CN111235115A - 一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用 - Google Patents

一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用，重组间充质干细胞利用重组慢病毒感染间充质干细胞获得；其中，重组慢病毒由过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得；过表达PTGS2的重组质粒由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi‑MCS‑3FLAG‑CBh‑gcGFP‑IRES‑puromycin制得。本发明可以提高MSCs对急性肝衰竭的治疗疗效。

Description

一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰 竭药物的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种制备治疗急性肝衰竭药物的应用，尤其涉及一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用。
背景技术
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一种以肝细胞迅速大量坏死和急剧下降的肝功能为特征的临床重症。目前肝移植是治疗ALF最为有效的手段，但由于供肝来源较少等原因限制了其应用。干细胞移植已被认为是治疗多种肝脏疾病的有效方式，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)正是其中的一种，已经被证明可以缓解多种急性或慢性肝脏疾病。但是临床试验结果显示治疗效果并不尽如人意，无法达到预期效果。因此，探究MSCs治疗肝脏疾病的具体机制，有利于对MSCs进行合理优化，提高MSCs治疗效果，促进临床转化。
ALF主要病理改变是多种原因(药物、病毒等)诱导肝细胞坏死，固有免疫系统激活释放大量炎性介质，进一步诱导肝细胞死亡，加重肝脏损伤。肝脏自身在损伤情况下，部分肝细胞会重新具备再生能力。当其再生能力超过肝脏坏死时，肝脏是具有功能的。但是ALF中大量的肝细胞死亡超出了肝脏本身的代偿能力，仍表现为肝功能的急剧丧失。因此，如何减轻肝脏损伤，提高肝细胞的增殖能力是缓解ALF的重要研究方向。
前期研究表明MSCs主要通过旁分泌作用，分泌大量细胞因子和生长因子，如肿瘤坏死因子诱导蛋白(tumor necrosis factor-inducible gene 6，TSG-6)、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)和转录生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)等，发挥抗凋亡、抗炎、促增殖和调节免疫等作用，从而发挥治疗作用。其中PGE2是一种广泛存在的生物脂质，主要是由环加氧酶(cyclooxygenase 2，COX2/PTGS2)催化分解花生四烯酸而来，在细胞的增殖、凋亡和调节免疫中均扮演重要角色。在肺部炎症和脑损伤等模型中发现MSCs可以通过分泌PGE2发挥治疗作用。因此，PGE2修饰的MSCs是否具有更强的减轻肝脏损伤、促进肝脏再生的功能是十分有意义的研究。
目前应用MSCs移植治疗ALF是一项有希望的治疗途径，但还存在一下缺陷：1、ALF主要病理改变是大量的肝细胞死亡超出了肝脏本身的代偿能力，多种因素(药物、病毒等)诱导肝细胞大量的坏死，释放大量的损伤相关分子模式(damage-associated molecularpatterns，DAMPs)，被肝脏内固有免疫系统识别，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，继而产生大量炎性因子，进一步引起肝脏损伤和肝功能丧失，因此，为了保证临床上能及时有效治疗ALF，异体来源的MSCs是更佳的选择；2、目前为止国内外的许多研究也发现干细胞移植疗效不佳的现象。对这一系列文献的回顾性研究发现主要有两个原因制约了MSC移植治疗的疗效，一是由于移植的MSC在肝脏的定植效率较低，二是由于肝功能衰竭体内存在过激的炎症反应，对移植的MSC具有一定的损伤作用。
发明内容
本发明提供一种，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种重组间充质干细胞，利用重组慢病毒感染间充质干细胞获得；其中，重组慢病毒由过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得；过表达PTGS2的重组质粒由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得。
本发明还提供重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、间充质干细胞的分离；步骤二、由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得过表达PTGS2的重组质粒；步骤三、过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得重组慢病毒；步骤四、重组慢病毒感染间充质干细胞。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二的具体方法为：利用前引物序列和后引物序列进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin用BamHI/AgeI于37℃进行酶切反应，收回酶切产物；将PCR扩增片段和酶切产物进行交换反应，然后冷却转化，获得过表达PTGS2的重组质粒。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，前引物序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，后引物序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；PCR扩增条件如下：98℃，5min；98℃10Ses，55℃10Ses，72℃90Ses，共30个循环；72℃，8min；4℃，∞。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，酶切反应条件为：配置50uL酶切体系，于37℃反应3h；酶切体系为ddH2O 41uL、10×CutSmart Buffer2 5uL、空质粒载体DNA 2uL、Age I 1uL、BamHI 1uL；空质粒载体DNA为1ug/uL；Age I为10U/μl；BamHI为10U/μl。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，交换反应条件为：10uL反应体系，37°C反应30min；反应体系为ddH2O 2.5uL、5×CEⅡBuffer 2uL、酶切产物目的基因片段2.5uL、PCR扩增片段2uL、ExnaseTMⅡ1uL；进行交换反应后置于冰水浴中冷却5min后立即转化；转化的具体操作为将10μL交换反应产物加入到100μL DH5α感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，然后42℃热激90s，冰水浴孵育2min，再加入500μL LB培养基，37℃过夜，获得过表达PTGS2的重组质粒。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，过表达PTGS2的重组质粒与慢病毒包装载体一起转染293T细胞进行慢病毒的包装，获得重组慢病毒。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，慢病毒包装载体为pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒。
进一步，本发明提供一种重组间充质干细胞的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤四中，重组慢病毒在聚凝安的存在下感染间充质干细胞，获得重组间充质干细胞，聚凝安的浓度为5ug/mL。
本发明还提供重组间充质干细胞的应用：重组间充质干细胞用于制备治疗急性肝衰竭的药物。
本发明中的间充质干细胞均来源于异体。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种调节炎症因子及免疫反应的重组间充质干细胞，利用PTGS2(即COX2)对MSCs进行修饰，提高MSCs的治疗疗效，一方面，通过修饰的MSCs对kupffer细胞极化影响免疫反应、NLRP3炎症小体的影响调节炎症，提高MSCs减轻肝脏损伤、促进肝脏再生的治疗功能；另一方面，PGE2修饰的MSCs还可以降低ALF体内过激的炎症反应，从而减轻肝脏损伤、促进肝脏再生。
附图说明
图1是小鼠骨髓间充质干细胞鉴定结果图；
图2是空质粒载体的结构示意图；
图3是pHelper 1.0、pHelper 2.0载体质粒的结构示意图；
图4是重组质粒包装和感染MSCs效率图；
图5是治疗ALF效果图；
图6是重组间充质干细胞调节Kupffer细胞极化图；
图7是重组间充质干细胞调节NLRP3炎性小体表达图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供一种重组间充质干细胞，利用重组慢病毒感染间充质干细胞获得。其中，重组慢病毒由过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得。过表达PTGS2可促进PGE2分泌。而过表达PTGS2的重组质粒由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-pu romycin制得。
重组间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、间充质干细胞的分离。
1、小鼠间充质干细胞的分离。
1)无菌状态下，取出4周龄小鼠小鼠股骨和胫骨，暴露骨髓腔；
2)用1ml一次性注射器抽取1ml MSCs Basal Medium，反复3-4次，将大部分骨髓冲出至15ml无菌离心管中；
3)1200rpm，4℃离心5min，弃去上清后，培养基重悬，置于25T培养瓶中(MSCsBasal Medium 4.5ml+0.5ml FBS)，放入细胞培养箱培养；
4)第2天半换液，然后2-3天更换新鲜培养基，标记为P0代，细胞密度达到90％后传代；
5)P3-6代MSCs用于后续实验。
小鼠间充质干细胞的鉴定。
1)胰酶消化贴壁的MSCs，PBS洗涤3次，1200rpm、4℃离心5min，1ml PBS重悬MSCs；
2)光学显微镜下对进行细胞计数，采用流式管收集细胞，细胞约5×105/管，最后加入PBS定容至1ml；
3)在各流式管中加入MSCs表面标记物抗体CD29、CD34、CD90、CD44和CD45，避光37℃孵育20min；
4)1200rpm、4℃、5min离心MSCs，PBS洗涤3次，1200rpm、4℃离心5min，0.5ml PBS重悬MSCs；
5)流式细胞仪上机检测鉴定，结果如图1所示。
步骤二、由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得过表达PTGS2的重组质粒。
步骤二的具体方法为：
1)利用前引物序列和后引物序列进行PCR扩增，得到PCR扩增片段。
在NCBI上找到小鼠PTGS2的序列(NM_011198)，设计引物序列，两端加入BamHI/AgeI酶切序列，前引物序列：5'TTCCAATCCATGTCAAAACCGT 3'(如SEQ ID No.1所示)，后引物序列：5'AGTCCGGGTACAGTCACACTT'(如SEQ ID No.2所示)。
PCR扩增条件如下：98℃，5min；98℃10Ses，55℃10Ses，72℃90Ses，共30个循环；72℃，8min；4℃，∞。
2)空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin用BamHI/AgeI于37℃进行酶切反应，收回酶切产物。
其中，酶切反应条件为：配置50uL酶切体系，于37℃反应3h。酶切体系为ddH2O41uL、10×CutSmart Buffer2 5uL、空质粒载体DNA 2uL、Age I 1uL、BamHI1uL；空质粒载体DNA为1ug/uL；Age I为10U/μl；BamHI为10U/μl。
3)将PCR扩增片段和酶切产物进行交换反应，然后冷却转化，获得过表达PTGS2的重组质粒。
其中，交换反应条件为：10uL反应体系，37℃反应30min。反应体系为ddH2O 2.5uL、5×CEⅡBuffer 2uL、酶切产物目的基因片段2.5uL、PCR扩增片段2uL、ExnaseTMⅡ1uL。
进行交换反应后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。转化的具体操作为将10μL交换反应产物加入到100μL DH5α感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，然后42℃热激90s，冰水浴孵育2min，再加入500μL LB培养基，37℃过夜，获得过表达PTGS2的重组质粒。
即以Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin为空质粒载体，如图2所示，长度为11945bp。将PTGS2序列导入该载体中构建重组质粒。倒入的位置在多克隆位点BamHI和AgeI之间，空质粒中的gcGFP将作为构建慢病毒和转染效率的指示蛋白。
取适量菌落进行测序，与目的基因序列进行比对后测序正确即可使用，过表达PTGS2的重组质粒的测序如SEQ ID No.3所示。
步骤三、过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得重组慢病毒。
其中，慢病毒包装载体为pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒，如图3所示。过表达PTGS2的重组质粒与慢病毒包装载体(过表达PTGS2的重组质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg)一起转染293T细胞进行慢病毒的包装，获得重组慢病毒。
本申请中应用的前引物序列、后引物序列、空质粒载体及慢病毒包装载体均购买自上海吉凯公司。
步骤四、重组慢病毒感染间充质干细胞。
其中，重组慢病毒在聚凝安(polybrene)的存在下感染间充质干细胞，获得重组间充质干细胞，聚凝安的浓度为5ug/mL。5ug/mL聚凝安可增加感染效率。
荧光显微镜观察感染效率，ELISA检测PGE2的分泌情况，如图4所示，表明重组慢病毒感染MSCs有效，可以促进MSCs分泌PGE2。
该重组间充质干细胞的应用：重组间充质干细胞用于制备治疗急性肝衰竭的药物。
1、PGE2的高表达增强MSCs治疗ALF的功能。
1)ALF模型的构建：选用6-8周大小的雄性C57BL/6J小鼠，于腹腔注射600mg/kg D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-Gal)和100mg/kg脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(LPS/D-Gal)构建小鼠ALF模型。
2)细胞移植：分别于尾静脉注射106个单纯MSCs、重组间充质干细胞(重组慢病毒感染间充质干细胞)以及生理盐水。
3)观察小鼠的七天生存率；小鼠眼球取血，全自动生化仪检测小鼠的ALT、AST肝功指标、小鼠肝脏固定后，HE切片染色检测炎症情况，并且进行坏死面积统计。图5为正常小鼠、诱导急性肝衰竭小鼠、MSCs移植治疗急性肝衰竭小鼠、过表达慢病毒感染MSCs(重组间充质干细胞)治疗急性肝衰竭小鼠、PBS(假手术组)治疗急性肝衰竭小鼠的治疗ALF的效果图。如图5所示，A显示的是急性肝衰竭小鼠的七天生存率，正常小鼠七天生存率为100％，慢病毒转染MSCs>MSCs移植>PBS>ALF的生存率；B是急性肝衰竭小鼠的ALT、AST检测，反应的肝脏损伤指标，可以发现慢病毒转染MSCs移植肝损伤最轻，MSCs移植次之；C是急性肝衰竭小鼠的HE染色，反应炎症坏死区域，下面的是坏死区域的统计，可以发现慢病毒转染MSCs移植坏死区域最少，MSCs移植次之。总体说明高表达PGE2的MSCs(重组间充质干细胞)具有更强的治疗ALF的效果。
2、PGE2的高表达增强MSCs的免疫调节、控制炎症功能。
1)将各组治疗ALF(步骤3)中)的肝脏标本进行F4/80、CD206免疫荧光染色。如图6所示，结果表明高表达PGE2的MSCs可促进M2型Kupffer细胞的极化。
2)将各组治疗ALF(步骤3)中)的肝脏标本进行Western Blot检测NLRP3炎症小体表达情况。如图7所示，结果表明高表达PGE2的MSCs可减轻炎症小体的表达。
本发明的重组间充质干细胞可以调节ALF肝脏中Kupffer细胞表型失衡的固有免疫反应，并且减轻炎症小体引起的细胞焦亡，具有维持免疫稳态、抵抗炎症损伤的功能，为ALF的治疗提供了一套更优的治疗方案，具有减轻肝脏损伤、促进肝脏再生的治疗功能。
序列表
<110> 南京鼓楼医院
<120> 一种重组间充质干细胞及其制备方法和在制备治疗急性肝衰竭药物的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttccaatcca tgtcaaaacc gt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtccgggta cagtcacact t 21
<210> 3
<211> 1812
<212> DNA
<213> 过表达PTGS2的重组质粒的测序结果(Sequencing results)
<400> 3
atgctcttcc gagctgtgct gctctgcgct gccctggggc tcagccaggc agcaaatcct 60
tgctgttcca atccatgtca aaaccgtggg gaatgtatga gcacaggatt tgaccagtat 120
aagtgtgact gtacccggac tggattctat ggtgaaaact gtactacacc tgaatttctg 180
acaagaatca aattactgct gaagcccacc ccaaacacag tgcactacat cctgacccac 240
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ggtgaaactc tggacagaca acataaactg cgccttttca aggatggaaa attgaaatat 720
caggtcattg gtggagaggt gtatcccccc acagtcaaag acactcaggt agagatgatc 780
taccctcctc acatccctga gaacctgcag tttgctgtgg ggcaggaagt ctttggtctg 840
gtgcctggtc tgatgatgta tgccaccatc tggcttcggg agcacaacag agtgtgcgac 900
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ttcaacattg aagaccagga gtacagcttc aaacagtttc tctacaacaa ctccatcctc 1200
ctggaacatg gactcactca gtttgttgag tcattcacca gacagattgc tggccgggtt 1260
gctgggggaa gaaatgtgcc aattgctgta caagcagtgg caaaggcctc cattgaccag 1320
agcagagaga tgaaatacca gtctctcaat gagtaccgca aacgcttctc cctgaagccg 1380
tacacatcat ttgaagaact tacaggagag aaggaaatgg ctgcagaatt gaaagccctc 1440
tacagtgaca tcgatgtcat ggaactgtac cctgccctgc tggtggaaaa acctcgtcca 1500
gatgctatct ttggggagac catggtagag cttggagcac cattctcctt gaaaggactt 1560
atgggaaatc ccatctgttc tcctcaatac tggaagccga gcacctttgg aggcgaagtg 1620
ggttttaaga tcatcaatac tgcctcaatt cagtctctca tctgcaataa tgtgaagggg 1680
tgtcccttca cttctttcaa tgtgcaagat ccacagccta ccaaaacagc caccatcaat 1740
gcaagtgcct cccactccag actagatgac attaacccta cagtactaat caaaaggcgt 1800
tcaactgagc tg 1812

Claims (10)

1.一种重组间充质干细胞，其特征在于：
利用重组慢病毒感染间充质干细胞获得；
其中，所述重组慢病毒由过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得；
所述过表达PTGS2的重组质粒由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得。
2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、间充质干细胞的分离；
步骤二、由扩增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得过表达PTGS2的重组质粒；
步骤三、所述过表达PTGS2的重组质粒和慢病毒包装载体转染细胞后获得所述重组慢病毒；
步骤四、所述重组慢病毒感染所述间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，步骤二的具体方法为：
利用前引物序列和后引物序列进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；
所述空质粒载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin用BamHI/AgeI于37℃进行酶切反应，收回酶切产物；
将所述PCR扩增片段和酶切产物进行交换反应，然后冷却转化，获得所述过表达PTGS2的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，所述前引物序列为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，后引物序列为如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；
所述PCR扩增条件如下：
98℃，5min；
98℃ 10Ses，55℃ 10Ses，72℃ 90Ses，共30个循环；
72℃，8min；
4℃，∞。
5.根据权利要求3所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，所述酶切反应条件为：配置50uL酶切体系，于37℃反应3h；
所述酶切体系为ddH2O 41uL、10×CutSmart Buffer2 5uL、空质粒载体DNA 2uL、Age I1uL、BamHI 1uL；
所述空质粒载体DNA为1ug/uL；
所述Age I为10U/μl；
所述BamHI为10U/μl。
6.根据权利要求3所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，所述交换反应条件为：10uL反应体系，37℃反应30min；
所述反应体系为ddH2O 2.5uL、5×CE Ⅱ Buffer 2uL、酶切产物目的基因片段2.5uL、PCR扩增片段2uL、ExnaseTM Ⅱ 1uL；
进行交换反应后置于冰水浴中冷却5min后立即转化；
所述转化的具体操作为将10μL交换反应产物加入到100μL DH5α感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，然后42℃热激90s，冰水浴孵育2min，再加入500μL LB培养基，37℃过夜，获得所述过表达PTGS2的重组质粒。
7.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，步骤三中，所述过表达PTGS2的重组质粒与慢病毒包装载体一起转染293T细胞进行慢病毒的包装，获得所述重组慢病毒。
8.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，所述慢病毒包装载体为pHelper 1.0载体质粒、pHelper 2.0载体质粒。
9.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
其中，步骤四中，所述重组慢病毒在聚凝安的存在下感染间充质干细胞，获得所述重组间充质干细胞，聚凝安的浓度为5ug/mL。
10.如权利要求1-9所述的重组间充质干细胞的应用，其特征在于：
所述重组间充质干细胞用于制备治疗急性肝衰竭的药物。
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