CN107365869A

CN107365869A - 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物

Info

Publication number: CN107365869A
Application number: CN201710804890.5A
Authority: CN
Inventors: 徐云明; 卞蓉蓉
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2037-09-08
Also published as: CN107365869B

Abstract

本发明公开了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物。所述方法包括：提取待检测样品的DNA；以所述的DNA为模板，利用所述的引物进行LAMP反应；对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌。发明针对肺炎克雷伯杆菌khe毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测肺炎克雷伯杆菌。

Description

利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物

技术领域

本发明涉及食源性致病微生物的检测，尤其涉及一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法。

背景技术

目前对于细菌的检测方法主要有细菌分离培养鉴定方法、免疫学检测方法、病理组织切片方法和分子生物学方法。

细菌分离培养鉴定是应用液体培养基、半固体培养基或固体培养基将分离得到的疑似细菌进行培养，并应用溶血实验、运动性实验、产酸产气等生化实验及染色镜检对微生物进行诊断。目前，在我国境内最常见也是应用最广泛的是国标法(GB4789.30-94)，还有其他的分离鉴定方法如FDA(美国食品药品监督管理局)法、改良FDA法、行标法(SN)和GNFIS法等。这类方法在目前所有类型的检测方法中的准确性是最高的，但是无论是哪种分离培养技术，他们都有一个共同的缺点，就是从样品的采集到病原微生物的分离鉴定结果，需要的试验周期都会很长，一般微生物的培养需要2天左右，有些微生物的分离培养需要十多天，才能得出结果，不能够适应目前快速、准确诊断的需求市场。同时由于操作的过程中，接触活体的细菌，对实验室操作人员构成一定的健康威胁。

免疫学检测方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，其中包括凝集反应方法、沉淀反应方法、免疫荧光技术、放射免疫测定方法、酶联免疫吸附试验、补体结合试验等。免疫学检测方法是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。这种诊断方法的缺点是检测过程中，需要的试剂非常昂贵，同时此方法在检测过程中，根据不同的检测目标微生物，其特异性也不尽相同，容易出现假阳性结果，造成误判，同时人为的操作对于实验结果的影响也是有的，所以需要具有一定素质和能力的实验室专业人员。

病理组织切片方法是取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片〔通常将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色〕，用显微镜进一步检查病变。根据病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。这种检测方法虽然准确性很高，但是最大的问题是，对从事病理组织学诊断的人员的专业性的要求会非常高，需要专业的病理组织学教师或者从事病理组织学研究的研究生，才有可能进行准确的诊断，也可以说这类诊断方法需要在显微病理学知识上具有丰富经历和经验的实验人员。

分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸(DNA)的凝胶电泳实验、核酸的分子杂交实验、核酸的体外扩增实验等方法，这些方法的优点是检测方法的特异性非常高，检测时间可以在6小时内完成。本方法的缺点在于，需要昂贵的变温反应装置和检测仪器。分子生物学诊断方法在实验过程中需要复杂的变温仪器，这种仪器的价格很高，对于基层的投放使用很难做到全覆盖。

随着人们生活水平的逐步提高，人们对食品的质量与安全要求越来越高，食源性致病微生物是引发食品安全事故的主要因素。据统计，在食源性疾病中，由致病菌引发的食物中毒是食品安全的主要问题，畜禽肉类产品是细菌性食源性疾病最主要的原因食品，而粮食类产品是导致死亡的主要食品。食源性疾病在全球是一个重要的公共卫生问题，是目前导致全球人类发病和死亡的重要原因。在美国食源性疾病每年导致5000人死亡，最新的数据显示，全球因腹泻病导致250万5岁以下儿童死亡，而且大多数发生在发展中国家。2015年第一季度我国病因明确的食源性疾病暴发起数占总暴发数的47％，由细菌污染导致的暴发占病因明确的食源性疾病暴发起数的33％。细菌性食源性疾病占主要部分(数据来源于国家食品安全风险评估中心)。

肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界，该菌近年来成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌。主要存在于人和动物肠道、呼吸道、泌尿生殖道。肺炎克雷伯氏菌又称肺炎杆菌，属革兰氏阴性杆菌，是引起呼吸道感染的主要病原体，常能引起人或牲畜的肺炎、脑膜炎、化脓性脓肿、胆道感染、泌尿系统感染和败血症等疾病。感染肺炎克雷伯菌是新生儿、免疫低下宿主、经外科途径感染的易感患者、糖尿病、肿瘤患者的主要危胁。国内外相关研究表明：肺炎克雷伯氏菌可通过婴幼儿配方乳粉和一些不经过加热直接食用的食品引起食物中毒，例如凉拌菜、汉堡包、蔬菜沙拉等，引起腹痛，腹泻，呕吐等消化道症状。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸体外扩增技术，由Notomi等人在2000年发明，在对病毒、真菌、寄生虫和细菌的诊断中已经使用并在商业上进行了应用。其特点是针对靶标基因的6个特定区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)下保温30～60分钟，即可完成核酸扩增反应。整个LAMP扩增过程是等温的不需要变性的，为链置换和延伸的过程，因此扩增产物大小也随着链置换反应的进行而改变，从而在电泳图上表现为大小不一的阶梯状的条带。

发明内容

发明目的：为克服现有技术的问题，本发明提供了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的引物及方法，可成功鉴定肺炎克雷伯杆菌。

技术方案：本发明所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的引物，包括外引物和内引物，外引物的碱基序列为：

F3：5’-GCGGGTAATAAATGCGGTTG-3’

B3：5’-GGAGAGCGATGAGGAAGAGT-3’；

内引物的碱基序列为：

FIP：5’-TACCGGCATCTGCCACACCTTTTTCACCACCAGCAGACGAAC-3’

BIP：5’-CGGGAAAACCCACGCTGTCGTTTTAGGGCTATCCGGAAGTGT-3’。

肺炎克雷伯杆菌的主要感染方式是通过进食而造成感染和发病，尤其是医院等人群密集和病患数量较多的地点和场所，发病明显。克雷伯杆菌是一个大的属，主要有肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。其中肺炎克雷伯菌对人致病性较强，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一。本发明中，食源性对肺炎克雷伯菌的种类没有限制作用。

肺炎克雷伯菌不同亚型的菌株，毒力基因的携带有非常大的差异性，本发明选择khe毒力基因作为检测目的基因，通过四个序列(登录号：CP020108.1，CP015120.1，KU158407.1，LT216436.1))进行比对得到目标保守区域，将该目标保守序列在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)检索比对后，发现该列出的100个比对结果中，全部属于肺炎克雷伯菌的基因片段，而未出现与其他菌株符合的现象，因此该保守序列适用于特异性检测肺炎克雷伯菌。进一步的，针对该保守序列，本发明设计了LAMP引物，通过多套引物实验，发现上述的引物具有最佳的检测效果。

本发明还提供了利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，包括：提取待检测样品的DNA；

以所述的DNA为模板，利用上述的引物进行LAMP反应；

对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌。

LAMP反应体系中，本发明对于反应的特异性和灵敏性皆有影响的甜菜碱(betaine)浓度、外、内引物浓度比、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、反应时间和反应温度条件进行了优化。甜菜碱在反应体系中，是作为一种辅助成分而存在的，实验中不加入甜菜碱也可以扩增反应。甜菜碱为DNA变性剂，有利于DNA双螺旋的打开，不但可以提高引物和模板链结合的特异性而且可以增强DNA的扩增效率，并且对酶有保护和稳定作用。dNTPs又称脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP Mixture)，总共包含四类成分:dATP、dGTP、dCTP和dTTP。它影响着反应的特异性。如果它的浓度低于5μM或其余四个部分中的一种浓度低于其他部分的浓度，会导致LAMP反应出现扩增错误而终止，扩增出的产物也就相对应的减少。如果dNTPs的浓度过高会和反应体系内的Mg²⁺发生化学反应，从而抑制LAMP反应，LAMP反应的产物也会减少。LAMP反应时共需要4条特异性引物，外引物的作用在于反应初始阶段通过链的置换过程，使内引物合成的链脱离DNA模板，产生哑铃状结构，自此之后的过程中，内引物的浓度直接影响着反应的扩增效率，适当提高内引物浓度可加快开始阶段的反应进程，提高反应效率。因此，适当的内、外引物比率不仅可以节约引物用量，还可使反应达到最好的扩增效率。反应体系内的Mg²⁺不仅是形成稳定碱基的中间体，而且对于酶活性的激活是必要的，可影响LAMP扩增反应的特异性和扩增产物的产量。若Mg²⁺浓度太高，很大程度上会增加引物错配的机率，出现非特异性扩增；若Mg²⁺浓度太低，就不能激活Bst DNA Polymerase的活性。

综上所述，对各反应条件进行了优选，所述LAMP反应体系为：7-8mM Mg²⁺，2.0-2.2mM dNTPs，0.2-0.4M甜菜碱，0.2-0.3μM外引物，1.4-1.6μM内引物，1-2μL Bst DNA聚合酶，2.5-3μL反应缓冲液，1-2μL gDNA，用ddH₂O补至25μL。

进一步优选的，所述LAMP反应体系为：8mM Mg²⁺，2.0mM dNTPs，0.4M甜菜碱，0.2μM外引物，1.4μM内引物，1μL Bst DNA聚合酶，2.5μL反应缓冲液，1μL gDNA，用ddH₂O补至25μL。Bst DNA聚合酶的酶活为8-10U/μL。

优选的，所述LAMP反应的温度为63-65℃，进一步优选为65℃。

优选的，所述LAMP反应的时间为60-62min，进一步优选为60min。

扩增结束后，通过检测反应产物中是否扩增出目的片段来判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌。优选的，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，琼脂糖的浓度为2％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明针对肺炎克雷伯杆菌khe毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测蜡样芽孢杆菌。

1、特异性更高：上述四种传统的诊断方法中，符合高特异性、快速的特点的是传统的分子生物学方法。传统的分子生物学方法，只锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的两个区域进行检测；本方法是以4条引物，锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的六个区域进行检测，特异性更高。

2、灵敏性更好：在细菌的传统分离培养鉴定、病理组织学诊断方法、免疫学检测方法、传统分子生物学检测方法中，分子生物学的检测方法的灵敏度是最高的，而本研究方法的灵敏性在对比试验聚合酶链式反应中，在更短的反应时间内，检测灵敏性至少高出一个数量级。

3、试验成本更低：本方法检测过程中，实验在恒温水浴条件下进行的，因此不需要昂贵的变温仪器，在诊断结果时，可以通过肉眼或是加入简单的指示试剂便可进行结果的判断，实验的成本比其他传统方式都低。

4、快速的检测时间：上述四种检测方法中，传统的分子生物学方法的检测速度和周期最快，本方法也是分子生物学方法中的一种，因此也保持了分子生物学诊断快速周期短的特点。在观察结果时，花费的时间比传统的分子生物学方法更快,在对比与聚合酶链式反应(PCR)的对比试验中，聚合酶链式反应大约在1.5h小时完成，本方法的反应时间只需要60分钟，所以检测周期和速度是更快的。

附图说明

图1为Mg²⁺浓度优化(mM)，M：DL2000DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图2为甜菜碱(betaine)浓度优化(M)，M：DL2000DNA Marker，N：阴性对照，*为选择的优化的条件；

图3为dNTPs浓度优化(mM)，M：DL2000DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图4为内外引物比例优化(内引物μM)，M：DL2000DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图5为反应温度优化(℃)，M：DL2000DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图6为反应时间优化(min)，M：DL2000DNA Marker，*为选择的优化的条件，N：阴性对照；

图7-1为LAMP特异性检测的一部分结果，M：DL2000DNA Marker，泳道1-10依次分别为：肺炎克雷伯氏菌、蜡样芽孢杆菌CGMCC 1.195、蜡样芽孢杆菌CMCC(B)63303、沙门氏菌CMCC 50774、副溶血弧菌、白假丝酵母菌、迟钝爱德华氏菌、哈氏弧菌、大肠杆菌(抗生素鉴定株)、金黄色葡萄球菌，N：阴性对照；

图7-2为LAMP特异性检测的另一部分结果，M：DL2000DNA Marker，M：泳道11-18依次分别为：伤寒沙门氏菌、沙门氏菌CMCC 50001、溶壁微球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、枯草芽孢杆菌、弗氏志贺菌、大肠埃希氏菌O157:H7、大肠埃希氏菌CGMCC 1.1369，N：阴性对照；

图8-1为LAMP方法的灵敏性检测(ng/μL)，M：DL2000DNA Marker，N：阴性对照，甬道1-8的DNA浓度依次分别为8.75、8.75×10^-1、8.75×10^-2、8.75×10^-3、8.75×10^-4、8.75×10^-5、8.75×10^-6、8.75×10^-6，*表示最低检测限；

图8-2为PCR方法的灵敏性检测(ng/μL)，M：DL2000DNA Marker，N：阴性对照，甬道a-g的DNA浓度依次分别为8.75、8.75×10^-1、8.75×10^-2、8.75×10^-3、8.75×10^-4、8.75×10^-5、8.75×10^-6，*表示最低检测限；

图9为对比例1中特异性结果图；

图10为本发明方法的技术流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明具体实施方式所用材料如下：

1主要试剂

三磷酸脱氧核苷酸(dNTP Mixture，25mM，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 100mM each)，甜菜碱(betaine)、高纯度细菌DNA提取试剂盒于生工生物工程(上海)股份有限公司购买；硫酸镁(Mg²⁺，25mM)，反应缓冲液(10×thermpol reaction buffer)与核酸大分子链置换酶(Bst DNA polymerase)于上海吉泰生物科技公司购买；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，均于青岛海博生物技术有限公司购买；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DNase消化酶于生工生物工程(上海)股份有限公司购买；核酸染料、琼脂糖，50×TAE缓冲液，购于天根生化科技(北京)有限公司；其余试剂均为分析纯。

2主要菌种

表1实验用菌株

注：菌种由吉林大学人兽共患病研究所，细菌病研究实验室赠予。本领域技术人员也可以根据菌株编号从公司购买或者保藏机构获得。

3仪器设备

电子分析天平(FR2014)购于上海良平公司，低温离心机(5425R)购于艾本德公司，自动凝胶成像仪(1708195)购于BIO-RAD公司，恒温水浴锅(XO-8D)购于南京先欧公司，4℃和-20℃冰箱(BCD-271TMBA)购于海尔公司，EPOCH仪器(BioTek)，超净工作台(BCM-1300)均购于苏州安泰公司，PCR仪(2720)购于ABI公司，核酸电泳仪(DYY-8C)购于北京六一仪器厂。

4试剂的制备

5M甜菜碱溶液的配制：称取甜菜碱粉末5.8g，加8mL ddH₂O摇匀，充分溶解，最后定容到10mL，0.22mm过滤器过滤，分装至无菌1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

TSB液体培养基的制备：称取TSB粉末3g，加入80mL ddH₂O加热溶解，最后定容到100mL，调节PH至7.4，分装到试管内，121℃高压灭菌20min。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)的制备：称取胰蛋白胨大豆琼脂培养基粉末4g，在蒸馏水中充分溶解并定容到100mL，121℃15min高压灭菌，等降至适宜温度时，在超净台中将其倒入一次性平板中，冷却备用。

实施例1

1细菌的复壮与培养

培养前，取保存的各种菌种在TSA琼脂平板上进行划线复壮，放入恒温培养箱37℃培养12h。挑取单个菌落接种至5mL的TSB液体培养基中，培养条件为37℃，震荡18-24h。分装于已加入适量甘油的2.0mLEP管中，-20℃保存备用。

2细菌基因组的提取

取分装备用的2.0mLEP管，12000rpm/min，离心1min，弃掉上清液，用ddH₂O洗涤菌体两次，然后用50μL无菌水溶解菌体。依据高纯度细菌DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的说明提取相应细菌的基因组，-20℃保存备用。

3LAMP引物的设计

在NCBI网站内搜索肺炎克雷伯杆菌khe毒力基因(登录号：CP020108.1，CP015120.1，KU158407.1，LT216436.1)，对上述基因的序列进行比对，找到保守序列。根据基因的保守序列设计LAMP引物，包括一对外引物和一对内引物。LAMP引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按照引物合成报告单的说明书，将装有引物的离心管12000×g，离心30s，使黏附在管壁的引物集中到管底。加入规定量的ddH₂O，内引物稀释终浓度为100μM，外引物稀释终浓度为10μM。

表2 LAMP引物序列

注：根据肺炎克雷伯杆菌khe基因(GenBank登录号CP015120.1)标注出的的引物位置。

4LAMP方法内反应组优化

LAMP反应体系：1μL Bst DNA聚合酶(8U/μL)，甜菜碱(betaine)，2.5μL 10×thermpol reaction buffer，Mg²⁺，dNTPs，1μL基因组模板(gDNA)，内引物(BIP和FIP)和外引物(B3和F3)，最后补灭菌蒸馏水至25μL，反应条件是65℃水浴60min。其中甜菜碱浓度，外、内引物比例，Mg²⁺浓度，dNTPs浓度，反应时间和反应温度对于反应的特异性和灵敏性皆有影响，因此对甜菜碱浓度、外、内引物比例、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、反应温度和反应时间条件进行优化。

4.1Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺浓度优化的条件范围：1.0～8.0mM，每1.0mM一个梯度。在反应体系内，除Mg²⁺的浓度外其余组分浓度不变，包括2.0mM的dNTPs，0.4M的甜菜碱，0.2μM的外引物(B3和F3)，1.4μM的内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的扩增样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.2甜菜碱浓度的优化

甜菜碱浓度优化的条件范围：0～1.0M，每0.2M一个梯度。在反应体系内，除甜菜碱的浓度外其余组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，2.0mM的dNTPs，0.2μM的外引物(B3和F3)，1.4μM的内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的扩增样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.3dNTPs的优化

dNTPs浓度优化的条件范围：1.0～2.4mM，每0.2mM一个梯度。在反应体系内，除dNTPs的浓度外其余组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，0.4M的甜菜碱，0.2μM的外引物(B3和F3)，1.4μM的内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的扩增样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.4内、外引物比例的优化

内引物浓度优化的条件范围：0.2～1.6mM，每0.2mM一个梯度。内、外引物浓度比优化范围：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1和8:1。在反应体系内，除内引物(BIP和FIP)的浓度外其余组分浓度不变，包括8mM Mg²⁺，0.4M的甜菜碱，2.0mM的dNTPs，0.2μM的外引物(B3和F3)，65℃水浴60min后，在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的扩增样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.5反应温度的优化

反应温度优化的条件范围：55～85℃，每5℃一个梯度。在反应体系内，包括2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μL Bst NDA聚合酶，8mM Mg²⁺，2.0mM dNTPs,0.4M的甜菜碱，0.2μM的外引物(B3和F3)，1.4μM内引物(BIP和FIP)，反应时间是60min，最后在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的样品充分混匀后，进行核酸电泳。

4.6反应时间的优化

反应时间优化的条件范围：40～70min，每5min一个梯度。在反应体系内，包括2.5μL 10×thermpol reaction buffer，1μL Bst NDA聚合酶，8mM Mg²⁺，2.0mM dNTPs,0.4M的甜菜碱，0.2μM的外引物(B3和F3)，1.4μM内引物(BIP和FIP)，反应时间是60min，最后在80℃水浴5min灭活DNA聚合酶终止LAMP反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的扩增样品充分混匀后，进行核酸电泳。

检测结果见图1-图6，优化的最佳条件为：甜菜碱0.4M，Mg²⁺8mM，dNTPs2.0mM，内引物1.4μM，反应温度为65℃，反应时间为60min。

实施例2LAMP方法的特异性实验

对表1所列18株菌种应用试剂盒法提取基因组DNA，按照优化后的25μL反应体系进行LAMP扩增，检验LAMP反应的特异性，扩增条件为：2.5μL 10×thermpol reactionbuffer，1μLBst DNA聚合酶，8mM Mg²⁺，0.4M甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.4μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min。结束LAMP实验之后，在80℃水浴5min灭活BstDNA Polymerase首先用肉眼观察肺炎克雷伯杆菌管与阴性结果对照管比较，简单离心之后观察管底，进行初步判断结果。用2％的琼脂糖凝胶，加入1μL上样缓冲液与5μL的样品充分混匀后，进行核酸电泳。

结果参见图7-1、与7-2，发明了特异性检测肺炎克雷伯杆菌的LAMP方法。

实施例3LAMP方法的灵敏性实验

取少量2步骤中提取的肺炎克雷伯杆菌基因组DNA，用微孔板分光光度计的Take3程序及仪器测定(Gene公司)基因组的初始浓度。然后用ddH₂O对基因组进行10倍稀释，共稀释8个梯度。用优化好的反应体系(2.5μL10×thermpol reaction buffer，1μLBst DNA聚合酶，8mM Mg²⁺，0.4M甜菜碱，2.0mM dNTPs，0.2μM外引物(B3和F3)，1.4μM内引物(BIP和FIP)，65℃水浴60min)对8个梯度的基因组进行特异性扩增。反应结束在80℃水浴5min终止反应，用2％的琼脂糖凝胶，加入核酸染料与5μL的样品充分混匀后，进行核酸电泳。利用常规PCR法(参考文献：He Y,Guo X,Xiang S,Li J,Li X,Xiang H,He J,Chen D,ChenJ.Comparative analyses of phenotypic methods and 16S rRNA,khe,rpoB genessequencing for identification of clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2016,109(7):1029-1040.)进行对比。引物序列：上游(SEQID NO.5)TGATTGCATTCGCCACTGG；下游(SEQ ID NO.6)GGTCAACCCAACGATCCTG。反应体系。PCR反应体系为25μL，包括2×PCR Master Mix 12.5μL，2.0mM dNTPs，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL gDNA，最后用ddH₂O补至25μL。反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55.8℃30s，72℃30s，35次循环；72℃7min。反应结束后进行1.0％核酸电泳。目的片段大小在428bp。

结果参见图8-1、图8-2，LAMP方法的最低检测限为8.75×10^-4ng/μL，常规PCR方法的最低检测限为8.75×10^-2ng/μL。

综上，本发明成功设计了肺炎克雷伯杆菌的LAMP引物，最终的反应体系确定为：8mM Mg²⁺，2.0mM dNTPs，0.4M betaine，0.2μM外引物(B3和F3)，1.4μM内引物(BIP和FIP)，1μL Bst DNA聚合酶(8U/μL),2.5μL 10×thermpol reaction buffer,1μL gDNA，用ddH₂O补至25μL，反应条件是65℃水浴60min。LAMP法基因组的最低检测限时0.875pg/μL。通过与常规PCR方法对比，本实验LAMP法的灵敏性优于常规PCR法，稳定性良好。即成功建立了肺炎克雷伯杆菌LAMP检测方法。

对比例1

在NCBI网站内搜索肺炎克雷伯菌kvgS毒力基因(登录号：AJ293851.1、CP006738.1、DQ211088.1)，对kvgS基因序列进行对比，找出保守序列，再针对保守序列设计一系列LAMP引物，包括一对内引物和一对外引物。引物序列见表3。

表3 LAMP引物序列

注b：根据蜡样芽孢杆菌kvgS基因(GenBank登录号AJ293851.1)标注的引物位置。

应用本引物，进行特异性实验过程中，出现被检测的肺炎克雷伯菌虽然有阳性结果，但是其他菌也出现了阳性结果，说明引物特异性不理想。结果在图9(注:泳道1:肺炎克雷伯菌，2-5：其他非肺炎克雷伯菌菌株，N：阴性对照)。

序列表

<110> 江苏农林职业技术学院

<120> 利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgggtaata aatgcggttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagagcgat gaggaagagt 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccggcatc tgccacacct ttttcaccac cagcagacga ac 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggaaaacc cacgctgtcg ttttagggct atccggaagt gt 42

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgattgcatt cgccactgg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtcaaccca acgatcctg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggatagtgt tgactcactg 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgtgtgtg tgtgtgtg 18

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attagtaacc ctgaattcga acggttttca cattcacagt tttatcaagc t 51

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gataggcctg gaataatagc tggctttttg tgtgtactga cctcaaac 48

Claims

1.一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的引物，包括外引物和内引物，其特征在于，外引物的碱基序列为：

F3：5’-GCGGGTAATAAATGCGGTTG-3’

B3：5’-GGAGAGCGATGAGGAAGAGT-3’；

内引物的碱基序列为：

FIP：5’-TACCGGCATCTGCCACACCTTTTTCACCACCAGCAGACGAAC-3’

BIP：5’-CGGGAAAACCCACGCTGTCGTTTTAGGGCTATCCGGAAGTGT-3’。

2.一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括：提取待检测样品的DNA；

以所述的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行LAMP反应；

对反应产物进行鉴定，判断是否含有肺炎克雷伯菌。

3.根据权利要求2所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，LAMP反应体系为：7-8mM Mg²⁺，2.0-2.2mM dNTPs，0.2-0.4M甜菜碱，0.2-0.3μM外引物，1.4-1.6μM内引物，1-2μL Bst DNA聚合酶，2.5-3μL反应缓冲液，1-2μL gDNA，ddH₂O补至25μL。

4.根据权利要求2所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，LAMP反应的温度为63-65℃。

5.根据权利要求2所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，LAMP反应的时间为60-62min。

6.根据权利要求2所述的利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。