CN109576334A - 检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒及方法 - Google Patents

检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒及方法，试剂盒包括如下：DF12完全培养基或DMEM完全培养基；DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基；胰酶；前列腺素E2检测试剂盒；6孔细胞培养板。本发明的方法简便，重复性好，特异性强，可以进行自动化或者半自动化检测。本发明试剂盒中采用前列腺素E2检测试剂盒检测细胞上清中PGE2的表达量，进行免疫抑制生物学效力检测灵敏度高，不受其他条件干扰。本发明试剂盒中的上清取样后可以进行低温保存，便于延时检测和复核检查。本发明试剂盒可以有效筛选免疫抑制生物学效力合格的间充质干细胞。

Description

检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒及检测方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一组源于基质细胞的细胞群，可以从成人的大多数组织获取。间充质干细胞对固有免疫系统及特异免疫系统都有调节作用，参与免疫反应机制，对过激的免疫反应具有很好的抑制和调节作用，可以作为药物用于治疗例如移植物抗宿主病(GVHD)、红斑狼疮、硬皮病等免疫性疾病。脐带和胎盘来源的间充质干细胞具有免疫原性低，无创采集，无伦理问题等优点成为干细胞药物的最佳候选种子细胞。
目前全球已有十多个间充质干细胞药品上市，还有很多的间充质干细胞产品正在进行审批，间充质干细胞因其来源、制备工艺、培养条件等差异导致其生物学效力具有很大的差别，非常需要简便的方法来进行生物学效力的检测。
传统的检测MSC免疫抑制作用生物学效力的方法是通过MSC细胞与外周血单个核细胞(PBMC)共培养后上清中的γ干扰素(IFN-γ)分泌量的高低来反映的，但是共培养时，间充质干细胞会受到微环境中炎性因子的影响，炎性因子可以增强或是减弱甚至是完全逆转间充质干细胞的生物学功能。研究表明：白介素1β(IL-1β)可以增强间充质干细胞的免疫活性，IFN-γ和TNF-α同样可以增强间充质干细胞的免疫调节功能。PBMC来自于不同的个体，不同个体的PBMC对免疫的应答的差异非常大，免疫应答产生的炎性因子的种类和浓度也不相同，同一株MSC细胞对不同个体的PBMC分泌的IFN-γ的抑制作用不一致。因此传统方法无法重复性的评价MSC细胞。
研究表明，间充质干细胞免疫调节机制主要是通过细胞与细胞间的直接接触和分泌可溶性细胞因子两方面实现的，但是其主要的机制集中于可溶性细胞因子的分泌，包括前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1TGFβ1)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)]、人类白细胞抗原G(human leucocyte antigen proteinG,HLA-G)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)等，这些可溶性因子都不同程度的参与了MSC细胞免疫抑制作用，但如果同时检测多种因子的表达，方法繁琐而且造价昂贵，不能作为一种简便的生物学效力的定量检测方法。
中国专利201210096807.0阐述了galectin-3的含量来判断细胞的免疫抑制能力强弱，方法虽然简便好用，但是通过我们的研究发现galectin-3不对MSC的免疫调节功能起决定作用，不能完全反应细胞的免疫抑制能力。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒。
本发明的第二个目的是提供一种简便的、特异性强的、检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒，包括如下：
(1)DF12完全培养基或DMEM完全培养基；
(2)DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基；
(3)胰酶；
(4)前列腺素E2检测试剂盒；
(5)6孔细胞培养板。
上述试剂盒低温保存，最好是保存在-20℃。
一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的方法，包括如下步骤：
(1)准备上述一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒；
(2)按5.2×104个细胞/cm2的接种密度，将间充质干细胞接种在装有DF12完全培养基或DMEM完全培养基的6孔细胞培养板，培养4小时，更换DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；
(2)用胰酶消化细胞，计数；
(3)用前列腺素E2检测试剂盒检测上清液中前列腺素E2的表达量，计算每106个间充质干细胞的前列腺素E2分泌量；
(4)当前列腺素E2量>141.59ng/106个细胞时，判定为间充质干细胞具有免疫抑制生物学效力。
间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
本发明的有益效果：
1、本发明的方法，简便，重复性好，特异性强，可以进行自动化或者半自动化检测。
2、本发明试剂盒中采用前列腺素E2检测试剂盒检测细胞上清中PGE2的表达量，进行免疫抑制生物学效力检测灵敏度高，不受其他条件干扰。
3、本发明试剂盒中的上清取样后可以进行低温保存，便于延时检测和复核检查。
4、本发明试剂盒可以有效筛选免疫抑制生物学效力合格的间充质干细胞。
附图说明
图1为PGE2、Galectin-3表达量分别与IFN-γ抑制率的相关性其中，图1A为PGE2表达量与IFN-γ抑制率的相关性。图1B为Galectin-3和表达量与IFN-γ抑制率的相关性。
图2为PGE2拮抗剂中和了MSC的免疫抑制作用，而IDO拮抗剂不能中和MSC的免疫抑制作用。横坐标：添加了拮抗剂的上清样本(NS-398:PGE2拮抗剂，1-M-T:IDO拮抗剂),纵坐标:IFN-γ抑制率。
图3为不同的收集时间的间充质干细胞的PGE2表达量。横坐标：细胞上清收集时间,纵坐标:PGE2表达量。
图4为不同来源的间充质干细胞的PGE2表达量。横坐标：不同来源的间充质干细胞(MSC),纵坐标:PGE2表达量。
图5为多样本MSC的PGE2表达量与IFN-γ抑制率。横坐标：脐带间充质干细胞样本编号,左纵坐标:PGE2表达量，右纵坐标:IFN-γ抑制率。
图6为MSC大样品的PGE2的表达量。横坐标：不同来源的间充质干细胞样本编号,纵坐标:PGE2表达量。
具体实施方式
前列腺素E2检测试剂盒为市售商品，生产商为美国Cayman公司或英国OxfordBiomedical research公司。
DF12完全培养基(购自Gibco公司)
胰酶(购自Gibco公司)
实施例中：
Galectin-3为半乳糖凝集素3的缩写；
PGE2为前列腺素E2的缩写；
IFN-γ为γ干扰素的缩写；
MSC为间充质干细胞的缩写；
无血清培养基为相应的培养基不含血清。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒，包括如下：
(1)DF12完全培养基或DMEM完全培养基；
(2)DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基；
(3)胰酶；
(4)前列腺素E2检测试剂盒；
(5)6孔细胞培养板。
上述试剂盒保存在-20℃。
实施例2
筛选与MSC免疫抑制作用最相关的指标
1.将脐带间充质干细胞接种在装有DF12完全培养基的6孔细胞培养板上，培养4小时，更换DF12无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；
2.将上清液与人外周血单个核细胞悬液(从人外周血中分离得到，细胞浓度为1×106个/ml，)按照体积比1:1的比例混合，总体积为200ul，接种于装有DF12完全培养基的96孔板中，在植物血凝素(PHA，购自sigma公司，终浓度10ug/ml)和白介素2(IL-2，购自peprotech公司，终浓度100U/ml)刺激下共培养72小时后收集培养上清，检测IFN-γ表达量，计算IFN-γ的抑制率。
IFN-γ的抑制率以下列公式计算：
A:人外周血单个核细胞单独培养时IFN-γ表达量；
B:脐带间充质干细胞培养上清与人外周血单个核细胞共培养时IFN-γ表达量。
同时用ELISA试剂盒(购自invitrogen公司、Cayman公司)检测脐带间充质干细胞培养上清中前列腺素E2(PGE2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、白介素6(IL-6)、半乳糖凝集素1(Galectin-1)、半乳糖凝集素3(Galectin-3)、转化生长因子β1(TGF-beta)、肝细胞生长因子(HGF)的蛋白表达量，并分析这些候选因子和γ干扰素(IFN-γ)抑制率之间的相关性。如表1所示为所有候选因子与IFN-γ抑制率的相关性，其中PGE2和IFN-γ抑制率的相关性最高(图1A)，Galectin-3和IFN-γ抑制率的相关性最低(图1B)
表1
在脐带间充质干细胞培养上清与人外周血单个核细胞悬液的共培养体系中,加入PGE2的拮抗剂NS-398(购自sigma公司)，或者IDO的拮抗剂1-M-T(购自sigma公司)，实验结果表明，加入拮抗剂NS-398后能够完全抵消间充质干细胞对人外周血单个核细胞的免疫抑制作用，而加入IDO拮抗剂后并不影响间充质干细胞对人外周血单个核细胞的免疫抑制作用(图2)。
由以上结果可知，PGE2是间充质干细胞的免疫调节的关键因子，对其免疫抑制作用具有决定性作用。
实施例3检测方法优化
间充质干细胞上清中PGE2表达量的检测方法优化
(1)最佳接种体系和接种密度筛选：
将脐带间充质干细胞分别接种于装有DF12完全培养基的96孔板、24孔板、6孔板、T25以及T75瓶中，接种密度分别为1×104/cm2、5.2×104/cm2、7×104/cm2，设3个平行，培养16小时后，应用CCK8试剂盒(购自碧云天公司)进行细胞数量检测，通过OD值判断接种的误差；如表2所示，接种体系越大，其平行性越好，孔间误差越小，其中6孔板、T25和T75的平行性最好，均能达到98％以上。而6孔板接种的数量最少，因此选定6孔板为最佳接种体系。接种密度为1×104/cm2时，细胞在不同体系中的融合度为30％，细胞增殖较慢；接种密度为5.2×104/cm2时，细胞在不同体系中的融合度为80％，细胞增殖较快；接种密度为7×104/cm2时，细胞在不同体系中的融合度为100％，细胞不再增殖；因此选定5.2×104/cm2为最佳接种密度。
表2：接种体系的平行性
体系 96孔板 24孔板 6孔板 T25 T75
平行性 93.6％ 95.3％ 98.7％ 98.1％ 99.2％
(2)最佳培养时间筛选
将脐带间充质干细胞接种于装有DF12完全培养基6孔板中，密度5.2×104/cm2，设3个平行，培养2、4、6小时后，更换无血清DF12培养基，培养24小时后收集上清，使用PGE2检测试剂盒(购自cayman公司)检测上清中PGE2的分泌量。实验结果显示培养2小时的PGE2的分泌量最低，培养4小时和培养6小时的PGE2的分泌量相近(表3)，考虑到节省时间和效率，选择4个小时为细胞最佳培养时间。
表3：不同培养时间的PGE2分泌量
(3)最佳收集时间筛选
将脐带间充质干细胞接种于装有DF12完全培养基6孔板中，密度5.2×104/cm2，培养4小时后，更换无血清DF12培养基，培养0小时、4小时、18小时、24小时、28小时、42小时、48小时、66小时以及72小时后收集上清，使用PGE2检测试剂盒检测上清中PGE2的分泌量。实验结果显示PGE2的分泌量一直为递增趋势，但在48小时时有所下降(图3)。考虑到24小时内细胞处于对数生长期，因此选择细胞上清的最佳收集时间为24小时。
实施例4不同来源的MSC的PGE2的分泌量的检测
将脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞分别接种于装有DF12完全培养基6孔板中，每种细胞各3株，密度5.2×104/cm2，培养4小时后，更换DF12无血清培养基，培养24小时后收集上清，胰酶(购自Gibco公司)消化细胞计数，使用PGE2检测试剂盒(购自cayman公司)检测上清中PGE2的分泌量。计算每106个细胞的PGE2的表达量；
实验结果显示不同的细胞均能检测到PGE2量，存在种属和个体差异(图4)。
实施例5PGE2表达量的检测评判标准设定
1.将11株脐带间充质干细胞按照5.2×104/cm2的接种密度分别接种在装有DF12完全培养基(购自Gibco公司)的6孔细胞培养板上，培养4小时，更换DF12无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；并用试剂盒检测其PGE2的表达量。胰酶消化细胞计数，计算每106个间充质干细胞的PGE2的表达量。
2.将11份上清液分别与人外周血单个核细胞悬液(从人外周血中分离得到，细胞浓度为1×106/ml，)按照体积比1:1的比例混合，总体积为200ul，接种于装有DF12完全培养基的96孔板中，在植物血凝素(PHA，购自sigma公司，终浓度10ug/ml)和白介素2(IL-2，购自peprotech公司，终浓度100U/ml)刺激下共培养72小时后收集培养上清，检测IFN-γ表达量，计算IFN-γ的抑制率，再计算每106个间充质干细胞的IFN-γ的抑制率。
3.将11株干细胞的PGE2的表达量和IFN-γ的抑制率进行分析比较(图5)，当脐带间充质干细胞培养上清对IFN-γ的表达抑制率>60％时，即当PEG2量>141.59ng/106个细胞时，评判细胞具有免疫抑制生物学效力，即评判标准。
实施例6大样本PGE2表达量的检测
选取了30个不同个体来源的人脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，分别接种于装有DF12完全培养基6孔板中，脐带间充质干细胞9株，其他种属的间充质干细胞每种细胞各7株，密度5.2×104/cm2，培养4小时后，更换无血清DF12培养基，24小时后收集细胞上清，胰酶消化细胞计数，用PGE2试剂盒检测其PGE2的表达量，计算106个细胞的PGE2的表达量(图6)。检测结果得出30个样本中有18个样本的间充质干细胞具有免疫抑制生物学效力。
实施例7
一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的方法，包括如下步骤：
(1)准备实施例1的一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒；
(2)按5.2×104个细胞/cm2的接种密度，将脐带间充质干细胞接种在装有DF12完全培养基的6孔细胞培养板，培养4小时，更换DF12无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；(2)用胰酶消化细胞，计数；
(3)用前列腺素E2检测试剂盒检测上清液中前列腺素E2的表达量，计算每106个脐带间充质干细胞的前列腺素E2分泌量；
(4)前列腺素E2量为176.4ng/106个细胞时，判定为脐带间充质干细胞具有免疫抑制生物学效力。
实施例8
一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的方法，包括如下步骤：
(1)准备实施例1的一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒；
(2)按5.2×104个细胞/cm2的接种密度，将胎盘间充质干细胞接种在装有DMEM完全培养基的6孔细胞培养板，培养4小时，更换DMEM无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；(2)用胰酶消化细胞，计数；
(3)用前列腺素E2检测试剂盒检测上清液中前列腺素E2的表达量，计算每106个胎盘间充质干细胞的前列腺素E2分泌量；
(4)前列腺素E2量为379.3ng/106个细胞时，判定胎盘间充质干细胞具有免疫抑制生物学效力。
用骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞替代本实施例的胎盘间充质干细胞，其它同本实施例，可以对骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞免疫抑制生物学效力进行检测。

Claims (3)

1.一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒，其特征是包括如下：
(1)DF12完全培养基或DMEM完全培养基；
(2)DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基；
(3)胰酶；
(4)前列腺素E2检测试剂盒；
(5)6孔细胞培养板。
2.一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)准备权利要求1的一种检测间充质干细胞免疫抑制生物学效力的试剂盒；
(2)按5.2×104个细胞/cm2的接种密度，将间充质干细胞接种在装有DF12完全培养基或DMEM完全培养基的6孔细胞培养板，培养4小时，更换DF12无血清培养基或DMEM无血清培养基，培养24小时，收集培养上清液；
(2)用胰酶消化细胞，计数；
(3)用前列腺素E2检测试剂盒检测上清液中前列腺素E2的表达量，计算每106个间充质干细胞的前列腺素E2分泌量；
(4)当前列腺素E2量>141.59ng/106个细胞时，判定为间充质干细胞具有免疫抑制生物学效力。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
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