CN103898050B - 高效分泌一氧化氮的重组间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效分泌一氧化氮的重组间充质干细胞及其制备方法与应用。该重组间充质干细胞,是降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述SOCS1是细胞因子信号传导抑制蛋白1。本发明的重组间充质干细胞分泌NO能力强，从而抑制T细胞活化的能力增强。本发明的重组间充质干细胞制备方法操作简单、方便实用。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效分泌一氧化氮的重组间充质干细胞及其制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且已从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞；同时，MSC是一种重要的免疫调节细胞，MSC在炎症细胞因子刺激后对免疫系统表现出很强的抑制作用，所以MSC应用于减少免疫排斥，延长移植物存活时间，治疗相关免疫失调症，如自身免疫疾病等方面。MSC在炎症因子刺激下能够分泌大量的趋化因子和具有免疫抑制特性的一氧化氮（NO）。在趋化因子的作用下，免疫细胞被趋化到MSC周围并被其局部高浓度的NO所抑制。然而在最新研究中，MSC被发现在一定条件下同样可以促进免疫反应，如果MSC所处环境中没有足够的促炎症细胞因子诱导其产生足量的NO，MSC是可以增强免疫反应的，这一现象在体外的细胞增殖实验以及迟发超敏反应的疾病动物模型中都得到了充分的验证。
细胞因子信号传导抑制蛋白1（suppressorofcytokinesignaling1,SOCS1）以负反馈通路来调控IFNγ、IFNα、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21在内的多种细胞因子信号通路。当细胞因子结合其受体时，SOCS1的表达就会上调，然后SOCS1结合Janus激酶酪氨酸激酶（JAK）的催化位点、结合并募集泛素转移酶复合体靶向到JAK中进行蛋白体降解，进而抑制JAK活性。SOCS1也调控STAT和间接调节TLR信号通路。树突细胞是专职的抗原递呈细胞，在维持自身抗原耐受和激活先天及适应性免疫方面具有关键的调节作用。以前研究表明SOCS1能在树突细胞中被诱导，沉默SOCS1能增强树突细胞和抗原特异抗肿瘤免疫的抗原递呈。下调树突细胞SOCS1的产生能够允许更多的信号传递到T细胞，并且导致记忆T细胞群体的扩张。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供在炎症因子刺激下能够高效分泌一氧化氮的重组间充质干细胞及其制备方法与应用。
本发明所提供的重组间充质干细胞,是降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述SOCS1为细胞因子信号传导抑制蛋白1。
本发明所提供的制备所述重组间充质干细胞的方法，包括降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到所述重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述SOCS1为细胞因子信号传导抑制蛋白1。
其中，所述离体的间充质干细胞为哺乳动物的离体的间充质干细胞，如小鼠的离体的间充质干细胞（骨髓间充质干细胞或胚胎间充质干细胞），所述SOCS1是具体为氨基酸序列为SEQIDNo.2的蛋白质。SEQIDNo.2由212个氨基酸组成。
上述重组间充质干细胞或方法中，所述降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量包括向所述受体间充质干细胞中导入抑制所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的物质。
上述重组间充质干细胞或方法中，抑制所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的物质可为任何可以降低所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的shRNA、编码所述shRNA的DNA分子、表达所述shRNA的表达载体、表达所述shRNA的重组微生物（如病毒）；抑制所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的物质还可为降低所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的siRNA、编码所述siRNA的DNA分子、表达所述siRNA的表达载体、表达所述siRNA的重组微生物（如病毒）。
其中，降低所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补。在本发明的一个实施方式中，降低所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的shRNA的核苷酸序列是SEQIDNo.1。
上述重组间充质干细胞或方法中，所述重组间充质干细胞具有下述A1和A2中的至少一种特性：
A1、所述重组间充质干细胞的一氧化氮分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
A2、所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
上述重组间充质干细胞或方法中，所述免疫抑制能力体现为抑制迟发型超敏反应能力。
上述的重组间充质干细胞在制备抑制T细胞增殖的产品（如药物）中的应用和在制备免疫抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
以上述的重组间充质干细胞为活性成分的抑制T细胞增殖的产品和免疫抑制剂，也属于本发明的保护范围。
上文中，所述免疫抑制剂均可为迟发型超敏反应抑制剂。
上文中，所述T细胞均可为CD3+T细胞。
下述1）-10）中的任一种抑制所述受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的生物材料也属于本发明的保护范围：
1）shRNA，是形成茎环结构的短发夹RNA，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补；
2）表达1）所述的shRNA的表达载体；
3）表达1）所述的shRNA的重组微生物细胞；
4）表达1）所述的shRNA的重组动物细胞；
5）表达1）所述的shRNA的重组植物细胞；
6）1）所述shRNA产生的siRNA；
7）表达6）所述siRNA的表达载体；
8）表达6）所述siRNA的重组微生物细胞；
9）表达6）所述siRNA的重组动物细胞；
10）表达6）所述siRNA的重组植物细胞。
上述生物材料中，1）所述的shRNA的一条链的核苷酸序列可为SEQIDNo.1，1）所述的shRNA的另一条链的核苷酸序列与SEQIDNo.1反向互补；1）所述shRNA产生的siRNA的一条链序列可为SEQIDNo.1的第4-22位，1）所述shRNA产生的siRNA的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补。
实验证明，同样数量的降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞MSC/SOCS1sh在炎性因子刺激下分泌NO的能力是受体间充质干细胞的2.6-4倍，所述重组间充质干细胞在MSC：T=1：80时仍能抑制T细胞增殖，重组间充质干细胞MSC/SOCS1sh与受体间充质干细胞相比，抑制迟发型超敏反应能力增强。本发明的重组间充质干细胞可稳定传代，冻存，复苏。本发明的重组间充质干细胞分泌NO能力强，从而抑制T细胞活化的能力增强。本发明的重组间充质干细胞制备方法操作简单、方便实用。因此，本发明建立了稳定的高效分泌NO的重组间充质干细胞的制备方法，为间充质干细胞的研究和应用奠定了基础。
附图说明
图1为炎症细胞因子诱导MSCs中的SOCS1表达。
A为原代MSCs用2ng/mlIFNγ+TNFα分别刺激0h、12h和24h的SOCS1基因相对表达量。
B为C3H10T1/2用2ng/mlIFNγ+TNFα分别刺激0h、12h和24h的SOCS1基因相对表达量。
C、C3H10T1/2分别用0、0.5、2和10ng/mlIFNγ+TNFα来处理24h，real-timePCR测定SOCS1mRNA含量。
D、C3H10T1/2分别用0、0.5、2和10ng/mlIFNγ+TNFα来处理24h，westernblot检测SOCS1含量。
图2为SOCS1敲低后MSCs的特性。
A.SOCS1敲低。SOCS1mRNA(上图)通过real-timePCR确定,蛋白表达(下图)通过westernblot检验。
B.BrdU掺入通过流式细胞仪分析评定。数值为表示方框内的细胞百分数。
C.MSC/CTLsh和MSC/SOCS1sh细胞表面标记通过流式细胞仪分析检验，横线上的数值表示方框内的细胞百分数。
D.成脂分化通过油红染色来检验；成骨分化用碱性磷酸酶ALP来评定。
图3为MSC/SOCS1sh增强对T细胞增殖的抑制。
图3中的百分数为发生增殖的细胞的百分比。左侧列由上至下分别为1：10MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：20MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：40MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：80MSC/CTLsh和T细胞共培养；右侧列由上至下分别为1：10MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：20MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：40MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：80MSC/SOCS1sh和T细胞共培养。
图4为敲低SOCS1能够增强MSCs体内的免疫抑制能力。
A.SOCS1缺陷的MSCs增强黑色素瘤生长。16天后，杀鼠取黑色素瘤并称其重量(上面柱状图)。每一组代表性的肿瘤拍照(下面照片)。数据表示的是代表性的3次独立实验mean±S.D.，＊P<0.05和＊＊P<0.01。PBS表示PBS组、MSC/SOCS1sh表示MSC/SOCS1sh组、MSC/CTLsh表示MSC/CTLsh组。
B.SOCS1缺陷的MSCs抑制迟发型超敏反应(DTH)。数据表示的是代表性的3次独立实验mean±S.D.，＊P<0.05和＊＊P<0.01。Saline表示Saline组、OVA表示OVA组、MSC/SOCS1sh表示MSC/SOCS1sh组、MSC/CTLsh表示MSC/CTLsh组，MSC表示受体间充质干细胞组。
图5为SOCS1负调控MSCs中的iNOS表达和NO生产。
A.iNOS表达通过real-timePCR(上图)和westernblot(下图)测定.MSC/CTLsh或MSC/SOCS1sh经或不经2ng/mlIFNγ+TNFα处理24h。
B.MSC/CTLsh或MSC/SOCS1sh不经过(上图)或经过(下图)照射处理,然后用2ng/mlIFNγ+TNFα处理24h。用Griess测定上清液中NO的含量。
C.CD3+T细胞经过PMA(50ng/ml)和ionomycin(1ug/ml)刺激24h,然后与MSC/CTLsh或MSC/SOCS1sh以1:20的比率(MSC:T)培养，在共培养开始时，添加L-NMMA(1mM)，48h后，所有的细胞经流式细胞仪测定T细胞增殖情况，数值近似等于方框内的细胞数。
图6为慢病毒载体GV118的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料和方法
下述实施例中的主要试剂与仪器如下：
α-MEM培养液（Gibco公司，cat.no.12000-022），DMEM-HG培养液（Gibco公司，cat.no.10566-024），胎牛血清（上海依科赛生物制品有限公司产品cat.no.FSP500）；0.01M、pH7.2-7.4的PBS，地塞米松，磷酸化维生素C，β-磷酸甘油，Ⅱ型胶原酶，胰酶，油红O染液，碱性磷酸酶试剂盒为Sigma公司产品。
慢病毒载体GV118(上海吉凯基因化学技术有限公司)的图谱如图6所示，含有荧光标记EGFP，含有元件mU6-MCS-Ubi-EGFP。
小鼠：C57BL/6小鼠从军事医学科学院实验动物中心购买，并且在无特定病原体条件下饲养。动物在年龄和性别上都相互匹配，并且所有的实验操作都符合军事医学科学院实验动物条例。
细胞：来源于骨髓的小鼠原代MSCs(MSCs)的分离和培养按照下述文献中的方法进行：Yang,Y.M.,Li,H.,Zhang,L.,Dang,R.J.,Li,P.,Wang,X.Y.,Zhu,H.,Guo,X.M.,Zhang,Y.,Liu,Y.L.,etal.(2013).[Anewmethodforisolatingandculturingmousebonemarrowmesenchymalstemcells].Zhongguoshiyanxueyexuezazhi/Zhongguobinglishenglixuehui=Journalofexperimentalhematology/ChineseAssociationofPathophysiology21,1563-1567。
鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)细胞（简称C3H10T1/2）从ATCC获得，并且生长在含有4mM谷氨酰胺、100U/ml青链霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液中(MEM,Gibco)，在5%CO237℃培养。
FACS检测MSC的免疫表型：抗鼠CD45,CD105,CD44,CD29,CD11b,Sca-1（Sca1）抗体来自BioLegend.BrdUflowkit来自BDPharmingen(SanDiego,CA,USA).数据在FACSAriaII(BD)上收集并且用FlowJo软件(TreeStar)分析。
病毒感染：MSCs在转染前一天种含血清和无抗生素的培养液中，次日，在10ug/mlpolybrene(SantaCruz)存在下，用含有表达鼠SOCS1shRNA(MSC/SOCS1sh)或对照慢病毒(MSC/CTLsh)(ShanghaiGeneChemCo.,Ltd,China)慢病毒来转染MSCs。稳定的转染克隆通过FACS筛选获得.
体外分化：对于成骨分化，细胞用成骨诱导分化完全培养液（DMEM-HG培养液含10%胎牛血清及10-7M地塞米松，10mMβ-磷酸甘油，50μMascorbate-2phosphate）来培养。对于成脂分化，细胞用成脂诱导分化完全培养液（DMEM-HG培养液含10%胎牛血清及10-6M地塞米松，10ng/ml胰岛素，0.5μMIBMX（isobutyl-1-methyl-xanthine）,200μMindomethacin）来培养，ALP检测和Oil-Red-O染色按照下述文献中的方法进行：Yang,Y.M.,Li,H.,Zhang,L.,Dang,R.J.,Li,P.,Wang,X.Y.,Zhu,H.,Guo,X.M.,Zhang,Y.,Liu,Y.L.,etal.(2013).[Anewmethodforisolatingandculturingmousebonemarrowmesenchymalstemcells].Zhongguoshiyanxueyexuezazhi/Zhongguobinglishenglixuehui=Journalofexperimentalhematology/ChineseAssociationofPathophysiology21,1563-1567。
NO检测：MSCs用IFNγ和TNFα(R&D)刺激.培养上清液的NO使用Griess试剂(Sigma-Aldrich)测定。简言之，所有NO3被NO还原酶转换成NO2,并且总的NO2用Griess反应检测。
定量PCR：总RNA用TRIZOL(Sigma)抽提并且用反转录酶试剂盒(Takara)反转录成cDNA。cDNA被用作模板添加TOYOBO品牌SYBRGreen试剂(Shanghai,China)在实时定量PCR来确定特定基因表达。其中，小鼠β-actin基因引物：
CTTCCGCCTTAATACTTC(forward)和AAGCCTTCATACATCAAG(reverse);小鼠SOCS1基因引物：CAACGGAACTGCTTCTTC(forward)和AAGGCAGTCGAAGGTCTC(reverse);小鼠iNOS基因引物：CAGCTGGGCTGTACAAACCTT(forward)和CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG(reverse)。
Westernblot：在SDS样品缓冲液的蛋白样品被加热并且在SDS-polyacrylamindegel上分裂.蛋白电印迹到PVDF转移膜上，并且用抗SOCS1,iNOS或β-ACTIN(CellSignalingTechnology,Inc.)抗体孵育，4℃过夜。最后，根据手册说明，把这个印迹易受于化学发光检测。
统计分析.数据用mean±S.D.来表示，通过非配对双尾t检验来评定数据差异。
本申请中，SOCS1是氨基酸序列为SEQIDNo.2的蛋白质，其NCBIReferenceSequence:NP_001258532.1。
实施例1、原代培养的鼠骨髓MSC和鼠胚胎MSC细胞系在炎症因子刺激下SOCS1基因表达量增加的倍数相同
将来源于骨髓的C57BL/6小鼠原代MSCs（简称原代MSCs）和鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TW)（简称C3H10T1/2）分别经过2ng/ml炎症因子IFNγ+TNFα刺激不同时间(12h和24h)，其SOCS1含量的变化用实时定量PCR检测。结果如图1中A和图1中B所示，与对照组（未进行炎症因子刺激）相比，来源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)中SOCS1显著的被诱导，并且SOCS1基因表达量增加的倍数相同。说明来源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM对炎症因子的反应是类似的，细胞系在体内外研究中更容易获得也更高效，所以随后的研究使用MSC细胞系—C3H10T1/2，并且指代MSCs。
具体的实验方法如下：将来源于骨髓的小鼠原代MSCs和鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)分别在含有2ng/mlIFNγ、2ng/mlTNFα、4mM谷氨酰胺、100U/ml青链霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液在5%CO237℃分别培养12h和24h进行炎症因子的刺激，同时设不进行炎症因子刺激的对照，用实时定量PCR检测这两种细胞中的SOCS1基因的表达量。
实施例2、间充质干细胞中SOCS1表达与炎症因子呈现出显著的剂量依赖性关系
将鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)在含有不同浓度炎症因子、4mM谷氨酰胺、100U/ml青链霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液在5%CO237℃培养24h，用实时定量PCR检测这两种细胞中的SOCS1基因的表达量并用westernblot检测SOCS1的表达量。所用的培养液中炎症因子的浓度分别为0ng/mlIFNγ和0ng/mlTNFα（0ng/mlIFNγ+TNFα）、0.5ng/mlIFNγ和0.5ng/mlTNFα（0.5ng/mlIFNγ+TNFα）、2ng/mlIFNγ和2ng/mlTNFα（2ng/mlIFNγ+TNFα）、10ng/mlIFNγ和10ng/mlTNFα（10ng/mlIFNγ+TNFα）。结果如图1中C和D所示，随着炎症因子IFNγ和TNFα刺激的浓度(0.5,2和10ng/ml)升高，鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)的SOCS1表达呈现出显著的剂量依赖性关系，在最高的炎症因子组，SOCS1mRNA水平升高到5倍(图1中C)。为了证实实时定量PCR结果，进一步做了westernblot检测。用同样处理，SOCS1的蛋白水平也显示显著增加(图1中D)。
实施例3、SOCS1基因表达量低于受体间充质干细胞的重组间充质干细胞的构建
1、抑制受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的物质的制备
该实验所制备的抑制受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的物质是表达靶向SOCS1的shRNA（名称为SOCS1sh）的重组慢病毒（名称为SOCS1sh慢病毒）。同时制备表达阴性对照shRNA（名称为CTLsh）的重组慢病毒（名称为CTLsh慢病毒）。
SOCS1sh的序列如下：
ucuACCUGAGUUCCUUCCCCUUcucgagAAGGGGAAGGAACUCAGGUaguuuuuuc（SEQIDNo.1）；
CTLsh的序列如下：ucuUUCUCCGAACGUGUCACGUcucgagACGUGACACGUUCGGAGAAaguuuuuuc。
将SOCS1sh的编码DNA（将SEQIDNo.1的核苷酸U替换为T的双链DNA）插入GV118的HpaⅠ和XhoⅠ位点间得到SOCS1sh的表达载体，将CTLsh的编码DNA（将SEQIDNo.2的核苷酸U替换为T的双链DNA）插入GV118的HpaⅠ和XhoⅠ位点间得到CTLsh的表达载体。用SOCS1sh的表达载体包装表达SOCS1sh的慢病毒（名称为SOCS1sh慢病毒），用CTLsh的表达载体包装表达CTLsh的慢病毒（名称为CTLsh慢病毒）。SOCS1sh慢病毒和CTLsh慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司制备。SOCS1sh慢病毒和CTLsh慢病毒中除表达的shRNA序列不同外，其它均相同。
2、一氧化氮分泌能力增加的重组间充质干细胞的制备
将C3H10T1/2作为受体间充质干细胞，制备一氧化氮分泌能力增加的重组间充质干细胞。具体方法如下：将鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)在转染前一天接种在含血清和无抗生素的培养液中，次日，在10ug/mlpolybrene（聚凝胺）(SantaCruz)存在下，用表达SOCS1sh的SOCS1sh慢病毒或表达CTLsh的CTLsh慢病毒转染鼠胚胎MSC细胞系C3H10T1/2(CCL-226TM)。根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，通过FACS筛选获得稳定的SOCS1sh慢病毒转染克隆（名称为MSC/SOCS1sh），稳定的CTLsh慢病毒转染克隆（名称为MSC/CTLsh）。MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh都显示绿色荧光。MSC/SOCS1sh即为一氧化氮分泌能力增加的重组间充质干细胞。
3、一氧化氮分泌能力增加的重组间充质干细胞的特性
3.1SOCS1基因表达特性
实时定量PCR检测受体间充质干细胞—C3H10T1/2、MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh中的SOCS1基因表达情况，westernblot检测MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh中的SOCS1表达情况，结果表明MSC/SOCS1sh中的SOCS1基因表达量是受体间充质干细胞—C3H10T1/2和MSC/CTLsh的1/3，说明靶向SOCS1的shRNA显著降低了受体间充质干细胞中的SOCS1基因表达量。westernblot的结果与实时定量PCR检测结果一致（图2中A）。图2中A中，MSC表示受体间充质干细胞C3H10T1/2。
3.2增殖特性、细胞周期动力学特性和免疫表型
下一步，分析了SOCS1在MSCs中沉默的作用。为了检验SOCS1对MSCs增殖的作用，做了细胞计数。培养10代，MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh的增殖活性没有显著差异，表现为初始均为4×103个/孔，三天后分别为(55±9.9)×103个/孔和(58±4.9)×103个/孔，七天后分别为(472.5±74.2)×103个/孔和(464±121)×103个/孔。而且，BrdU插入数据显示SOCS1沉默没有引起细胞周期动力学的明显改变(图2中B)。MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh的CD105,CD44,CD29,Sca-1呈现阳性，CD45,CD11b为阴性；FACS结果显示MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh含有相似的免疫表型(图2中C)。
其中，细胞计数的方法如下：将MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh分别按4×103个/孔种于48孔板，第三天和第七天分别用0.25%的胰酶(Gibco,cat.no.12664-025)消化3-5分钟，然后计数。
BrdU掺入法检测细胞增殖：将MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh分别按1.5×105个/孔种于6孔板，每孔加入BrdU（Sigma,B5002）至其终浓度为10μM，2小时后用0.25%的胰酶消化细胞，按试剂盒说明进行抗体标记（BD，cat.no.552598）。
3.3能分化为成脂细胞和成骨细胞
MSCs能够分化成脂肪细胞和成骨细胞取决于体外的培养条件。当用成脂诱导分化完全培养液培养时，MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh能够分化成脂肪，通过油红染色检测，MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh显示正常的脂滴聚集(图2中D上图)。当用成骨诱导分化完全培养液培养时，MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh能够被诱导成骨分化,成骨诱导后，MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh显示增强的ALP活性，ALP为一种成骨细胞分化的早期标志(图2中D下图)。对分化标志物Runx2andOsteocalcium的表达分析证实类似的成骨进程。
3.4增强体内外的免疫抑制
3.4.1增强体外免疫抑制
检验了敲低SOCS1的MSCs—MSC/SOCS1sh免疫调节功能。由于在免疫细胞中，SOCS1通过抑制Januskinases(JAKs)作为诸如IFNγ、IL-12的多种细胞因子信号传递的负反馈调节剂。假设MSC/SOCS1sh具有免疫增强活性。为了检验这个假设，小鼠CD3+T细胞（下文简称T细胞）用CFSE染色并用PMA和inomyosin来刺激,然后与不同比率的MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh培养。正如所料，从CFSE强度降低所示，T细胞增殖被MSC/CTLsh抑制。然而，与刺激T细胞增殖相反，MSC/SOCS1sh展示更强的免疫抑制活性。在1:80(MSCs：Tcells)的低比率时，MSC/SOCS1sh能显著地抑制T细胞增殖，而MSC/CTLsh组的T细胞增殖比例与受体间充质干细胞相近(图3)。
具体实验方法如下：经CD3εMicroBeadKits(MiltenyiBiotec)从小鼠脾脏分离的CD3+T细胞用5μMCFSE(Invitrogen)在室温标记7min。根据手册方案说明来中止标记。洗后，CD3+T细胞用50ng/mlPMA，1ug/mlionomycin(Sigma)激活24h,然后与MSC/SOCS1sh或MSC/CTLsh进行共培养。细胞分裂由荧光密度减弱所反映，经流式细胞仪分析。
实验设八个处理，分别为1：10MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：20MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：40MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：80MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：10MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：20MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：40MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：80MSC/SOCS1sh和T细胞共培养。将T细胞按6×105个细胞/孔种入48孔板，按照相应的比例接入MSC，共培养48h后收集T细胞，所有细胞通过CFSE强度减弱所示使用流式细胞仪来检测T细胞增殖，数据代表三次独立的实验。
其中，八个处理的共培养细胞中，接入的T细胞均为6×105个细胞/孔；1：10MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：20MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：40MSC/CTLsh和T细胞共培养，1：80MSC/CTLsh和T细胞共培养这四个处理中接入的MSC/CTLsh分别是6×104个细胞/孔、3×104个细胞/孔、1.5×104个细胞/孔、7500个细胞/孔；1：10MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：20MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：40MSC/SOCS1sh和T细胞共培养，1：80MSC/SOCS1sh和T细胞共培养这四个处理中接入的MSC/SOCS1sh分别是6×104个细胞/孔、3×104个细胞/孔、1.5×104个细胞/孔、7500个细胞/孔。
3.4.2增强体内免疫抑制
免疫反应对于控制肿瘤生长是至关重要的。由于MSC/SOCS1sh在体外显示更强的免疫抑制能力，检测它对小鼠体内黑色素瘤模型中的作用。B16-F0黑色素瘤细胞与MSC/SOCS1sh或MSC/CTLsh联合注入小鼠体内，16天后，肿瘤称重。发现两种MSCs都能促进肿瘤生长，但MSC/SOCS1sh表现出更强的效果，MSC/SOCS1sh组肿瘤的重量是MSC/CTLsh组的2倍(图4中A)。MSCs免疫抑制的一个显著效应是能够抑制DTH反应。进一步检验了它在DTH反应中的免疫抑制效果。OVA免疫的小鼠用OVA单独或OVA结合MSC/SOCS1sh或MSC/CTLsh来给小鼠足垫注射，通过测量足垫增厚来评价DTH反应。与预期一样，施加MSC/CTLsh能够降低炎症。与其对黑色素瘤模型效果相似，MSC/SOCS1sh表现出更强的免疫抑制作用，足垫增厚表现快速降低，MSC/SOCS1sh组足垫增厚是OVA组的0.5倍，MSC/SOCS1sh组足垫增厚是MSC/CTLsh组的0.7倍，是受体间充质干细胞组的0.7倍(图4中B)。说明降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞MSC/SOCS1sh与受体间充质干细胞相比，抑制迟发型超敏反应能力增强，体内免疫抑制能力增强。
总之，降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞MSC/SOCS1sh与受体间充质干细胞相比，体内外免疫抑制能力均增强。
图4中A的增强黑色素瘤生长的实验方法如下：小鼠黑色素瘤细胞B16-F0（ATCC-CRL-6322TM）在体外用α-MEM完全培养基中培养。
C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。实验重复三次，每次重复将实验动物随机分成三组（每组10只），即PBS组、MSC/SOCS1sh组和MSC/CTLsh组，分别进行如下处理：
PBS组：实验第1天进行初次免疫，第3、6、9天分别进行加强免疫。其中，初次免疫为：每只小鼠后背皮下注射100μl含5×105个B16-F0的PBS（在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入B16-F0得到的细胞悬液，100μl该细胞悬液中B16-F0的含量为5×105个细胞）；加强免疫均为每只小鼠后背皮下注射PBS。
MSC/SOCS1sh组：实验第1天进行初次免疫，第3、6、9天分别进行加强免疫。其中，初次免疫为：每只小鼠后背皮下注射100μl含5×105个B16-F0和1×106个MSC/SOCS1sh的PBS（在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入B16-F0和MSC/SOCS1sh得到的细胞悬液，100μl该细胞悬液中B16-F0的含量为5×105个细胞，MSC/SOCS1sh的含量为1×106个细胞）；加强免疫均为每只小鼠后背皮下注射100μl含1×106个MSC/SOCS1sh的PBS（在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入MSC/SOCS1sh得到的细胞悬液，100μl该细胞悬液中MSC/SOCS1sh的含量为1×106个细胞）。
MSC/CTLsh组：实验第1天进行初次免疫，第3、6、9天分别进行加强免疫。其中，初次免疫为：每只小鼠后背皮下注射100μl含5×105个B16-F0和1×106个MSC/CTLsh的PBS（在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入B16-F0和MSC/CTLsh得到的细胞悬液，100μl该细胞悬液中B16-F0的含量为5×105个细胞，MSC/CTLsh的含量为1×106个细胞）；加强免疫均为每只小鼠后背皮下注射100μl含1×106个MSC/CTLsh的PBS（在0.01M、pH7.2-7.4的PBS中加入MSC/CTLsh得到的细胞悬液，100μl该细胞悬液中MSC/CTLsh的含量为1×106个细胞）。
每天观察小鼠并且第16天当肿瘤长大到影响运动时对小鼠进行安乐死。取下黑色素瘤然后称重。
图4中B的迟发型超敏反应的实验方法如下：C57BL/6小鼠，雌性，8～10周龄。实验重复三次，每次重复将实验动物随机分成五组（每组10只），即Saline组、OVA组、MSC/SOCS1sh组、MSC/CTLsh组和受体间充质干细胞组，分别进行如下处理：
Saline组：第一天每只小鼠尾根注射50μl生理盐水和50μl完全弗氏佐剂来进行免疫，第7天将30μl生理盐水注射到右后脚垫，左后脚垫注射30ul生理盐水。24h后，用游标卡尺(no.7308,Mitutoyo,Tokyo,Japan)来测量抗原诱导的足垫增厚情况。厚度增加为右后足垫厚度减去左后脚垫厚度。
OVA组：第一天每只小鼠尾根注射50μl含OVA的生理盐水（在生理盐水中加入OVA得到的液体，50μl该液体中OVA的含量为10μg）和50μl完全弗氏佐剂来进行免疫，第7天将含200μgOVA的30μl生理盐水（在生理盐水中加入OVA得到的液体，30μl该液体中OVA的含量为200μg）注射到右后脚垫，左后脚垫注射30ul生理盐水。24h后，用游标卡尺(no.7308,Mitutoyo,Tokyo,Japan)来测量抗原诱导的足垫增厚情况。厚度增加为右后足垫厚度减去左后脚垫厚度。
MSC/SOCS1sh组：第一天每只小鼠尾根注射50μl含OVA的生理盐水（在生理盐水中加入OVA得到的液体，50μl该液体中OVA的含量为10μg）和50μl完全弗氏佐剂来进行免疫，第7天将含200μgOVA和2.5×105个细胞MSC/SOCS1sh的30μl生理盐水（在生理盐水中加入OVA和MSC/SOCS1sh得到的液体，30μl该液体中OVA的含量为200μg，MSC/SOCS1sh的含量为2.5×105个细胞）注射到右后脚垫，左后脚垫注射30ul生理盐水。24h后，用游标卡尺(no.7308,Mitutoyo,Tokyo,Japan)来测量抗原诱导的足垫增厚情况。厚度增加为右后足垫厚度减去左后脚垫厚度。
MSC/CTLsh组：第一天每只小鼠尾根注射50μl含OVA的生理盐水（在生理盐水中加入OVA得到的液体，50μl该液体中OVA的含量为10μg）和50μl完全弗氏佐剂来进行免疫，第7天将含200μgOVA和2.5×105个细胞MSC/CTLsh的30μl生理盐水（在生理盐水中加入OVA和MSC/CTLsh得到的液体，30μl该液体中OVA的含量为200μg，MSC/CTLsh的含量为2.5×105个细胞）注射到右后脚垫，左后脚垫注射30ul生理盐水。24h后，用游标卡尺(no.7308,Mitutoyo,Tokyo,Japan)来测量抗原诱导的足垫增厚情况。厚度增加为右后足垫厚度减去左后脚垫厚度。
受体间充质干细胞组：第一天每只小鼠尾根注射50μl含OVA的生理盐水（在生理盐水中加入OVA得到的液体，50μl该液体中OVA的含量为10μg）和50μl完全弗氏佐剂来进行免疫，第7天将含200μgOVA和2.5×105个细胞C3H10T1/2的30μl生理盐水（在生理盐水中加入OVA和C3H10T1/2得到的液体，30μl该液体中OVA的含量为200μg，C3H10T1/2的含量为2.5×105个细胞）注射到右后脚垫，左后脚垫注射30ul生理盐水。24h后，用游标卡尺(no.7308,Mitutoyo,Tokyo,Japan)来测量抗原诱导的足垫增厚情况。厚度增加为右后足垫厚度减去左后脚垫厚度。
3.5一氧化氮分泌能力增加
先前研究表明前炎症细胞因子能够刺激小鼠MSCs表达iNOS和产生NO,这能够抑制T淋巴细胞增殖。在前炎症细胞因子存在下，MSCs生产NO能力不随着传代增加而改变。为了检测炎症细胞因子诱导MSCs产生NO效率，增加IFN-γ+TNF-α(每种0.5ng/ml,2ng/ml和10ng/ml)浓度梯度来刺激MSCs。结果表明MSCs对低浓度的细胞因子就有强烈反应。当添加IFN-γ+TNF-α浓度低到0.5ng/ml，就能观察到显著地诱导出NO生成。Real-timePCR显示iNOS（一氧化氮合酶）的产生随着IFN-γ+TNF-α刺激浓度梯度增加而增多。接着，检测SOCS1敲低后iNOS的表达。iNOSmRNA和iNOS蛋白表达分别通过real-timePCR和westernblottinganalysis来检测。图5中A显示在MSC/SOCS1sh中iNOSmRNA和iNOS蛋白表达显著增加。炎症因子刺激MSC/SOCS1sh和MSC/CTLsh，其上清液用于测定NO浓度。如图5中B所示，SOCS1敲低后，NO生成显著增加，不管MSCs是否被照射：在不照射的情况下，相同细胞数量的MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌量是62.3μM，相同细胞数量的MSC/CTLsh的一氧化氮分泌量是15.7μM，相同细胞数量的受体间充质干细胞-C3H10T1/2的一氧化氮分泌量是15.5μM，MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌能力是MSC/CTLsh的4倍，MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌能力是受体间充质干细胞的4倍；在照射的情况下，相同细胞数量的MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌量是60.1μM，相同细胞数量的MSC/CTLsh的一氧化氮分泌量是22.7μM，相同细胞数量的受体间充质干细胞-C3H10T1/2的一氧化氮分泌量是21.9μM，MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌能力是MSC/CTLsh的2.6倍，MSC/SOCS1sh的一氧化氮分泌能力是受体间充质干细胞的2.7倍。说明降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞MSC/SOCS1sh与受体间充质干细胞相比，一氧化氮分泌能力显著增加，增加了2.7-4倍。图5中B中，MSC表示受体间充质干细胞C3H10T1/2。
为了进一步证实NO依赖性的MSC/SOCS1sh强力免疫抑制功能方式，添加iNOS抑制剂NG-monomethyl-L-arginineacetatesalt(L-NMMA)来测定T细胞增殖。与期望的一致，在共培养测定中，L-NMMA完全恢复T细胞增殖(图5中C)。因此，SOCS1可能通过抑制iNOS表达及NO产生来削弱MSCs免疫抑制能力。
其中，图5中B上图的实验方法如下：实验重复三次，每次重复将MSC/SOCS1sh、C3H10T1/2和MSC/CTLsh分别在含有2ng/mlIFNγ、2ng/mlTNFα、4mM谷氨酰胺、100U/ml青链霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液在5%CO237℃24h，用Griess测定上清液中NO的含量。其中，测定NO时培养液中的细胞含量均为10000个细胞/100μl。
图5中B下图的实验方法如下：实验重复三次，每次重复将MSC/SOCS1sh、C3H10T1/2和MSC/CTLsh分别用60Co照射,照射剂量为15Gy，在含有2ng/mlIFNγ、2ng/mlTNFα、4mM谷氨酰胺、100U/ml青链霉素和10%胎牛血清(FBS)的MEM培养液在5%CO237℃24h，用Griess测定上清液中NO的含量。其中，测定NO时培养液中的细胞含量均为10000个细胞/100μl。
Claims (14)
1.重组间充质干细胞,是降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到的重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述SOCS1是细胞因子信号传导抑制蛋白1；所述SOCS1是氨基酸序列为SEQIDNo.2的蛋白质；所述降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量通过向所述受体间充质干细胞中导入shRNA实现，所述shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补。
2.根据权利要求1所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述重组间充质干细胞具有下述A1和A2中的至少一种特性：
A1、所述重组间充质干细胞的一氧化氮分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
A2、所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述免疫抑制能力体现为抑制迟发型超敏反应能力。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组间充质干细胞，其特征在于：所述离体的间充质干细胞为哺乳动物的离体的间充质干细胞。
5.制备权利要求1所述重组间充质干细胞的方法，包括降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量得到所述重组间充质干细胞；所述受体间充质干细胞为离体的间充质干细胞；所述SOCS1是细胞因子信号传导抑制蛋白1；所述SOCS1是氨基酸序列为SEQIDNo.2的蛋白质；所述降低受体间充质干细胞中SOCS1基因表达量通过向所述受体间充质干细胞中导入shRNA实现，所述shRNA是形成茎环结构的短发夹RNA，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组间充质干细胞具有下述A1和A2中的至少一种特性：
A1、所述重组间充质干细胞的一氧化氮分泌能力高于所述受体间充质干细胞；
A2、所述重组间充质干细胞的免疫抑制能力高于所述受体间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述免疫抑制能力体现为抑制迟发型超敏反应能力。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述离体的间充质干细胞为哺乳动物的离体的间充质干细胞。
9.权利要求1-4中任一所述的重组间充质干细胞在制备抑制T细胞增殖的产品中的应用。
10.权利要求1-4中任一所述的重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用。
11.抑制T细胞增殖的产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的重组间充质干细胞。
12.免疫抑制剂，其活性成分为权利要求1-4中任一所述的重组间充质干细胞。
13.下述1)-10)中的任一种抑制受体间充质干细胞中SOCS1基因表达的生物材料：
1)shRNA，是形成茎环结构的短发夹RNA，所述茎环结构中茎的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，所述茎环结构中茎的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补；
2)表达1)所述的shRNA的表达载体；
3)表达1)所述的shRNA的重组微生物细胞；
4)表达1)所述的shRNA的重组动物细胞；
5)表达1)所述的shRNA的重组植物细胞；
6)1)所述shRNA产生的siRNA；
7)表达6)所述siRNA的表达载体；
8)表达6)所述siRNA的重组微生物细胞；
9)表达6)所述siRNA的重组动物细胞；
10)表达6)所述siRNA的重组植物细胞。
14.根据权利要求13所述的生物材料，其特征在于：1)所述的shRNA的一条链的核苷酸序列是SEQIDNo.1，1)所述的shRNA的另一条链的核苷酸序列与SEQIDNo.1反向互补；1)所述shRNA产生的siRNA的一条链序列是SEQIDNo.1的第4-22位，1)所述shRNA产生的siRNA的另一条链序列与SEQIDNo.1的第4-22位反向互补。
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