JP5878650B2 - 間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法 - Google Patents
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Description
実例1:間充織幹細胞の分離、培養及び増加
脂肪・骨髄・臍帯の取得は、寄付者の同意のもとで行われている。ヒト脂肪由来幹細胞の採集、分離及び培養は、次の通りである:脂肪吸引物は、低密度の脂質成分と高密度の水性成分との2つの成分に分けられ、水性成分は、液体部分である。液体成分は、脂肪由来幹細胞の原料に用いられている。得られた脂肪組織を、無菌条件で同じ体積のPBS液を用いて3回〜5回繰り返し洗い、0.1%のI型コラゲナーゼを加え、37℃の水浴で振動し、60分間消化した後、10%のウシ胎仔血清を含有するDMEM培養基で消化を終止させる。1000gで10分間遠心し、上清液及び懸濁液の残存組織を捨て、2倍体積の赤血球分解液(NH4C1 154mmol/L+KHC03 10 mmol/L+EDTA0.1mmol/L)を加えて10分間静置し、遠心し、上清液を捨てる。適量なPBS液で3回洗い、200メッシュスクリーンで濾過し、細胞計数板で細胞懸濁液を計数し、1−3×105の細胞を150cm2の培養フラスコに接種し、20mLの無血清の高グルコースDMEM/f12の培養基を加え、20ng/mlのEGF、20ng/mlのEGF−2、10ng/mlのPDGF−BB、5ng/mlのIGF、0.5ng/mlのTGF−βを添加して均一に混合し、37℃、5%の二酸化炭素飽和湿度のインキュベーター内に置いて培養する。本発明の培養基は、未分化の間充織幹細胞を迅速に増加させる培養液であり、均一度の高い未分化の間充織幹細胞を培養することができるので、次の造血幹細胞の生成を確実に保障することができる。位相差顕微鏡で細胞の形態的特徴及び増殖状況を観察し、36〜48時間の経過後、初めて液を変え、その後、72時間ごとに液を変える。細胞融合が培養フラスコの底の80%を超えると、通常のトリプシンで消化して継代培養する。
生物情報学技術及び相関する予測ソフト(ターゲットスキャン;Target Scan)により、私達は、3種類のmiRNAs(図2参照)を選別・鑑定した。一番目のmiRNAは、miRNA−138−1であり、そのシーケンスが対応する短いヘアピンDNAのシーケンスは、次の通りである:
CCCUGGCAUGGUGUGGUGGGGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGUUGCCAAUCAGAGAACGGCUACUUCACAACACCAGGGCCACACCACACUACAGG
CGUUGCUGCAGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGACGAGCAGCGCAUCCUCUUACCCGGCUAUUUCACGACACCAGGGUUGCAUCA
CCGGGGAGAAGUACGGUGAGCCUGUGAUUAUUCAGAGAGGCUAGAUCCUCUGUGUUGAGAAGGAUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGUUCUCCAGG
RNA/DNAシンセサイザーにより4種類の異なるヌクレオチドモノマーを所定の設計シーケンスで3種類の異なる小型RNA一本鎖に合成し、これらの小型RNA一本鎖のシーケンスは、上述に説明した通りである。合成後の小型RNA一本鎖は、分離・純化により他の成分を除去し、アニールして3つの特徴を有するmiRNAsを形成する。これらの3種類のmiRNA分子を冷凍し乾燥粉末に濃縮して処方の小核酸活性成分とし、低温で保存する。乾燥粉末は、miRNA−138−1、miRNA−138−2及びmiRNA−433を含み、これらのmiRNAは、いずれも1つのEID1遺伝子のシードフラグメントを含む。これらをそれぞれEID1の3‘UTRシーケンスを含むルシフェラーゼプラスミド(pRL−TK)と共に脂肪間充織幹細胞をトランスフェクションし、その後36時間ルシフェラーゼ活性の結果を分析したところ、これらの小型RNA分子(siR−EID1、shR−EID1及びsRNA−Mを含む)がいずれもターゲット遺伝子EID1 (図3参照)を効果的に減少させて、異なるヒストン及び多種の転写因子をアセチル化するので、結果として間充織幹細胞を活性化させ他の幹細胞に容易に形質転換させやすいことが示された。小型RNAの干渉効果を強化するために、私達は、miRNA−138−1、miRNA−138−2及びmiRNA−433を合成した後、この3種類の小型RNA(sRNA−M)の組み合わせ戦略を用い、最終的な小核酸活性成分は、ドライパウダー重量が1:1:1の比率で混合して調整することを採択した。
前記小核酸成分の混合物及び細胞透過性ペプチド(北京吉利奥生物技術発展有限会社より購入する)を医学用脱イオン水に溶解し、10分間まんべんなくかき混ぜ、核酸及びポリペプチドの重量パーセントが1:10〜1:100の割合になるよう、撹拌しながら小核酸活性成分の溶液をゆっくりと細胞透過性ペプチドの溶液に滴下する。撹拌を続け、小核酸活性成分及び細胞透過性ペプチドを十分に混合することができるようにし、20分間静置して、ナノ粒子に十分にセルフ―アセンブル(self−assemble)させ、すぐに使用できるようにする。
表1:間充織幹細胞から造血幹細胞へ転換する誘導スキーム
表2:EID1mRNAの異なる部位をターゲティングするsiR−EID1分子のシーケンス
シーケンス番号 シーケンス(プラス鎖)
1 GGAGGACGACTACGACTATTT
2 GCATCTGTCTTGCTGGAAGCT
3 GGTTGAGCGGTTTGCACAATG
4 GGTTTGCACAATGTCGGAAAT
5 GGCGAGGAATTTGATGACTGG
6 GCGAGGAATTTGATGACTGGG
7 GCTCTTGAAGAAGCCGACAAG
8 GACAAGATGTTTCTGAGAACA
9 GGCGGGTTTCAGATGCATTAT
10 GCGGGTTTCAGATGCATTATG
11 GGTTTCAGATGCATTATGATT
12 GGACCCAACTTTCCGCTATCT
13 GCCACAGTTATCAAAGGCTAC
14 GACACTAAATGTGTGTGAATG
15 GCCCAGAAATTACCTTGGTAT
16 GCTTGTTATTTGTCATGCACC
17 GCTTCAGCTATCTAATTCACA
18 GCCCTATCAATGAGTATGTTG
19 GCCGTGGTTACCTTACTAAGA
20 GCTGAAGTTCTAGGAGAGTAA
21 GCTCCATTATAGCAGTAAAGA
22 GAACGAATATCCAATGCAACA
23 CAAATACTCACCATTGTGTTA
実例4:間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する小核酸−ポリペプチドのナノ粒子。
miRNA−433及びmiR−138をヒト間充織幹細胞にトランスフェクションして1〜2日間後、付着した紡錘状間充織幹細胞を浮遊する円形の幹細胞に形質転換する。造血幹細胞を誘導し増加させる培養基(表3は、処方を示している)において5×105/mlの細胞密度で少なくとも3日間培養し、これらの幹細胞は、徐々に間充織幹細胞の特異的抗原(例えば、CD44、CD73、CD105、CD166、CD29、F1k−1)を失うと同時に、造血幹細胞の表面抗原(例えば、CD34、CD133、CD49f、CD38、CD45、CD41及びCD90)(図4参照)を得る。また、迅速に増加することができる。
小型RNA分子がトランスフェクションされた間充織幹細胞を、臨界致死量の放射処理を経たマウスの体内に移植する。10週間後、ヒト脂肪間充織幹細胞から分化した造血細胞を検出することができる。その後、マウスの骨髄から、移植されたヒト間充織幹細胞から分化した造血幹細胞を分離し、臨界致死量の放射処理を経た他のマウスの体内に再度移植する。10週間後、抗ヒトモノクローナル抗体を用いてマウスの骨髄に対してFACS分析を行った結果、臨界致死量の放射処理を経たマウスの骨髄から造血幹細胞及び造血前駆細胞のマーカー遺伝子の発現を検出した。これらの造血前駆細胞(M−HSCs)は、CD33、CD13、CD19、CD3、CD235、CD61及びCD56のような分子マーカーを特に発現させる血球細胞にさらに分化することができる(図8参照)。明らかに、この種類の誘導造血幹細胞は、再生不良性貧血及び白血病のような血液病の治療に更に用いることができる。
Claims (10)
- 均質な間充織幹細胞の培養基を調整するステップ1と、
多種の小型RNA分子を組合わせるステップ2と、
核酸とポリペプチドのナノ粒子を組み合わせて移入するステップ3と、
転換された造血幹細胞の培養基を誘導し増殖させるステップ4と、
多種の造血関連遺伝子を活性化するステップ5とを含み、
前記ステップ2における前記多種の小型RNA分子は、miR−138−1、miR−138−2、及びmiR−433であることを特徴とする、間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。 - 前記ステップ1における培養基は、無血清の高グルコースDMEM/F12培養基にEGF、FGF−2、PDGF−BB、IGF及びTGF−βの5因子を添加する培養基であることを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記ステップ4における培養基は、無血清の高グルコースDMEM/F12培養基にshh、SCF、TPO、Flt3L、デルタ1、IGFBP、アンジオポエチン、BMP4、LIF、TGF−βの10因子を添加する培養基であることを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記ステップ2における多種の小型RNA分子の組み合わせの比率は、miR−138−1、miR−138−2、miR−433の粉末重量比が1:1:1であることを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記ステップ3における核酸とポリペプチドのナノ粒子のアセンブル方法は、ステップ2における多種の小型RNA分子の組み合わせの混合物とポリペプチドトランスフェクション試薬を医学用脱イオン水にそれぞれ溶解した後、撹拌しながら多種の小型RNA分子の混合物溶液をポリペプチドトランスフェクション試薬溶液に滴下し、小型RNAの活性成分とポリペプチドトランスフェクション試薬を混合させるように撹拌を続け、20分間静置し、ナノ粒子にセルフ−アセンブルさせることを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記核酸とポリペプチドのナノ粒子により間充織幹細胞をトランスフェクションする方法は、1日1回トランスフェクションさせ、全部で2回トランスフェクションさせることを特徴とする請求項5に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記転換された造血幹細胞の培養は、造血幹細胞を誘導し増加させる培養基において5×105/mlの細胞密度を用いて少なくとも3日間培養することを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記活性化される多種の造血関連遺伝子は、Runx1、Bmi1、HoxB4、Gata1、Gata2、Gfi1、Sall4、Pu.1、Scl、Mcl、C−myc、C−myb、Kcl4、Cxcr4及びCrbであることを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 前記造血幹細胞を誘導し増加させる培養基の処方は、0−1μg/m1 ソニック ヘッジホッグ、0−1μg/m1 デルタ1、0−1μg/m1 FGF2、0−1μg/m1 IGFBP、0−1μg/m1 SCF、0−1μg/m1 アンジオポエチン、0−1μg/m1 TPO、0−1μg/m1 MBP、0−1μg/m1 LIF、0−1μg/m1 TGF−β、0−100μM TEPA、及び1−5mM NACを含むことを特徴とする請求項1に記載の間充織幹細胞を誘導して造血幹細胞に転換する方法。
- 試薬キットは、小型RNA分子であるmiR−138−1、miR−138−2、及びmiR−433がポリペプチドのナノ粒子と共に間充織幹細胞にトランスフェクションされることで間充織幹細胞から転換される造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基を含み、前記造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基は、造血幹細胞の増殖に必要な細胞増殖因子及び細胞分化抑制剤を含み、前記造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基の処方は、80−100%(v/v)のDMEM F12基本培養基、0−1μg/m1 ソニック ヘッジホッグ、0−1μg/m1 デルタ1、0−1μg/m1 FGF2、0−1μg/m1 IGFBP、0−1μg/m1 SCF、0−1μg/m1 アンジオポエチン、0−1μg/m1 TPO、0−1μg/m1 MBP、0−1μg/m1 LIF、0−1μg/m1 TGF−β、0−100μM TEPA、及び1−5mM NACであることを特徴とする造血幹細胞を誘導し増殖させる培養基試薬キット。
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