CN111549124A - 一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用，属于医学检测技术领域，本发明公开的分子标记物包括bta‑miR‑223、bta‑miR‑205和bta‑miR‑21‑5p中的一种或几种，本发明进一步公开了用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒，包括扩增bta‑miR‑223的引物对、扩增bta‑miR‑205的引物对和扩增bta‑miR‑21‑5p的引物对，本发明利用所述分子标记物及含有分子标记物引物组的试剂盒能够快速有效的检测患金葡菌乳房炎的奶牛，减少由奶牛金葡菌乳房炎带来的经济损失。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用。
背景技术
奶牛乳房炎也叫做奶牛乳腺炎，这种炎症反应的持续发生，可引起患病奶牛的乳腺组织严重的病理损伤，乳腺的泌乳和防御功能被破坏，该疾病的爆发，将导致牛场倾倒大量质检不合格牛奶，且药物治疗成本增加，甚至可能导致患病奶牛死亡，从而使奶牛养殖业遭受巨大经济损失。奶牛乳房炎的致病菌以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占整个奶牛乳房炎病例的90％以上，目前在世界许多国家金黄色葡萄球菌是最常见和最重要的乳房炎致病菌，导致的经济损失最为严重。
金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)乳房炎是奶牛乳腺组织受到金葡菌感染而引起炎症反应的一种常见临床性疾病。由于金葡菌特有的生物学特性，可逃避机体免疫系统，寄生乳腺组织后，降低乳腺免疫力，释放TNF-α、IL-6、IL-1β等，与其他致病菌型乳房炎相比，金葡菌乳房炎的特点是引起不平衡的免疫抑制、持续感染、潜伏期长。
传统的乳房炎检测方法主要是利用乳汁病原微生物检查、体细胞计数法(SCC)等方法进行诊断，检测方法相对繁琐，结果判定主观性较强，准确度较低。研究发现，40％被金葡菌感染的奶牛的SCC反而低于未感染时，因此不能准确地断定高低SCC与金葡菌感染之间的关系，这也导致在奶牛生产中不能正确排除感染金葡菌的奶牛。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物，所述的分子标记物包括bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5p中的一种或几种，所述的bta-miR-223的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的bta-miR-205的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的bta-miR-21-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了一种上述的分子标记物在制备检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒中的应用。
优选地，所述用于检测奶牛金葡菌乳房炎分子标记物的引物组，包括扩增bta-miR-223的引物对、扩增bta-miR-205的引物对和扩增bta-miR-21-5p的引物对；所述扩增bta-miR-223的引物对的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述扩增bta-miR-205的引物对的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；所述扩增bta-miR-21-5p的引物对的序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
本发明还提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒，包括上述的引物组。
优选的，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
优选的，所述的试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为正常乳腺组织的cDNA。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：
本发明提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用，所述分子标记物包括bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5p中的一种或几种，扩增bta-miR-223、bta-miR-205或bta-miR-21-5p的上下游引物，通过检测bta-miR-223、bta-miR-205或bta-miR-21-5p基因的表达水平来诊断是否患奶牛金葡菌乳房炎，所述bta-miR-223、bta-miR-21-5p表达上调或bta-miR-205表达下调，表达倍数在1.24倍以上，若bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5p中任一一个分子标记物出现上述表达差异，则断定为患奶牛金葡菌乳房炎。本发明通过检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物，与健康牛进行比较，检测快速、简便、特异和有效，从而实现奶牛金葡菌乳房炎的早诊断、早治疗，减少了奶牛金葡菌乳房炎带来的经济损失。
附图说明
图1为2号奶牛乳房炎病原菌分离鉴定结果图，其中(A)为大肠杆菌，(B)为链球菌，(C)为金葡菌；
图2为1号、2号、4号、6号、7号、8号牛奶样中金葡菌nuc基因PCR鉴定结果图；
图3为1号、2号、4号、6号、7号、8号牛乳腺组织中的bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5的PCR表达量图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物，所述的分子标记物包括bta-miR-223、bta-miR-205或bta-miR-21-5p中的一种或几种，所述的bta-miR-223的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA，所述的bta-miR-205的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体如下：TCCTTCATTCCACCGGAGTCTG，所述的bta-miR-21-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体如下：TAGCTTATCAGACTGATGTTGACT。
本发明还提供了一种上述的分子标记物在制备检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物引物组，包括扩增bta-miR-223的引物对、扩增bta-miR-205的引物对和扩增bta-miR-21-5p的引物对。本发明中，所述扩增bta-miR-223的引物对的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，具体如下：
GCGCGTGTCAGTTTGTCAAAT(SEQ ID NO：4)，
AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：5)；
所述扩增bta-miR-205的引物对的序列如和SEQ ID NO：7所示，具体如下：
CGTCCTTCATTCCACCGG(SEQ ID NO：6)，
AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：7)；
所述扩增bta-miR-21-5p的引物对的序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，具体如下：
CGCGTAGCTTATCAGACTGATG(SEQ ID NO：8)，
AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQ ID NO：9)。
本发明还提供了一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒，包括上述的引物组。
在本发明中，所述的试剂盒优选的还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂和阴性对照，所述的RNA提取试剂优选为5min极速RNA提取试剂盒，所述阴性对照优选为正常乳腺组织的cDNA，在本发明中，所述的正常乳腺组织cDNA取自健康牛，优选的体积为1.5cm×1.5cm×0.3cm。
本发明对所述RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可；在本发明具体实施过程中，所述的5min极速RNA提取试剂盒购自杭州海基生物技术有限公司，货号B0132；所述的反转录试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B532451，所述的PCR试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号RR420A。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在本实施例中，基于bta-miR-223、bta-miR-205或bta-miR-21-5p的引物组，组装本发明所述的用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒。
本发明所述的用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒的组成如下：
1)RNA提取试剂：
2)反转录试剂：
3)定量PCR试剂：
4)扩增分子标记物的bta-miR-223的引物对的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述扩增分子标记物bta-miR-205的引物对的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；扩增分子标记物bta-miR-21-5p的引物对的序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；扩增内参基因U6的引物对的序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
5)乳腺正常组织cDNA，作为阴性对照组与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同。
在本实施例中，从黑龙江省绥化市裕达牧业有限公司中选取患金葡菌乳房炎奶牛3头，健康牛3头，用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物bta-miR-223、bta-miR-205或bta-miR-21-5p表达水平的方法，包括如下步骤：
1)健康牛及金葡菌乳房炎奶牛的乳腺组织总RNA提取：所述乳腺组织的制备方法：将3头健康牛和3头金葡菌乳房炎患病牛送至屠宰场屠宰后，酒精擦拭奶牛乳房，用无菌手术刀和无菌手术剪分离出1.5cm×1.5cm×0.3cm体积的奶牛乳腺腺泡组织，PBS清洗3遍，得到乳腺组织；根据5min极速RNA提取试剂盒说明书的操作步骤，提取奶牛乳腺组织RNA；
2)cDNA合成：使用miRNA第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，bta-miR-223反转录引物序列如SEQ ID NO：12所示，具体如下：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGGGT；bta-miR-205反转录引物序列如SEQ ID NO：13所示，具体如下：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGACT；bta-miR-21-5p反转录引物序列为如SEQ IDNO：14所示，具体如下：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTCAA；内参选U6，U6反转录引物序列如SEQ ID NO：15所示，具体如下：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；在无RNA酶离心管中依次加入下述反转录试剂，反转录体系为：2×miRNA L-RT Solution mix10.0μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5μL，Total RNA 4.0μL，10μM茎环引物1.0μL，RNase-free water 3.5μL，轻轻混匀后离心4s，反应混合物16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存；
3)MiRNAs RT-qPCR扩增：MiRNA RT-qPCR扩增体系为dH2O 17.25μL，dNTP mixture2.0μL，模板DNA 1.0μL，rTaq酶0.25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，10μM上游引物1.0μL，10μM下游引物1.0μL；扩增分子标记物的bta-miR-223的引物对的序列如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示；所述扩增分子标记物bta-miR-205的引物对的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；扩增分子标记物bta-miR-21-5p的引物对的序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；内参选U6，扩增U6的引物对的序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，具体如下：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO：10)，CAGTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO：11)；MiRNAsRT-qPCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。
4)鉴定：扩增完成后，利用2-ΔΔCT方法分析基因表达量，其中3头患金葡菌乳房炎的奶牛bta-miR-223或bta-miR-21-5p基因片段均表达上调，bta-miR-205均表达下调，表明试剂盒检测的准确性，也进一步说明bta-miR-223或bta-miR-21-5p基因片段表达上调，bta-miR-205基因片段表达下调，若bta-miR-223、bta-miR-21-5p和bta-miR-205任一分子标记物出现上述表达差异，则奶牛患有金葡菌乳房炎。
实施例2
随机选取8头候选中国荷斯坦奶牛，候选奶牛为黑龙江省绥化市裕达牧业有限公司提供的2岁头胎次泌乳奶牛，分别通过传统鉴定方法与本实施例2所述的试剂盒和方法进行乳房炎奶牛致病菌鉴定效果的比较。
1、传统鉴定方法
8头候选中国荷斯坦奶牛中健康牛及乳房炎奶牛致病菌的鉴定，步骤如下：
a)乳汁体细胞数统计
1)采集8头候选中国荷斯坦奶牛的乳汁，在采集乳汁样品时，分别将8头候选中国荷斯坦奶牛固定在围栏中，分别对其4个乳区进行酒精擦拭消毒，用手挤出乳汁，对前三把乳汁进行丢弃处理；2)将乳汁收集在50mL无菌离心管中，对此32份乳汁样品进行标记，放置在有冰袋的保温泡沫箱内，经陆地运输带回至实验室，4℃保存；3)使用奶牛体细胞计数仪，测定32份乳汁样本体细胞数，依据如下判定标准：变性奶样直接判定为临床型乳房炎，体细胞数小于10万/mL判定为健康乳区，体细胞数为20～50万/mL判定为隐性乳房炎，体细胞数大于100万/mL判定为临床型乳房炎；
b)候选健康牛及候选乳房炎奶牛乳汁致病菌的分离鉴定
1)将乳汁接种在LB肉汤培养基中，37℃培养过夜；2)吸取10μL菌液，划线接种在LB固体培养基，37℃培养24h；3)挑取单菌落，进行革兰氏染色，以此区分球菌或杆菌，革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌；4)将初步鉴定为球菌的菌落，继续分别接种至肉汤培养基和血琼脂培养基，根据其菌落形态、触酶以及凝固酶试验观察，区分链球菌和金葡菌；
c)候选健康牛及候选金葡菌乳房炎奶牛乳汁致病菌的PCR鉴定1)将初步鉴定为金葡菌的菌落，接种在LB肉汤培养基中，37℃培养过夜；2)在200μL离心管进行PCR反应，通过扩增金葡菌特异性致病基因nuc，比对目的条带，从而鉴定金葡菌的存在，其中PCR反应体系如下：dH2O 14.25μL，dNTP mixture 2μL，金葡菌菌液4μL，Taq酶0.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，10μM Nuc上游引物1μL，10μM Nuc下游引物1μL，PCR反应条件：变性温度为95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min，Nuc上游引物序列如SEQ ID NO：16所示，具体如下：5′-GCCGAATTCGTTATGACAGAATACT-3′(SEQ ID NO：16)，下游引物序列如SEQ ID NO：17所示，具体如下：5′-CAAGTCGACCAGCGTTGTCTTCGC-3′(SEQ ID NO：17)。
2、采用实施例2所述的试剂盒和方法分别对1号、2号、4号、6号、7号、8号奶牛进行乳房炎奶牛致病菌鉴定。
8头候选奶牛体细胞数试验结果如表1所示。
表1 8头候选奶牛体细胞数(SCC)
由表1可知，初步将1号、4号、8号牛判定为健康牛，将2号、6号、7号判定为乳房炎患病牛，并且2号、6号和7号牛，均显示出临床乳房炎的临床特性，肉眼可见乳房肿胀、发红，触摸检查发现乳房发热、疼痛。
通过对1号、4号、8号牛以及2号、6号、7号奶牛的乳汁进行病原菌分离培养发现，在1号、4号和8号三头健康牛的乳汁中，并未分离获得金葡菌及其他乳房炎致病菌；而在2号、6号和7号三头乳房炎奶牛中，分离获得了大肠杆菌，链球菌和金葡菌常见乳房炎致病菌；其中葡萄球菌在营养琼脂平板上可见光滑、隆起、圆形，革兰氏阳性菌落，个别菌落较大，呈现金黄色，符合其形态学特性(见图1)，由此，判定2号、6号和7号乳房炎患病牛的乳腺存在金葡菌感染。
由图2可知，经乳汁样本PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，在1号、4号和8号(依次对应的是泳道1、2和3)健康牛乳汁中未检测到nuc目的条带；而在2号、6号和7号(依次对应的是泳道4、5和6)金葡菌乳房炎患病牛乳汁中，检测到nuc基因目的条带，说明患病牛乳房炎的发生，涉及金葡菌的感染。
因此，由表1和图1-2可知，通过乳汁体细胞数统计、候选健康牛及候选乳房炎奶牛乳汁致病菌的分离鉴定和候选健康牛及候选金葡菌乳房炎奶牛乳汁致病菌的PCR鉴定的步骤，最终成功鉴定出1号、4号和8号为健康牛，2号、6号和7号为金葡菌乳房炎患病牛。
由图3和表2可知，利用本发明中的试剂盒检测bta-miR-223、bta-miR-205、bta-miR-21-5p的表达量，其中1号、4号和8号中的bta-miR-223、bta-miR-205、bta-miR-21-5p的表达量和乳腺正常组织表达量无显著差异，而2号、6号和7号中的bta-miR-223、bta-miR-21-5p的表达量与乳腺正常组织表达量相比，表达显著上调，分别为乳腺正常组织表达量3.95倍、1.24倍，2号、6号和7号中的bta-miR-205的表达量与乳腺正常组织表达量相比，表达显著下调，为乳腺正常组织表达量1.57倍，通过本发明所述的试剂盒检测金葡菌乳房炎奶牛与传统方法检测的结果一致，因此本发明的试剂盒能够准确区分金葡菌乳房炎患病牛，且本发明的试剂盒检测，与传统方法相比，操作简便、快速、准确率高。
表2健康牛和金葡菌乳房炎患病牛的mi-RNA表达量的数据结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccttcattc caccggagtc tg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcttatca gactgatgtt gact 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcgtgtca gtttgtcaaa t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtccttcat tccaccgg 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcgtagctt atcagactga tg 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtgcaggg tccgaggt 18
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactggggt 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccagact 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagtcaa 50
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccgaattcg ttatgacaga atact 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caagtcgacc agcgttgtct tcgc 24
Claims (6)
1.一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物包括bta-miR-223、bta-miR-205和bta-miR-21-5p中的一种或几种，所述的bta-miR-223的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的bta-miR-205的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的bta-miR-21-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记物在制备检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述分子标记物的引物组，其特征在于，包括扩增bta-miR-223的引物对、扩增bta-miR-205的引物对和扩增bta-miR-21-5p的引物对；所述扩增bta-miR-223的引物对的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述扩增bta-miR-205的引物对的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；所述扩增bta-miR-21-5p的引物对的序列如SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示。
4.一种用于检测奶牛金葡菌乳房炎的试剂盒，其特征在于包括权利要求3所述引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为正常乳腺组织的cDNA。
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