 MA Ρキナーゼキナーゼ 7 (MKK7)、 MKK 7をコードするポリヌクレオチドおよび MKK 7をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターから選ばれる少なくとも 1つとを含んでなる試薬キット。