CN110846343B - 一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法，属于基因工程领域。该方法将Sox4基因片段与腺病毒pAdtrack‑CMV载体连接，得到重组腺病毒表达质粒pAdtrack‑Sox4。线性化的pAdtrack‑Sox4与AdEasy载体形成的重组子转染HEK293细胞生成腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒，并采用微量全细胞病变法检测病毒滴度，最终实现腺病毒包装、生产和纯化的整个过程。该Sox4基因重组腺病毒可成功侵染293T细胞和小鼠腹股沟脂肪组织，实现了Sox4基因在体细胞和小鼠组织中的持续高表达，这为日后开展有关Sox4基因功能的研究奠定了良好的技术基础。

Description

一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法。
背景技术
Sox4是Sox家族成员之一。Sox4基因不含有内含子，只含有一个较长的外显子，转录出的鼠源性mRNA片段长2969bp。Sox4基因的高表达主要存在于发育胚胎的中枢神经系统、肺、胸腺、表皮干细胞和胶质瘤干细胞。Sox4与人体疾病的发生有着密切的关系。Sox4基因的突变或者缺失可导致先天性疾病、发育异常和肿瘤的形成。研究还表明Sox4对细胞分化和增殖起到重要的决定性作用。Sox4-/-小鼠胚胎致死，而Sox4-/+的小鼠的骨形成明显减少，软骨发育缓慢（Nissen-Meyer LS等, 2007）。由于Sox4基因过表达小鼠模型个体建立时间久，费用高，若以体外培养的细胞作为研究对象，一般过表达载体转染效率较低，过表达时效短，因此，研究Sox4基因重组腺病毒，可实现在小鼠体内组织和体外细胞中持续过表达Sox4基因，为研究Sox4基因功能奠定良好的技术基础。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供了一种表达Sox4基因重组腺病毒的构建、制备及纯化方法。此方法可用于制备过表达Sox4基因的重组腺病毒，以获得Sox4基因持续表达的细胞或小鼠组织的研究模型。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种表达Sox4基因重组腺病毒制备方法，该方法包括：
步骤A1，以小鼠的Sox4(NCBI Reference Sequence: NM_009238.2)基因CDS区序列为模板，选择KpnⅠ和HindⅢ两个酶切位点，设计引物；引物序列如下：
Sense：GGGGTACCATGGTACAACAGACCAACAACG
Antisense： CCCAAGCTTTCAGTAGGTGAAGACCAGGTTAGA；
步骤A2，扩增Sox4基因序列，以小鼠肝脏组织RNA反转录成的cDNA为模板扩增Sox4基因，胶回收PCR后的片段，得到Sox4片段；
步骤A3，将步骤A2得到的Sox4片段与pAdtrack-CMV空载双酶切；
步骤A4，将A3中双酶切后的Sox4片段与pAdtrack-CMV的酶切产物进行连接反应，连接反应按照摩尔比Sox4片段: pAdtrack-CMV载体=8:1的比例进行；
步骤A5，转化出pAdtrack-Sox4克隆：加入A4中的连接产物到DH5α感受态细胞进行转化；平板长出克隆后，随机挑取8-10个克隆到20μL已灭菌ddH2O中，进行菌落PCR，并同时在新的有氨苄抗性的平板上划线保种；
步骤A6，取A5中菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，提取阳性质粒，将阳性质粒送去测序公司测序，选取测序正确的质粒，得到pAdtrack-Sox4腺病毒过表达质粒；
步骤A7，线性化pAdtrack-Sox4质粒：取pAdtrack-Sox4腺病毒过表达质粒，用PmeI（MssI）酶线性化；然后在线性化片段中加入FastAD去磷酸酶，进行孵育、跑胶纯化片段后，纯化产物转入稳转AdEasy载体的BJ5183感受态细胞中，进行培养；
步骤A8，挑选并鉴定重组子：在培养板上挑选取最小的克隆子，接种到含卡那霉素的培养基中进行培养并抽提菌液中的质粒，将质粒经PacI酶切鉴定，若出现一条3kb或4.5kb的片断，则该质粒为阳性克隆的重组子；
步骤A9，转染细胞：用PacI酶切重组子使其线性化，再用常规酚氯仿抽提法提出线性化的质粒，将线性化质粒转染HEK293细胞；
步骤A10，包装出腺病毒：培养步骤A9的HEK293细胞，镜下见100%绿色荧光，待三分之一细胞漂起来时，用PBS收集细胞，反复冻融三次，裂解细胞，使细胞中的病毒释放出来，然后离心收取上清；
步骤A11，检测腺病毒在细胞中表达效果，将含有pAd-Sox4腺病毒的上清加入293T细胞中，检测Sox4的表达效率。
如上所述的一种表达Sox4基因重组腺病毒的纯化方法，包括如下步骤：
步骤B1，将收到的表达Sox4基因重组腺病毒加入到一个10cm培养盘的HEK293细胞中，按照A10收取新的病毒，新的病毒可以感染更多HEK293细胞产生大量腺病毒；
步骤B2，氯化铯梯度离心纯化病毒：（1）步骤B1中的腺病毒加入PEG8000/2.5MNaCl，上下颠倒混匀，冰浴；（2）离心，弃上清，将沉淀溶于CsCl溶液中，然后离心、取上清；（3）取BECKMAN高速离心管，依次向管中加入1.4g/mL的CsCl、1.3g/mL的CsCl和（2）中的上清；（4）将离心管放入高速离心机中进行离心，用针管吸出病毒带；（5）将（4）步骤吸出的病毒转入透析袋中，透析过夜后分装保存到低温冰箱；
步骤B3，病毒滴度的测定：采用微量全细胞病变法（cytopathic effect，CPE）检测病毒滴度。
步骤B4，检测已纯化腺病毒在小鼠组织中表达效果。在小鼠腹股沟处皮下注射Sox4腺病毒，检查Sox4表达效率。
有益效果：相对于现有技术，本发明提供了一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法。以pAdtrack-CMV腺病毒表达载体为基础，成功引入Sox4基因，得到表达Sox4基因重组腺病毒。该Sox4腺病毒能成功感染293T细胞和小鼠腹股沟脂肪组织。被该腺病毒感染的细胞和组织体内的Sox4蛋白水平呈显著性上升，可成功实现Sox4基因在体细和组织中的持续表达，为进一步研究Sox4基因功能提供了良好的实验技术。
附图说明
图1为本发明Sox4基因CDS序列PCR扩增图。
图2为本发明的pAdtrack-Sox4载体结构图。
图3为本发明表达Sox4重组腺病毒重组子的PacI酶切鉴定图。
图4为本发明中重组子转染HEK293细胞后获得第一代病毒的绿色荧光图。
图5为本发明中293T细胞中加入pAd-Sox4腺病毒后检测Sox4的蛋白表达水平。
图6为本发明中Sox4重组腺病毒稀释度为10-5时，感染60小时后细胞CPE图。
图7为本发明中小鼠腹股沟脂肪注射pAd-Sox4腺病毒后检测Sox4的蛋白表达水平。
具体实施方式
本发明提供了一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法。以pAdtrack-CMV腺病毒表达载体为基础，引入Sox4基因，得到表达Sox4基因重组腺病毒。用HEK293细胞培养大量腺病毒，并采用氯化铯梯度离心纯化病毒。
一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备方法
步骤A1，以小鼠的Sox4(NCBI Reference Sequence: NM_009238.2)基因序列为模板，根据pAdtrack-CMV载体序列，选择KpnⅠ和HindⅢ两个酶切位点设计序列，克隆Sox4的CDS序列全长，引物序列如下：
Sense：GGGGTACCATGGTACAACAGACCAACAACG
Antisense： CCCAAGCTTTCAGTAGGTGAAGACCAGGTTAGA
步骤A2，扩增Sox4基因序列，提取小鼠肝脏组织RNA，反转录成cDNA。再以cDNA为模板，以步骤A1引物序列为引物，扩增Sox4基因的CDS区。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若跑胶片段为1323bp如图1所示，则将片段使用胶回收试剂盒进行片段回收，送测序公司测序。反应体系和反应条件如下：
反转录体系（康为世纪试剂盒）：
Figure 893215DEST_PATH_IMAGE001
反转录反应条件：
Figure 810356DEST_PATH_IMAGE002
扩增Sox4序列反应体系：
Figure 527776DEST_PATH_IMAGE003
扩增Sox4序列反应条件：
Figure 860668DEST_PATH_IMAGE004
步骤A3，用KpnⅠ和HindⅢ将Sox4片段与pAdtrack-CMV空载双酶切。双酶切体系如下：
Figure 675041DEST_PATH_IMAGE005
放入37℃恒温水浴酶切1小时。
步骤A4，将双酶切后Sox4片段与pAdtrack-CMV的片段使用胶回收试剂盒进行片段回收，胶回收片段进行连接反应。按摩尔比Sox4片段: pAdtrack-CMV载体=8:1的比例进行连接反应，反应体系如下：
Figure 435186DEST_PATH_IMAGE006
22℃孵育30分钟。
步骤A5，转化出pAdtrack-Sox4克隆。10μL连接产物加入100μL的DH5α感受态细胞进行转化。平板长出克隆后，随机挑取8-10个克隆到20μL已灭菌ddH2O中，并同时在新的有氨苄抗性的平板上划线保种。然后以如下反应体系和条件进行菌落PCR：
反应体系：
Figure 639903DEST_PATH_IMAGE007
PCR 反应条件：
预变性 95℃ 5分钟
循环（40cycles） 95℃ 10秒
55℃ 30秒
72℃ 30秒
延伸 72℃ 5分钟
步骤A6，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若跑胶片段为1323bp，则鉴定为阳性克隆，提取阳性质粒。将阳性质粒送去测序公司测序，测序引物为pAdtrack-CMV通用测序引物，选取测序序列与Sox4基因CDS区序列完全一致的质粒。pAdtrack-Sox4载体结构图见图2。
步骤A7，线性化pAdtrack-Sox4质粒，取1μg 的pAdtrack-Sox4腺病毒过表达质粒，用PmeI（MssI）酶线性化。然后在线性化片段中加入1μL FastAD去磷酸酶，在37℃中孵育片段30分钟。跑胶纯化片段后，取100ng纯化产物转入200μL稳转AdEasy载体的BJ5183感受态细胞中，37℃培养20小时。
步骤A8，挑选并鉴定重组子，在培养板上挑选取最小的克隆子，接种到4ml含卡那霉素的培养基中，37℃摇床220rpm中速培养16小时。抽提菌液中的质粒。质粒经PacI酶切鉴定，若出现一条3kb或4.5kb的片断，则该质粒为阳性克隆的重组子，见图3为表达Sox4重组腺病毒重组子的PacI酶切鉴定图。
步骤A9，转染细胞，用PacI酶切10μg重组子使其线性化，再用常规酚氯仿抽提法提出线性化的质粒，将线性化质粒用TurboFect转染法转染进6cm培养盘密度为70%的HEK293细胞中。
步骤A10, 包装出腺病毒，培养步骤A9的HEK293细胞7-10天，镜下见100%绿色荧光如图4所示。待三分之一细胞漂起来时，用1ml的PBS收集细胞，分别置于-80℃和37℃反复冻融三次，裂解细胞，使细胞中的病毒释放出来，然后4℃ 12000rpm离心15min，无菌条件下收取上清。
步骤A11，检测腺病毒在细胞中表达效果。将含有pAd-Sox4腺病毒的上清加入293T细胞中，检测Sox4的表达效率如图5所示，pAd-Sox4腺病毒在293T细胞中可以成功过表达。
一种表达Sox4基因的重组腺病毒的纯化方法
步骤B1，培养大量的HEK293细胞，用于扩大腺病毒感染，将步骤A10中收到的病毒全部加入到一个10cm培养盘密度90%的HEK293细胞中，待被感染细胞荧光到达100%且三分之一细胞漂起来时，按照步骤A10收取新的病毒。新的病毒可以感染5到10个10cm培养盘密度90%的HEK293细胞。按照步骤A10收取大量的腺病毒。
步骤B2，氯化铯梯度离心纯化病毒，（1）步骤B1中的腺病毒每20ml加入10mL 20%PEG8000/2.5M NaCl，上下颠倒混匀，冰浴1小时；（2）4℃ 12000g离心40分钟，弃上清，将沉淀溶于5mL 1.1g/mL CsCl溶液中，然后4℃ 8000g离心5分钟，取上清；（3）取容量为12.5mL的BECKMAN高速离心管，依次向管中加入2mL 1.4g/mL CsCl，3mL 1.3g/mL CsCl和5mL（2）中的上清；（4）将离心管放入高速离心机中，调制温度20℃，转速 22800rpm离心2小时，用针管在1.3-1.4g/mL密度之间吸出病毒带；（5）将（4）步骤吸出的病毒转入透析袋中，4℃透析过夜后分装保存到-80℃的低温冰箱。
透析缓冲液的配方：
50mM MgCl2 10mL，甘油100mL，用PBS溶液定溶至1L。
各种密度CsCl溶液的配方：
密度（g/mL） 质量（g） 终体积（mL）
1.4 7.84 10
1.3 4.03 10
1.1 1.32 10
溶于灭菌20mM Tris8.0溶液中。
步骤B3，病毒滴度的测定。采用微量全细胞病变法（cytopathic effect，CPE）检测病毒滴度。CPE指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。取24孔板1块，每孔加入5×104个HEK293细胞，培养24小时。取出步骤B2提取的腺病毒，用DMEM培养基稀释病毒，稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，依次缓慢加入200μl各个稀释度的病毒到24孔板的细胞中。每个稀释度均作2个复孔，同时设不加入腺病毒而加入200μl超纯水的对照组，目的用于排除细胞状态，人工操作等因素对CPE检测病毒滴度实验的干扰。将24孔板放入培养箱中继续培养36-48小时。镜下观察各孔细胞形态和绿色荧光，若90%细胞变圆，10%的细胞浮起，认为此时为CPE。实验期间镜检观察每孔细胞的状态，确定对应CPE时的病毒稀释度，如图6所示。按照公式计算最终腺病毒的滴度：
Figure 838803DEST_PATH_IMAGE008
。
步骤B4，检测已纯化腺病毒在小鼠组织中表达效果，取4周龄的雄性C57/BL6小鼠，实验组在腹股沟处皮下注射Sox4腺病毒，对照组小鼠注射空载腺病毒。每3天注射一次，每次注射腺病毒的病毒量为1×1010 pfu/Kg，共注射5次。5次注射完毕后，15天后取小鼠腹股沟脂肪，提取蛋白质，检查Sox4表达效率如图7所示，pAd-Sox4腺病毒在小鼠脂肪组织中可以成功过表达。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
序列表
<110> 河南理工大学
<120> 一种表达Sox4基因重组腺病毒的制备及纯化方法
<130> 2019-9-10
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
GGGGTACCAT GGTACAACAG ACCAACAACG 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
CCCAAGCTTT CAGTAGGTGA AGACCAGGTT AGA 33

Claims (1)

1.一种表达Sox4基因重组腺病毒制备方法，其特征在于，该方法包括：
步骤A1，以小鼠的Sox4基因CDS区序列为模板，选择KpnⅠ和HindⅢ两个酶切位点，设计引物；引物序列如下：
Sense：GGGGTACCATGGTACAACAGACCAACAACG
Antisense：CCCAAGCTTTCAGTAGGTGAAGACCAGGTTAGA；
步骤A2，扩增Sox4基因序列，以小鼠肝脏组织RNA反转录成的cDNA为模板扩增Sox4基因，胶回收PCR后的片段，得到Sox4片段；
步骤A3，将步骤A2得到的Sox4片段与pAdtrack-CMV空载双酶切；
步骤A4，将A3中双酶切后的Sox4片段与pAdtrack-CMV的酶切产物进行连接反应，连接反应按照摩尔比Sox4片段:pAdtrack-CMV载体＝8:1的比例进行；
步骤A5，转化出pAdtrack-Sox4克隆：加入A4中的连接产物到DH5α感受态细胞进行转化；平板长出克隆后，挑取克隆到已灭菌ddH2O中，进行菌落PCR，并同时在新的有氨苄抗性的平板上划线保种；
步骤A6，取A5中菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，提取阳性质粒，将阳性质粒送去测序公司测序，选取测序正确的质粒，得到pAdtrack-Sox4腺病毒过表达质粒；
步骤A7，线性化pAdtrack-Sox4质粒：取pAdtrack-Sox4腺病毒过表达质粒，用PmeI(MssI)酶线性化；然后在线性化片段中加入FastAD去磷酸酶，进行孵育、跑胶纯化片段后，纯化产物转入稳转AdEasy载体的BJ5183感受态细胞中，进行培养；
步骤A8，挑选并鉴定重组子：在培养板上挑选取最小的克隆子，接种到含卡那霉素的培养基中进行培养并抽提菌液中的质粒，将质粒经PacI酶切鉴定，若出现一条3kb或4.5kb的片断，则该质粒为阳性克隆的重组子；
步骤A9，转染细胞：用PacI酶切重组子使其线性化，再用常规酚氯仿抽提法提出线性化的质粒，将线性化质粒转染HEK293细胞；
步骤A10，包装出腺病毒：培养步骤A9的HEK293细胞，镜下见100％绿色荧光，待三分之一细胞漂起来时，用PBS收集细胞，分别置于-80℃和37℃反复冻融三次，裂解细胞，使细胞中的病毒释放出来，然后离心收取上清，得到含有pAd-Sox4腺病毒的上清；
步骤A11，检测腺病毒在细胞中表达效果，将含有pAd-Sox4腺病毒的上清加入293T细胞中，检测Sox4的表达效率，
还包括纯化方法，纯化方法包括如下步骤：
步骤B1，将收到的表达Sox4基因重组腺病毒加入到一个10cm培养盘的HEK293细胞中，按照A10收取新的病毒，新的病毒可以感染更多HEK293细胞产生大量腺病毒；
步骤B2，氯化铯梯度离心纯化病毒：(1)步骤B1中的腺病毒加入PEG8000/2.5M NaCl，上下颠倒混匀，冰浴；(2)离心，弃上清，将沉淀溶于CsCl溶液中，然后离心、取上清；(3)取BECKMAN高速离心管，依次向管中加入1.4g/mL的CsCl、1.3g/mL的CsCl和(2)中的上清；(4)将离心管放入高速离心机中，调制温度20℃，转速22800rpm离心2小时，用针管吸出病毒带；(5)将(4)步骤吸出的病毒转入透析袋中，4℃透析过夜后分装保存到-80℃的低温冰箱，透析袋中透析缓冲液的配方：50mM MgCl2 10mL，甘油100mL，用PBS溶液定溶至1L；
步骤B3，病毒滴度的测定：采用微量全细胞病变法(cytopathic effect，CPE)检测病毒滴度；
步骤B4，检测已纯化腺病毒在小鼠组织中表达效果，在小鼠腹股沟处皮下注射Sox4腺病毒，每3天注射一次，每次注射腺病毒的病毒量为1×1010pfu/Kg，共注射5次，5次注射完毕后，15天后取小鼠腹股沟脂肪，提取蛋白质检查Sox4表达效率。
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