CN110184372A - 一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用，所述的特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示，通过提取待测样品基因组DNA，使用上述引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在204bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有肺炎克雷伯菌。采用本发明的检测方法检测肺炎克雷伯菌所需时间短、特异性强、灵敏度较高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

Description

一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为肠杆菌科克雷伯氏菌属的成员，属于革兰氏阴性杆菌，显微镜观察为短小杆状，两端钝圆，无芽孢和鞭毛。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界,该菌是重要的条件致病菌，主要定植于人和动物的消化道、呼吸道、泌尿生殖道，常能引起人或牲畜的肺炎、脑膜炎、化脓性脓肿、胆道感染、泌尿系统感染和败血症等疾病。断奶、运输等应激后的牛常发生一种急性牛呼吸道疾病，其原因是牛感染肺炎克雷伯氏菌后,对溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛支原体等病原的易感性增加，牛只抵抗力与免疫力下降，造成严重的经济损失。同时，我国肉牛产业快速发展，“北牛南运”的养殖模式导致牛呼吸道疾病的发生与日俱增，严重影响肉牛产业的健康发展。目前，该病原体在中国的分布流行十分广泛,造成巨大的经济损失，成为威胁牛养殖业的重要病原。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，针对防治。

传统上的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原，控制病情蔓延。而诸如16SrRNA测序等手段，不适用于常规检测。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。本发明建立的检测方法可为临床上肺炎克雷伯菌快速诊断和流行病学调查提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛源肺炎克雷伯菌PCR检测引物及方法，该引物可用于肺炎克雷伯菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物，所述的特异性引物包括正向引物和反向引物，具体为：

正向引物F：5’-CCAGCTTCCAGATAGCCG-3’；

反向引物R：5’-GCTACTTCCCGACAGCCC-3’。

在本发明的另一方面，提供了一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)使用上述引物进行PCR扩增；

3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在204bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有肺炎克雷伯菌。

进一步，所述的样品基因组利用一管式通用样品DNA抽提试剂盒提取。

进一步的，所述的PCR扩增反应体系为10μL：2×Taq PCR MasterMix(blue)5μL，引物对1μL，模板DNA 1μL，双蒸水补至10μL。

进一步的，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，降温4℃，结束。

此外，本发明还提供了所述的特异性引物在牛源肺炎克雷伯菌检测中的应用。

同时，本发明还提供了一种用于检测牛源肺炎克雷伯菌的试剂盒，所述的试剂盒包含上述引物对。

本发明的有益效果为：

采用本发明的检测方法检测肺炎克雷伯菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时常、准确性低、检出率低等缺点。而16S rRNA通用引物扩增后，还需要测序确定细菌种属，不适用常规检测。同时，本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特意，易于判定，相对于16S rRNA测序的方法又节约了时间。

附图说明

图1为实施例中肺炎克雷伯菌特异性引物的PCR反应条件优化；M：Maker；1-7退火温度分别为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；61℃8：阴性对照；

图2为实施例中PCR检测方法特异性评估试验凝胶电泳结果图；M：Maker；1：肺炎克雷伯菌，2：志贺氏菌，3：奈瑟菌，4：深红沙雷氏菌，5：金黄色葡萄球菌，6：皮特不动杆菌，7：多杀性巴氏杆菌，8：摩根菌，9：变形杆菌，10：大肠杆菌，11：柯氏柠檬酸杆菌，12：铜绿假单胞菌，13：阴性对照；

图3为实施例中PCR检测方法灵敏度评价试验凝胶电泳结果图；M：Maker；1：42.5ng/uL；2：42.5×10^-1ng/uL；3：42.5×10^-2ng/uL；4：42.5×10^-3ng/uL；5：42.5×10^-4ng/uL；6：42.5×10^-5ng/uL；7：42.5×10^-6ng/uL；8：阴性对照；

图4为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图，M：Maker；1:肺炎克雷伯菌阳性对照；2-11为疑似菌株；12：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1一种牛源肺炎克雷伯菌特异性PCR检测方法建立

(一)肺炎克雷伯菌特异性引物设计

本实施例针对肺炎克雷伯菌的毒力蛋白基因(khe基因)，设计出对肺炎克雷伯菌具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物，该特异性引物对具体信息如下：

引物序列为：

F：5’-CCAGCTTCCAGATAGCCG-3’；

R：5’-GCTACTTCCCGACAGCCC-3’。

(二)肺炎克雷伯菌DNA模板制备

2.1牛源肺炎克雷伯菌DNA的提取

使用一管式通用样品DNA抽提试剂盒(细菌)，提取肺炎克雷伯菌的DNA，具体步骤如下：

1)取100～200μL 37℃恒温培养箱培养24h的肺炎克雷伯菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温10000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，加入100μL Qlysis-G Reagent，充分振荡使菌体悬浮，再加入10μL Proteinase K溶液，震荡混匀，65℃水浴5min至细胞完全裂解。水浴过程中，每1分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。

2)95℃水浴3min。水浴过程中，每1分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。

3)水浴后向离心管中加入100μLBufferNST，充分颠倒混匀。

4)12000rpm室温离心5min，收集DNA溶液，即为肺炎克雷伯菌DNA。此步去除不溶的组织和细胞碎片。

5)取上清液作为模板直接用于PCR检测或4℃保存。

2.2牛源肺炎克雷伯菌特异性引物最佳退火温度的探索

分别以肺炎克雷伯菌的菌液为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。PCR扩增产物在1.2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5μL，用全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果，根据PCR后的凝胶电泳结果确定为肺炎克雷伯菌特异性引物的最佳退火温度。

PCR扩增反应体系为10μL：2×TaqPCR MasterMix(blue)5μL，引物对1μL，模板DNA1μL，双蒸水3μL。

PCR扩增反应程序为：第一阶段，94℃预变性5min；第二阶段，94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；第三阶段，72℃延伸10min；第四阶段，12℃保存，结束。

由图1可见，除61℃外，其余温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为60℃。

(三)牛源肺炎克雷伯菌特异性PCR检测方法建立

PCR检测体系为：10μL反应体系具体为2×Taq PCR MasterMix(blue)为5μL；引物对为1μL；模板DNA为1μL最后用灭菌双蒸水补至10μL；最后用灭菌双蒸水补至10μL；

PCR检测反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，降温4℃，结束。

(四)PCR扩增结果凝胶电泳判定

判断具体为：PCR扩增产物在1.2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5μL，用全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果，如果出现204bp的单一扩增条带，则说明样品中含有肺炎克雷伯菌；反之，则样品中不含肺炎克雷伯菌。

实施例2特异性评估试验

按实施例1中DNA模板制备与PCR检测方法，对本实验室保存的肺炎克雷伯菌，志贺氏菌，奈瑟菌，深红沙雷氏菌，金黄色葡萄球菌，皮特不动杆菌，多杀性巴氏杆菌，摩根菌，变形杆菌，大肠杆菌，柯氏柠檬酸杆菌，铜绿假单胞菌进行PCR扩增反应。

图2中电泳结果为只有肺炎克雷伯菌在204bp处出现特异性条带，而其他菌种未出现特异性条带。

实施例3灵敏度评价试验

接种肺炎克雷伯菌于1mL营养肉汤液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h增菌后，用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后，NanoDropTM One超微量紫外分光光度计计数得到基因组DNA浓度为42.5ng/uL，取1mL菌液按实施例1提取基因组DNA，用灭菌双蒸水按10～10⁶进行10倍梯度稀释基因组DNA，以7个梯度稀释液为模板进行PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯光下观察凝胶电泳结果。

如图3所示，在泳道3可以看到清晰条带，相对应检测细菌最低浓度为42.5×10^{- 3}ng/uL，本法具有较好的灵敏度。

实施例4临床疑似菌株检测

利用实施例1建立的肺炎克雷伯菌特异性PCR检测方法对从肉牛口腔和鼻腔中分离到的10株疑似菌株进行检测。

检测结果见图4，图中可知，泳道4、11菌株呈阳性结果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物及其方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccagcttcca gatagccg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctacttccc gacagccc 18

Claims (7)

1.一种检测牛源肺炎克雷伯菌特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物如SEQ IDNO.1～2所示。

2.一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，存在204bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有肺炎克雷伯菌。

3.根据权利要求2所述的一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，所述的样品基因组利用一管式通用样品DNA抽提试剂盒提取。

4.根据权利要求2所述的一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为10μL：2×Taq PCR Master Mix(blue)5μL，引物对1μL，模板DNA1μL，双蒸水补至10μL。

5.根据权利要求2所述的一种检测牛源肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，降温4℃，结束。

6.权利要求1所述的特异性引物在牛源肺炎克雷伯菌检测中的应用。

7.一种用于检测牛源肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的特异性引物。