CN111154904A - 坏死杆菌白细胞毒素基因pcr诊断试剂盒及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL 2000，30μL的引物lktA‑F，30μL的引物lktA‑R，引物lktA‑F和引物lktA‑R的浓度为10μM，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照；通过对PCR反应条件优化，研制出了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，通过PCR检测结果与阳性对照和阴性对照比较，证明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒可以准确快速检测到样品中是否含有坏死杆菌白细胞毒素，并且使用本试剂盒检测具有操作简单，反应灵敏，结果准确的特点。
Description
技术领域
本发明涉一种诊断试剂盒，具体涉及坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法。
背景技术
腐蹄病(Footrot)是由坏死杆菌所导致的能够严重影响动物生产的疾病，作为奶牛三大疾病之一，腐蹄病在我国发病率较高，患该病严重的牛场发病率可达30％-40％，是高度接触性传染病。引发奶牛腐蹄病的因素有很多，当奶牛精饲料比例过高、粗纤维摄入量不足时，导致反刍功能下降，进而引起奶牛瘤胃pH值降低和瘤胃生理机能紊乱，引发瘤胃内的微生物产生过多的内毒素，致使奶牛抵抗力下降；奶牛蹄部在粪污中被泡软时，易导致牛蹄被尖锐物体刺入，以至于在伤口深部产生厌氧环境，厌氧菌在此大量繁殖，菌体产生的毒素会危害机体，导致奶牛腐蹄病。患病奶牛蹄部出现红肿糜烂、软组织增生、脓液流出、组织坏死，并且散发恶臭，严重者出现蹄壳脱落的现象，从而造成体温升高、喜卧、精神沉郁、食欲降低等全身症状，以及支跛、四肢交替负重、疼痛跛行等局部症状，这些症状会致使奶牛生产性能下降，患病严重奶牛会被提前淘汰，造成重大的经济损失。
坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)是革兰氏阴性、专性厌氧多形态杆菌，坏死杆菌包含两个亚种，Fnn和Fnf，Fnn感染家畜为主，而Fnf感染人为主，二者都具有非常强的致病性，均广泛存在于自然界中，在动物口腔、胃肠道等均可分离得到，坏死杆菌属于条件性致病菌，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。坏死杆菌生长条件苛刻，需在培养基中添加血液、葡萄糖、肝块或者脑块等营养物质；坏死杆菌常引起皮肤、皮下组织坏死性病变，如腐蹄病、坏死性皮炎、坏死性口炎等；动物机体处于健康状态下，坏死杆菌无法侵入，只有当组织出现蹄部浸软、外伤和微生物感染的前提下，才能在蹄部组织深部大量繁殖；多数情况下坏死杆菌会和节瘤拟杆菌混合侵入奶牛蹄部，此种情况下病情更加严重；坏死杆菌能产生多种毒力因子，白细胞毒素(Leukotoxin)、溶血素、溶胶原蛋白、血凝素、内毒素、血小板凝集素、血小板凝集素；这些毒力因子可以逃避宿主天然免疫屏障，为菌体入侵机体创造条件；其中白细胞毒素是坏死杆菌的主要毒力因子，是细胞外泌的蛋白质；白细胞毒素能对牛羊等反刍兽的白细胞和马的多形核细胞产生毒害作用，而对兔、猪的白细胞没有毒害作用；白细胞毒素对中性粒细胞具有吞噬作用，其释放的产物会对肝细胞造成一定的损伤，能够直接降低肝细胞的防御作用，造成肝实质损伤，从而导致肝脓肿。白细胞毒素可以作为免疫原，在坏死杆菌培养物的上清液中可大量获得，给牛注射培养物的上清液可大大降低牛患腐蹄病概率。
现阶段关于坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒；进行PCR检测后，仍需做进一步的革兰氏染色鉴定，由于感染动物的坏死杆菌白细胞毒素lktA基因十分保守，且坏死杆菌白细胞毒素lktA基因序列具有特异性和很高的同源性；目前坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌白细胞毒素毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明旨在提供坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，通过对PCR反应条件进行优化，研制出了检测坏死杆菌白细胞毒素基因PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照和阳性对照比较，证明其可以起到快速检测到是否有坏死杆菌白细胞毒素基因的作用，而且具有检测结果准确，具有操作快捷、灵敏，检测方式简单，特异性强，使用效果好的特点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：
lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC 3'；
lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC 3'。
进一步的，所述的试剂盒还包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL 2000，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的浓度为10μM。
进一步的，所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照为坏死杆菌A25菌基因组DNA。
坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法包括以下步骤：
步骤一：培养坏死杆菌A25菌
将A25菌加入苛氧厌氧液体培养基中进行培养备用；
步骤二：细菌革兰氏染色鉴定
对步骤一培养的每代细菌需要进行细菌革兰氏染色鉴定，将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定，使用革兰氏染液染色；
步骤三：提取细菌基因组
选取5mL步骤一培养的活力在最好状态的坏死杆菌A25的菌液，进行离心、洗涤后，运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组；
步骤四：设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物
依据已经提交于GenBank上的坏死杆菌A25菌株白细胞毒素的核苷酸序列在NCBI上进行设计，利用Primer-BLAST方法设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA的引物，将所选的引物进行合成，设计出上游引物lktA-F和下游引物lktA-R；
步骤五：PCR方法的建立
设计出坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物后，经过实验，设计最佳反应温度，以步骤三提取的坏死杆菌A25菌株的基因组为模板，用lktA引物对基因组进行PCR扩增；
步骤六：利用阴性对照及阳性对照的结果证明，用引物均可以扩增出其目的条带，目的条带片段大小为1700bp，无非特异性片段产生，结果表明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR检测方法建立成功。
进一步的，步骤一所述的培养坏死杆菌A25菌的具体步骤为：
S1.将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜；
S2.将所述乳白色均一浑浊的菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养；
S3.传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。
进一步的，步骤二所述的细菌革兰氏染色鉴定的具体步骤包括：
S1.将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定；
S2.首先将Ⅰ号结晶紫染色液加在已被固定的细菌载玻片上，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；
S3.然后在细菌载玻片上再滴加Ⅱ号革兰氏碘液，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；
S4.随后滴加Ⅲ号95％酒精液到细菌载玻片上，夏季脱色30s，冬季脱色1min；
S5.最后使用Ⅳ号沙黄染色液对细菌载玻片染色1min，用滤纸吸干载玻片上水分，在显微镜下观察，观察时使用显微镜油镜观察革兰氏染色的坏死杆菌A25菌株。
进一步的，步骤五所述的PCR方法建立过程中，PCR体系为25μL，最佳反应条件为，退火温度57℃，引物浓度为10μM，其中各原料组分为：2×premix预混酶12.5μL，上游引物lktA-F 0.5μL，下游引物lktA-R 0.5μL，提取的坏死杆菌A25菌株的模板DNA 3.0μL，去离子水8.5μL。
进一步的，步骤五所述的PCR方法建立过程中，lktA引物的反应条件为：
首先92℃预变性5.0min；
然后94℃变性1.0min；
57℃退火1.0min；
72℃延申1.5min；
循环30次；
最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。
进一步的，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法还包括对PCR诊断试剂盒的敏感性试验，所述敏感性试验的具体步骤为：在PCR反应中，将坏死杆菌A25菌株基因组样本进行连续的倍比稀释，从100稀释至10-9后，再进行PCR反应，坏死杆菌A25菌株基因组原始浓度为0.2μg/μL；坏死杆菌白细胞毒素基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，在DNA倍比稀释为10-5时，均有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；当倍比稀释至10-6后，无目的条带产生；表明坏死杆菌白细胞毒素lktA基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，证明PCR诊断试剂盒具有高的敏感性。
进一步的，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法还包括对PCR诊断试剂盒的特异性试验，所述特异性试验的具体步骤为：在相同的PCR反应体系和PCR反应条件下，利用lktA引物对坏死杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的基因组进行PCR反应，结果表明坏死杆菌DNA扩增后有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；而大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的扩增后均无目的条带出现，结果为阴性；表明坏死杆菌白细胞毒素lktA引物具有特异性，证明PCR诊断试剂盒具有的特异性。
本发明的有益效果是：本发明公开了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照和阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测到是否有坏死杆菌白细胞毒素基因的目的，利用本发明研制的PCR诊断试剂盒检测结果准确，并且具有快捷、灵敏、检测方式简单、使用效果好的特点。
附图说明
图1为本发明坏死杆菌A25菌株革兰氏染色镜检结果图。
图2为本发明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR试验图。
图3为本发明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR敏感性试验图。
图4为本发明PCR特异性试验图。
图5为本发明临床样品检测试验图。
其中：在图2中，M代表DL2 000 DNA Marker，1代表坏死杆菌A25菌株lktA基因PCR扩增产物，2代表阴性对照；
在图3中，M代表DL2 000 DNA Marker，1代表阴性对照，2-7代表倍比稀释样品进行PCR扩增产物；
在图4中，M代表DL2 000 DNA Marker，1代表阳性对照，2代表阴性对照，3代表金黄色葡萄球菌PCR扩增产物，4代表链球菌PCR扩增产物，5代表大肠杆菌PCR扩增产物；
在图5中，M代表DL2 000 DNA Marker；1代表阳性对照；2代表阴性对照；3-8代表病料PCR鉴定结果。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
参照附图1-5所示的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法包括以下步骤：
步骤一：培养坏死杆菌A25菌，将A25菌加入苛氧厌氧液体培养基中进行培养，传代培养，使细菌活力达到最好状态备用，其具体包括的步骤为：S1.将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜；S2.将所述乳白色均一浑浊的菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养；S3.传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。
步骤二：细菌革兰氏染色鉴定，对步骤一培养的每代细菌需要进行细菌革兰氏染色鉴定，将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定，使用革兰氏染液染色，其具体包括的步骤为：S1.将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定；S2.首先将Ⅰ号结晶紫染色液加在已被固定的细菌载玻片上，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；S3.然后在细菌载玻片上再滴加Ⅱ号革兰氏碘液，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；S4.随后滴加Ⅲ号95％酒精液到细菌载玻片上，夏季脱色30s，冬季脱色1min；S5.最后使用Ⅳ号沙黄染色液对细菌载玻片染色1min，用滤纸吸干载玻片上水分，在显微镜下观察，观察时使用显微镜油镜观察革兰氏染色的坏死杆菌A25菌株，观察结果如图1所示(在图1中，显示为革兰氏阴性菌，镜下菌体呈长丝状)。
步骤三：提取细菌基因组，选取5mL步骤一培养的活力在最好状态的坏死杆菌A25菌液，12000rpm离心1min，弃去上清，加入PBS吹吸均匀，并12000rpm离心1min，重复3次，然后运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组；
运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组的具体步骤如下：使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签；
1.将PBS洗涤的细菌12000rpm离心1min，收集菌体沉淀；
2.向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；
3.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀；
4.加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；(注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验；如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯)
5.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；
9.重复操作步骤8；
10.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；(注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验)
11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL ddH2O，室温放置2-5min，12000rpm离心2min；将溶液收集到离心管中(注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响；ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解；为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm离心2min；)。
步骤四：设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA引物，依据已经提交于GenBank上的坏死杆菌A25菌株白细胞毒素(lktA)的核苷酸序列(AF312861)在NCBI上进行设计，利用Primer-BLAST方法设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA的引物，将所选的引物交由北京擎科生物技术有限公司合成，设计出特异性引物上游引物lktA-F和特异性引物下游引物lktA-R。所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R如表1所示：
表1 lktA特异性引物
步骤五：PCR方法的建立，设计出坏死杆菌白细胞毒素基因lktA引物后，经过数次实验，设计出最佳反应温度，以步骤三提取的坏死杆菌A25菌株的基因组为模板，用lktA引物对基因组进行PCR扩增，在扩增过程中，加入阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去离子水(ddH20)；阳性对照为坏死杆菌A25菌株基因组DNA；扩增时，所述PCR体系为25μL，最佳反应条件为，退火温度57℃，引物浓度为10μM，其反应体系如表2所示：
表2 PCR反应体系
进行PCR扩增时，所述lktA引物反应条件为：首先92℃预变性5.0min；然后94℃变性1.0min；57℃退火1.0min；72℃延申1.5min；循环30次；最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。
步骤六：以坏死杆菌白细胞毒素lktA为引物，对所提坏死杆菌DNA进行PCR扩增，PBS为阴性对照，扩增产物置于1％琼脂糖凝胶中电泳分析，结果如图2所示，在1700bp有目的条带产生，其大小于预期结果相符，且无非特异性片段产生，结果表明坏死杆菌白细胞毒素lktA基因PCR检测方法建立成功。
通过上述步骤一—步骤六，建立了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，该试剂盒包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL 2000，30μL的上游引物lktA-F，30μL的下游引物lktA-R，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的浓度为10μM。
其中，所述的上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：
lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC 3'；
lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC 3'；
所述的阴性对照为去离子水，所述的阳性对照为坏死杆菌A25菌基因组DNA；
所述的2×premix预混酶：选用2×TaqMasterMix(E005)，购自近岸蛋白质科技有限公司。
步骤七：对坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒进行敏感性试验，在PCR反应中，将坏死杆菌A25菌株基因组样本进行连续的倍比稀释，从100稀释至10-9后，再进行PCR反应，坏死杆菌A25菌株基因组原始浓度为0.2μg/μL；坏死杆菌白细胞毒素基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，实验结果如图3所示，在DNA倍比稀释为10-5时，均有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；当倍比稀释至10-6后，无目的条带产生；结果表明坏死杆菌白细胞毒素lktA基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，证明PCR诊断试剂盒具有高的敏感性。
步骤八，对坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒特异性试验，在相同的PCR反应体系和PCR反应条件下，利用lktA引物对坏死杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的基因组进行PCR反应；结果如图4所示，坏死杆菌DNA扩增后有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；而大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的扩增后均无目的条带出现，结果为阴性；结果表明，坏死杆菌白细胞毒素lktA引物具有特异性，证明PCR诊断试剂盒具有的特异性。
实施例1：临床病料的采集处理及鉴定：
步骤一：取患病奶牛蹄部病料，清理患肢病变部位，用已消毒的剪刀和镊子剪下新病变部位，立刻放入真空无菌杯运送至实验室；
步骤二：在玻璃匀浆器中加入PBS分别对20份病料组织进行研磨处理，使用组织基因组DNA提取试剂盒对研磨出的产物进行离心、振荡、裂解、洗脱等一系列操作，得到20份病料的基因组DNA；
步骤三：对20份病料基因组DNA进行PCR扩增(反应体系，条件如上所述)，扩增后的产物进行琼脂糖核酸凝胶电泳；
步骤四：应用建立的PCR方法，检测了临床病料样品的DNA，结果如临床样品检测试验图5所示；
步骤五：将鉴定为阳性的病料进行PCR扩增(反应体系，条件如上所述)，扩增出的产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下、纯化，将纯化后的产物送至擎科生物科技有限公司进行测序；
步骤六：检测到病料基因组由1700bp组成，与已经发表的白细胞毒素基因核苷酸同源性96.20％。
通过实施例1的实验结果，进一步证明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒通过PCR检测结果与阴性对照和阳性对照比较，便可得到检测结论，在实际中，能够对临床中坏死杆菌基因进行快捷、灵敏、准确的检测，而且检测方式简单，使用效果好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：
lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC 3'；
lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC 3'。
2.根据权利要求1所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL2000，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的浓度为10μM。
3.根据权利要求2所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照为坏死杆菌A25菌基因组DNA。
4.根据权利要求2所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法包括以下步骤：
步骤一：培养坏死杆菌A25菌
将A25菌加入苛氧厌氧液体培养基中进行培养备用；
步骤二：细菌革兰氏染色鉴定
对步骤一培养的每代细菌需要进行细菌革兰氏染色鉴定，将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定，使用革兰氏染液染色；
步骤三：提取细菌基因组
选取5mL步骤一培养的活力在最好状态的坏死杆菌A25的菌液，进行离心、洗涤后，运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组；
步骤四：设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物
依据已经提交于GenBank上的坏死杆菌A25菌株白细胞毒素的核苷酸序列在NCBI上进行设计，利用Primer-BLAST方法设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA的引物，将所选的引物进行合成，设计出上游引物lktA-F和下游引物lktA-R；
步骤五：PCR方法的建立
设计出坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物后，经过实验，设计最佳反应温度，以步骤三提取的坏死杆菌A25菌株的基因组为模板，用lktA引物对基因组进行PCR扩增；
步骤六：利用阴性对照及阳性对照的结果证明，用引物均可以扩增出其目的条带，目的条带片段大小为1700bp，无非特异性片段产生，结果表明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR检测方法建立成功。
5.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，步骤一所述的培养坏死杆菌A25菌的具体步骤为：
S1.将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜；
S2.将所述乳白色均一浑浊的菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养；
S3.传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。
6.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，步骤二所述的细菌革兰氏染色鉴定的具体步骤包括：
S1.将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定；
S2.首先将Ⅰ号结晶紫染色液加在已被固定的细菌载玻片上，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；
S3.然后在细菌载玻片上再滴加Ⅱ号革兰氏碘液，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；
S4.随后滴加Ⅲ号95％酒精液到细菌载玻片上，夏季脱色30s，冬季脱色1min；
S5.最后使用Ⅳ号沙黄染色液对细菌载玻片染色1min，用滤纸吸干载玻片上水分，在显微镜下观察，观察时使用显微镜油镜观察革兰氏染色的坏死杆菌A25菌株。
7.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，步骤五所述的PCR方法建立过程中，PCR体系为25μL，最佳反应条件为，退火温度57℃，引物浓度为10μM，其中各原料组分为：2×premix预混酶12.5μL，上游引物lktA-F0.5μL，下游引物lktA-R 0.5μL，提取的坏死杆菌A25菌株的模板DNA 3.0μL，去离子水8.5μL。
8.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，步骤五所述的PCR方法建立过程中，lktA引物的反应条件为：
首先92℃预变性5.0min；
然后94℃变性1.0min；
57℃退火1.0min；
72℃延申1.5min；
循环30次；
最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。
9.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法还包括对PCR诊断试剂盒的敏感性试验，所述敏感性试验的具体步骤为：在PCR反应中，将坏死杆菌A25菌株基因组样本进行连续的倍比稀释，从100稀释至10-9后，再进行PCR反应，坏死杆菌A25菌株基因组原始浓度为0.2μg/μL；坏死杆菌白细胞毒素基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，在DNA倍比稀释为10-5时，均有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；当倍比稀释至10-6后，无目的条带产生；表明坏死杆菌白细胞毒素lktA基因的最低检测量为10-5稀释倍比，即2.073pg/μL，证明PCR诊断试剂盒具有高的敏感性。
10.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法还包括对PCR诊断试剂盒的特异性试验，所述特异性试验的具体步骤为：在相同的PCR反应体系和PCR反应条件下，利用lktA引物对坏死杆菌、大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的基因组进行PCR反应，结果表明坏死杆菌DNA扩增后有目的条带产生，大小为1700bp，与目的条带相符；而大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的扩增后均无目的条带出现，结果为阴性；表明坏死杆菌白细胞毒素lktA引物具有特异性，证明PCR诊断试剂盒具有的特异性。
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