CN105483151A - Pten基因干扰慢病毒载体及其制备方法 - Google Patents

Pten基因干扰慢病毒载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，涉及基因工程技术领域，制备了PTEN基因干扰慢病毒载体，分别将4个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序,还与pHelper？1.0、pHelper2.0两种包装质粒共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，再利用Real-time？PCR，对4个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％，为进一步大量扩增提取病毒奠定了基础。

Description

PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法。
背景技术
PTEN又名MMAC1/TEP1，是1997年由三个独立的研究小组几乎在同一时间克隆出来的一种抑癌基因。据LiJ.YenC.LiawD.etal.PTEN，aputativeproteintyrosinephosphatasegenemutatedinhumanbrain.breastandprostatecancer[J].Science.1997，275(28)：1943-1947，中报道用代表性差别分析法(representationaldifferenceanalysis，RDA)，在浸润性乳腺癌的两个移植瘤中发现了10q23染色体特定区域的纯合性缺失，并通过外显子俘获分析法(exontrapanalysis)分离出一种新的基因，对其开放阅读框架(ORF)序列分析揭示了它可能编码蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)，且与张力蛋白，辅助蛋白有大片同源区，因此将其命名为PTEN(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosome10)。同时，由于10q23LOH在胶质母细胞瘤中的频率为70％左右，Steck等对此现象研究时，亦从其细胞系中克隆得到亚定位于10q23.3，于多种进展期癌中突变的基因，称之为MMAC1之后不久，在搜索PTPs家族新成员过程中又获得一受TGF-β调节、上皮细胞富含的磷酸酶基因TEP1，(TGF-βregulatedandepithelialcell-enrichedphosphatase)，详见SteckPA.PershouseMA.JasserSA.etal.Identificationofacandidatetumorsuppressorgene.MMAC1.atchromosome10q23.3thatismutatedinmultipleadvancedcancers[J].NatGenet，1997，15(4)：356-362.在比较PTEN、MMAC1和TEP1三者cDNA及编码的蛋白后将其归为同一基因。随后文献中多以PTEN或PTEN/MMAC1的形式出现。PTEN基因异常广泛存在于人类各种恶性肿瘤中，如恶性神经胶质瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤等。PTEN基因正常表达可以抑制肿瘤细胞侵袭、转移和生长，该基因异常将导致PTEN蛋白表达下降甚至完全不表达。PTEN基因失活与细胞信号转导、肿瘤发病机理、浸润转移、恶性转化、无限制生长和临床预后等有较为密切的关系。
PTEN基因定位于第10号染色体10q23.3区，有9个外显子，其cDNA序列内包含一个由1209个核苷酸组成的开放阅读框，第5个外显子编码第122～123位氨基酸，该编码序列与蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区的核心基序符合，是迄今为止发现的第一个编码具有双重特异磷酸酶功能的抑癌基因。同其它抑癌基因一样，PTEN为一高度保守基因，人、小鼠、犬的PTEN序列有99.75％的同源性，在细胞的分化中起着重要的作用。PTEN编码一个由403个氨基酸组成的一条肽链，PTEN蛋白没有SH2结构，也没有跨膜信号，它是定位于细胞浆的一种磷酸脂酶。PTEN蛋白的氨基酸序列氨基端与细胞骨架蛋白tensin和神经触突泡转运相关蛋白auxilin高度同源，提示PTEN在维持细胞的结构和信号转导中起重要作用。PTEN基因具有双重磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性，SimpsonL.ParsonsR.PTEN:lifeasatumorsuppressor[J].ExpCellRes.2001，264(1)：29-41.报道PTEN主要是通过脂质磷酸酶发挥抑癌作用。磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸[PtdIns(3，4，5)P3，简称PIP3]是PTEN作用的主要底物，PIP3是细胞生长因子的第二信使，其在细胞膜上地聚集能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。而PTEN可以使其脱磷酸，降低细胞内的PIP3水平，阻断其后的传导通路，使细胞周期阻断在G1期或促使细胞凋亡，对细胞的生长起负调节作用。当PTEN基因发生体细胞突变或丢失而失活时，导致细胞内PIP3的水平增高，其后的信号传导加强，使细胞无限增殖形成肿瘤。此外，PTEN基因也具有蛋白酪氨酸酶活性，使磷酸化的酪氨酸和丝氨酸局部粘连激酶(FAK)脱磷酸，抑制整合素介导的细胞浸润和转移。
在人类大多数恶性肿瘤中，均有抑癌基因的突变，如P53、PTEN、P16、BRCA1、BRCA2、Rb1等。PTEN是迄今为此发现的第一个具有双重磷酸酶功能的抑癌基因，在人类的恶性肿瘤中广泛存在突变(约25～50％)，如恶性神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、头颈癌、肾癌等，尤其是在甾体激素依赖性肿瘤中如前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌等，而PTEN基因在子宫内膜癌中的突变是所有恶性肿瘤中检出率最高的，同时也是至今在子宫内膜样腺癌中鉴定出的最常见的突变基因，突变率在36％～83％，在子宫内膜癌前病变中也发现有18～55％的突变率。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术不足，本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，制备了PTEN基因干扰慢病毒载体，转染Hela细胞，Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、利用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取180-200μl转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2-4μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
S2、将步骤S1中处理后的4只离心管放到预加温到40-45℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却l-2分钟；
S3、向上述4支离心管中分别加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育42-46分钟使细菌复苏，再将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和Amp抗性的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，16小时；
S4、将4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别阳性克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。
优选的，步骤S1所述利用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
优选的，步骤S2所述4只离心管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却2分钟。
一种PTEN基因干扰慢病毒载体，所述载体转染Hela细胞，利用Real-timePCR，对PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行检测。
优选的，所述Hela细胞内PTEN基因的表达有下调作用。
(三)有益效果
本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，制备了PTEN基因干扰慢病毒载体，分别将4个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序,还与pHelper1.0、pHelper2.0两种包装质粒共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，再利用Real-timePCR，对4个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％，为进一步大量扩增提取病毒奠定了基础。
附图说明
图1为本发明质粒简化图；
图2为本发明辅助质粒简图；
图3为本发明PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆图；
图4为本发明Real-timePCR检测四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1.实验材料
慢病毒载体质粒：pGCSIL-GFP质粒；包装质粒pHelper1.0和pHelper2.0(CMV8.91，PMD.G)(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)。
siRNA片断1：
CcggaaGATCAGCATACACAAATTATTCAAGAGATAATTTGTGTATGCTGATCttTTTTTg；
aattcaaaaaaaGATCAGCATACACAAATTATCTCTTGAATAATTTGTGTATGCTGATCtt；
siRNA序列：GATCAGCATACACAAATTA
siRNA片断2：
CcgggaCCAATGGCTAAGTGAAGATTTCAAGAGAATCTTCACTTAGCCATTGGtcTTTTTg；
aattcaaaaagaCCAATGGCTAAGTGAAGATTCTCTTGAAATCTTCACTTAGCCATTGGtc；
siRNA序列：CCAATGGCTAAGTGAAGAT
siRNA片断3：
CcggcaGTATAGAGCGTGCAGATAATTCAAGAGATTATCTGCACGCTCTATACtgTTTTTg；
aattcaaaaacaGTATAGAGCGTGCAGATAATCTCTTGAATTATCTGCACGCTCTATACtg；
siRNA序列：GTATAGAGCGTGCAGATAA
siRNA片断4：
CcggaaGTGAAGATGACAATCATGTTTCAAGAGAACATGATTGTCATCTTCACttTTTTTg；
aattcaaaaaaaGTGAAGATGACAATCATGTTCTCTTGAAACATGATTGTCATCTTCACtt；
siRNA序列：GTGAAGATGACAATCATGT
(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)
2.主要试剂和实验耗材
缩滤膜
枪头美国AcxygenScientific
移液管美国Costar
3.主要仪器
4.实验用溶液配制
(1)293T细胞培养基(100ml)：DMEMwithhighglucose88ml，FBS10ml，L-glutamine1ml，Streptomycine-Penicilline1ml，过滤后4℃保存。
(2)ITS培养基(100ml)：DMEMwithhighglucose98ml，Insulin10μg/ml，Transferrin5μg/ml，L-glutamine1ml，Streptomycine-Penicilline1ml，过滤后4℃保存。
(3)100μg/mlPoly-D-lysine溶液
储存液：1mg/ml，无菌PBS配制，储存于-20℃。
工作液：将储存液用无菌PBS10倍稀释，4℃保存。
(4)Polybrene溶液
无菌蒸馏水配制成8mg/ml溶液，-20℃保存。
(5)293T细胞冻存液(10ml)：FBS9ml，DMSO1ml，混匀，放置4℃保存。
5.实验方法
5.1PTEN基因干扰慢病毒载体的制备
(1)使用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒；
表1酶切反应体系
(2)4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，对照1，对照2，连接组1、2、3、4如表2所示，
表2各组加入原料及其量
分别将对照组1、对照组2、连接组1.2.3.4，置于4℃12小时，准备转化；
(3)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
(4)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒，不要摇动试管。之后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟；
(5)每管加800μlSOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；
(6)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收；
(7)倒置平皿，于37℃培养，16小时；
(8)之后进行阳性克隆PCR鉴定；
Primer1(+):5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’
Primer2(-):5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’
(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)
(9)与4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别阳性克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。
注：
菌落PCRTemplate：在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μlLB，混匀取1μl作为模板；
阴性对照：排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；
PCR条带大小：连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：343bp(从载体中切掉24bp)；没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：306bp。
5.2293T细胞冻存复苏及培养
(1)293T细胞冻存：当293T细胞长到培养皿底面积的80％时，用0.5％胰蛋白酶消化2分钟，加入完全培养基终止胰酶消化，离心后去胰酶，重悬于冻存液中，冻存细胞每毫升冻存液中的细胞不应低于106个。将冻存管放于装有异丙醇的逐步降温盒中，先置于4℃20分钟后，-80℃过夜，最后转移到液氮罐中长期保存；
(2)复苏较早代数的生长旺盛的293T细胞(P3-P4)将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中不时摇动，尽快解冻，转移入15ml离心管中，逐滴缓慢加入9倍体积的预热293T细胞培养基，1000rpm离心3分钟。吸除上清，重悬于新的培养液中，接种到100mm培养皿中培养。细胞培养应保持在较高的密度；
(3)细胞长满后进行传代，用不含Ca2+,Mg2+的PBS轻轻洗一遍，每皿细胞加入2ml0.5％胰蛋白酶消化，37℃孵育2-3min，加入4ml完全培养基(含血清)以去除胰酶作用，用巴斯德管轻轻将细胞吹打下来，转移至15ml离心管中，1000rpm离心3分钟，吸除上清，加入4ml完全培养基充分重悬混匀，按1:4-1:5比例进行传代。
5.3用瞬时转染的方法制备慢病毒载体病毒上清
(1)转染前一天：用100μg/ml的Poly-D-lysine溶液包被100mm培养皿，室温作用60分钟，回收Poly-D-lysine溶液，可重复使用2－3次，使用前用无菌PBS洗两次。在100mm培养皿中，接种约5×106个293T细胞，加入8ml293T细胞培养基，培养24小时，使其细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数；
(2)转染当天：一个100mm培养皿细胞需要的三个质粒DNA总量为16μg,三个质粒分配比例为：pGC:CMV8.91:PMD.G＝3:4:1；
(3)取400μlOPTI-MEM培养基置于5ml聚苯乙烯管中，将载体质粒DNA溶于其中，轻柔混匀，室温放置5分钟；
(4)同时在另一管同样含有400μlOPTI-MEM培养基的5ml聚苯乙烯管中，加入Lipofectamine200032μl,轻柔混匀，室温放置5分钟；
(5)将以上两种液体混合，室温放置20分钟，每10分钟轻微震荡；
(6)将DNA与脂质体的混合液加入含有8ml新鲜培养基的100mm293T细胞培养皿中，边加边摇动培养皿使其充分混匀，37℃、5％CO2孵箱中培养；
(7)转染后8-12小时后弃去转染液，加入新鲜的ITS培养液8ml，24小时后收集培养基(即病毒上清)至4度保存，再重新往培养皿中加入8mlITS培养液，再过24小时候收集第二次病毒上清，将这二次取的病毒上清500g离心去除细胞碎片，0.45μm滤器过滤于无菌离心管中，浓缩前暂时放置4℃保存。
5.4病毒上清的浓缩
(1)取4ml无菌PBS加入Ultra-Plus20滤膜上，2500rpm，离心5分钟，湿润滤膜，弃去管底PBS溶液；
(2)将经过0.45μm滤器过滤的病毒上清加入滤膜插件中，4℃，4000g，离心20分钟；
(3)用黄枪头小心吸取滤膜插件上的浓缩的病毒上清，迅速分装于1.5mlEP管中，除少量用于检测病毒滴度的放置于4℃外，其他的置于－80℃低温冰箱中进行保存。Ultra-Plus20滤膜可以重复使用2-3次，每次重复前都需要用无菌PBS湿润清洗。
5.5病毒上清滴度鉴定
(1)第一天：用100μg/ml的Poly-D-lysine溶液包被24孔板，以每孔2×104个细胞的密度将293T细胞接种于六孔板；
(2)第二天：将病毒上清加至293T细胞培养液中，最好将病毒上清的加入量设置为一个等比或等差数列，如10倍稀释，同时根据每孔中的最终溶液量以8μg/ml的浓度加入Polybrene；
(3)第三天：荧光显微镜下计算GFP阳性细胞数，下面公式计算病毒上清滴度。例：在加入1000倍稀释(1E-3μl)病毒原液(原液量为1μl)的孔中，观察到5个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有5个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是5/(1E-3)＝5E+3，单位为TU/μl，也就等于2E+6TU/ml。
5.6干扰慢病毒对目的基因干扰效果检测
5.6.1靶细胞慢病毒感染
(1)处于对数生长期的Hela细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液接种于12-well培养板中(2×104孔)，于37℃、5％CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30％，根据MOI值，加入适宜量的病毒。12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。
(2)感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于50％者继续培养，待感染时间达到5天后收集细胞抽提RNA进行RT-PCR检测实验；感染效率低于50％的实验组，重新进行感染实验。
5.6.2Trizol法提取细胞总RNA
(1)将转染后细胞吹打收集到15ml离心管中，用DPBS液洗二次，每次500rpm离心3分钟；
(2)弃上清，将15ml离心管迅速转移到RNA操作台中，加入1mlTrizol，反复吹打，直至离心管中细胞团块完全消失，将细胞的Trizol裂解液转移到1.5m的Eppendorf管中；
(3)加入0.2ml氯仿，盖紧盖子后用力振荡15秒，室温静置5分钟；
(4)在预冷的低温超速离心机中4℃，12000×g离心，15分钟；
(5)将离心后形成的上层氯仿相转移到一个新的1.5ml的Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻翻转混匀，室温静置10分钟；
(6)在低温超速离心机中4℃，12000×g离心，15分钟；
(7)弃去上清，底部白色沉淀即为RNA，注意不要将管底的沉淀也一并弃去；
(8)加入1ml75％乙醇悬浮RNA沉淀后，不吹打沉淀，在低温超速离心机中4度，7500×g，离心10分钟来将RNA沉淀洗1遍；
(9)尽量将Eppendorf管中的乙醇弃除，保留管底的RNA沉淀，在超净台内开盖晾干残留在管中的乙醇；
(10)在RNA沉淀半透明时加入20μlNuclease-FreeWater将RNA充分溶解后分装，储存在-80℃低温冰箱中；
(11)总RNA的定量：RNA在紫外光260nm波长处有最大吸收峰，1OD表示总RNA浓度为40μg/ml。取总RNA样品1μl，加入0.1％DEPC处理的双蒸水99μl(将RNA稀释100倍)，以0.1％DEPC处理的双蒸水作空白对照，用分光光度计测定RNAOD260/OD280比值(反映样品的纯度)及总RNA浓度；
(12)用无RNA酶的DNA酶处理提取的RNA样品，去除RNA样品中的DNA污染。
反应体系和反应条件：RNA-5μl，10×reactionbuffer-1μl，RNase-freeDNase-1μl/1μgDNA，无核酶水-3μl，37℃作用30分钟；
◆加入1μlStopBuffer,65℃作用10分钟终止反应；
◆取1μl用无核酶水1:40稀释，测OD定量。
5.6.3RNA逆转录为cDNA模板
(1)第一步，随机引物与RNA模板结合；
反应体系：Oligo(dT)151μl，RNA模板2μg，加Nuclease-FreeWater至5μl，反应条件：70℃水浴作用5分钟，迅速转入冰上冷却；
(2)第二步，逆转录反应，在冰上继续往第一步的Eppendorf管中加入下列物质：反应体系：5×FirstStrandBuffer4μl，DTT(0.1M)2μl，dNTP(10mM)1μl，RNaseOUTTRecombinantRibonucleaseInhibitor(40U/μl)0.5μl，SuperScriptTMII反转录酶(200U/μl)0.5μl，MgCl2(25mM)2.4μl，Nuclease-FreeWater补齐至15μl，反应条件：水浴，25℃5分钟，42℃60分钟；
(3)第三步，70℃水浴作用15分钟终止反应，迅速转入冰上冷却，模板cDNA保存于-20℃。
5.6.4利用Real-timePCR反应检测细胞中PTEN的表达量
(1)PTENReal-time引物：
上游F：5'-CCGTTACCTGTGTGTGGTGATATC-3'
下游R：5'-GAATGTATTTACCCAAAAGTGAAACATT-3'
扩增片段大小：94bp
(2)GAPDHReal-time引物：
上游F：5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3'
下游R：5'-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3'
扩增片段大小：177bp
(3)Real-timePCR标准曲线扩增：
以GFP阴性对照组的cDNA为模板扩增标准曲线，将模板cDNA用样品稀释Buffer按1/3，1/9，1/27，1/81,1/243,1/729倍比稀释。以稀释好的cDNA为模板，分别扩增PTEN1和GAPDH的标准曲线。每个稀释浓度做两个重复管，两管之间的C(t)值相差小于0.4才可采用，结果取平均值。
反应体系：(20μl)，其中SYBRTaqpremixbuffer(2×)-10μl，Forwardprimer-0.4μl，Reverseprimer-0.4μl，ddH2O-8.2μl，cDNA-1μl；
(4)不同转染组样品曲线扩增：用反应Buffer将样品cDNA1:10倍稀释，按与标准曲线同样的反应体系和反应条件扩增。每个稀释浓度做两个重复管，结果取平均值。用标准曲线测定细胞PTEN的mRNA水平上的表达量，以PTEN/GAPDH表示细胞中的PTEN基因在mRNA水平上的相对表达量，对比不同组的相对表达量即可检测PTEN的变化情况。
6实验结果
图1所示为PTEN干扰质粒(pGCL-GFP)，基因干扰片段(即shRNA茎环结构)插入MCS区，由U6启动子驱动表达，后接PCMV启动子驱动表达绿色荧光蛋白(GFP)。
图2中，pHelper1.0：该质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。
pHelper2.0：该质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
6.1PTEN基因干扰慢病毒载体的制备及目的基因干扰效果
分别将四个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序(连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343bp，如图3所示)。最后利用Real-timePCR，四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用。其中KD3#是最佳靶点，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％。因此选择使用连接#3干扰序列的基因干扰载体，并大量扩增提取病毒备用(如图4所示)。4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序。PCR条带大小：连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：343bp(从载体中切掉24bp)；没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：306bp。#1：阴性对照(ddH2O)；#2：阴性对照(空载组)；#3：Marker；#4，6，7，8为阳性克隆；#5：阴性克隆。
6.2Real-timePCR检测四个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果。
如图4所示，Real-timePCR检测结果显示：四个靶点对Hela细胞内目的基因的表达都有显著下调作用。其中KD#3是最佳靶点，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％。因此选择使用连接#3干扰序列的基因干扰载体，并大量扩增提取病毒备用，为进一步大量扩增提取病毒奠定了基础。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
siRNA片断1：
CcggaaGATCAGCATACACAAATTATTCAAGAGATAATTTGTGTATGCTGATCttTTTTTg；
aattcaaaaaaaGATCAGCATACACAAATTATCTCTTGAATAATTTGTGTATGCTGATCtt；
siRNA序列：GATCAGCATACACAAATTA
siRNA片断2：
CcgggaCCAATGGCTAAGTGAAGATTTCAAGAGAATCTTCACTTAGCCATTGGtcTTTTTg；
aattcaaaaagaCCAATGGCTAAGTGAAGATTCTCTTGAAATCTTCACTTAGCCATTGGtc；
siRNA序列：CCAATGGCTAAGTGAAGAT
siRNA片断3：
CcggcaGTATAGAGCGTGCAGATAATTCAAGAGATTATCTGCACGCTCTATACtgTTTTTg；
aattcaaaaacaGTATAGAGCGTGCAGATAATCTCTTGAATTATCTGCACGCTCTATACtg；
siRNA序列：GTATAGAGCGTGCAGATAA
siRNA片断4：
CcggaaGTGAAGATGACAATCATGTTTCAAGAGAACATGATTGTCATCTTCACttTTTTTg；
aattcaaaaaaaGTGAAGATGACAATCATGTTCTCTTGAAACATGATTGTCATCTTCACtt；
siRNA序列：GTGAAGATGACAATCATGT。

Claims (5)

1.一种PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取180-200μl转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2-4μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；
S2、将步骤S1中处理后的4只离心管放到预加温到40-45℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却l-2分钟；
S3、向上述4支离心管中分别加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育42-46分钟使细菌复苏，再将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和Amp抗性的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，16小时；
S4、将4个siRNA干扰片断连接pGCSIL-GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别阳性克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。
2.根据权利要求1所述的PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S1所述利用AgeI和EcoRI酶切消化pGCSIL-GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL-GFP连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
3.根据权利要求1所述的PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，步骤S2所述4只离心管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却2分钟。
4.一种如权利要求1-3任一所述的PTEN基因干扰慢病毒载体，其特征在于，所述载体转染Hela细胞，利用Real-timePCR，对PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行检测。
5.根据权利要求4所述的PTEN基因干扰慢病毒载体，其特征在于，所述Hela细胞内PTEN基因的表达有下调作用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410632A (zh) * 2022-01-28 2022-04-29 江苏大学 特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703508A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 边红 靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体及其构建、筛选方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703508A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 边红 靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体及其构建、筛选方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨波等: "SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建", 《同济大学学报（医学版）》 *
王玉梅等: "人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定", 《郑州大学学报（医学版）》 *
许成芳等: "PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响", 《中山大学学报（医学科学版）》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410632A (zh) * 2022-01-28 2022-04-29 江苏大学 特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用
CN114410632B (zh) * 2022-01-28 2024-08-30 江苏大学 特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用

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