CN103468725A - Pten基因过表达重组腺病毒载体的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了PTEN基因过表达重组腺病毒载体，是在腺病毒载体的多克隆位点插入有上述PTEN基因的mRNA。本发明还提供了上述过表达载体的构建方法和用途。本发明构建的PTEN基因过表达重组腺病毒载体可引起PTEN基因的过量表达，既可以促进脂肪酸的氧化代谢，又能有效地增加决定VLDL组装与分泌，进而增强甘油三酯的转运能力，可用于治疗奶牛脂肪肝。

Description

PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建及应用

技术领域

本发明属于动物分子生物学和基因工程领域，涉及一种PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建及应用。 

背景技术

围产期奶牛脂肪肝是因围产期奶牛能量负平衡导致的代谢性疾病，但因没有有效的防治措施给养牛业带来了巨大的损失，寻找一种有效的治疗方法迫在眉睫。鉴于围产期奶牛（特别是荷斯坦品种奶牛）肝脏氧化脂肪酸的能力弱，合成和分泌脂蛋白能力不足是脂肪肝发生的主要环节，建立调控肝脏脂肪酸氧化和VLDL分泌与合成的基因疗法，或许能为围产期奶牛脂肪肝的防治提供新思路。 

磷酸酶张力蛋白同系物（Phosphoatase and tensin homolog，PTEN）是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，通过对细胞内多条信号转导通路的负性调控，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导肿瘤细胞凋亡，对维持细胞的正常生理活动发挥重要作用。PTEN的抑癌功能一直是肿瘤发生发展中的研究热点。然而，近来越来越多的研究发现：PTEN通过其脂质磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依赖于磷酸酶的生物活性，在脂肪肝脏的发生和发展方面发挥着重要的作用。 

最近几年，对PTEN基因及其蛋白的研究已经延伸至其他领域，而不再仅仅局限于肿瘤。肝脏是机体内重要的新陈代谢器官，在正常机体内，PTEN基因及其蛋白有相对较高的表达。PTEN基因及其蛋白的异常表达除了会在肝细胞癌中出现，也在其他肝脏疾病发生的重要调节。 

分子生物学技术，在研究生物学功能和疾病治疗等方面发挥着重要的作用。目前存在腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等基因传递载体系统，每种载体都有它特有的优势和缺点。腺病毒对大多数细胞，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞都具有感染效率，感染效率几乎能达到100%，同时它携带进入宿主细胞内的基因不会不整合到宿主细胞，不干扰宿主细胞基因的表达。但腺病毒也具有自身的缺点，主要是进行重组腺病毒的构建和包装步骤比较繁琐，要求的也比较高，操作起来较其他两种载体系统要复杂的多。而逆转录病毒与腺病毒相比，对细胞的转染效率要差的很多，对大多数细胞种类的的感染效率都比较低，一般都不超过30%，从而影响实验效果，尤其是本实验使用的原代培养的肝细胞转染效果会更差。同时慢病毒的转染效率还依赖细胞的分裂，而本实验的肝细胞是原代的并且没有分裂功能，所以更加不适用。另外逆转录病毒载体 也有自身的缺点，主要是它会将转入的外源性基因整合到宿主细胞的基因组上，引起宿主细胞内的基因突变、甚至有激活癌基因的风险，一旦发生突变可能会对宿主细胞造成极大的破坏和损伤。但从它的构建及包装来说，要比腺病毒操作程序要简单很多，易于操作。第三种载体传递系统慢病毒也是实验研究中常用的一种基因载体传递系统，就转染效率而言，基本介于腺病毒和逆转录病毒载体传递系统之间，感染效率能够达到30%以上。但慢病毒载体传递系统的缺点与逆转录病毒相类似，它也能将转入的外源性基因整合到宿主细胞基因组上，对宿主细胞基因表达具有一定的风险，可能会造成基因突变、癌变等。但慢病毒传递系统的构建和包装步骤不是很繁琐，易于操作。 

腺病毒是一种无包膜双链DNA的动物病毒。基因组大小约为36kb，常用于研究DNA复制、转录和作为基因工程载体。上世纪50年代发现了腺病毒，一共有100余种血清型。能感染多种组织和器官，包括肝脏、尿道和膀胱、呼吸道、胃肠道和眼等。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的，与脂质体转染质粒进入细胞相比，腺病毒基因组进入细胞核的效率要高出很多，一般可以达到40%以上，尤其是进入细胞核的效率是脂质体的1000倍。 

腺病毒载体可广泛的用于哺乳动物的基因表达，在很多组织中都能表达重组蛋白，被广泛的应用于体外基因转导、基因治疗和体内接种疫苗等各个领域。腺病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类型，腺病毒都能够很好转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的优点。同时腺病毒系统具有高效、安全、生产周期短、病毒滴度高、易于浓缩及贮存等优点。因此，可以考虑将PTEN基因的mRNA构建入腺病毒载体，用于目的基因的过表达，研究PTEN基因在奶牛脂肪肝中所起的作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种PTEN基因的mRNA，用于构建过表达重组腺病毒载体。 

本发明的第二个目的是提供PTEN基因过表达重组腺病毒载体，能够使得目的基因过表达。 

本发明的第三个目的是提供上述PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建方法。 

本发明的第四个目的是提供上述PTEN基因过表达重组腺病毒载体的用途。 

本发明通过以下技术方案来实现： 

一、一种PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

二、一种PTEN基因过表达重组腺病毒载体，是在腺病毒载体的多克隆位点插入有上述PTEN基因的mRNA。 

三、上述的PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建方法，该方法包括以下步骤： 

（1）PTEN基因cDNA的获取以及逆转录成mRNA； 

（2）将目的片段PTEN构建入穿梭质粒载体中； 

（3）将目的片段PTEN构建入腺病毒质粒载体中。 

四、上述的PTEN基因过表达重组腺病毒载体在治疗奶牛脂肪肝中的应用。 

采用上述技术方案的积极效果：本发明构建的PTEN基因过表达重组腺病毒载体可引起PTEN基因的过量表达，既可以促进脂肪酸的氧化代谢，又能有效地增加决定VLDL组装与分泌，进而增强甘油三酯的转运能力，可用于治疗奶牛脂肪肝。 

附图说明

图1是PTEN基因PCR结果图 

图中，M:DL2000；1:PTEN； 

图2是重组穿梭质粒pShuttle-GFP-PTEN酶切鉴定结果图； 

图中，M:Marker(1kb DNA ladder)；从上到下是:10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb,3kb,2.5k,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp；1-3：阳性克隆 

图3是重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PTEN酶切鉴定结果图； 

图中，M:Marker(1kb DNA ladder)从上到下是:10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb,3kb,2.5k,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp；1-3.阳性克隆； 

图4是转染pAdxsi-GFP-PTEN48h后PTEN mRNA相对表达量荧光定量PCR结果。 

具体实施方式

下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制： 

本发明中的生物材料来源： 

1、pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛生物有限公司，pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体、pAdxsi载体购自诺赛基因组研究中心有限公司； 

2、引物为自行设计并委托上海生工合成。 

实施例1 

根据Genbank公布的PTEN基因mRNA序列，设计并合成荧光定量PCR引物，送上海生工合成。引物具体序列为：F：AAGCTTATGAGAGACGGCGGCGG（SEQ ID NO.2）；R:GGATCCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC（SEQ ID NO.3）。 

采用肝穿刺的方法采取少量奶牛肝脏组织，快速放入液氮中，用于总RAN的提取。使用TRIZOL法提取肝脏组织总RNA，反转录成cDNA,-80℃保存备用。 

以cDNA作为模板，进行PCR扩增目的基因。反应体系为10×PCR Buffer2.5μL，dNTP Mixture2.0μL，模板cDNA2.0μL，上游引物（10μM/μL）1.0μL，下游引物（10μM/μL）1.0μL，TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，dd H₂O16.25μL，总体积25.0μL。 

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。 

取3μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统观察拍照。 

按照胶回收试剂盒说明书操作，具体过程此处略。将回收的DNA贮存-20℃备用。目的基因的链接转化、质粒提取及测序按常规方法进行。构建成功后，送上海生物工程有限公司测序鉴定。对PTEN基因质粒进行了PCR鉴定，鉴定结果见图1。 

实施例2 

本实施例说明重组穿梭载体的构建。 

用内切酶EcoRV/SalI酶切(CIP去磷酸化处理)pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体，1%凝胶电泳后切胶分别回收约5.1Kb载体目的基因片段，因为紫外线照射过久可能会损伤DNA，所以本步骤不存电泳图。具体酶切体系及反应条件见表1。 

表1穿梭质粒酶切体系及反应条件 

将携带PTEN表达全序列的原始质粒用EcoRV/XhoI进行双酶切，经1%凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒（柱离心型）（具体步骤参照试剂盒使用说明，此处略）回收和纯化等步骤，回收得到约1.2kb的PTEN mRNA表达全序列片段。为避免紫外照射时间过久损伤DNA，本步骤不存有电泳图）酶切体系及反应条件见表2。 

表2KpnI/BamHI和EcoRV/XhoI酶切体系及反应条件 

将过表达载体构建使用的酶切及纯化后的载体片段和原始基因插入片段用T4DNA连接酶进行连接，连接体系及反应条件见表3。3～4h后，取连接产物3μL进行感受态DH5α菌株转化，此步骤按照常规方法操作，具体步骤略。然后涂于固体培养基（卡那抗性）上，37℃培养10～12h后，挑取若干单克隆菌落，接种于LB液态培养基内，37℃300rpm摇床过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒小提质粒（此步具体步骤按试剂盒说明操作，此处略）。 

表3T4DNA连接酶连接体系及反应条件 

实施例3 

本实施例用于说明重组穿梭质粒的酶切鉴定。 

使用BamHI（过表达重组穿梭质粒）内切酶对重组穿梭质粒进行酶切鉴定，预计可获得结果为：过表达重组穿梭质粒阴性克隆为5.1kb一条带；正向插入克隆为1.2kb/5.1Kb两条带。酶切鉴定体系及反应条件见表4，酶切后，1%的琼脂糖凝胶电泳照相，结果如图2所示。 

表4BamHI酶切重组穿梭质粒酶切鉴定体系及反应条件 

实施例4 

本实施例用于说明重组腺病毒载体的构建。 

用I-CeuI和I-SceI对pAdxsi载体进行双酶切和CIP去磷酸化，酶切体系及反应条件见表5，酶切结束后，向体系中加入加入10%SDS，75℃灭活10min。 

表5I-CeuI和I-SceI双酶切pAdxsi载体酶切体系及反应条件 

用乙醇沉淀法进行酶切后的载体回收，具体方法为：用去离子水将酶切体系补足150uL，再分别加入酚和氯仿各75uL，充分混匀，12000rpm离心5min；离心后吸取上清，加入浓度为3M，PH值为5.2的NaOAc30uL，再加入750uL的无水乙醇，-20℃沉淀15min后进行4℃离心15min。弃上清，加入500ul70％乙醇，4℃再离心5min，弃上清。再用乙醇洗脱一遍后，室温状态下晾干3-5min，加入适量的去离子水溶解。 

用I-CeuI和I-SceI内切酶对pShuttle-GFP-PTEN（过表达）进行双酶切，酶切体系及反应条件见表6。电泳后回收纯化含目的基因的片段（具体步骤按胶回收与纯化试剂盒使用说明操作，此处略），因避免紫外线照射过久发生DNA损伤，此步骤不照相留图。 

表6I-CeuI和I-SceI酶切体系及反应条件 

将酶切后的片段和载体片段用T4DNA连接酶进行连接，转化到感受态DH5α，方法同实施例2，然后涂于固体培养基（氨苄抗性）上，37℃培养10～12h后，挑取若干单克隆菌落，接种于LB液态培养基内，37℃300rpm摇床过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒小提质粒。 

实施例5 

本实施例用于说明重组腺病毒载体的酶切鉴定。 

使用XhoI限制性内切酶对重组腺病毒载体质粒进行酶切，酶切鉴定的反应条件见表7。根据重组腺病毒载体序列分析来看，携带目的基因表达框被XhoI酶切后预计获得 的片段为：过表达腺病毒质粒：阳性克隆：14Kb、11.8Kb、6.4Kb、2.47Kb、1.45Kb和0.6Kb；阴性克隆：14kb、11.8kb、4.0kb、2.47kb、1.45kb和0.6kb。结果如图3所示。 

表7XhoI限制性内切酶酶切重组腺病毒载体质粒鉴定反应条件 

实施例6 

本实施例用于说明重组腺病毒的生产与纯化。 

取2ml对数生长期的菌液2ml接种于100mL LB培养基中，加入100ug/ml滤菌后的Amp液，置于37℃摇床进行培养，摇床设置为300rpm震荡过夜，用大提质粒试剂盒进行质粒提取，具体操作方法参照试剂盒（此处略）。 

用PacI限制性内切酶酶切携带目的基因阳性腺病毒质粒，反应体系见表8。 

表8PacI限制性内切酶酶切反应体系 

取重组腺病毒载体质粒pAdxsi-GFP-PTEN5ug，细胞平铺培养板80-90%面积时为转染时间。转染操作方法按说明书操作，此处略。 

转染6h后换新鲜细胞培养液,并观察细胞出毒迹象。出毒时，细胞变大变圆，呈葡 萄状，有明显噬斑。当大部分细胞出现病变后，细胞会自行脱落，即可收毒，收完后放入-80℃冰箱保存。 

将收集好的病毒，在干冰酒精及37℃水浴反复冻融三次后，3000转离心5min，收集上清液，即可获得pAdxsi-GFP-PTEN第一代毒种（P1）。取2mlP1代病毒感染一个75cm的细胞培养瓶的细胞，进行病毒扩增。2d后收集细胞和培养液的混合物，2000转离心5min,在弃上清后的沉淀物内加1mlST buffer（培养液+10%血清+2.5%甘油），-80℃保存待用。上清可用于继续扩增。 

（1）在6个细胞培养瓶中接种293细胞细胞4×10⁶，过夜培养后，细胞铺满瓶底至90%左右。将P2代病毒分别均匀的接种于6个培养瓶内，分别于培养24h和48h后，显微镜下观察细胞变化情况。 

（2）收取细胞，2000rpm离心5min，用ST buffer、votex混匀细胞离心沉淀物。反复冻融三次，再离心5min，此次留用上清液，再次将上清液接种于40个新培养的细胞瓶中，进行扩大培养。 

（3）3000rpm离心混悬液，取细胞沉淀，再用腺病毒保存液重悬进行悬浮混匀，再经反复冻融后获得的腺病毒保存于-80℃冰箱用于下一步实验。 

采用经典方法对上述实验获得的病毒液TCID50值进行测定，具体的操作方法如下： 

（1）将生长良好，密度为为80-90％的293细胞消化收取，并计数细胞数量。 

（2）用5％FBS的DMEM培养液重悬细胞，制备浓度要达到浓度为1×10⁵/ml，每细胞培养板需加入11ml。 

（3）取2个96孔板，每孔加入100μl细胞重悬液。 

（4）感染样品的制备： 

1、第一组稀释的具体方法为：当细胞重悬液浓度比较高时，从10⁶开始，倍比稀释8个梯度；而当重悬液浓度比较低时，将从10⁴开始进行稀释，也倍比稀释8个梯度； 

2、再进行第二组稀释，操作时要尽量小心，避免因为疏忽混淆两组稀释液样品。 

（5）按如下方法接种培养板：取96孔板，将11和12列做为阴性对照，在每个培养孔中各加入5％FBS的DMEM100μL。再将配好的8个梯度的稀释液依次加入A-H排，并仔细做好标记，以免混淆。放入37℃CO₂培养箱中培养。 

第二块板的操作同上。 

具体的加液方式见表9： 

表9培养板结构图 

注：样品稀释梯度可随具体情况调整 

（6）将上述设置好的96孔细胞培养板放在37℃CO₂培养箱中培养，于培养后第3d到第10d之间显微镜下观察细胞生长状态，第10d将获得的结果进行分析。 

（7）结果的计算方法： 

①在培养后的10d，有三种判定标准，一是在12个孔内至少有一个样品稀释液CPE是明显的；二是至少有一个样品稀释液出现明显的CPE孔数大于3个小于9个,孔内有明显的CPE；三是至少有一个样品稀释液在12个孔内都是明显无CPE。 

②病毒活性计算公式如下： 

对于100μl样品，滴度T＝10^{1+d（s-0.5）}

d＝log₁₀稀释度＝1（对于10倍的稀释度而言） 

s＝阳性比率之和（从第一个10倍稀释度算起） 

将TCID50/ml转换成PFU/ml：T＝a×10^bTCID50/ml＝a×10^b-0.7PFU/ml； 

本检测做一次重复试验，两次重复实验得到的滴度值应相差≤10^0.7。 

试验例1 

在采用本实验张才博士改良的胶原酶两步灌流法分离犊牛肝细胞的基础上，通过低速离心和添加红细胞裂解液来减少红细胞数量，提高肝细胞纯度。细胞计数后，六孔培养板每孔接种2mL细胞悬浮液，使最终接种密度为1×10⁵个/cm²。4h后将贴壁培养基置换成无血清无双抗培养基。倒置显微镜观察细胞生长状况。 

将分离培养48h后，换成无血清无双抗的培养液，将细胞分成三组：（1）空白对照组（Control组）：只加入PBS缓冲液；（2）阴性对照组（AD-GFP组）：按照最佳 MOI值转染阴性对照腺病毒；（3）过表达组（AD-GFP-PTEN组）：按照最佳MOI值转染携带Adxsi-GFP-PTEN过表达载体的腺病毒。每组设3个重复。继续放入培养箱培养，于48h后分别提取各孔细胞的总RNA，RNA反转录后，-80℃保存备用。 

荧光定量PCR结果显示，如图4，转染Adxsi-GFP-PTEN48h后，PTEN mRNA表达量明显增加，为空白对照组的4.5倍，与空对照及阴性对照相比差异极显著（p<0.01），空对照组与阴性对照组差异不显著(p>0.05)。证实携带Adxsi-GFP-PTEN过表达载体腺病毒构建成功。 

VLDL测定液的收集：在转染后24h和48h分别收取上清，-20℃保存待检。测定时，将两者混合后，计算出的浓度值乘以2，即为48h培养液中VLDL的终浓度。TG含量测定：转染48h后，将收完上清的细胞用PBS冲洗两遍，用细胞刮刮下，再用PBS液清洗两遍，用200μlPBS液混悬后，超声波仪冰浴破碎，用全自动生化分析仪按试剂盒说明进行操作，获得数据进行统计分析。 

经过对细胞内TG含量和培养上清中VLDL浓度进行检测后（结果见表10），可以看出，当PTEN mRNA和蛋白表达增加后，过表达组细胞内TG含量明显降低，而培养上清中的VLDL含量显著增加，差异极显著（p<0.01），因此可以减少脂肪在肝细胞中的聚集，为治疗奶牛脂肪肝提供一种新思路。 

表10转染48h后细胞内TG浓度、培养液中VLDL含量测定结果 

a、b字母不同表示存在差异显著性（p<0.05），相同表示无差异(p>0.05)。 

Claims (4)

1.一种PTEN基因的mRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种PTEN基因过表达重组腺病毒载体，是在腺病毒载体的多克隆位点插入有权利要求1所述的PTEN基因的mRNA。

3.权利要求2所述的PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）PTEN基因cDNA的获取以及逆转录成mRNA；

（2）将目的片段PTEN构建入穿梭质粒载体中；

（3）将目的片段PTEN构建入腺病毒质粒载体中。

4.权利要求2所述的PTEN基因过表达重组腺病毒载体在治疗奶牛脂肪肝中的应用。

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