CN105316286A - 一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞。本发明的方法通过降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞C3-shM细胞中Mysm1基因的表达量降低，细胞增殖迅速，分化能力增强，PGE2分泌能力增强，对于CD3+T细胞增殖抑制能力增强。本发明制备方法操作简单、方便实用，建立了快速获得大量间充质干细胞的方法，有望解决临床MSC量不够的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞。
背景技术
间充质干细胞(MesenchymalStemcell,MSC)是最早从骨髓中分离的一种非造血干细胞。MSC可分化为成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞、神经元、肌肉细胞和肠上皮细胞等。MSC的多向分化特性使其成为理想的种子细胞用于衰老、病变引起的组织损伤修复及抑制免疫相关疾病。虽然MSC可从多种组织中分离获得，但在临床应用中存在的普遍问题是MSC纯度不够、数量不够且自我更新能力差等。
Mysm1是MYb-like,SWIRMandMPNdomain-containingprotein-1的缩写，又称为2A-DUB，或者KIAA1915/MYSM1，是组蛋白H2A去泛素化酶之一。Mysm1可以特异性的调节组蛋白H2A的单泛素化，从而改变组蛋白修饰，进而影响基因的转录。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速获得大量的间充质干细胞。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组间充质干细胞的制备方法。
本发明所提供的重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述Mysm1为组蛋白H2A去泛素化酶。
本发明的重组间充质干细胞与所述受体间充质干细胞相比，所述Mysm1基因的表达量降低；所述Mysm1基因的表达量可以为Mysm1基因的mRNA水平。
上述方法中，所述Mysm1是氨基酸序列为SEQIDNo.1所示的蛋白质。SEQIDNo.1由819个氨基酸组成。
上述方法中，所述Mysm1基因为编码SEQIDNo.1所示蛋白质的基因，其cDNA序列为SEQIDNo.2所示。
上述方法中，所述降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量包括向受体间充质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质。
上述方法中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质为下述1)-10)中任一种生物材料：
1)shRNA，是形成茎环结构的短发夹RNA；
2)表达1)所述的shRNA的表达载体；
3)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞；
4)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞；
5)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞；
6)1)所述shRNA产生的siRNA；
7)表达6)所述siRNA的表达载体；
8)表达6)所述siRNA的重组微生物细胞；
9)表达6)所述siRNA的重组动物细胞；
10)表达6)所述siRNA的重组植物细胞。
上述方法中，所述生物材料中，1)所述的shRNA的核苷酸序列是SEQIDNo.3。
上述方法中，所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质可为表达所述shRNA的重组慢病毒LV-shmMysm1。
上述方法中，所述重组慢病毒LV-shmMysm1与所述受体间充质干细胞共培养，抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因的表达。
上述方法中，所述重组慢病毒LV-shmMysm1按照如下方法制备：将表达SEQIDNo.3所示的shRNA的重组质粒、质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G共转染哺乳动物细胞，培养细胞后得到所述重组慢病毒。
上述方法中，所述表达SEQIDNo.3所示的shRNA的重组质粒具体可为质粒pLKO.1-shmMysm1。
上述方法中，所述哺乳动物细胞具体可为293T/17细胞
上述方法中，所述重组慢病毒的感染剂量MOI可为(5-40)，具体可为5。
上文中，所述离体的间充质干细胞可为哺乳动物的离体的间充质干细胞，具体可为小鼠的离体的间充质干细胞(胚胎间充质干细胞)。
本发明所提供的上述方法制备得到的重组间充质干细胞也属于本发明保护的范围。
上述重组间充质干细胞具有下述1)-6)中至少一种特性：
1)所述重组间充质干细胞的增殖能力高于所述受体间充质干细胞；
2)所述重组间充质干细胞的分化能力高于所述受体间充质干细胞；
3)所述重组间充质干细胞的成骨标志基因RUNX2的表达能力高于所述受体间充质干细胞；
4)所述重组间充质干细胞的成脂标志基因PPARγ的表达能力高于所述受体间充质干细胞；
5)所述重组间充质干细胞的前列腺素E2分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
6)所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
上文中，所述免疫抑制能力可为抑制T细胞增殖的能力，具体可为抑制CD3+T细胞增殖的能力。
实验证明，采用本发明的方法制备的重组间充质干细胞C3-shM细胞干扰了Mysm1基因的表达，增殖迅速，分化能力增强。以C3H/10T1/2细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为1，C3-G细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为0.96，C3-shM细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为0.56。C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的增殖能力相当，C3-shM细胞的增殖能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3-shM细胞的BrdU阳性细胞比例为24.1％，C3-G细胞的BrdU阳性细胞比例为15.3％。C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2的表达量和成脂相关基因PPARγ的表达量均明显高于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，以C3-G细胞中成骨相关基因RUNX2相对β-actin的表达量为1，C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2相对β-actin的表达量为23；以C3-G细胞中成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量为1，C3-shM细胞中成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量为15。在TNF-α和IFN-γ的刺激下，诱导培养的C3-shM细胞中PGE2基因表达水平显著升高，是诱导培养的C3-G细胞中PGE2基因表达水平的5倍；在非诱导培养和诱导培养条件下，C3-shM细胞分泌PEG2的水平均明显高于C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞，C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分泌PEG2的水平相当。C3-shM细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力相当。当C3-shM细胞与CD3+T细胞的数量比为1:10时，CD3+T细胞的增殖率只有33.2％，强于相同条件下C3-G细胞(57.7％)对CD3+T细胞增殖抑制能力；单纯CD3+T细胞的增殖率为85.7％。本发明制备方法操作简单、方便实用，建立了快速获得大量间充质干细胞的方法，有望解决临床MSC量不够的问题。
附图说明
图1为重组间充质干细胞的免疫表型鉴定结果图。C3-G细胞和C3-shM细胞免疫表型鉴定图中的横坐标和纵坐标与C3H/10T1/2细胞免疫表型鉴定图中的横坐标和纵坐标相同。
图2为实时荧光定量PCR检测细胞中Mysm1基因的mRNA表达量结果。其中，A为C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量检测结果；B为C3-G细胞和C3-shM细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量检测结果。
图3为流式细胞仪检测重组间充质干细胞的增殖能力结果。其中，A为C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞的增殖能力检测结果；B为C3-G细胞和C3-shM细胞的增殖能力检测结果。
图4为重组间充质干细胞的分化能力检测结果。其中，A为C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞中成骨相关基因RUNX2和成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量结果；B为C3-G细胞和C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2和成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量结果。
图5为荧光定量PCR检测细胞中PGE2的基因表达水平。其中，A为非诱导培养的C3-G细胞和非诱导培养的C3H/10T1/2细胞PGE2的基因表达水平；B为C3-shM细胞和C3-G细胞在诱导和非诱导培养条件下PGE2的基因表达水平。
图6为C3-shM细胞和C3-G细胞在诱导和非诱导培养后ELISA检测PGE2分泌水平。
图7为C3-shM细胞、C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞对CD3+T细胞增殖的抑制结果。其中，A为C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞对CD3+T细胞增殖的抑制结果；B为C3-shM细胞和C3-G细胞对CD3+T细胞增殖的抑制结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小鼠MSC细胞系C3H/10T1/2细胞为中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心的产品，产品目录号为SCSP-506。
下述实施例中的α-MEM培养液(Gibco公司，cat.no.12000-022)，DMEM-HG培养液(Gibco公司，cat.no.10566-024)，胎牛血清(Gibco公司)；0.01M、pH7.2-7.4的PBS缓冲液(下文中的PBS缓冲液)，地塞米松，磷酸化维生素C，β-磷酸甘油，胰酶、TRIZOL、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-Methylxanthine，IBMX)和吲哚美辛(indomethacin)均为Sigma公司的产品；TNF-α和INF-γ均为Perotech公司的产品；PGE2ELISA试剂盒为北京海诚远宏科技有限公司的产品；聚凝胺(Polybrene)为SantaCruz公司的产品；CD3εMicroBead试剂为德国美天旎生物技术有限公司的产品；反转录酶试剂盒和SYBRGreen试剂均为东洋纺(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)的产品；丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和ionomycin均为eBioscience公司的产品；CFSE为Invitrogen公司的产品；BrdU检测试剂盒为BD公司的产品；PEI(polyethylenimine)为PolysciencesInc公司的产品，产品目录号为Cat.No.23966)。
下述实施例中的抗小鼠CD44、CD105、Sca-1和MHCⅡ的抗体均为BD公司的产品。
下述实施例中的质粒pLKO.1-puroeGFPshRNA为Sigma公司的产品，产品目录号为SHC005V。
下述实施例中的质粒pLKO.1-shmMysm1，具体信息见：
http://www.broadinstitute.org/rnai/public/clone/details？cloneId＝TRCN000 0085873。
下述实施例中的质粒pMDLg/pRRE(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12251)，具体信息见http://www.addgene.org/12251/，公众可从中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的质粒pRSV-Rev(慢病毒包装质粒；Addgene，Cat.No.12253)，具体信息见http://www.addgene.org/12253/，公众可从中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的质粒pMD2.G(信封质粒；Addgene，Cat.No.12259)，具体信息见http://www.addgene.org/12259/，公众可从中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞
本实施例以小鼠MSC细胞系C3H/10T1/2细胞作为受体间充质干细胞，向该受体间充质干细胞中导入表达针对Mysm1基因的shRNA重组慢病毒，得到了与受体间充质干细胞相比，Mysm1基因的表达量降低的重组间充质干细胞。该重组间充质干细胞与受体间充质干细胞相比，增殖能力和分化能力均增加。具体方法如下：
1、通过Mysm1基因沉默制备重组间充质干细胞
LV-shmMysm1重组慢病毒：将293T/17细胞(又称HEK293T/17细胞；ATCCNumber：CRL-11268TM)接种于10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞达到85％融合时转染混合物1，继续培养60-72小时后收取上清，即为LV-shmMysm1重组慢病毒液(可以干扰Mysm1基因的表达)。
混合物1的制备方法：将10μg质粒pLKO.1-shmMysm1、5μg质粒pMDLg/pRRE、2.5μg质粒pRSV-Rev、3μg质粒pMD2.G与80μg转染试剂PEI混合，得到转染混合物，将转染混合物共同转染293T/17细胞后，得到表达针对Mysm1基因的shRNA的重组慢病毒。
pLKO.1-shmMysm1是表达降低Mysm1基因表达量的shRNA(名称为shmMysm1)的表达载体，Mysm1是氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质，shRNA的核苷酸序列是SEQIDNo.3。
LV-GFP重组慢病毒：将293T/17细胞接种于10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞达到85％融合时转染混合物2，培养60-72小时后收取上清，即为LV-GFP重组慢病毒液(可以干扰GFP基因表达)。
混合物2的制备方法：将10μg质粒pLKO.1-puroeGFPshRNA、5μg质粒pMDLg/pRRE、2.5μg质粒pRSV-Rev、3μg质粒pMD2.G与80μg转染试剂PEI混合，得到转染混合物，将转染混合物共同转染细胞后，得到表达针对eGFP基因的shRNA的重组慢病毒。
质粒pMDLg/pRRE、质粒pRSV-Rev和质粒pMD2.G都是制备慢病毒的质粒，质粒pLKO.1-shmMysm1为表达Mysm1基因的shRNA的质粒，质粒pLKO.1-puroeGFPshRNA为表达eGFP基因的shRNA的质粒。
将小鼠MSCs细胞系C3H/10T1/2悬浮于含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM培养液中，得到C3H/10T1/2细胞悬液。将C3H/10T1/2细胞悬液按2×105/cm2的密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞达到80％融合时，加入LV-shmMysm1重组慢病毒液(MOI＝5)，并加入polybrene(工作浓度为8μg/mL)，继续培养6小时后吸除原培养液，加入等体积的含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM培养液，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中传代培养，获得Mysm1基因敲除的C3H/10T1/2细胞，命名为实验组重组间充质干细胞(简称C3-shM细胞)。
对照组除将LV-shmMysm1重组慢病毒液替换为LV-GFP重组慢病毒液外，其余条件均不变，获得对照组间充质干细胞(简称C3-G细胞)。
二、重组间充质干细胞的鉴定
1、免疫表型鉴定
采用含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM培养液培养步骤一获得的C3-shM细胞，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待该细胞生长至对数期时采用0.25％胰酶消化，收集细胞，采用PBS缓冲液清洗3次，最后用PBS缓冲液重悬细胞，并用血细胞计数板计数。用PBS缓冲液稀释细胞悬液，得到C3-shM细胞液，C3-shM细胞液中细胞密度为2×106个/mL。向100μLC3-shM细胞液加入抗体，每种抗体单独加入细胞液中检测，所用抗体分别为抗小鼠CD44，CD105，Sca-1和MHCII的抗体，4℃摇床避光反应30分钟，然后在400g条件下离心5min，收集细胞沉淀并用PBS清洗2次，采用1％多聚甲醛200μL固定，进行流式分析。
C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的免疫表型鉴定方法同C3-shM细胞。
实验结果如下：C3-shM细胞和C3-G细胞均高效表达Sca-1分子、CD105分子和CD44分子，细胞所占比例均在90％以上，MHCII分子的表达量均比较低，与C3H/10T1/2细胞的表型鉴定结果一致(图1)。
2、重组间充质干细胞中Mysm1基因沉默效率鉴定
将培养至第三代的C3-shM细胞采用Tripure试剂裂解，收取细胞裂解液，提取RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，QRT-PCR)检测细胞中Mysm1基因的mRNA表达量，以相对于β-actin基因的mRNA表达量来表示，以检测该基因的沉默效率，实验重复三次。
其中，Mysm1基因引物对：
Forward：5’-GATGCAGAAGCAGCATACCA-3’；
Reverse：5’-CCTCCACAGACAAATGCTCA-3’。
C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的Mysm1基因沉默效率鉴定方法同C3-shM细胞。
实验结果如下：以C3H/10T1/2细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为1，C3-G细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为0.96，C3-shM细胞中Mysm1基因的mRNA相对于β-actin基因的mRNA表达量为0.56(图2)；C3-shM细胞中Mysm1基因的mRNA的表达量明显低于C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞
3、重组间充质干细胞的增殖能力检测
取对数生长期的C3-shM细胞接种于6孔板内，细胞密度为(1-1.5)×105/孔，待细胞生长到80％融合时，加入工作浓度为10μmol/L的BrdU，1小时之后按照BrdU检测试剂盒说明书进行细胞增殖能力的检测，实验重复三次。
C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的增殖能力检测方法同C3-shM细胞。
流式细胞仪检测结果如图3所示，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞的增殖能力相当，C3-shM细胞的增殖能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3-shM细胞的BrdU阳性细胞比例为24.1％，C3-G细胞的BrdU阳性细胞比例为15.3％，结果表明，干扰Mysm1表达后，间充质干细胞的增殖能力明显增强。
4、重组间充质干细胞的分化能力检测
细胞用成骨诱导分化完全培养液：DMEM-HG培养液含10％(体积百分比)胎牛血清，浓度为10-7M的地塞米松，浓度为10mM的β-磷酸甘油和浓度为50μM的磷酸化维生素C。
细胞用成脂诱导分化完全培养液：DMEM-HG培养液含10％(体积百分比)胎牛血清，浓度为10-6M的地塞米松，浓度为10ng/mL的胰岛素，浓度为0.5μM的IBMX和浓度为200μM的吲哚美辛。
将C3-shM细胞、C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分别用成骨诱导分化完全培养液和成脂诱导分化完全培养液进行诱导培养7天，分别获得成骨诱导的C3-shM细胞、C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞，成脂诱导的C3-shM细胞、C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞。
按照如下方法进行实时荧光定量PCR实验，实验重复三次：
收集诱导培养7天后的细胞，用TRIZOL抽提总RNA并且用反转录酶试剂盒反转录成cDNA。cDNA被用作模板添加TOYOBO品牌SYBRGreen试剂采用实时荧光定量PCR来确定特定基因的表达，以相对于β-actin基因的表达量来表示。
其中，小鼠β-actin基因引物对:
Forward：5’-CTTCCGCCTTAATACTTC-3’；
Reverse：5’-AAGCCTTCATACATCAAG-3’；
小鼠成骨相关基因RUNX2引物对：
Forward：5’-CCACAAGGACAGAGTCAGAT-3’；
Reverse：5’-GATAGGAGGGGTAAGACTGG-3’；
小鼠成脂相关基因PPARγ引物对：
Forward：5’-TTGATTTCTCCAGCATTTCT-3’；
Reverse：5’-GCACTTTGGTATTCTTGGAG-3’。
结果如图4所示，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞中成骨相关基因RUNX2的表达量和成脂相关基因PPARγ的表达量均相当；C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2的表达量和成脂相关基因PPARγ的表达量均明显高于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞。以C3-G细胞中成骨相关基因RUNX2相对β-actin的表达量为1，C3-shM细胞中成骨相关基因RUNX2相对β-actin的表达量为23；以C3-G细胞中成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量为1，C3-shM细胞中成脂相关基因PPARγ相对β-actin的表达量为15。
5、重组间充质干细胞高效分泌前列腺素E2(PGE2)的鉴定
培养液1：含10％(体积百分含量)胎牛血清、浓度为5ng/mL的TNF-α和浓度为5ng/mL的IFN-γ的α-MEM培养液。
1)荧光定量PCR检测PGE2的基因表达水平
将步骤一获得的重组病毒感染72h后的C3-shM细胞和重组病毒感染72h后的C3-G细胞分别用培养液1进行诱导培养，按照(1-1.5)×105的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中在TNF-α和IFN-γ的刺激下培养12h，分别获得诱导培养的C3-shM细胞和诱导培养的C3-G细胞。将步骤一获得的重组病毒感染72h后的C3-shM细胞、重组病毒感染72h后的C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分别用含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM培养液培养，按照(1-1.5)×105的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养12h，分别获得非诱导培养的C3-shM细胞、非诱导培养的C3-G细胞和非诱导培养的C3H/10T1/2细胞。
按照如下方法进行实时荧光定量PCR反应，实验重复三次：
用TRIZOL抽提细胞的总RNA并且用反转录酶试剂盒反转录成cDNA。cDNA被用作模板添加TOYOBO品牌SYBRGreen试剂采用实时荧光定量PCR来确定特定基因的表达，以相对于β-actin基因的表达量来表示。
其中，小鼠β-actin基因引物:
Forward：5’-CTTCCGCCTTAATACTTC-3’；
Reverse：5’-AAGCCTTCATACATCAAG-3’；
PGE2基因的基因引物：
Forward：5’-AAGGCCATGAATGACCAGGG-3’；
Reverse：5’-TGTTCGGTACACGTTGGGAG-3’。
结果如图5所示，非诱导培养的C3-shM细胞中PGE2基因的表达水平明显高于非诱导培养的C3-G细胞和非诱导培养的C3H/10T1/2细胞，非诱导培养的C3-G细胞和非诱导培养的C3H/10T1/2细胞的PGE2基因的表达水平相似。在TNF-α和IFN-γ的刺激下，诱导培养的C3-shM细胞中PGE2基因表达水平显著升高，是诱导培养的C3-G细胞中PGE2基因表达水平的5倍。
2)ELISA检测PGE2分泌水平
将步骤一获得的重组病毒感染72h后的C3-shM细胞、重组病毒感染72h后的C3-G细胞分别用培养液1进行诱导培养，按照(1-1.5)×105的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中在TNF-α和IFN-γ的刺激下培养12h，收集培养孔中的上清液，分别获得诱导培养的C3-shM细胞的上清液和诱导培养的C3-G细胞的上清液。将步骤一获得的重组病毒感染72h后的C3-shM细胞、重组病毒感染72h后的C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分别用含10％(体积百分含量)胎牛血清的α-MEM培养液培养，按照(1-1.5)×105的细胞密度接种于6孔板中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养12h，收集培养孔中的上清液，分别获得非诱导培养的C3-shM细胞的上清液、非诱导培养的C3-G细胞的上清液和非诱导培养的C3H/10T1/2细胞的上清液。
将收取的各细胞上清液，用PGE2ELISA试剂盒检测PGE2水平，实验重复两次。
结果如图6所示，在非诱导培养和诱导培养条件下，C3-shM细胞分泌PEG2的水平均明显高于C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞，C3-G细胞和C3H/10T1/2细胞分泌PEG2的水平相当。
6、重组间充质干细胞抑制T细胞增殖实验
小鼠麻醉后，将脾脏取出置于PBS缓冲液中，将脾脏研磨并用筛网过滤，离心，裂解红细胞，死细胞利用密度梯度法去除。CD3+T细胞按照流程采用CD3εMicroBead套装进行分选，得到CD3+T细胞。分选后的CD3+T细胞用CFSE常温避光标记7分钟，清洗2次后加入含PMA(50ng/mL)和ionomycin(1μg/mL)的1640完全培养液，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养12小时后，按照间充质干细胞与CD3+T细胞的数量比分别为1:160、1:80、1:40、1:20和1:10的数量比分别加入C3-shM细胞和C3-G细胞，共培养48小时；按照间充质干细胞与CD3+T细胞的数量比分别为1:80、和1:20的数量比分别加入C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，共培养48小时利用CFSE的荧光衰减密度来检测CD3+T细胞的增殖情况，实验重复三次。
结果如图7所示，C3-shM细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力明显强于C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞，C3H/10T1/2细胞和C3-G细胞对CD3+T细胞的增殖抑制能力相当。当C3-shM细胞与CD3+T细胞的数量比为1:20时，CD3+T细胞的增殖率只有44.7％，强于相同条件下C3-G细胞(67.6％)对CD3+T细胞增殖抑制能力；当C3-shM细胞与CD3+T细胞的数量比为1:10时，CD3+T细胞的增殖率只有33.2％，强于相同条件下C3-G细胞(57.7％)对CD3+T细胞增殖抑制能力；单纯CD3+T细胞的增殖率为85.7％。
Claims (9)
1.一种重组间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量，得到重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述Mysm1为组蛋白H2A去泛素化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Mysm1是氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述降低受体间充质干细胞中Mysm1基因的表达量包括向受体间充质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质为下述1)-10)中任一种生物材料：
1)shRNA；
2)表达1)所述的shRNA的表达载体；
3)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞；
4)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞；
5)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞；
6)1)所述shRNA产生的siRNA；
7)表达6)所述siRNA的表达载体；
8)表达6)所述siRNA的重组微生物细胞；
9)表达6)所述siRNA的重组动物细胞；
10)表达6)所述siRNA的重组植物细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：1)所述的shRNA的核苷酸序列是SEQIDNo.3。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述抑制所述受体间充质干细胞中所述Mysm1基因表达的物质为表达所述shRNA的重组慢病毒。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述离体的间充质干细胞为哺乳动物的离体的间充质干细胞。
8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的重组间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述重组间充干细胞具有下述1)-6)中至少一种特性：
1)所述重组间充质干细胞的增殖能力高于所述受体间充质干细胞；
2)所述重组间充质干细胞的分化能力高于所述受体间充质干细胞；
3)所述重组间充质干细胞的成骨标志基因RUNX2的表达能力高于所述受体间充质干细胞；
4)所述重组间充质干细胞的成脂标志基因PPARγ的表达能力高于所述受体间充质干细胞；
5)所述重组间充质干细胞的前列腺素E2分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
6)所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
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