CN110613842B

CN110613842B - 一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗及其制备方法

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Publication number: CN110613842B
Application number: CN201910976696.4A
Authority: CN
Inventors: 郭东华; 孙东波; 李春秋; 原东伟; 蒋剑成; 贺显晶; 张思瑶; 王志慧; 吕思文; 高晶; 姚爽; 肖佳薇; 汪锋锋; 王丽娜
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110613842A

Abstract

本发明涉及一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗，包含牛坏死杆菌一种外膜蛋白43kDa OMP、坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL‑4及坏死杆菌溶血素截短蛋白H2三种蛋白，三种蛋白的用量比为1：1：1。本发明还涉及上述牛坏死杆菌的亚单位疫苗的制备方法。本发明的牛坏死杆菌的亚单位疫苗包含牛坏死杆菌一种外膜蛋白43kDa OMP、坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL‑4及坏死杆菌溶血素截短蛋白H2三种蛋白，联合应用，免疫后产生的特异性抗体水平高，可很好的激起小鼠的细胞免疫及体液免疫，有效保护小鼠抵抗坏死杆菌的攻击，免疫保护效果较好，保护效果与全菌灭活疫苗相当。

Description

一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)又称为犊白喉杆菌，坏死棒状杆菌及坏死放线菌，为革兰氏阴性的严格厌氧细菌，具有多形性特性，形状多为杆状，但不具有荚膜和芽孢，没有运动性。菌宽约0.5μm，长约100μm，少数300μm，在一些培养物中还可见到较一般形态粗两倍的杆状菌体，在病变组织和肉汤中以丝状较多。坏死杆菌广泛分布在自然界，它即是人和动物口腔、呼吸道、胃肠道内寄生的正常菌群，也是各种化脓性和坏死性疾病的原发性或继发性病原，一种人畜共患病病原，主要引起动物的肝脓肿、腐蹄病、猪皮肤溃疡、坏死性喉炎以及人的Lemierre's综合症等疾病。在坏死杆菌引起的疾病中，以奶牛腐蹄病和牛肝脓肿最为常见。腐蹄病特点是发病率高、死亡率低，最大的危害是导致感染动物生产性能下降乃至淘汰。牛腐蹄病是Adams等人在1960年首次发现的，它可以引起反刍动物蹄部组织化脓等症状，具有较强的传染性。目前在我国该病的发病率约为5％-55％，对奶牛养殖业的影响巨大。

坏死杆菌为严格厌氧菌，它的培养条件严苛，培养坏死杆菌的最适温度为37℃-38℃，最适宜的pH值为7.0。但在无氧的固体培养基中培养形成菌落后，再放在有氧条件下继续培养的时侯，已经长大的菌落仍然可以继续增大。普通培养基中加入血清、葡萄糖、肝或脑组织块等营养物质后，可以促进坏死杆菌的生长，但是在葡萄糖肉汤中培养细菌时，要加入硫基乙酸钠用于降低培养基氧化还原电势。在液体培养基中坏死杆菌常呈现细丝状，平滑、絮状、颗粒状漂浮或沉淀，培养的细菌菌液呈现均匀的混浊，伴有恶臭味。坏死杆菌在血平板上培养48h后，可形成中间凸起，边缘不整齐的半透明的菌落，有β溶血现象，有时也可见α溶血环。

目前研究认为，坏死杆菌侵入宿主细胞后，主要通过其毒力因子完成对动物的感染以及介导机体损伤。坏死杆菌主要致病因子包括：白细胞毒素、溶血素、内毒素脂多糖、血凝素、黏附素、血小板凝集因子、皮肤坏死毒素和一些胞外酶。其中白细胞毒素(lktA)和溶血素(Hly)被公认为是坏死杆菌引起奶牛腐蹄病和肝脓肿的两个主要毒力因子。在不同致病菌株中高度保守，所以是牛坏死杆菌疫苗研究的两个重要靶蛋白。近十年来，国内外研究者在白细胞毒素和溶血素作为亚单位疫苗候选抗原和诊断方面做了大量研究。尽管，白细胞毒素和溶血素作为疫苗抗原在一定程度上能抵制坏死杆菌的感染，但是免疫保护效果与临床应用仍然有很大的差距。这些研究提示我们，牛坏死杆菌与其他病原菌类似，感染宿主是一个复杂的过程，仅仅依靠白细胞毒素和溶血素等毒力因子，探索牛坏死杆菌病的致病机理和防治方案还远远不够，有必要对牛坏死杆菌毒力因子以外的其他相关蛋白进行拓展研究。

细菌对宿主靶细胞的黏附作用，是细菌建立感染以及进一步引起机体损伤的关键步骤，所以一直是细菌致病机理和抗菌药物设计研究的热点问题。尽管，已证明牛坏死杆菌同属的其他厌氧梭菌成员和一些革兰氏阴性菌成员的外膜蛋白能黏附宿主靶细胞，在病原菌感染中发挥重要作用。但是，牛坏死杆菌黏附宿主的相关蛋白尚未得到揭示。由此可见，牛坏死杆菌黏附宿主细胞相关蛋白的探索研究，是十分必要的！这一科学问题研究，能为更好的理解牛坏死杆菌感染机制，为牛坏死杆菌的抗菌药物设计研究提供新的理论基础。

目前，国内外预防牛、羊腐蹄病的发生主要是依靠传统灭活疫苗的免疫，实践也证明灭活疫苗对腐蹄病的防治发挥了重要作用。但是，不可回避的是灭活疫苗存在着细菌大量培养困难、免疫效果差和天然毒素引起严重的副反应等缺点，为该疫苗广泛的应用带来了困难。因此，研制能够替代传统灭活疫苗，同时具有抗原制备方便、免疫效果好、毒性作用小和廉价的腐蹄病新型基因工程重组亚单位疫苗是十分必要的，这将为反刍动物腐蹄病的免疫预防提供新的途径。

革兰氏阴性菌外膜的主要结构是外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMP)，其功能主要是维持结构，物质运输，黏附和介导机体保护性免疫等，外膜蛋白还可以作为多种噬菌体的受体，与受体的充分结合是大肠埃希氏菌素的内传所必不可少的。OMP基于它的免疫活性和免疫保护性已是当前研究热点之一，也是研制致病菌疫苗或药物的潜在靶点。外膜蛋白是革兰氏阴性细菌特有的结构，存在于细菌胞浆膜和肽聚糖层的外侧，包围整个原生质体。其厚度约为8-10nm，占细胞壁干重的80％左右。OMP是典型非对称性的磷脂双层结构，由脂质双层、微孔蛋白、脂蛋白和脂多糖组成。OMP的数量及种类因菌株不同及培养条件而不同。Wu等(2005年)报道了革兰氏阴性菌外膜蛋白的结构，为临床应用奠定了理论基础。革兰氏阴性菌的外膜具有分子筛作用，起主要作用的是微孔蛋白(porin)，其常以非共价键与脂多糖(LPS)、肽聚糖紧密的相连。OMP为细菌本身固有物质，正如细菌的荚膜、鞭毛、菌毛等在宿主细胞体内具有多种生物功能一样，OMP在机体生命活动中也起到十分重要的作用。外膜蛋白在介导免疫反应中起重要作用，参与免疫保护作用，减少细菌感染以及增加宿主的免疫球蛋白G(IgG)Fc的结合活性。随着分子生物学和基因检测技术的发展，通过基因工程大量获得OMP成为现实。人工合成的OMP在激活免疫细胞方面与天然OMP具有相同的免疫效果。因此外膜蛋白拥有设计疫苗，预防疾病，诊断和治疗疾病的巨大潜力，成为设计疫苗重要的一个毒力因子。

白细胞毒素(leukotoxin)是一种细胞外分泌性蛋白，是坏死杆菌最主要的毒力因子，它能够抑制中性粒细胞和枯否(氏)细胞的吞噬作用。它对牛、羊瘤胃上皮细胞、中性粒细胞、巨嗜细胞、肝细胞等具有很强的毒性作用，并且对牛、羊等反刍动以及人的中性粒细胞的细胞毒性具有特异性。白细胞毒素对猪和兔的中性粒细胞不具有毒性作用，而对马的中性粒细胞毒性作用也较强。白细胞毒素可以刺激巨噬细胞活化，使其释放促炎细胞因子如白介素-1(IL-1)肿瘤坏死因子(TNF)等。Narayanan等(2001)在2001年成功扩增得到坏死杆菌全长的白细胞毒素基因，并且将坏死杆菌的白细胞毒素lktA基因截短为5段，通过原核表达技术得到了5个重组白细胞毒素截短蛋白，分别命名为BSBSE、SX、GAS、SH、FINAL，通过Western blot检测分析，五个重组蛋白均具有良好的反应原性。应用所获的重组白细胞毒素截短蛋白免疫小鼠，结果显示这五个截短的重组蛋白均对小鼠有保护作用。另外，有研究表明，给奶牛接种用含有白细胞毒素的坏死杆菌培养液上清，可以有效的降低奶牛的腐蹄病发病率。

溶血素(hemolysin)也是坏死杆菌的主要毒力因子之一，基因全长为4107bp，由1368个氨基酸组成，它的分子量为150kDa，为坏死杆菌的一种分泌蛋白。它的毒力作用主要表现为能够使红细胞溶解。溶血素通过溶解红细胞，破坏机体红细胞的携氧能力，在其感染部位营造出无氧环境，有利于坏死杆菌的繁殖生长。有研究发现，含有溶血素的坏死杆菌菌液上清，涂布于血平板上，可以出现溶血现象。苗立光等人研究表明，天然的坏死杆菌溶血素免疫家兔，具有免疫保护作用。

综上所述，坏死杆菌亚单位疫苗的研究是很有必要的。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗，以提高动物对牛坏死杆菌的抵抗力。

本发明的第二目的是提供上述牛坏死杆菌的亚单位疫苗的制备方法。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗，包含牛坏死杆菌一种外膜蛋白43kDa OMP、坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4及坏死杆菌溶血素截短蛋白H2三种蛋白，三种蛋白的用量比为1：1：1。

进一步的，所述的外膜蛋白43kDa OMP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，坏死杆菌溶血素截短蛋白H2的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，编码外膜蛋白43kDa OMP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码坏死杆菌溶血素截短蛋白H2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

二、一种根据上述的牛坏死杆菌的亚单位疫苗的制备方法，该方法包含以下步骤：

(1)43kDa OMP、PL-4、H2基因片段的获得；

(2)构建重组载体pET-32a-43kDa OMP、pGEX-6p-1-PL-4及pET-32a-H2；

(3)转化感受态细胞BL21，即得工程菌pET-32a-43kDa OMP-BL21、pGEX-6p-1-PL-4-BL21及pET-32a-H2-BL21；

(4)重组大肠杆菌诱导表达获得目的蛋白；

(5)三种蛋白等比例混合后按常规操作制备疫苗。

进一步的，重组大肠杆菌诱导表达获得目的蛋白的具体方法为：

(1)取重组大肠杆菌，接种到添加有终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、280r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，诱导条件为16℃，160r/min过夜培养；

(2)离心，收集菌体，超声破碎裂解，收集上清及沉淀，分离纯化即得。

具体的，步骤(1)中，IPTG的终浓度为0.5mmol/L；诱导表达的温度为16℃；诱导表达的时间为12小时。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的牛坏死杆菌的亚单位疫苗包含牛坏死杆菌一种外膜蛋白43kDa OMP、坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4及坏死杆菌溶血素截短蛋白H2三种蛋白，联合应用，免疫后产生的特异性抗体水平高，可很好的激起小鼠的细胞免疫及体液免疫，有效保护小鼠抵抗坏死杆菌的攻击，免疫保护效果较好，保护效果与全菌灭活疫苗相当。

附图说明

图1是pET-32a空载体SDS-PAGE结果，其中M为高分子量蛋白marker(购自碧云天生物技术有限公司)；1是pET-32a超声破碎沉淀；2：pET-32a超声破碎上清；

图2是pGEX-6p-1空载体SDS-PAGE结果，其中M为高分子量蛋白marker；1为pGEX-6p-1超声破碎沉淀；2为pGEX-6p-1超声破碎上清；

图3是纯化pET-32a-43kDa OMP重组蛋白SDS-PAGE结果，其中M为高分子量蛋白marker；1为纯化pET-32a-43kDa OMP重组蛋白；

图4是纯化pGEX-6p-1-PL-4重组蛋白SDS-PAGE结果，其中M为高分子量蛋白marker；2-4为纯化pGEX-6p-1-PL-4重组蛋白；

图5是纯化pET-32a-H2重组蛋白SDS-PAGE鉴定，其中M为高分子量蛋白marker；3-5为纯化pET-32a-H2重组蛋白；

图6是小鼠血清抗体效价；

图7是小鼠IL-4含量检测，其中图7为小鼠IL-4含量检测；图8为小鼠IL-2含量检测；图9为小鼠IL-10含量检测；图10为小鼠IL-1β含量检测；图11小鼠INF-γ含量检测；图12小鼠TNF-α含量检测；

图8是小鼠IL-2含量检测；

图9是小鼠IL-10含量检测；

图10是小鼠IL-1β含量检测；

图11是小鼠INF-γ含量检测；

图12是小鼠TNF-α含量检测；

图13是小鼠肝脏细菌载量；

图14是小鼠肝脏病理切片(H.E.40×)，其中A为43kDa OMP+PL-4+H2组；B为坏死杆菌灭活组；C为PBS对照组；

图15是小鼠肝脏病理切片(H.E.400×)，其中A为43kDa OMP+PL-4+H2组；B为坏死杆菌灭活组；C为PBS对照组。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、坏死杆菌A25菌株购自美国ATCC公司(菌种编号：ATCC 25286)。

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明43kDa OMP、PL-4及H2基因的克隆及表达载体的构建。

按照GenBank上已发表的坏死杆菌43kDa OMP、白细胞毒素lktA及溶血素hly基因序列，利用Primer5.0软件，设计特异性引物进行PCR扩增，设计的特异性引物均由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。引物序列如下：

表1坏死梭杆菌特异性扩增引物

利用天跟细菌基因组DNA提取试剂盒提取坏死杆菌的基因组。已所提取基因组为模板，按常规方法进行PCR扩增。扩增体系及反应条件如下：

表2 PCR反应体系及反应条件

续表2 PCR反应体系及反应条件

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒对电泳后的PCR片段进行胶回收纯化，按照Omega胶回收试剂盒说明书进行操作，将纯化后的PCR片段进行测序。

纯化后的43kDa OMP及H2基因片段和pET-32a载体，PL-4基因片段和pGEX-6p-1载体分别进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，酶切产物利用胶回收试剂盒进行纯化回收，然后将纯化后的溶血素基因截短片段和pET-32a、pGEX-6p-1载体进行连接，连接体系如下所示：3μL纯化PCR产物、1μL pET-32a载体(pGEX-6p-1载体)、13μL ddH₂O、2μL连接Buffer、1μL T4 DNA连接酶轻轻混匀后瞬间离心，最后放于16℃连接12h以上；连接后的产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，然后各取200μL转化后的菌液涂于含有100μg/mL Amp⁺的LB平板上，放于37℃培养箱中过夜培养16h左右；培养后进行菌落PCR鉴定，即随机性的从各LB平板上挑取1个单菌落接种于50μLSOB液体培养基中，混匀，作为PCR样品模板备用，PCR扩增体系与反应条件如表2所示。然后取3μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳方法分析。将菌落PCR鉴定后为阳性的菌液各50μL接种于5mL含有100μg/mL Amp⁺的LB液体培养基中，在37℃中摇菌12h，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，提取的质粒送至哈尔滨博仕生物技术有限公司进行核苷酸序列的测序分析，测序结果与GenBank发表的牛坏死梭杆菌A25菌株溶血素基因核苷酸序列进行比对和分析。鉴定正确的重组质粒，转化感受态BL21，即得工程菌pET-32a-43kDaOMP-BL21、pGEX-6p-1-PL-4-BL21及pET-32a-H2-BL21。

实施例2

本实施例说明重组大肠杆菌的诱导表达。

将pGEX-6p-1-PL-4-BL21、pET-32a-H2-BL21、pET-32a-43kDa OMP-BL21阳性菌及pET-32a、pGEX-6p-1空载体以1:1 000的比例分别接种于LB(Amp⁺)液体培养基中，37℃恒温摇床220r/min培养。当细菌OD₆₀₀的值达到0.4-0.6时，菌液中加入IPTG进行诱导表达，IPTG终浓度为0.5mmol/L，诱导条件为16℃，160r/min过夜培养。收集诱导后的菌液，离心并超声破碎，具体如下：

细菌沉淀收集，将各诱导后的菌液放入高速离心机中8 000r/min离心10min，弃上清收集沉淀物，用灭菌的PBS缓冲液吹洗沉淀3次，每次5 000r/min离心10min，最后将各诱导后的细菌沉淀分别用PBS溶液悬起备用。

菌体超声破碎，将处理好的细菌沉淀分别放于冰水混合物上进行超声波破碎处理，细菌悬液呈透明澄清为佳。将超声后诱导菌液12 000r/min离心30min，收集上清及沉淀，取部分进行SDS-PAGE分析，剩余超声后的菌液沉淀用PBS缓冲液溶解后于-20℃保存，上清直接放-20℃保存。

实施例3

本实施例说明重组蛋白的纯化。

1、pET-32a-43kDa OMP重组蛋白纯化

将柱温和翻转使Ni-NTA Agarose重悬，同时反复轻敲。向纯化柱中加入树脂，树脂因重力作用完全下沉，吸出上清，再加入灭菌蒸馏水，再次反复翻转并敲打纯化柱，让树脂重悬。树脂因重力作用完全下沉，吸出上清。加入Denaturing binding buffer，上下轻柔的翻转柱子，使树脂重悬，再通过重力作用让树脂自然下沉，吸出上清，重复2-3次，使蛋白纯化在变性条件下进行。将细菌裂解产物Ni-NTA柱中，室温下使用磁力搅拌器轻柔的搅拌，使裂解物与树脂充分作用20-30min。再次自然沉淀树脂，并小心吸出上清，加入Wash buffer用于洗柱，上下轻微翻转晃动使树脂重悬，作用约2min后自然沉降树脂，并小心吸出上清，重复洗涤2-3次，以彻底洗去未吸附的蛋白。接着垂直固定好吸附柱，打开其底部的开口加入Elution buffer洗脱蛋白，收集洗脱下来的蛋白。将洗脱获得的蛋白加入含有Dialysisbuffer的透析袋中，透析过夜，以除去尿素。

2、pET-32a-H2重组蛋白纯化

将柱温和翻转使Ni-NTA Agarose重悬，同时反复轻敲。向纯化柱中加入树脂，树脂因重力作用完全下沉，吸出上清，再加入灭菌蒸馏水，再次反复翻转并敲打纯化柱，让树脂重悬。树脂因重力作用完全下沉，吸出上清。将细菌裂解产物加入到处理好的纯化柱中，室温下使用磁力搅拌器轻柔的搅拌20-30min，保持树脂在裂解缓冲液中处于悬浮状态，有利于充分结合，再利用重力作用使树脂自然沉降，吸出上清。纯化柱中加入配置好的Washbuffer，用于洗去未吸附的蛋白。洗脱：再用Elution buffer洗脱蛋白，收集目的蛋白。

3、pGEX-6p-1-PL-4重组蛋白纯化

细胞裂解物与谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，轻微搅拌晃动约1h，使蛋白能够充分吸附。以2 000r/min的转速离心10min，弃去上清，加入Wash buffer，轻微搅拌晃动，使沉淀悬浮于溶液中，2 000r/min离心10min，弃去上清。重复洗涤5次，除去未结合的蛋白。最后一次洗涤离心弃上清后，加入Elution buffer进行洗脱，轻摇约10min，2 000r/min离心10min，收集上清。重复洗脱2-3次，收集上清。

将上述纯化后的重组蛋白，取少许用于SDS-PAGE电泳分析，其余放入-20℃冰箱保存，如需长时间保存，应放入-80℃冰箱保存。

实施例4

本实施例说明重组蛋白SDS-PAGE鉴定。

样品制备：将已获得蛋白样品以5:1的体积比与6×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合均匀，在沸水浴中煮沸10-15min，瞬时离心将管壁上的液体离心下来，放置备用。

SDS-PAGE凝胶的配置：选择1mm的玻璃板固定在配胶架上，加满去离子水放置约15min，来验证配胶板是否漏液。验漏完成后，小心弃去板内的水，用滤纸小心吸干水分。12％分离胶配置：吸取去离子水1.6mL、30％(29:1)丙烯酰胺2mL、1.5mol/LTris(pH8.8)1.3mL、过硫酸铵50μL以及10％SDS 50μL，混合均匀，最后加入2μL TEMED混合均匀后用注射器沿着长玻璃板壁加入到配胶板内，再用去离子水封顶压平。放置约30min后，待胶凝固后，小心弃去水封层的水，用滤纸吸干多余的水分。5％浓缩胶配置：吸取去离子水1.4mL、30％(29:1)丙烯酰胺330μL、1mol/L Tris(pH6.8)250μL、过硫酸铵20μL以及10％SDS 20μL，混合均匀，最后加入2μL TEMED混合均匀加入到分离胶上层直至加满，并插入样品梳。放置30-40min后，待胶凝固。

加样及电泳：将凝固好的胶板安装在电泳槽中，电泳槽中加入1×电泳液，电泳液至少需要没过玻璃板短板。小心取下加样孔的样品梳，在加样孔中按顺序依次加入蛋白Marker和处理好的蛋白样品。蛋白样品每孔加10μL，蛋白Marker 3μL。加完样品后连接电泳仪，设置电泳电压为60V，当蛋白质Marker的所有条带都进入分离胶并且条带已经分开后，可以将电泳电压调至100V，直至蛋白条带达到胶板最低端停止电泳。

考马斯亮蓝染色：取下跑完的蛋白胶，切除浓缩胶，将分离胶放入适宜的容器中，倒入考马斯亮蓝R-250染色液染色20-30min。染色完成后，染色液倒入回收容器中，染色液可反复使用2-3次。

脱色：分离胶用去离子水冲洗，洗去分离胶表面多余的染色液，放入容器中，加入脱色液进行脱色。脱色直至到出现清晰的条带为止，用去离子水清洗分离胶终止脱色，中途可跟换2-3次脱色液。脱色完成后用凝胶成像系统照胶观察。结果如图1-5所示。

实施例5

本实施例说明重组蛋白43kDa OMP、PL-4及H2的体内保护效果。

一、细菌培养

将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养24-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜。将菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养。传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。

二、细菌灭活

将中性甲醛加入到培养好的坏死杆菌菌液中，使甲醛终浓度达到0.2％，在厌氧培养箱中37℃继续灭活24h，将灭活后的菌液以1:100接种于苛氧厌氧培养基中，厌氧条件下培养24h，看是否有细菌生长。如细菌未生长则灭活成功，保存备用。

三、免疫小鼠

1、小鼠分组

本试验选用体重约20g/只的雌性BALA/c小鼠为实验动物，分为3个实验组，分别为43kDa OMP+PL-4+H2组、灭活坏死杆菌组及PBS对照组，每组10只小鼠。

2、小鼠免疫

小鼠采用背部皮下多点注射的方式的免疫，每次免疫注射量为0.25mL/只。初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，第二次、第三次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化。每次免疫间隔两周。小鼠免疫蛋白量如表3所示。其中重组蛋白原始浓度为：43kDa OMP：5.26mg/mL；PL-4：0.945mg/mL；H2：0.647mg/mL。

表3小鼠免疫剂量

四、血清收集

小鼠采取断尾采血的方式采集血清，第一次、第二次免疫后两周小鼠断采血，第三次免疫后一周采血。每次将收集的全血先在37℃培养箱中放置2小时，在转移到4℃冰箱中放置过夜，析出血清。第二天取出全血，离心机3 000r/min离心10-15min，小心吸取上清。再次将上清3 000r/min离心10-15min，为了去除更多的红细胞。最后吸取上清，放入-20℃冰箱中保存备用。

五、小鼠攻菌

培养坏死杆菌A25菌株，将菌液5 000-6 000r/min离心25min，收集细菌沉淀，并用无菌生理盐水洗菌体沉淀2-3次，最后用生理盐水重悬菌体，使细菌终浓度约为1×10⁷CFU/mL。将处理好的坏死杆菌注入小鼠体内，注射方式为小鼠腹腔，注射剂量为0.25mL/只。小鼠攻菌后观察记录小鼠死亡情况，攻菌后7天采集未死亡小鼠血液并处死。攻菌后小鼠采血方式为摘眼球采血。死亡小鼠需在灭菌的超净工作台中无菌解剖。结果如表5：

表5小鼠攻菌保护试验结果

六、肝脏细菌载量

将无菌采集的小鼠肝脏取一小块称量后放入组织研磨器中，加入3mL生理盐水研磨组织呈组织匀浆液，并用生理盐水分别以1:10、1:100、1:1 000及1:10 000的比例稀释组织匀浆液。将稀释后的组织匀浆液取20μL涂布于厌氧固体培养基中，厌氧培养24h。记录菌落数在30-200个之间的平板中的单菌落数，按比例求出小鼠肝脏细菌载量。

七、ELISA检测小鼠抗体效价

所需试剂配制：包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)：1.59g Na2CO3+2.93g NaHCO3+1L蒸馏水；洗涤液(0.05％PBS-T)：500μL Tween-20+1L PBS；封闭液(5％脱脂乳)：5g脱脂乳+100mL PBS-T；终止液(2mol/L H₂SO₄)：10mL 98％浓H₂SO₄+90mL蒸馏水。

应用包被液将抗原蛋白稀释为1μg/mL，并将灭活坏死杆菌用包被液稀释，分别将稀释好的底物加入ELISA板中，每孔加100μL，用封板膜封好放入4℃冰箱包被过夜。

包被过夜后，将孔中剩余液体弃去，每孔加入300μL洗涤液，震荡洗涤5min后弃去洗涤液。重复洗涤5次，最后一次拍干孔中液体。每孔加入200μL封闭液封板放入37℃培养箱中孵育2h。

封闭后，弃去多余的封闭液，用洗涤液洗板5次，拍干板中多余液体。将小鼠血清用PBS倍比稀释后加入酶标板中，每孔中加入100μL稀释后的一抗，封板膜封好板37℃孵育1h，弃去板中液体洗板5次拍干孔中液体。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的酶标二抗，酶标二抗运用PBS以1:5 000的比例稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h。

二抗孵育后，弃去液体，洗板5次后拍干孔中液体，每孔加入TMB单组份显色液100μL，在避光处室温孵育10-15min，最后加入100μL终止液，在酶标仪上读取450nm的吸光度值。由图6可知蛋白免疫小鼠后，试验组能够产生较高的针对坏死杆菌的抗体水平。其中三免后，43kDa OMP+PL-4+H2组为1:120 000，PBS对照组的效价在一免、二免、三免均低于1:400。

八、小鼠细胞因子检测

本试验应用商品ELISA试剂盒检测试验小鼠血清中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的含量。方法如下：

洗涤液的配制：将浓缩洗涤液液用蒸馏水30倍稀释，制成洗涤液备用。

取EP空管五支，分别加入标准样品稀释液150μL，然后在第一支EP试管中用加入150μL标准样品，吹吸8-10次，吹吸时要避免产生气泡，然后吸取150μL加入第二支试管中，以此类推倍比稀释到第五个EP试管，标准品稀释后备用。

A1、A2孔留空作为对照孔(对照孔不加样品和酶标试剂，其余相同)。A3-A12每两孔为一组，分别加入50μL稀释后的标准样品。除去A排外，每孔中加入49μL样品稀释液和1μL待检血清，吹吸混合均匀。将ELISA试剂板用封板膜封板，置于37℃恒温培养箱中孵育30min。

一抗孵育后去除封板膜，倒除废液(注意不要让液体相互污染)，拍干。将每孔加满洗涤液，利用旋窝振荡器震荡30s，弃去洗液，重复五次，拍干板。

将酶标试剂加入ELISA板中，每孔中加入50μL，A1、A2作为对照组不加，将ELISA板用封膜封板，置于恒温培养箱中，37℃，30min。

去除封板膜，倒除废液(注意不要让液体相互污染)，拍干。将每孔加满洗涤液，利用旋窝振荡器震荡30s，弃去洗液，重复五次，拍干试剂板。

向拍干的酶标板中每孔加入50μL显色液A及50μL显色液B，利用旋窝振荡器震荡30秒，使A、B显色液混合均匀，避光显色10-15min。

显色后每孔加入50μL的终止液，此时每孔变黄，停止反应。

以A1、A2孔调零，作为标准孔。反应终止后15分钟内，用酶标仪检测450nm波长时吸光度值。

本试验中六个细胞因子的标准品稀释浓度如表4所示。

表4标准品稀释浓度

由图7-图12可以看出，小鼠免疫后，试验组IL-4、IL-2、IL-1β、IL-10、IFN-γ的含量在一免、二免、三免都呈上升趋势。在小鼠第三次免疫后，43kDa OMP+PL-4+H2组细胞因子含量达到较高值。结果表明，43kDa OMP、PL-4及H2蛋白联合免疫小鼠后，能够较好的刺激小鼠机体，激发机体的免疫反应。

九、小鼠肝脏病理组织学观察

1、石蜡切片的制备

首先将采集的小鼠肝脏放入4％的甲醛溶液中浸泡备用，浸泡透组织后，取1cm×1cm×0.5cm大小的组织块，放入包埋盒中做好标记。取材完成后，需用流动水冲洗，以去除甲醛。

冲洗后控干水，放入组织脱水机器中进行组织脱水浸蜡。流程如下：70％C₂H₅OH50min；80％C₂H₅OH 50min；90％C₂H₅OH 50min；95％C₂H₅OH 50min；100％C₂H₅OHⅠ35min；100％C₂H₅OHⅡ35min；混合脱水液(100％C₂H₅OH:二甲苯＝1:1)30min，二甲苯Ⅰ30min；二甲苯Ⅱ20min；蜡Ⅰ(熔点52-54℃)1h；蜡Ⅱ(熔点54-56℃)1h；蜡Ⅲ(熔点58-60℃)1h。

将脱水浸蜡后的的组织用融化的熔点58-60℃蜡包裹，冷却后在包埋盒里形成固定大小的蜡块，此过程称为包埋。

包埋后的蜡块用组织切片机进行切片，切片厚度为4-5μm，切好的组织需要进行两步展开，首先运用30％C₂H₅OH进行组织的第一次展开，再将其放入42-45℃水中进行第二次展开。两次展片是为了让组织充分展开，没有重叠。将展好的组织用载玻片捞起，使其平整的贴于载玻片上，做好标记。将捞出的片进行烤片，使组织更牢固的贴在载玻片上。

2、H.E染色

将制备好的小鼠肝脏病理组织切片，首先进行脱蜡浸水，除去组织中的蜡，使水进入组织。脱蜡进水的流程如下：二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ2min；100％C2H5OHⅠ 2min；100％C2H5OHⅡ2min；90％C2H5OH 2min；80％C2H5OH 2min；70％C2H5OH 2min。

脱蜡进水后的组织切片水洗5min，控干水后进行H.E染色。首先将切片放入苏木素染色液中染色2-5min，再次水洗5min。然后将切片放入酸化液(1％盐酸-酒精，1mL浓盐酸+99mL 75％C₂H₅OH)中2-4s后迅速取出水洗5min，使用酸化液是为了脱去组织中多余的苏木素染色液，所以时间不可过长，容易脱去已染细胞核的苏木素颜色。接着将切片浸入伊红染色液中染色8-10min，取出水洗5min，控干水。

染完色的组织切片进行脱水透明，脱去组织中的水平，使组织透明便于镜下观察。脱水透明过程如下：70％C₂H₅OH 5s；80％C₂H₅OH 5s；90％C₂H₅OH 5s；100％C₂H₅OH 8s；二甲苯4-5min。

切片脱水透明后进行封片，将中性树胶滴于载玻片上，盖上盖玻片，排出气泡，晾干后显微镜下观察。

由表5及图13-图15可以看出，对各组进行攻菌试验后，其中PBS对照组在攻菌后7天内出现小鼠死亡，死亡两只，而坏死杆菌灭活疫苗组和43kDa OMP+PL-4+H2组在七天内没有死亡，保护率达到80％。剖杀小鼠后，检测小鼠肝脏细菌载量，结果如图13所示，攻菌后PBS对照组的细菌载量最高，达到5.91×10⁸CFU/g，与其他试验组差异显著。43kDa OMP+PL-4+H2为3.2×10⁶CFU/g，坏死杆菌灭活疫苗组为1.41×10⁶CFU/g。采集小鼠的肝脏，制作石蜡切片，通过H.E(苏木素-伊红)染色，显微镜观察小鼠肝脏病理变化。H.E染色镜检结果如图14与图15，PBS组小鼠肝脏可见严重的充血、出血现象，细胞颗粒变性明显，43kDa OMP+PL-4+H2组肝脏细胞出现颗粒变性。PBS组与试验组相比，肝脏病变严重。

结果说明，本发明43kDa OMP、PL-4及H2蛋白联合免疫能够有效保护小鼠抵抗坏死杆菌的攻击，免疫保护效果较好，保护效果与全菌灭活疫苗相当。

综上，本发明采用基因工程的方式成功的构建了基因工程菌，并表达得到了重组蛋白43kDa OMP、PL-4及H2。重组蛋白免疫后产生的特异性抗体水平高，可很好的激起小鼠的细胞免疫及体液免疫。可以显著保护小鼠抵抗坏死杆菌的攻击，说明重组蛋白43kDaOMP、PL-4及H2是坏死杆菌的保护性抗原，可以制备成为疫苗，临床应用前景良好。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗及其制备方法

<130> B013

<141> 2019-10-15

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> PRT

<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

<400> 1

Met Lys Lys Leu Ala Phe Val Leu Gly Ser Leu Leu Val Ile Gly Ser

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Lys Glu Val Met Pro Ala Pro Met Pro Glu Pro Glu

20 25 30

Val Lys Ile Val Glu Lys Pro Val Glu Val Ile Val Tyr Arg Asp Arg

35 40 45

Val Val Gln Ala Pro Ala Lys Trp Lys Pro Asn Gly Ser Val Gly Val

50 55 60

Glu Leu Arg Thr Gln Gly Lys Val Glu Asn Lys Gly Lys Lys Ala Thr

65 70 75 80

Glu Glu Asn Ala Arg Lys Gly Trp Ala Gly Lys Glu Pro Asn Val Arg

85 90 95

Leu Glu Thr Lys Ala Ser Val Asn Phe Thr Glu Asn Gln Asn Leu Glu

100 105 110

Val Arg Thr Arg Gln Thr His Val Leu Thr Lys Thr Asp Ser Asp Lys

115 120 125

Glu Glu Ser Asn His Lys Asp Thr Gln Val Arg Ile Arg His Thr Tyr

130 135 140

Asn Phe Gly Lys Leu Gly Ser Ser Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Ser

145 150 155 160

Gln Tyr Leu His Asp Asp His Val Asp Ser Leu Arg Thr Arg Ala Val

165 170 175

Phe Asp Phe Ala Asp Tyr Ile Tyr Ser Asn Ser Leu Phe Lys Thr Thr

180 185 190

Ala Leu Glu Ile Gly Pro Ser Tyr Lys Tyr Val Trp Gly Gly Asn Asp

195 200 205

Asp Arg Tyr Tyr Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Ala Glu Phe Glu

210 215 220

Leu Pro Tyr Gly Phe Gly Phe Gln Ala Glu Phe Glu Asp Ala Phe Thr

225 230 235 240

Tyr Thr Ser Thr Gly Lys Gly Asp Gly Lys Arg Asp Lys Ala Lys Leu

245 250 255

Gly His Ala Asp Phe Val Leu Ser His Ser Leu Asp Leu Tyr Lys Glu

260 265 270

Gly Lys His Ser Leu Ala Phe Leu Asn Glu Leu Glu Tyr Glu Thr Phe

275 280 285

Trp Ala Trp Asp Lys Lys Asp Ala Ser Met Glu Glu Trp Pro His Val

290 295 300

Asp Gly His Gly Arg Val Asn Ser Glu Gly Lys Asn Lys Lys Trp Gly

305 310 315 320

Ala Tyr Glu Leu Thr Tyr Thr Pro Lys Leu Gln Tyr Asn Tyr Gln Ala

325 330 335

Thr Glu Phe Val Lys Leu Tyr Ala Ala Ile Gly Gly Glu Tyr Val Asn

340 345 350

Arg Glu Asn Asn Lys Ser Thr Ala Arg Tyr Trp Arg Trp Asn Pro Thr

355 360 365

Ala Trp Ala Gly Met Lys Val Thr Phe

370 375

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

<400> 2

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Glu Glu Thr Asp Asp Tyr Ile Thr Thr Gln Gly Gln Val Asp Lys Val

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Val Asp Lys Val Phe Lys Asn Leu Asn Ile Asn Glu Asp Leu Ser Gln

65 70 75 80

Lys Arg Lys Ile Ser Asn Lys Lys Gly Phe Val Thr Asn Ser Ser Ala

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Thr His Thr Leu Lys Ser Leu Leu Ala Asn Ala Ala Gly Ser Gly Gln

100 105 110

Ala Gly Val Ala Gly Thr Val Asn Ile Asn Lys Val Tyr Gly Glu Thr

115 120 125

Glu Ala Leu Val Glu Asn Ser Ile Leu Asn Ala Lys His Tyr Ser Val

130 135 140

Lys Ser Gly Asp Tyr Thr Asn Ser Ile Gly Val Val Gly Ser Val Gly

145 150 155 160

Val Gly Gly Asn Val Gly Val Gly Ala Ser Ser Asp Thr Asn Ile Ile

165 170 175

Lys Arg Asn Thr Lys Thr Arg Val Gly Lys Thr Thr Met Ser Asp Glu

180 185 190

Gly Phe Gly Glu Glu Ala Glu Ile Thr Ala Asp Ser Lys Gln Gly Ile

195 200 205

Ser Ser Phe Gly Val Gly Val Ala Ala Ala Gly Val Gly Ala Gly Val

210 215 220

Ala Gly Thr Val Ser Val Asn Gln Phe Ala Gly Lys Thr Glu Val Asp

225 230 235 240

Val Glu Glu Ala Lys Ile Leu Val Lys Lys Ala Glu Ile Thr Ala Lys

245 250 255

Arg Tyr Ser Ser Val Ala Ile Gly Asn Ala Ala Val Gly Val Ala Ala

260 265 270

Lys Gly Ala Gly Ile Gly Ala Ala Val Ala Val Thr Lys Asp Glu Ser

275 280 285

Asn Thr Arg Ala Arg Val Lys Asn Ser Lys Ile Met Thr Arg Asn Lys

290 295 300

Leu Asp Val Ile Ala Glu Asn Glu Ile Lys Ser Gly Thr Gly Ile Gly

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Ser Ala Gly Ala Gly Ile Leu Ala Ala

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<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

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<210> 4

<211> 1134

<212> DNA

<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

<400> 4

atgaaaaaat tagcatttgt attaggttct ttattagtca tcggttctgc cgcttctgct 60

aaagaagtga tgcctgctcc tatgcctgaa cctgaagtta aaatcgttga aaaacctgtc 120

gaagttatcg tttatcgtga ccgtgtcgtt caagcgcctg ctaaatggaa acctaatggg 180

tctgttggtg ttgaattaag aactcaagga aaagttgaaa acaaaggtaa aaaagctact 240

gaagaaaatg caagaaaagg ttgggctgga aaagaaccta atgttagatt ggaaacaaaa 300

gcttctgtaa acttcactga aaatcaaaat ttggaagtaa gaacaagaca aactcatgtt 360

cttactaaaa cagattctga taaggaagaa tcaaatcata aagatacaca agtaagaatt 420

cgacatactt ataactttgg aaaattaggt tcttctaaag ttggatttaa ggtagcatct 480

caatatttac atgatgatca tgttgattct ttaagaacaa gagcagtgtt tgattttgct 540

gattatattt atagcaatag cttattcaaa acaactgcat tagaaattgg tccttcatat 600

aaatatgtat ggggaggaaa tgatgacaga tattataatg ctcttggact ttatgcaaat 660

gcagaattcg aattgccata tggatttggt ttccaagcag aatttgaaga tgcctttact 720

tatacttcta ctggtaaggg agatggaaaa agagataaag ctaaactagg acatgcagat 780

tttgttttat ctcatagctt agatttatat aaagaaggaa aacattcttt ggctttctta 840

aatgaattag aatatgaaac tttctgggct tgggataaaa aagatgctag tatggaagaa 900

tggccacatg ttgatggaca tggaagagtt aatagtgaag gaaaaaataa aaaatgggga 960

gcatatgaac ttacttatac tccaaaactt caatataact accaagctac tgaattcgta 1020

aaattgtatg cagctattgg aggagaatac gtaaatagag aaaataataa atcaactgca 1080

cgttactgga gatggaatcc aacagcatgg gctggtatga aagttacttt ctaa 1134

<210> 5

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<212> DNA

<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

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<213> 坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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Claims

1.一种牛坏死杆菌的亚单位疫苗，其特征在于：包含牛坏死杆菌外膜蛋白43 kDa OMP、坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4及坏死杆菌溶血素截短蛋白H2三种蛋白，三种蛋白的质量比为1：1：1；所述的外膜蛋白43 kDa OMP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，坏死杆菌溶血素截短蛋白H2的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的牛坏死杆菌的亚单位疫苗，其特征在于：编码外膜蛋白43 kDaOMP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码坏死杆菌白细胞毒素截短蛋白PL-4的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码坏死杆菌溶血素截短蛋白H2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.一种根据权利要求1所述的牛坏死杆菌的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：该方法包含以下步骤：

（1）43 kDa OMP、PL-4、H2基因片段的获得；

（2）构建重组载体pET-32a-43 kDa OMP、pGEX-6p-1-PL-4及pET-32a-H2；

（3）转化感受态细胞BL21，即得工程菌pET-32a-43 kDa OMP-BL21、pGEX-6p-1-PL-4-BL21及pET-32a-H2-BL21；

（4）重组大肠杆菌诱导表达获得目的蛋白；

（5）三种蛋白等比例混合后按常规操作制备疫苗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：重组大肠杆菌诱导表达获得目的蛋白的具体方法为：

（1）取重组大肠杆菌，接种到添加有终浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、280 r/min摇床培养，至OD₆₀₀值达到0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，诱导条件为16℃，160 r/min过夜培养；

（2）离心，收集菌体，超声破碎裂解，收集上清及沉淀，分离纯化即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，IPTG的终浓度为0.5 mmol/L；诱导表达的温度为16℃；诱导表达的时间为12小时。