CN107557374A - 人乳头瘤病毒亚型l1基因的重组质粒构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，解决了目前由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品，易出现干扰性质的HPV检测结果的问题，其技术方案要点是：NCBI数据库查找HPV不同亚型L1区的基因序列，采用网站上BLAST功能对其进行生物信息学分析，选定GP5+/6+区域作为靶基因目的片段，利用Primer Premier 5.0软件分别设计25组型特异性引物，对相应阳性样本进行PCR扩增，扩增产物用于构建标准质粒，并成功完成HPV病毒25个亚型重组标准质粒的构建工作，为通过HPV核酸检测的分子生物学技术筛查是否有高危型HPV感染的测试结果的稳定性提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)，属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的病毒。HPV基因组为环状双链DNA，基因组长约8000碱基对(bp)。
根据功能可以把HPV基因组分为3个功能区：(1)早期转录区：又被称为E区，由4500个碱基对组成，分别编码为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8这8个早期类蛋白，其中E1的功能与HPV的DNA的复制密切相关；E2是一类激活蛋白，E5与细胞的转化关系紧密，而早起的E6和E7是HPV表面的主要癌基因，因此早期专路器主要具有控制病毒的复制和转化的功能；
(2)晚期转录区：又被称为L区，由2500个碱基对组成，主要编码2个衣壳蛋白L1和L2，L1和L2构成了HPV的衣壳，还和HPV的增殖有关联；其中L1是主要衣壳蛋白(约占衣壳蛋白的80％以上)；它既是一种糖蛋白，也是一种核蛋白，在其翻译加工完成后迅速定位于核中；在病毒颗粒形成过程中，L1具有自组装的功能；HPV的衣壳蛋白与其他病毒的衣壳蛋白相比，不同型的HPV的L1蛋白的氨基酸序列的同源性在60％以上；
(3)长控制区：又称LCR区，由1000对碱基对组成，在E8和L1之间，包含复制起始区和复制转录控制元件。
20世纪80年代，德国病毒学家Harald zur Hausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与其具体的基因型，可以作为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。
通过分子水平的检测可辅助子宫颈细胞学检查，能够筛查是否有高危型HPV感染。基于HPV核酸检测的分子生物学技术主要包括：第二代杂交捕获法(HC2)、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及PCR-杂交法等。
现有的HPV核酸检测的分子生物学技术大多针对HPV病毒的基因组中的L1保守区，但目前由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品，易出现干扰性质的HPV检测结果(假阴性或假阳性)，假阴性结果可能导致宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导致不必要的频繁筛查和侵袭性处置，将会引起潜在的公共卫生风险。
发明内容
本发明的第一个目的是提供人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，通过重组质粒的构建提供了阳性参考对照样本，免了由于缺乏各种亚型的L1阳性对照核酸标准样品造成的检测结果出现假阴性或假阳性。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，所述方法包括如下步骤：
Step.1针对NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型的基因序列使用NCB1网站上的BLAST功能进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，并通过Primer Premier 5.0针对HPV病毒亚型设计特异性引物；
Step.2选取GP5+/6+引物组所在区域为中心，上下各延伸150～300bp作为构建重组质粒标准样品的目标区域，对HPV病毒亚型分别进行病毒DNA的提取，并对应的构建重组质粒；
Step.3使用对应的重组质粒以及对应的特异性引物在10×Buffer、2.5μM dNTPs、25μMMgCl2、10μM Primer F、10μM Primer R、SDW、DNA、Taq(5U/μL)的混合体系中进行PCR扩增后，经洗脱得到PCR纯化后的重组质粒；
Step.4将纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接后，将连接后的重组质粒导入感受态细胞中进行转化，将转化后的感受态细胞接种到固体培养基中，培养12～16h，得到若干菌落；
Step.5选取培养基上的单菌落分别置于离心管中并加入液体培养基，混合形成菌液，进行离心、培养后，使用特异型引物与通用型引物分别对同一管离心管内的菌液进行PCR检测。
通过采用上述技术方案，利用NCBI数据库的BLAST检索程序进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，BLAST系统的运算机制不同于全序列比较，该系统的设计要注重平衡运算速度和增加系统非同源序列的敏感性，注重通过序列片段的某些区域来测定共有的相似序列片段的序列之间的关系，所以，不仅仅是一个通过序列排队比较测定序列的同源性简单工具，而且也是通过序列片段的相似性来对序列的结构和功能进行比较的工具，能够精确的进行同源性和差异性的对比，增加了比较的敏感性。
在PCR扩增体系中，10×Buffer起到催化效果，2.5μM dNTPs为合成DNA的原料，25μM MgCl2的Mg2+能够使PCR扩增产物带型基本一致；10μM Primer F为上游引物；10μM PrimerR为下游引物；SDW为灭菌去离子水，作为溶剂，经过灭菌后可以避免杂菌污染；DNA作为扩增样品、Taq(5U/μL)是Mg2+依赖性酶，对Mg2+的浓度十分敏感，优化Mg2+的浓度，能够促进Taq的酶活性。
pMDTM19-T Vector是一种高效克隆PCR产物的专用载体，由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成；大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；同时，由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
经重组质粒转化为感受态细胞，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定后，能够确保重组基因插入的正确性，在构建过程中，在靶基因的上下游用不同的内切酶切开形成黏末端，避免了插入错误，有利于阳性克隆的筛选，通过该方法，制得的各种HPV病毒亚型的L1阳性对照核酸标准样品，能够作为阳性对照样本，避免出现干扰性质的HPV检测结果。
作为优选，根据NCBI数据库筛选的25个HPV病毒亚型为：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV83。
通过采用上述技术方案，上述25个HPV病毒亚型包含了既包含了高危型HPV病毒如16、58亚型，又包含了低危型的HPV病毒如11、6亚型，具有代表性。
作为优选，选取GP5+/6+引物组所处的区域作为PCR检测的靶基因区域。
通过采用上述技术方案，GP5+/6+具有相对较高的特异度和敏感度，GP5+/6+在PCR产物的电泳中产物的特异度好，杂带少，虽然GP6+引物的3′端仍然存在3个碱基的保守序列，但如果向外延伸，将会使两条引物的Tm值相差过大，且，引物过长，必然需要提高PCR反应的煺火温度，这也不利于与引物存在较多剪辑错配的HPV型的检测，GP5+/6+引物总体上提高了引物与模板的结合能力，以获得更好的特异性和敏感性。
作为优选，Step.2中病毒DNA的提取方法如下：
(1)选取病毒液和蛋白酶按体积比10:1混匀后，72℃水浴至溶液清亮；
(2)冷却至室温后加入异丙醇混匀；
(3)经吸附柱收集病毒DNA，除去废液后，将吸附柱用洗脱缓冲液EB洗脱病毒DNA；
(4)将病毒DNA存放在-20～4℃下进行保存。
通过采用上述技术方案，利用蛋白酶提取DNA，由于未使用机械力量破碎细胞，所提取到的总DNA受机械剪切的程度较少，用这种方法提出的DNA进行PCR扩增，其产物含有的嵌合体较少。
作为优选，所述洗脱缓冲液EB在65～70℃水浴中预热至65～70℃。
通过采用上述技术方案，将洗脱缓冲液EB0预热后能够促进溶解，使质粒伸展，易于过柱，同时还能活化吸附柱中的吸附膜，让它具有更好的透析作用，提高洗脱效率。
作为优选，Step.4中纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接的反应体系按pMD19-TSimple Vector：重组质粒：Soiution I：SDW为体积比1:6:10:3混合而成。
通过采用上述技术方案，pMD19-T Simple Vector能够与高效连接液Solution I在短时间内完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
作为优选，所述单菌落的边缘光滑且相邻单菌落互不接触。
通过采用上述技术方案，选取互不接触的单菌落可以避免纯化不够导致同一平板中存在不同单菌落时，避免单菌落之间互相污染影响下面的实验。
作为优选，Step.5中PCR检测的反应体系按2×Power Taq PCR Master Mix：10μMPrimer F：10μM Primer R：SDW：菌液按体积比25:2:2:19:2混合而成。
通过采用上述技术方案，在该反应体系中，具有稳定高效的特点，不仅简化了操作程序、减少了污染、大大降低了劳动强度和取样误差，而且增加了PCR反应中的特异性，降低了对PCR的要求，使实验结果更加精确。
作为优选，Step.5中所述菌液经PCR扩增后的PCR产物用琼脂浓度为1.2％琼脂凝胶电泳检测。
通过采用上述技术方案，琼脂凝胶电泳检测能够检测少量的DNA，且检测范围广。
作为优选，Step.4中的固定培养基为LB琼脂固体培养基，所述LB琼脂固体培养基中添加有氨苄。
通过采用上述技术方案，培养基中接种的感受态细胞是作为克隆转化的细菌，因转化的质粒含有抗性基因，为了防止外界环境细菌的污染，在LB琼脂固体培养基添加氨苄能够放置外界环境细菌的污染，在培养基中加抗生素还可以避免工程菌在传代过程中出现质粒表达量少、不表达甚至质粒丢失的情况。
综上所述，本发明具有以下有益效果：。
本发明通过NCBI数据库查找HPV不同亚型L1区的基因序列，采用网站上BLAST功能对其进行生物信息学分析，选定GP5+/6+区域作为靶基因目的片段，利用Primer Premier5.0软件分别设计25组型特异性引物，对相应阳性样本进行PCR扩增，扩增产物用于构建标准质粒，并成功完成HPV病毒25个亚型重组标准质粒的构建工作。由于该方法适用于25个亚型重组标准质粒构建，相较于其他标准质粒，可以减少标准质粒之间的差异性，不仅为后续实验中不同研究方法体系的建立提供了阳性参考对照，而且解决了阳性样本间病毒载量的差异，为通过HPV核酸检测的分子生物学技术筛查是否有高危型HPV感染的测试结果的稳定性提供了保障。
附图说明
图1为重组质粒标准样品的目标区域图；
图2为HPV病毒重组质粒构建PCR扩增电泳图；
图3为HPV6亚型重组质粒构建扩增电泳图和菌液PCR鉴定电泳图；
图4为HPV亚型重组标准质粒的菌液PCR鉴定电泳图；
图5为HPV6亚型重组标准质粒测序结果对比图；
图6为HPV亚型重组标准质粒测序结果对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例
一、基因序列分析和型特异性引物设计
通过NCBI数据库获得25个HPV亚型的基因序列，其对应的基因型和对应的登录号如下所示：HPV6(AF092932)，HPV11(M14119)，HPV16(K02718)，HPV18(AY262282)，HPV26(X74472)，HPV31(J04353)，HPV33(M12732)，HPV35(M74117)，HPV39(M62849)，HPV40(X74478)，HPV42(M73236)，HPV43(AJ620205)，HPV44(U31788)，HPV45(X74479)，HPV51(M62877)，HPV52(X74481)，HPV53(X74482)，HPV56(X74483)，HPV58(D90400)，HPV59(X77858)，HPV66(U31749)，HPV68(X67161)，HPV73(X94165)，HPV81(AJ620209)，HPV83(AF151983)。然后使用NCBI网站上的BLAST功能对不同HPV亚型基因组中的L1区序列进行生物信息学分析，包括同源性和差异性。
通过查阅相关文献，GP5+/6+、MY09/11、SPF这三组通用引物组所在区域的突变位点较多，可以作为备选引物设计区域。其中，25个亚型的病毒基因序列的突变在GP5+/6+引物组所处的区域中相较于MY09/11、SPF物组所处的区域中多，因此，可将GP5+/6+引物组所处的区域作为检测的靶基因区域。
参见图一，以GP5+/6+引物组所在的区域(大约150bp)为中心，上下各延伸150bp-300bp，将整个区域(450bp-750bp)作为构建重组质粒标准样品的目标区域。并通过PrimerPremier 5.0软件设计25个亚型特异性引物。
二、病毒DNA的提取
(1)取200μL含HPV病毒亚型的病毒液，放入1.5mL离心管；
(2)加入200μL结合液CB，振荡15秒，充分混匀，再加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，颠倒轻摇充分混匀，72℃水浴10分钟，获得澄清且透亮的溶液；
(3)冷却至室温，加入100μL异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀；
(4)将微量吸附柱，优选为硅胶膜离心吸附柱放入收集管中，将步骤(3)所得溶液都加入一个微量吸附柱中，10,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；
(5)加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液；
(6)加入700μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
(7)加入500μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
(8)将吸附柱放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，除尽漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(9)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的中间部位加30-50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，得到病毒DNA；
(10)将病毒DNA在2-8℃环境中存放，如果要长时间存放，可以放置在-20℃中。
三、病毒重组质粒的构建
3.1PCR扩增
使用Primer Premier 5.0软件设计得到的特异性引物对病毒DNA进行PCR扩增，PCR体系和反应程序见表1：
表1 PCR扩增反应体系和反应程序
3.2扩增产物纯化
(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；
(2)加入2倍体积的Buffer NJ，于55-65℃水浴中至凝胶完全融化；
(3)融化后加入与胶等体积的异丙醇，混匀；
(4)将上一步所得溶液加入到GBC吸附柱上(吸附柱容积为800μL)。室温下放置2min后，10,000xg离心60秒。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管；
(5)弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。加入600μL DNA Wash buffer至柱子中。室温下10,000xg离心30-60秒；
(6)重复用600μL DNA Wash buffer洗涤柱。室温下10,000xg离心30-60秒；
(7)弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集管。室温下,13,000xg离心2min以甩干柱子基质残余的液体；
(8)把柱子装在一个干净的1.5mL离心管上，加入15-25μL(具体取决于预期的终产物浓度)Elution Buffer到柱基质上，室温放置1min，12,000xg离心1min以洗脱纯化DNA。
3.3纯化产物的连接
将PCR扩增纯化后的纯化DNA与pMD19-T载体连接，反应体系见表2，得到纯化DNA与pMD19-T载体连接的重组质粒：
表2纯化DNA与pMD19-T载体连接体系及反应程序
3.4感受态细胞转化
将重组质粒导入感受态细胞进行转化，操作流程如下：
(1)将感受态细胞置于冰上解冻，直到细胞溶化；
(2)在10μL/离心管的连接产物中，加入100μL的感受态细胞；
(3)冰上放置30min，每隔7-8min，混匀连接产物，但离心管不离开冰面，动作轻柔；
(4)42℃热激90s离心管外表面；
(5)迅速拿出离心管放到冰上，冰敷2min；
(6)在超净工作台中，将冰敷后的产物加入到900μL不含抗生素的LB液体培养基中。混匀后置于摇床，调节温度37℃，转速200rpm，培养90min；
(7)吸取已转化感受态细胞加到含氨苄的LB琼脂固体培养基上，均匀涂开并涂干；
(8)将LB琼脂固体培养基置于37℃培养箱内，向上正方置1h后倒置LB琼脂固体培养基，37℃过夜培养12-16h，培养基表面长出若干单菌落。
四、阳性克隆的筛选与鉴定
(1)观察LB琼脂固体培养基，选取若干单个、饱满、白色、边缘光滑的单菌落，于背面做好标记；
(2)准备相应个数的15mL离心管，向管中加入3mL带有抗生素的LB液体培养基，做好对应标记；
(3)选取干净的1μL的黄色枪头挑取单菌落至对应的离心管中，反复吸打混匀，菌落标记与离心管标记一一对应；
(4)将离心管置于摇床，37℃，200r/min，培养4-6h；
(5)使用特异型引物与通用型引物分别对同一管菌液进行菌液PCR检测；
(6)每管离心管取2μL菌液，用做菌液PCR反应模板，分别用上述设计的特异性引物和通用引物M13F/R进行PCR扩增，菌液PCR反应体系及程序见表3，得到PCR产物；
表3菌液PCR反应体系及程序
(7)PCR扩增产物用1.2％琼脂凝胶电泳检测，并将菌液PCR检测出含有目的片段的菌液进行测序，由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成，测序结果利用MegAlign软件进行分析比对。
对比例
对比例为实施例中步骤三病毒重组质粒的构建中未进行扩增产物纯化步骤所制得的重组质粒。
实验结果
1、特异性引物的设计
25个HPV病毒亚型的重组标准质粒构建中使用的25组型特异性引物的设计如表4所示，其中RP表示下游引物，FP表示下游引物：
表4：重组质粒标准样品构建的引物
2、PCR扩增结果
实施例以及对比例经过表4设计的引物进行PCR扩增，所有25个HPV亚型所得的PCR扩增电泳图的结果如图2所示。
以HPV6亚型标准质粒的构建结果为例，目的片段经PCR扩增、电泳鉴定后，在紫外下切胶，然后用相关试剂盒进行回收纯化。回收所得的HPV6亚型目的片段与pMD19-T载体连接，随后转化到感受态细胞中，所得菌液进行菌液PCR鉴定，电泳结果如图3所示。
将图3与图2进行对比，图2中的HPV6亚型特异性引物扩增产物大小为594bp；图3中，通用型引物扩增产物比特异性引物扩增产物大150bp左右，符合实验预期。其他亚型的电泳图如图4所示。
3.重组质粒测序鉴定
以HPV6亚型标准质粒的构建结果为例，利用GenBank数据库和MegAlign软件，将测序公司反馈回来的测序结果，与该基因序列进行分析比对，如图5所示，发现HPV6亚型重组质粒中的目的片段与NCBI数据库中的基因序列吻合率为99.4％。本发明构建的标准质粒可作为阳性参考对照，用于检测方法研究。
其他构建好的重组质粒测序比对分析结果如图6所示。
4.重组质粒浓度及拷贝数的换算
使用紫外分光光度计DU730测重组质粒浓度，之后使用换算公式得出重组质粒的拷贝数,拷贝数换算公式如下：
拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(浓度(ng/μL)×10-9)/(DNA length×660)
质粒浓度及拷贝数换算的结果如表5所示：
表5质粒浓度及拷贝数换算
对阳性样本的病毒载量的确定可以通过比对从而鉴别诊断HPV的感染阶段，避免由于不同HPV病毒亚型存在不同病毒载量导致无法通过阳性样本进行对比，进而使HPV感染阶段的确诊更加可靠。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
Step.1针对NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型的基因序列使用NCB1网站上的BLAST功能进行同源性和差异性的生物信息学序列分析，并通过Primer Premier 5.0针对HPV病毒亚型设计特异性引物；
Step.2选取GP5+/6+引物组所在区域为中心，上下各延伸150~300bp作为构建重组质粒标准样品的目标区域，对HPV病毒亚型分别进行病毒DNA的提取，并对应的构建重组质粒；
Step.3使用对应的重组质粒以及对应的特异性引物在10× Buffer、2.5μM dNTPs、25μM MgCl2、10 μM Primer F、10 μM Primer R、SDW、DNA、Taq (5U/μL)的混合体系中进行PCR扩增后，经洗脱得到PCR纯化后的重组质粒；
Step.4将纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接后，将连接后的重组质粒导入感受态细胞中进行转化，将转化后的感受态细胞接种到固体培养基中，培养12~16h，得到若干菌落；
Step.5选取培养基上的单菌落分别置于离心管中并加入液体培养基，混合形成菌液，进行离心、培养后，使用特异型引物与通用型引物分别对同一管离心管内的菌液进行PCR检测。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，根据NCBI数据库筛选的HPV病毒亚型为：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV83。
3.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，选取GP5+/6+引物组所处的区域作为PCR检测的靶基因区域。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，Step.2中病毒DNA的提取方法如下：
（1）选取病毒液和蛋白酶按体积比10:1混匀后，72℃水浴至溶液清亮；
（2）冷却至室温后加入异丙醇混匀；
（3）经吸附柱收集病毒DNA，除去废液后，将吸附柱用洗脱缓冲液EB洗脱病毒DNA；
（4）将病毒DNA存放在-20~4℃下进行保存。
5.根据权利要求4所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液EB在65~70℃水浴中预热至65~70℃。
6.根据权利要求1-3任一项所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，Step.4中纯化后的重组质粒与pMD19-T载体连接的反应体系按PMD19-T SimpleVector：重组质粒：Soiution I：SDW为体积比1:6:10:3混合而成。
7.根据权利要求1-3所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，所述单菌落的边缘光滑且相邻单菌落互不接触。
8.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，Step.5中PCR检测的反应体系按2× Power Taq PCR Master Mix：10 μM Primer F：10 μMPrimer R：SDW：菌液按体积比25:2:2:19:2混合而成。
9.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，Step.5中所述菌液经PCR扩增后的PCR产物用琼脂浓度为1.2%琼脂凝胶电泳检测。
10.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒亚型L1基因的重组质粒构建方法，其特征在于，Step.4中的固定培养基为LB琼脂固体培养基，所述LB琼脂固体培养基中添加有氨苄。
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