CN108368479A

CN108368479A - 细胞效能分析

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Publication number: CN108368479A
Application number: CN201680068019.7A
Authority: CN
Inventors: G·鲁索蒂; J·福勒; C·维维
Original assignee: Cell Structure Co
Current assignee: Cell Structure Co
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2018-08-03
Also published as: EP3356515A4; EP3356515A1; WO2017058838A1; MX2018004005A; JP2018533370A; JP2021182935A; US20180284142A1; US20200363435A1; HK1255078A1; AU2016330612A1; CA3000390A1

Abstract

本文提供了用于评价细胞效能的方法。

Description

细胞效能分析

本申请要求2015年9月29日提交的美国临时专利申请号No.62/234,404的优先权权益，将其内容以其整体并入本文中。

1.技术领域

本文提供了用于评价细胞效能的方法。

2.背景技术

细胞疗法代表了一种新的且令人激动的用于广泛的治疗适应症的治疗形式。用于评价用于细胞疗法中的细胞效能的准确、可再现且相关的分析对于质量控制目的而言是重要的，例如，确保基于细胞的治疗产品的稳定性和一致性。

3.发明内容

本文提供了用于评价细胞效能的方法，例如，评价细胞制备物(例如，属于打算用于治疗用途的一批细胞的细胞制备物)中的细胞的效能。本文提供的方法利用了评价细胞效能之前延长的细胞培养时间(例如，恢复时间)，如与本领域使用的标准细胞效能分析相比的。已经确定，结合这样延长的细胞培养时间导致在取自相同细胞批次的细胞制备物以及包括相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞制备物中提高的分析可靠性和降低的变异性。

在特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)一定的时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；和(ii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理(surrogate)的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞一定的时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)约48小时；和(ii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞约48小时；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)约48小时；和(ii)进行分析以确定细胞是否产生前列腺素E2(PGE2)，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞约48小时；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生前列腺素E2(PGE2)，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)一定的时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；(ii)在包含能够诱导细胞中的一种或多种基因产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养所述细胞，例如，引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞一定的时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；(iii)在包含能够诱导细胞中一种或多种基因产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iv)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养获得细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)约48小时；(ii)在包含能够诱导细胞中一种或多种基因产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞约48小时；(iii)在包含能够诱导细胞中一种或多种基因产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iv)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)约48小时；(ii)进一步在包含能够诱导细胞产生PGE的试剂的培养基中培养细胞；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生PGE2，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。在特定实施方式中，所述能够诱导细胞产生PGE2的试剂是白细胞介素-1(IL-1)β。

在另一个特定实施方案中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养所述细胞约48小时；(iii)进一步在包含能够诱导细胞产生PGE的试剂的培养基中培养细胞；和(iv)进行分析以确定细胞是否产生PGE2，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。在特定实施方式中，所述能够诱导细胞产生PGE2的试剂是白细胞介素-1(IL-1)β。

可以使用任何细胞类型，例如，打算/适合用作治疗剂的任何细胞类型，来进行本文中所述的用于评价细胞效能的方法。可以用于本文中所述的方法中的示例性细胞类型包括，但不限于，间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)，组织培养贴壁(plastic-adherent)CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞，胚胎干细胞，胚胎生殖细胞，诱导的多能性干细胞，间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞，骨髓衍生的间质基质细胞，组织贴壁胎盘干细胞(PDAC)，脐带干细胞，羊水干细胞，羊膜衍生的粘附细胞(AMDAC)(参见美国专利申请公开No.2010/0124569)，成骨胎盘粘附细胞(OPAC)(参见美国专利申请公开No.2010/0047214)，脂肪干细胞，角膜缘干细胞，牙髓干细胞，成肌细胞，内皮祖细胞，神经干细胞，脱落的牙齿衍生的干细胞，毛囊干细胞，真皮干细胞，孤雌生殖(parthenogenically)衍生的干细胞，重编程的干细胞，羊膜衍生的粘附细胞，侧群干细胞；和自然杀伤细胞，例如，美国专利No.8,263,065和8,926,964或国际专利申请公开No.WO2014/028453和WO 2014/123879中描述的自然杀伤细胞。

在特定实施方式中，本文中所述方法中使用的细胞是胎盘细胞，例如，胎盘干细胞。在特定实施方式中，本文中所述方法中使用的胎盘细胞粘附于组织培养塑料并且是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺，如例如通过流式细胞术可检测的。可以用于本文中所述方法中的胎盘细胞的更多特征描述于5.1节中。

在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的细胞来自之前已经制备的一批细胞。在某些实施方式中，当本文提供的方法中使用的细胞来自之前已经制备的一批细胞时，在用于该方法之前，所述细胞已经被保存，例如，低温保存。在某些实施方式中，当本文提供的方法中使用的细胞来之前已经制备的自一批细胞时，在用于该方法之前，所述细胞没有被保存，例如，没有低温保存。

在特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段长于24小时。在另一个特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量的变异性最小化的时间段为48小时或约为48小时。在另一个特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为65小时或约为65小时。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时或约66小时。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为30小时至36小时、36小时至42小时、42小时至48小时、48小时至54小时、54小时至60小时或60小时至66小时。

在某些实施方式中，用作细胞群体中细胞效能的代理的标志物与待使用本文中所述的方法测定效能的细胞的作用机理(MOA)相关。在某些实施方式中，作为细胞群体中细胞效能的代理的标志物与细胞的免疫抑制活性相关。在特定实施方式中，PGE2的表达是本文所述方法中使用的细胞效能的代理。在另一个特定实施方式中，以下一种多种蛋白质(和/或编码它们的基因)之一的表达是本文所述方法中使用的细胞效能的代理：ANG、EGF、ENA-78、FGF2、卵泡抑素(Follistatin)、G-CSF、GRO、HGF、IL-6、IL-8、瘦素(Leptin)、MCP-1、MCP-3、PDGFB、PLGF、Rantes、TGFB1、血小板生成素、TIMP1、TIMP2、uPAR、VEGF、VEGFD、血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮细胞粘附分子)、层粘连蛋白(laminin)和/或纤连蛋白。在特定实施方式中，所述细胞是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺胎盘干细胞(参见5.1节)。

可以使用本领域已知的任何方法来完成用作细胞效能代理的标志物的检测。在特定实施方式中，可以通过ELISA来检测用作细胞效能代理的标志物。在另一个特定实施方式中，通过使用MultiplexBead分析来检测用作细胞效能代理的标志物。在另一个特定实施方式中，使用测量基因表达的分析，例如，RT-PCR，来检测用作细胞效能代理的标志物。

在某些实施方式中，检测细胞效能代理的方法需要从细胞培养物收集条件培养基，例如，在恢复时间后从细胞培养物收集培养基和/或在包含能够诱导细胞中一种或多种基因产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养细胞后从细胞培养物收集培养基。

在某些实施方式中，本文所述方法中使用的细胞是粘附细胞。可以使用例如组织培养平板，例如，6孔、24孔、48孔或96孔组织培养平板，来完成本文所述的方法中这些细胞的培养。在特定实施方式中，使用48孔组织培养平板在本文所述的方法中培养粘附细胞。

在某些实施方式中，本文所述方法中使用的细胞是非粘附细胞。例如，可以使用组织培养平板，例如，6孔、24孔、48孔或96孔组织培养平板，或通过使用试管、烧瓶和/或本领域已知用于在悬浮液中培养细胞的其他容器，来完成在本文所述的方法中这些细胞的培养。

在某些实施方式中，定量地完成其中细胞已经进行培养时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在特定实施方式中，通过在给定时间点将细胞培养物中的细胞计数并将计数的细胞数与不同时间点(例如，较早或较晚)从相同细胞的培养物计数的细胞数比较，来完成其中细胞已经进行培养时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在另一个特定实施方式中，通过在给定时间点目视观察细胞培养物中的细胞，确定细胞培养物的汇合百分比，并将细胞培养物的汇合百分比与在不同时间点(例如，较早或较晚)从相同细胞培养物目视观察的细胞汇合百分比进行比较，来完成其中细胞已经进行培养时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。用于实时目视观察细胞培养物的方法是本领域已知的。在特定实施方式中，如果确定从取自相同细胞批次的细胞群体检测到计数的细胞数或汇合百分比的变异性降低，和/或如果确定从包括相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞群体检测到计数的细胞数或汇合百分比的变异性降低，则确定使细胞数量变异性最小化的时间段。

在某些实施方式中，定性地完成其中细胞已经进行培养时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在特定实施方式中，如果确定从取自相同细胞批次的细胞群检测到代理标志物的量(例如，PGE2的水平)的变异性降低，和/或如果确定从包括相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞群体检测到代理标志物的量(例如，PGE2的水平)的变异性降低，则确定使细胞数量变异性最小化的时间段。

在某些实施方式中，如果确定本文所述方法中使用的细胞产生用作细胞效能代理的标志物，那么将初始未培养细胞群体分成适合施用于人类受试者的一批细胞。在特定实施方式中，将所述批次低温保存。

在某些实施方式中，如果确定本文所述方法中使用的细胞产生用作细胞效能代理的标志物，那么将对应于该细胞群体的细胞(例如，来自相同批次细胞的其他细胞)施用于受试者，例如，人类。

3.1定义

如本文中使用的，术语“约”在涉及所述数值时表示所述数值加或减10％内的值。

如本文中使用的，术语“衍生”表示从其分离或以其它方式纯化的。例如，胎盘衍生的粘附细胞是从胎盘分离的。术语“衍生”包括从直接自组织(例如，胎盘)分离的细胞培养的细胞，以及从初级分离物培养或扩增的细胞。

如本文中使用的，术语“分离的细胞”，例如，“分离的胎盘细胞”、“分离的胎盘干细胞”等，表示基本上与干细胞所来源的组织(例如，胎盘)的其他不同的细胞分离的细胞。例如，如果在干细胞收集和/或培养过程中，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％的与干细胞天然相关的细胞(例如，非干细胞)或展示不同标志物谱的干细胞从干细胞除去，则细胞是“分离的”。

如本文中使用的，术语“分离的细胞群体”表示与该细胞群体所来源的组织(例如，胎盘)的其他细胞基本上分离的细胞的群体。

如本文中使用的，术语“胎盘细胞”是指从哺乳动物胎盘分离的干细胞或祖细胞(例如，如以下5.1节中所述的)或从分离自哺乳动物胎盘的细胞培养(作为初级分离物或培养的细胞，与原代培养后的传代数无关)的干细胞或祖细胞。然而，在某些实施方式中，本文中使用的术语“胎盘细胞”不是指滋养层、细胞滋养层、合胞体滋养层(syncitiotrophoblast)、成血管细胞、成血管细胞、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、获自胚泡的内细胞群的细胞或获自后期胚胎的生殖腺脊的细胞，例如，胚胎生殖细胞。

如本文中使用的，当特定标志物高于背景可检测时，胎盘细胞对于该标志物是“阳性的”。例如，通过使用抗体，或通过基于编码标志物的基因或mRNA的序列的寡核苷酸探针或引物来完成特定标志物的检测。例如，胎盘细胞对于例如CD73是阳性的，因为CD73可以以可检测地高于背景(与例如同种型对照相比)的量在胎盘细胞上可检测到。在标志物可以用于将细胞从至少一种其他细胞类型区分开时，细胞对于该标志物也是阳性的，或通过细胞呈现或表达时，可以用于选择或分离细胞。在例如抗体介导的检测的情况中，“阳性”，作为存在特定细胞表面标志物的指示，表示所述标志物使用对该标志物特异性的抗体，例如，荧光标记的抗体，是可检测的；“阳性”还指呈现产生可检测地高于背景的信号(例如，在血细胞计数器中)的量的标志物的细胞。例如，在细胞用对CD200特异性的抗体可检测地标记并且来自抗体的信号可检测地高于对照(例如，背景或同种型对照)的信号时，细胞是“CD200⁺”。相反，相同情况中的“阴性”表示与对照(例如，背景或同种型对照)相比，使用对于细胞表面标志物特异性的抗体，该标志物是不可检测的。例如，在细胞不能重复地用对于CD34特异性抗体可检测地标记到高于对照(例如，背景或同种型对照)的程度时，细胞是“CD34^-”。使用合适的对照，使用抗体没有检测到或不可检测的标志物以相似的方式是阳性或阴性。例如，如果从来自细胞或细胞群体的RNA中检测到的OCT-4RNA含量可检测地高于背景，例如，如通过检测RNA的方法如RT-PCR、狭缝印迹等测定的，则细胞或细胞群体可以确定为是OCT-4⁺。除非本文中另外指出，分化簇(“CD”)标志物使用抗体检测。在某些实施方式中，OCT-4确定存在，并且如果OCT-4使用RT-PCR可检测到，则细胞是“OCT-4⁺”。

如本文中使用的，术语“受试者”、“患者”和“个体”可以互换使用来指打算对其施用细胞治疗剂的哺乳动物。在特定实施方式中，受试者是人类。

4.附图说明

图1证明了与24小时恢复培养时间段相比，在细胞效能分析中使用48小时恢复培养时间段导致改善的分析间以及分析内变异性，如通过细胞的百分汇合测量的。24小时培养：浅灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的左条。48小时培养：深灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的右条。

图2证明了与24小时恢复培养时间段相比，在细胞效能分析中使用48小时恢复培养时间段导致改善的分析间以及分析内变异性，如通过细胞的百分汇合测量的。24小时培养：浅灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的左条。48小时培养：深灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的右条。

图3证明了与24小时恢复培养时间段相比，在细胞效能分析中使用48小时恢复培养时间段导致改善的变异性，如通过PGE2的测量测定的(左图)，并且进一步证实了与24小时恢复培养时间段相比，在细胞效能分析中使用48小时恢复培养时间段导致改善的分析间变异性，如通过细胞的百分汇合测量的(右图)。24小时培养：浅灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的左条。48小时培养：深灰色阴影；每个批号上以及“批至批”组上的右条。

图4证明了与24小时恢复培养时间段相比，在细胞效能分析中使用48小时恢复培养时间段导致降低的分析内变异性(图4A)和降低的分析间变异性(图4B)，不影响动态范围(图4C)，并且导致提高的统计功效(图4D)。

5.具体实施方式

本文提供了用于评价细胞效能的方法，例如，评价细胞制备物(例如，属于打算用于治疗用途的一批细胞的细胞制备物)中的细胞效能。本文提供的方法在评价细胞效能之前利用了延长的细胞培养时间，例如，恢复时间，如与本领域使用的标准细胞效能分析相比的。已经确定了结合这样延长的细胞培养时间导致在取自相同细胞批次的细胞制备物以及包含相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞制备物中提高的分析可靠性和降低的变异性。

在特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)一定时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；和(ii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞一定时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)一定时间段，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；(ii)在包含一种或多种能够诱导细胞中的一种或多种基因产生的试剂的培养基中进一步培养所述细胞，例如，以引起细胞的一种或多种蛋白质的产生增加；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞一定，该时间段使得在细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；(iii)在包含一种或多种能够诱导细胞中一种或多种基因产生的试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，以引起细胞的一种或多种蛋白质的产生增加；和(iv)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)培养获得细胞群体(例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体)约48小时；(ii)在包含一种或多种能够诱导细胞中一种或多种基因产生的试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，以引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iii)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

在另一个特定实施方式中，本文提供了一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体，例如，打算/适合用作细胞疗法的细胞群体；(ii)培养细胞约48小时；(iii)在包含一种或多种能够诱导细胞中一种或多种基因产生的试剂的培养基中进一步培养细胞，例如，以引起细胞的一种或多种蛋白质产生增加；和(iv)进行分析以确定细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

可以使用任何细胞类型，例如，打算/适合用作治疗剂的任何细胞类型，来进行本文中所述的用于评价细胞效能的方法。可以用于本文所述的方法中的示例性细胞类型包括，但不限于，间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)，组织培养贴壁CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞，胚胎干细胞，胚胎生殖细胞，诱导的多能性干细胞，间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞，骨髓衍生的间质基质细胞，组织贴壁胎盘干细胞(PDAC)，脐带干细胞，羊水干细胞，羊膜衍生的粘附细胞(AMDAC)(参见美国专利申请公开No.2010/0124569)，成骨胎盘粘附细胞(OPAC)(参见美国专利申请公开No.2010/0047214)，脂肪干细胞，角膜缘干细胞，牙髓干细胞，成肌细胞，内皮祖细胞，神经干细胞，脱落的牙齿衍生的干细胞，毛囊干细胞，真皮干细胞，孤雌生殖衍生的干细胞，重编程的干细胞，羊膜衍生的粘附细胞，侧群干细胞和自然杀伤细胞，例如，美国专利No.8,263,065和8,926,964或国际专利申请公开No.WO 2014/028453和WO 2014/123879中描述的自然杀伤细胞。

在特定实施方式中，本文所述方法中使用的细胞是胎盘细胞，例如，胎盘干细胞。在特定实施方式中，本文所述方法中使用的胎盘细胞粘附于组织培养塑料并且是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺，如例如通过流式细胞术可检测的。可以用于本文所述方法中的胎盘细胞的更多特征描述于5.1节中。

在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的细胞来自之前已经制备的一批细胞。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的细胞来自之前已经制备的一批细胞时，所述细胞在用于该方法之前已经保存，例如，低温保存。在某些实施方式中，当本文提供的方法中使用的细胞来自之前已经制备的一批细胞时，所述细胞在用于该方法之前没有保存，例如，没有低温保存。

在特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段长于24小时。在另一个特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为48小时或约为48小时。在另一个特定实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为65小时或约为。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时或约66小时。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的使细胞数量变异性最小化的时间段为30小时至36小时、36小时至42小时、42小时至48小时、48小时至54小时、54小时至60小时或60小时至66小时。

在某些实施方式中，用作细胞群体中的细胞效能的代理的标志物与其效能使用本文中所述的方法评价的细胞的作用机理(MOA)相关。在某些实施方式中，用作细胞群体中的细胞效能的代理的标志物与细胞的免疫抑制活性相关。在特定实施方式中，PGE2的表达是本文的所述方法中使用的细胞效能的代理。在另一个特定实施方式中，一种或多种以下蛋白质(和/或编码它们的基因)之一的表达是本文的所述方法中使用的细胞效能的代理：ANG、EGF、ENA-78、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、GRO、HGF、IL-6、IL-8、瘦素、MCP-1、MCP-3、PDGFB、PLGF、Rantes、TGFB1、血小板生成素、TIMP1、TIMP2、uPAR、VEGF、VEGFD、血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮细胞粘附分子)、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。在特定实施方式中，所述细胞是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺胎盘干细胞(参见5.1节)。

可以使用本领域已知的任何方法来完成用作细胞效能的代理的标志物的检测。在特定实施方式中，可以通过ELISA来检测用作细胞效能的代理的标志物。在另一个特定实施方式中，通过使用MultiplexBead分析来检测用作细胞效能的代理的标志物。在另一个特定实施方式中，使用测量基因表达的分析，例如，RT-PCR，来检测用作细胞效能的代理的标志物。

在某些实施方式中，检测细胞效能的代理的方法需要从细胞培养物收集条件培养基，例如，在恢复时间后从细胞培养物收集培养基和/或在包含一种或多种能够诱导细胞中一种或多种基因产生的试剂的培养基中进一步培养细胞后从细胞培养物收集培养基。

在某些实施方式中，本文所述方法中使用的细胞是粘附细胞。可以使用组织培养平板，例如，6孔、24孔、48孔或96孔组织培养平板，来完成本文所述的方法中这些细胞的培养。在特定实施方式中，使用48孔组织培养平板在本文所述的方法中培养粘附细胞。

在某些实施方式中，本文所述方法中使用的细胞是非粘附细胞。例如，可以使用组织培养平板，例如，6孔、24孔、48孔或96孔组织培养平板，或通过使用试管、烧瓶和/或本领域已知用于在悬浮液中培养细胞的其他容器，来完成本文所述的方法中这些细胞的培养。

在某些实施方式中，定量地完成在细胞已经培养一定时间段时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在特定实施方式中，通过在给定时间点对细胞培养物中的细胞计数并将计数的细胞数与在不同时间点(例如，较早或较晚)从相同细胞的培养物计数的细胞数比较来完成在细胞已经培养一定时间段时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在另一个特定实施方式中，通过在给定时间点目视观察细胞培养物中的细胞，确定细胞培养物的百分汇合，并将细胞培养物的百分汇合与在不同时间点(例如，较早或较晚)从相同细胞的培养物目视观察的细胞百分汇合比较来完成在细胞已经培养一定时间段时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。用于实时地目视观察细胞培养物的方法是本领域已知的。在特定实施方式中，如果确定从取自相同细胞批次的细胞群体检测到的计数的细胞量或汇合百分比的变异性降低，和/或如果确定从包括相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞群体检测到的计数的细胞量或汇合百分比的变异性降低，则确定最小化细胞数量变异性的时间段。

在某些实施方式中，定性地完成在细胞已经培养一定时间段时使细胞数量变异性最小化的时间段的测定。在特定实施方式中，如果确定从取自相同细胞批次的细胞群体检测到的代理标志物的量(例如，PGE2的水平)的变异性降低，和/或如果确定从包含相同细胞类型但取自不同细胞批次的细胞群体检测到的代理标志物的量(例如，PGE2的水平)的变异性降低，则确定细胞数量变异性最小化的时间段。

5.1分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群体

可用于本文提供的方法中的分离的胎盘细胞，有时在本文中称为PDAC(以及有时还称为“PDA-002”)，可获自胎盘或其部分，粘附于组织培养基质并且具有多能性细胞或干细胞的特征，但不是滋养层。在某些实施方式中，本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞具有分化成非胎盘细胞类型的能力。

本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞可以是胎儿或母体来源的(即，可以分别具有胎儿或母体的基因型)。优选地，分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群体是胎儿来源的。如本文中使用的，短语“胎儿来源”或“非母体来源”表示分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体获自脐带或与胎儿相关的胎盘结构，即，具有胎儿基因型。如本文中使用的，短语“母体来源”表示细胞或细胞群体获自与母体相关的胎盘结构，例如，其具有母体基因型。分离的胎盘细胞，例如，PDAC，或包括分离的胎盘细胞的细胞群体，可以包括仅是胎儿或母体来源的分离的胎盘细胞，或可以包括胎儿或母体来源的分离的胎盘细胞的混合群体。可以通过以下讨论的形态学、标志物和培养物特征来鉴定和选择分离的胎盘细胞和包括分离的胎盘细胞的细胞群体。

在某些实施方式中，如果确定本文所述的方法中使用的细胞产生用作细胞效能的代理的标志物，那么将初始未培养的细胞群体分成适合施用于人类受试者的一批细胞。在特定实施方式中，将所述批次低温保存。

在某些实施方式中，如果确定本文所述方法中使用的细胞产生用作细胞效能的代理的标志物，那么将对应于该细胞群体的细胞(例如，来自相同批次细胞的其他细胞)施用于受试者，例如，人类。

5.1.1物理和形态学特征

可以用于本文所述方法中的分离的胚胎细胞(PDAC)，在原代培养物或细胞培养物中培养时，粘附于组织培养基质，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料)，或粘附于覆盖了胞外基质或配体(如层粘连蛋白、胶原蛋白(例如，天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃粘连蛋白和细胞外膜蛋白(例如，(BD DiscoveryLabware，Bedford，Mass.))的组织培养表面。培养物中的分离的胎盘细胞一般呈现成纤维细胞样(fibroblastoid)、星形外观，多个胞质突起从中心细胞体延伸。然而，细胞在形态上可以与相同条件下培养的成纤维细胞区分开，因为分离的胎盘细胞比成纤维细胞呈现出更高数量的这样的突起。在形态上，分离的胎盘细胞也可以与造血干细胞区分开，造血干细胞在培养物中通常呈现出更圆的或鹅卵石的形态。

在某些实施方式中，在本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞，在生长培养基中培养时，产生类胚样体。类胚样体是可以在增殖的分离胎盘细胞的粘附层顶部上生长的非连接的细胞团块。使用术语“类胚样”，因为细胞团块类似于类胚体(从胚胎干细胞的培养物生长的细胞团块)。其中类胚样体可以在分离胎盘细胞的增殖培养物中产生的生长培养基包括包含例如DMEM-LG(例如，来自Gibco)；2％胎牛血清(例如，来自Hyclone Labs.)；1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(例如，来自Sigma)；10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐(例如，来自Sigma)；表皮生长因子10ng/mL(例如，来自R&DSystems)；和血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(例如，来自R&D Systems)的培养基。

5.1.2细胞表面、分子和遗传标志物

本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞，例如，分离的多能胎盘细胞或分离的胎盘干细胞，以及这样的分离胎盘细胞的群体，是组织培养贴壁人胎盘细胞，其具有多能细胞或干细胞的特征，并且表达多种可以用于鉴定和/或分离细胞或包括干细胞的细胞群体的标志物。在某些实施方式中，PDAC是血管生成的，例如，在体外或在体内。本文中所述的分离的胎盘细胞和胎盘细胞群体(即，两个或更多个分离的胎盘细胞)包括直接获自胎盘或其任何部分(例如，绒毛膜、胎盘绒毛叶等)的胎盘细胞和含胎盘细胞的细胞群体。分离的胎盘细胞群体还包括培养物中的分离胎盘细胞的群体(即，两个或更多个)，以及容器(例如，袋子)中的群体。本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞不是骨髓衍生的间充质细胞、脂肪衍生的间充质干细胞或获自脐带血、胎盘血或外周血的间充质细胞。本文所述方法中有用的胎盘细胞，例如，胎盘多能细胞和胎盘细胞，在本文中有描述，并且描述于例如美国专利No.7,311,904；7,311,905和7,468,276；以及美国专利申请公开No.2007/0275362中，将其公开内容以其整体按引用并入本文中。

在一个实施方式中，分离的胎盘细胞，例如，PDAC，是CD34^-、CD10⁺和CD105⁺，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，分离的CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞具有分化成神经表型的细胞、成骨表型的细胞和/或成软骨表型的细胞的潜能。在另一个特定实施方式中，分离的CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞另外是CD200⁺。在另一个特定实施方式中，分离的CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞另外是CD45^-或CD90⁺。在另一个特定实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺和CD105⁺胎盘细胞另外是CD45^-和CD90⁺，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞另外是CD90⁺或CD45^-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方案中，分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盘细胞另外是CD90⁺和CD45^-，如通过流式细胞术检测的，即，细胞是CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺。在另一个特定实施方式中，所述CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺和CD200⁺细胞另外是CD80^-和CD86^-。

在某些实施方案中，所述胎盘细胞是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺，以及CD38^-、CD45^-、CD80^-、CD86^-、CD133^-、HLA-DR,DP,DQ^-、SSEA3^-、SSEA4^-、CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、HLA-A,B,C⁺、PDL1⁺、ABC-p⁺和/或OCT-4⁺中的一种或多种，如通过流式细胞术检测的。在其他实施方案中，上述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞中任一个另外是CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺或SH4⁺中的一个或多个。在另一个特定实施方案中，所述细胞另外是CD44⁺。在以上分离的CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盘细胞中任一个的特定实施方案中，细胞另外是CD117^-、CD133^-、KDR^-(VEGFR2^-)、HLA-A,B,C⁺、HLA-DP,DQ,DR^-或程序化死亡-1配体(PDL1)⁺中的一个或多个，或其任意组合。

在另一个实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-或程序化死亡-1配体(PDL1)+中的一个或多个，或其任意组合。在其他实施方案中，所述CD34^-、CD10⁺、CD105⁺细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-或程序化死亡-1配体(PDL1)+。

在另一个特定实施方案中，本文中所述的任何胎盘细胞另外是ABC-p+，如通过流式细胞术检测的，或是OCT-4+(POU5F1+)，如通过RT-PCR测定的，其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白(也称为乳腺癌抗性蛋白(BCRP)和米托蒽醌抗性蛋白(MXR))，而OCT-4是八聚体-4蛋白(POU5F1)。在另一个特定实施方式中，本文所述的任何胎盘细胞另外是SSEA3-或SSEA4-，如通过流式细胞术测定的，其中SSEA3是阶段特异性胚胎抗原3，而SSEA4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一个特定实施方式中，本文所述的任何胎盘细胞另外是SSEA3-和SSEA4-。

在另一个特定实施方式中，本文中所述的任何胎盘细胞另外是MHC-I+(例如，HLA-A,B,C+)、MHC-II-(例如，HLA-DP,DQ,DR-)或HLA-G-中的一个或多个。在另一个特定实施方式中，本文中所述的任何胎盘细胞另外是MHC-I+(例如，HLA-A,B,C+)、MHC-II-(例如，HLA-DP,DQ,DR-)和HLA-G-中的一个或多个。

在某些实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+和ABC-p+中的一个或多个或者全部，其中通过胎盘组织的物理和/或酶促破坏来获得所述分离的胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34-，其中所述分离的胎盘细胞具有至少一种以下的特征：OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-和SSEA4-。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3-和SSEA4-。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、SSEA3-和SSEA4-。在另一个特定实施方案中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34-，并且是SH2+或SH3+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、SH2+和SH3+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、SSEA3-和SSEA4-，并且是SH2+或SH3+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34-，以及是SH2+或SH3+，并且是CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-或SSEA4-中的至少一个。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SSEA3-和SSEA4-，并且是SH2+或SH3+。

在另一个实施方式中，本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34-、CD45-、SSEA3-或SSEA4-。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-和SSEA4-。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-以及SSEA4-、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、OCT-4+、CD34-或CD45-。

在另一个实施方式中，本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+；其中所述分离的胎盘细胞另外是OCT-4+、SSEA3-或SSEA4-中的一个或多个。

在某些实施方式中，本文公开的方法中有用的分离的胎盘细胞是CD200+或HLA-G-。在特定实施方式中，分离的胎盘细胞是CD200+和HLA-G-。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述干细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+和CD105+。在另一个特定实施方式中，在允许类胚样体形成的条件下，所述分离的CD200+或HLA-G-胎盘细胞促进包括分离的胎盘细胞的胎盘细胞群体中类胚样体的形成。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞从不是干细胞或多能细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞从没有展示这些标志物的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述的方法中有用的分离的胎盘细胞是CD73+、CD105+和CD200+。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞是HLA-G-。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34-、CD38-、CD45-和HLA-G-。在另一个特定实施方式中，当细胞群体在允许类胚样体形成的条件下培养时，所述分离的CD73+、CD105+和CD200+胎盘细胞促进包括分离的胎盘细胞的胎盘细胞群体中一个或多个类胚样体的形成。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞从不是分离的胎盘细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞与不展示这些标志物的胎盘细胞分离开。

在某些其他实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、HLA-G-或ABC-p+中的一个或多个。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-和OCT-4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、HLA-G-、SH2+、SH3+、SH4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34-、SSEA3-和SSEA4-。在特定实施方式中，所述分离的OCT-4+、CD34-、SSEA3-和SSEA4-胎盘细胞另外是CD10+、CD29+、CD34-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34-，以及是SH3+或SH4+。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD34-，以及是CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+或OCT-4+任一。

在另一个实施方案中，本文所述的方法中有用的分离的胎盘细胞是CD200+和OCT-4+。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是CD73+和CD105+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是HLA-G-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G-。在另一个特定实施方式中，在允许类胚样体形成的条件下培养细胞群体时，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞促进包括分离的细胞的胎盘细胞群体产生一个或多个类胚样体。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞从不是干细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞从不展示这些特征的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是CD73+、CD105+和HLA-G-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+和HLA-G-胎盘细胞另外是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞另外是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞另外是OCT-4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞另外是CD200+。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞另外是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。在另一个特定实施方式中，在允许类胚样体形成的条件下培养细胞群体时，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞促进包括所述细胞的胎盘细胞群体中类胚样体的形成。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞从不是分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G-胎盘细胞从不展示这些标志物的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述的方法中有用的分离的胎盘细胞是CD73+和CD105+，并且在允许类胚样体形成的条件下培养细胞群体时，促进包括所述CD73+、CD105+细胞的分离的胎盘细胞群体中一个或多个类胚样体的形成。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是OCT-4+。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是OCT-4+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞从不是所述细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞从不展示这些特征的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述的方法中有用的分离的胎盘细胞是OCT-4+，并且在允许类胚样体形成的条件下培养时促进包括所述细胞的分离的胎盘细胞群体中一个或多个类胚样体的形成。在特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD34-、CD38-或CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-和CD45-。在另一个特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞从不是OCT-4+胎盘细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞从不展示这些特征的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45-、CD133-和CD34-胎盘细胞。在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的细胞群体是包括分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述分离的细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45-、CD133-和CD34-胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体与不是HLA-A,B,C+、CD45-、CD133-和CD34-胎盘细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体基本上不含母体成分；例如，所述分离的胎盘细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-胎盘细胞。在另一个实施方式中，本文所述的方法中有用的细胞群体是包括分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不是所述分离的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45-、CD117-和CD133-胎盘细胞是非母体来源的，即，具有胎儿基因型。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不展示这些特征的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-胎盘细胞。在另一个实施方式中，本文所述的方法中有用的细胞群体是包括(例如富集)分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的CD10-、CD33-、CD44+、CD45-和CD117-胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不是所述细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不展示这些标志物的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-胎盘细胞。在另一个实施方式中，用于本文所述方法中的细胞群体是包含例如富集分离的CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是CD10-、CD13-、CD33-、CD45-和CD117-胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不是所述细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不展示这些特征的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是HLA A,B,C+、CD45-、CD34-和CD133-，并且另外是CD10+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+和/或HLA-G-，和/或对CD117是阴性的。在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的细胞群体是包括分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述群体中至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的所述细胞是作为HLA A,B,C+、CD45-、CD34-、CD133-，并且另外对CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200是阳性的和/或对CD117和/或HLA-G-是阴性的分离的胎盘细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不是所述细胞的胎盘细胞分离开。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体从不展示这些标志物的胎盘细胞分离开。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是作为CD200+和CD10+的分离的胎盘细胞，如通过抗体结合测定的，和CD117-的分离的胎盘细胞，如通过抗体结合和RT-PCR两者测定的。在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是作为CD10+、CD29-、CD54+、CD200+、HLA-G-、MHC I+类和β-2-微管蛋白+的分离的胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞。在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是其中至少一种细胞标志物的表达比间充质干细胞(例如，骨髓衍生的间充质干细胞)高至少两倍的胎盘细胞。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个特定实施方式中，所述细胞群体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是作为CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘蛋白低、CD184/CXCR4-、β2-微管蛋白低、MHC-I低、MHC-II-、HLA-G低，和/或PDL1低中的一个或多个的分离的胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞。在特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞至少是CD29+和CD54+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞至少是CD44+和CD106+。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞至少是CD29+。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的细胞群体包括分离的胎盘细胞，并且所述细胞群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE--cadherindim、CD184/CXCR4-、β2-microglobulindim、HLA-Idim、HLA-II-、HLA-Gdim低和/或PDL1dim中的一个或多个的分离胎盘细胞。在另一个特定实施方式中，所述细胞群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P-、CD80-、CD86-、CD103-、CD104-、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-cadherindim、CD184/CXCR4-、β2-microglobulindim、MHC-Idim、MHC-II-、HLA-Gdim和PDL1dim。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞是作为CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+和ABC-p+中的一个或多个或者全部的分离的胎盘细胞，其中ABC-p是胎盘特异性的ABC转运蛋白(也称为乳腺癌抗性蛋白(BCRP)和米托蒽醌抗性蛋白(MXR))，其中所述分离的胎盘细胞通过灌注已经排干脐带血并灌注以除去残余血液的哺乳动物(例如，人)胎盘获得。

在以上任一特征的另一个特定实施方式中，通过流式细胞术测定细胞标志物(例如，分化簇或免疫原性标志物)的表达；在另一个特定实施方式中，通过RT-PCR来测定标志物的表达。

基因谱型证实了分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞群体可以与其他细胞区分开，所述其他细胞例如为间充质干细胞，例如，骨髓衍生的间充质干细胞。本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞可以基于一个或多个基因的表达与例如间充质干细胞区分开来，所述基因的表达在分离的胎盘细胞中或在某些分离的脐带干细胞中，与骨髓衍生的间充质干细胞相比明显更高。特别地，本文提供的方法中有用的分离的胎盘细胞可以基于一个或多个基因的表达与间充质干细胞区分开来，其中当细胞在等同条件下生长时，所述基因的表达在分离的胎盘细胞中比等同数量的骨髓衍生的间充质干细胞明显更高(即，高至少两倍)，其中所述的一个或多个基因是ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A或前述任意的组合。参见，例如，美国专利申请公开No.2007/0275362，将其公开内容以其整体按引用并入本文中。在某些特定实施方式中，例如，通过RT-PCR或微阵列分析，例如，使用U133-A微阵列(Affymetrix)，来测定所述一个或多个基因的所述表达。在另一个特定实施方式中，当在包含DMEM-LG(例如，来自Gibro)；2％胎牛血清(例如，来自Hyclone Labs)；1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)；1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；10^-9M地塞米松(例如，来自Sigma)；10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐(例如，来自Sigma)；表皮生长因子10ng/ml(例如，来自R&D Systems)；和血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng//mL(例如，来自R&D Systems)的培养基中培养多个群体倍增(例如，从约3至约35个群体倍增)时，所述分离的胎盘细胞表达所述一个或多个基因。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞特异性的或分离的脐带细胞特异性的基因是CD200。

这些基因的具体序列可以以以下登录号在GenBank中找到：NM_001615(ACTG2)、BC065545(ADARB1)、NM_181847(AMIGO2)、AY358590(ARTS-1)、BC074884(B4GALT6)、BC008396(BCHE)、BC020196(C11orf9)、BC031103(CD200)、NM_001845(COL4A1)、NM_001846(COL4A2)、BC052289(CPA4)、BC094758(DMD)、AF293359(DSC3)、NM_001943(DSG2)、AF338241(ELOVL2)、AY336105(F2RL1)、NM_018215(FLJ10781)、AY416799(GATA6)、BC075798(GPR126)、NM_016235(GPRC5B)、AF340038(ICAM1)、BC000844(IER3)、BC066339(IGFBP7)、BC013142(IL1A)、BT019749(IL6)、BC007461(IL18)、(BC072017)KRT18、BC075839(KRT8)、BC060825(LIPG)、BC065240(LRAP)、BC010444(MATN2)、BC011908(MEST)、BC068455(NFE2L3)、NM_014840(NUAK1)、AB006755(PCDH7)、NM_014476(PDLIM3)、BC126199(PKP-2)、BC090862(RTN1)、BC002538(SERPINB9)、BC023312(ST3GAL6)、BC001201(ST6GALNAC5)、BC126160或BC065328(SLC12A8)、BC025697(TCF21)、BC096235(TGFB2)、BC005046(VTN)和BC005001(ZC3H12A)，截至2008年3月。

在某些特定实施方式中，当细胞在等同条件下生长时，所述分离的胎盘细胞以可检测地高于等同数量的骨髓衍生的间充质干细胞的水平表达ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN和ZC3H12A中的每一个。

在特定实施方式中，胎盘细胞以可检测地高于等同数量的骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)的水平表达CD200和ARTS1(1型肿瘤坏死因子的氨肽酶调节剂)；ARTS-1和LRAP(白细胞-衍生的精氨酸氨肽酶)；IL6(白细胞介素-6)和TGFB2(转化生长因子，β2)；IL6和KRT18(角蛋白18)；IER3(立即早期应答3)、MEST(中胚层特异性转录同源物)和TGFB2；CD200和IER3；CD200和IL6；CD200和KRT18；CD200和LRAP；CD200和MEST；CD200和NFE2L3(核因子(红系-衍生的2)-样3)；或CD200和TGFB2，其中所述骨髓衍生的间充质干细胞在培养中经历了与所述分离的胎盘细胞经历的传代数相等的传代数。在其他特定实施方式中，所述胎盘细胞以可检测地高于等同数量的骨髓衍生的间充质干细胞BM-MSC的水平表达ARTS-1、CD200、IL6和LRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18和MEST；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；或IER3、MEST和TGFB2，其中所述骨髓衍生的间充质干细胞在培养中经历了与所述分离的胎盘细胞经历的传代数相等的传代数。

可以通过标准技术来评价上述基因的表达。例如，可以通过常规技术单独选择和构建基于基因的序列的探针。例如，可以在包括针对一个或多个基因的探针的微阵列上评价基因的表达，所述微阵列例如为AffymetrixHuman Genome U133A 2.0阵列，或AffymetrixHuman Genome U133Plus 2.0(Santa Clara，加利福尼亚)。即使针对特定GenBank登录号的序列被修改，也可以评价这些基因的表达，因为使用公知的标准技术可以容易地产生针对修改的序列特异性的探针。

这些基因的表达水平可以用于证实分离的胎盘细胞群体的身份、鉴定细胞群体为包括至少多个分离的胎盘细胞的细胞群体等。证实其身份的分离的胎盘细胞群体可以是克隆的，例如，从单一分离的胎盘细胞扩增的分离胎盘细胞群体，或干细胞的混合群体，例如，仅包含从多个分离的胎盘细胞扩增的分离的胎盘细胞的细胞群体，或包含如本文中所述的分离的胎盘细胞和至少一种其他类型的细胞的细胞群体。

这些基因的表达水平可以用于选择分离的胎盘细胞的群体。例如，如果以上所列的一个或多个基因的表达在来自细胞群体的样品中明显高于等同的间充质干细胞的群体，则可以选择细胞群体，例如，克隆扩增的细胞。这样的选择可以是来自多个分离的胎盘细胞群体、多个其身份未知的细胞群体的群体，等等。

可以基于与例如间充质干细胞对照中的一个或多个基因的表达水平(例如，等同数量的骨髓衍生的间充质干细胞中所述的一个或多个基因的表达水平)相比一个或多个这样的基因的表达水平来选择分离的胎盘细胞。在一个实施方式中，将包含等同数量间充质干细胞的样品中所述一个或多个基因的表达水平用作对照。在另一个实施方式中，用于在某些条件下测试的分离的胎盘细胞的对照是代表所述条件下间充质干细胞中所述一个或多个基因的表达水平的数值。

在某些实施方式中，本文提供的方法中有用的胎盘细胞(例如，PDAC)在暴露于1-100ng/mL VEGF共4至21天后不表达CD34，如通过免疫定位检测的。在特定实施方式中，所述胎盘粘附细胞粘附于组织培养塑料。在另一个特定实施方式中，当在血管生成因子(如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))的存在下培养时，例如，在如MATRIGEL^TM的基质上，所述细胞群体诱导内皮细胞形成发芽或管状结构。

在另一个方面中，本文提供的PDAC(细胞群体，例如，PDAC的群体，或其中所述分离的细胞群体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是PDAC的细胞群体)分泌VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR或半乳糖凝集素-1中的一种或多种或者全部，例如至一个或多个细胞在其中生长的培养基中。在另一个实施方式中，与正常含氧条件(例如，约20％或约21％O₂)相比，所述PDAC在低氧条件下(例如，低于约5％O₂)表达提高水平的CD202b、IL-8和/或VEGF。

在另一个实施方式中，本文中所述的任何PDAC或包含PDAC的细胞群体可以引起与所述胎盘衍生的粘附细胞接触的内皮细胞群体中形成芽或管状结构。在特定实施方式中，将PDAC与人内皮细胞(其形成芽或管状结构)共同培养，或支持内皮细胞芽的形成，例如，当在细胞外基质蛋白(如I和IV型胶原蛋白)和/或血管生成因子(如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))的存在下，例如，在如胎盘胶原蛋白或MATRIGEL^TM的基质之中或之上培养至少4天时。在另一个实施方式中，任何包含本文中所述的胎盘衍生粘附细胞的细胞群体分泌血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或白细胞介素-8(IL-8)，并且因此在细胞外基质蛋白(如I和IV型胶原蛋白)的存在下，例如在如胎盘胶原蛋白或MATRIGEL^TM的基质之中或之上培养时，可以诱导人内皮细胞形成芽或管状结构。

在另一个实施方式中，以上任何包含胎盘衍生的粘附细胞(PDAC)的细胞群体分泌血管生成因子。在特定实施方式中，所述细胞群体分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或白细胞介素-8(IL-8)。在其它特定实施方案中，包含PDAC的细胞群体分泌一种或多种血管生成因子，并且因此在体外伤口愈合分析中诱导人内皮细胞迁移。在其他特定实施方式中，包含胎盘衍生的粘附细胞的细胞群体诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞的成熟、分化或增殖。

本文中所述的分离的胎盘细胞在原代培养物中，或在培养基中增殖的过程中，展示出以上特征(例如，细胞表面标志物和/或基因表达谱的组合)，所述培养基包含例如DMEM-LG(Gibco)、2％胎牛血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、1×亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)、10^-9M地塞米松(Sigma)、10^-4M抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)、表皮生长因子(EGF)10ng/mL(R&D Systems)、血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D Systems)和100U青霉素/1000U链霉素。

在本文中公开的任何胎盘细胞的某些实施方式中，所述细胞是人类细胞。在本文中公开的任何胎盘细胞的某些实施方式中，所述细胞标志物特征或基因表达特征是人类标志物或人类基因。

在所述分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个特定实施方式中，所述细胞或群体已经扩增，例如传代至少、约或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多次，或增殖至少、约或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个群体倍增。在所述分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个特定实施方式中，所述细胞或群体是初级分离物。在本文中公开的分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞是胎儿来源的(即，具有胎儿基因型)。

在某些实施方式中，所述分离的胎盘细胞在生长培养基(即配制用于促进增殖的培养基)中培养过程中不分化，例如，在生长培养基中增殖的过程中。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞为了增殖不需要饲养层。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞在不存在饲养层的情况中在培养中不分化，仅仅是由于缺乏饲养细胞层。

在另一个实施方式中，本文所述方法中有用的细胞是分离的胎盘细胞，其中多个所述分离的胎盘细胞对于醛脱氢酶(ALDH)是阳性的，如通过醛脱氢酶活性测定评价的。这样的测定是本领域已知的(参见，例如，Bostian and Betts，Biochem.J.，173，787，(1978))。在特定实施方式中，所述ALDH测定使用(Aldagen，Inc.，Ashland，Oregon)作为醛脱氢酶活性的标志物。在特定实施方式中，所述多个是所述细胞群体中的约3％至约25％的细胞。在另一个实施方式中，本文提供了分离的脐带细胞群体，例如，多能的分离的脐带细胞，其中多个所述分离的脐带细胞对于醛脱氢酶是阳性的，如通过使用作为醛脱氢酶活性指示剂的醛脱氢酶活性测定评价的。在特定实施方式中，所述多个是所述细胞群体中约3％至约25％的细胞。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的脐带细胞的群体显示出比具有大约相同的细胞数量并且在相同条件下培养的骨髓衍生的间充质干细胞的群体高至少三倍或至少五倍的ALDH活性。

在包含本文中所述的分离胎盘细胞的任何细胞群体的某些实施方式中，所述细胞群体中的胎盘细胞基本上不含具有母体基因型的细胞，例如，所述群体中的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的胎盘细胞具有胎儿基因型。在包含本文中所述的分离胎盘细胞的任何细胞群体的某些其他实施方式中，包含所述胎盘细胞的细胞群体基本上不含具有母体基因型的细胞；例如，所述群体中的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞具有胎儿基因型。

在以上任何分离的胎盘细胞或分离胎盘细胞的细胞群体的特定实施方式中，所述细胞，或所述群体中至少约95％或约99％的细胞的核型是正常的。在以上任何胎盘细胞或细胞群体的另一个特定实施方式中，所述细胞，或所述细胞群体中的细胞，是非母体来源的。

带有任何以上标志物组合的分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体可以以任意比率组合。任何两个或更多个以上分离的胎盘细胞群体可以组合以形成分离的胎盘细胞群体。例如，分离的胎盘细胞的群体可以包括由上述一个标志物组合限定的分离胎盘细胞的第一群体，以及由上述另一个标志物组合限定的分离胎盘细胞的第二群体，其中所述第一和第二群体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的率例组合。以相似的方式，任意三个、四个、五个或更多个上述的分离胎盘细胞或分离胎盘细胞群体可以组合。

例如，可以通过破坏胎盘组织(使用或未用酶消化)(参见5.2.3部分)或灌注(参见5.2.4部分)，来获得本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞。例如，可以根据包括以下的方法来产生分离的胎盘细胞的群体：灌注已经排干脐带血并灌注除去残留的血的哺乳动物胎盘；用灌注溶液灌注所述胎盘；和收集所述灌注溶液，其中灌注后的所述灌注溶液包含胎盘细胞群体，其包括分离的胎盘细胞；和从所述细胞群体分离多个所述分离的胎盘细胞。在特定实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉和脐动脉，并在其流出胎盘后收集。在另一个特定实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或通过脐动脉并从脐静脉收集。

在各种不同的实施方案中，获自胎盘灌注的细胞群体内含有的分离的胎盘细胞为所述胎盘细胞群体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。在另一个特定实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘细胞包括胎儿和母体细胞。在另一个特定实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘细胞为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％的胎儿细胞。

在另一个特定实施方式中，本文提供了包含通过灌注收集的如本文中所述的分离胎盘细胞的群体的组合物，其中所述组合物包括至少一部分用于收集分离的胎盘细胞的灌注溶液。

可以通过用组织破坏酶消化胎盘组织以获得包括所述细胞的胎盘细胞群体，并且从所述胎盘细胞的剩余部分分离或基本上分离多个胎盘细胞，可以产生本文所述的分离的胎盘细胞的分离群体。可以消化整个胎盘或胎盘的任何部分以获得本文中所述的分离的胎盘细胞。在特定实施方式中，例如，所述胎盘组织可以是完整胎盘、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或之前任何的组合。在其他特定实施方式中，所述组织破坏酶是胰蛋白酶或胶原蛋白酶。在各种不同的实施方式中，从消化胎盘获得的细胞群体内含有的分离的胎盘细胞为所述胎盘细胞群体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。

上述分离的胎盘细胞群体和分离胎盘细胞的群体通常可以包含约、至少或不超过1×10³、3×10³、5×10³、1×10⁴、3×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹或1×10¹⁰个分离的胎盘细胞(例如，作为包含胎盘干细胞的药物组合物的部分)或约1×10³至3×10³、3×10³至5×10³、5×10³至1×10⁴、1×10⁴至3×10⁴、3×10⁴至5×10⁴、5×10⁴至1×10⁵、1×10⁵至3×10⁵、3×10⁵至5×10⁵、5×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至3×10⁶、3×10⁶至5×10⁶、5×10⁶至1×10⁷、1×10⁷至3×10⁷、3×10⁷至5×10⁷、5×10⁷至1×10⁸、1×10⁸至3×10⁸、3×10⁸至5×10⁸、5×10⁸至1×10⁹、1×10⁹至5×10⁹或5×10⁹至1×10¹⁰个分离的胎盘细胞(例如，作为包含胎盘干细胞的药物组合物的部分)。本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞的群体包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的活的分离的胎盘细胞，例如，如通过例如锥虫蓝拒染测定的。

5.2获得分离的胎盘细胞的方法

5.2.1干细胞收集组合物

通常，使用生理上可接受的溶液，例如，细胞收集组合物，从哺乳动物胎盘获得以上5.1节中描述的分离的胎盘细胞。示例性的细胞收集组合物详细描述于相关的发明名称为“用于收集胎盘干细胞和保存器官的改进介质”的美国专利申请公开No.2007/0190042中，将其公开内容以其整体按引用并入本文中。

细胞收集组合物可以包含适合于细胞(例如，本文中所述的分离的胎盘细胞)的收集和/或培养的任何生理学上可接受的溶液，例如，盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、Kreb’s溶液、改良的Kreb’s溶液、Eagle’s溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM、H.DMEM等)，等。

细胞收集组合物可以包含一种或多种倾向于保存分离的胎盘细胞的组分，即，从收集时到培养时，防止分离的胎盘细胞死亡，或延迟分离的胎盘细胞死亡，降低细胞群体中死亡的分离胎盘细胞的数量等。这样的组分可以是例如细胞凋亡抑制剂(例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普酸钠、胼酞嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携带氧的全氟化碳(例如，全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。

所述细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、RNase或DNase等。这样的酶包括，但不限于，胶原蛋白酶(例如，胶原蛋白酶I、II、III或IV，来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的胶原蛋白酶等)；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、LIBERASE、透明质酸酶等。

所述细胞收集组合物可以包含杀菌或灭菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，所述抗生素是大环内酯(例如，托普霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋新、头孢罗齐、头孢克罗、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如，青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方案中，所述抗生素是对革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌活性的，所述细菌例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。在一个实施方案中，所述抗生素是庆大霉素，例如，培养基中约0.005％至约0.01％(w/v)。

所述细胞收集组合物还可以包含以下的一种或多种化合物：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；高于20,000道尔顿分子量的大分子，在一个实施方案中，以足以维持内皮完整性和细胞存活力的量存在(例如，合成的或天然产生的胶体，多糖，如葡聚糖，或聚乙二醇，以约25g/l至约100g/l，或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如，丁基羟基茴香醚、丁羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM至约100μM存在)；还原剂(例如，N-乙酰基半胱甘酸，以约0.1mM至约5mM存在)；防止钙进入细胞中的试剂(例如，戊脉安，以约2μM至约25μM存在)；硝化甘油(例如，约0.05g/L至约0.2g/L)；抗凝剂，在一个实施方案中，以足以帮助防止残余的血液凝固的量存在(例如，肝素或水蛭素，以约1000单位/l至约100,000单位/l的浓度存在)；或含有氨氯吡脒的化合物(例如，氨氯吡脒、乙基异丙基氨氯吡脒、环己氨氯吡脒、二甲基氨氯吡脒或六亚甲基氨氯吡脒，以约1.0μM至约5μM存在)。

5.2.2.胎盘的收集和操作

通常，在出生后胎盘排出后短时间内回收人胎盘。在优选实施方式中，在知情同意后并且在获取患者的完整医疗史并且与胎盘相关联后，从患者回收胎盘。优选地，在分娩后继续记录医疗史。这样的医疗史可以用于配合随后胎盘或从其收集的分离胎盘细胞的使用。例如，根据医疗史，分离的人胎盘细胞可以用于与胎盘相相的婴儿的个性化用药，或用于所述婴儿的父母、同胞或其他亲属的个性化用药。

在收集分离的胎盘细胞之前，优选除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，分娩后，收集胎盘中的脐带血。胎盘可以经历常规的脐带血回收处理。通常，使用针或套管，借助重力，以使胎盘放血(参见，例如，Anderson，美国专利No.5,372,581；Hessel等，美国专利No.5,415,665)。通常将针或套管置于脐静脉中，并且可以轻轻按摩胎盘以帮助从胎盘排干脐带血。这样的脐带血回收可以在商业上进行，例如，LifeBank USA，Cedar Knolls，N.J.。优选地，将胎盘重力排干而没有进一步操作，以最小化脐带血回收过程中的组织破坏。

通常，将胎盘从分娩室或出生室转移至另一个位置，例如，实验室，用于回收脐带血和收集干细胞，例如，通过灌注或组织离解。胎盘优选在无菌的、隔热的运输设备(将胎盘的温度保持在20-28℃之间)中运输，例如，通过将胎盘(夹紧近端脐带)放置在无菌的拉链锁塑料袋中，随后将其放入隔热容器中。在另一个实施方式中，将胎盘在基本上如未决美国专利No.7,147,626中所述的脐带血收集试剂盒中运输，将所述专利的公开内容按引用并入本文中。优选地，将胎盘在分娩后四至二十四小时递送至实验室。在某些实施方式中，将近端脐带夹紧，优选在脐带血回收之前插入胎盘中的4-5cm(厘米)内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在进一步处理胎盘前，将近端脐带夹紧。

胎盘在细胞收集之前可以储存在无菌条件下以及在室温或5℃至25℃的温度下。在灌注胎盘以除去任何残余脐带血之前，胎盘可以储存四至二十四小时，长达四十八小时，或长于四十八小时的时间段。在一个实施方式中，从排出后约零小时至约两小时收集胎盘。胎盘优选储存在5℃至25℃温度的抗凝溶液中。合适的抗凝溶液是本领域公知的。例如，可以使用肝素或华法令钠的溶液。在优选实施方式中，抗凝溶液包括肝素的溶液(例如，1:1000溶液中1％w/w)。收集胎盘细胞前，放血的胎盘优选储存不超过36小时。

哺乳动物胎盘或其部分在通常如上收集并制备后可以以任何本领域已知的方式来处理，例如，可以灌注或破坏，例如，用一种或多种组织破坏酶消化，以获得分离的胎盘细胞。

5.2.3胎盘组织的物理破坏和酶消化

可以通过器官的部分或全部的物理破坏从哺乳动物胎盘收集胎盘细胞。例如，可以将胎盘或其一部分例如压碎、剪切、切碎、切丁、剁碎、浸软等。随后可以将组织培养以获得分离的胎盘细胞群体。通常，使用例如培养基、盐水溶液或干细胞收集来破坏胎盘组织。

在物理破坏和/或酶消化以及干细胞回收前，可以将胎盘解剖成组分。可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘绒毛叶或其任意组合的全部或一部分获得分离的胎盘细胞，包括从完整的胎盘。优选地，分离的胎盘细胞获自包括羊膜和绒毛膜的胎盘组织。通常，可以通过破坏小块胎盘组织来获得分离的胎盘细胞，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900mm³体积的胎盘组织块。可以使用任何物理破坏方法，只要破坏的方法保留所述器官中多个，更优选大部分，并且更优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞存活，如通过例如锥虫蓝拒染测定的。

通常可以在排出后约头三天内的任何时间，但优选在排出后约8小时至约18小时，从胎盘或其一部分收集分离的粘附胎盘细胞。

在特定实施方式中，在适用于分离的胎盘细胞增殖的组织培养基中培养破坏的组织。

在另一个特定实施方式中，通过胎盘组织的物理破坏收集分离的胎盘细胞，其中所述物理破坏包括酶消化，其可以通过使用一种或多种组织消化酶来完成。所述胎盘或其一部分也可以是物理破坏并且用一种或多种酶消化，并且然后将所得到的材料浸入或混入细胞收集组合物中。

优选的细胞收集组合物包含一种或多种组织破坏酶。可以用于破坏胎盘组织的酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶、分散酶或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可受到血清中的α2微管蛋白抑制，并且因此用于消化的介质通常不含血清。EDTA和DNase通常用于酶消化程序中以提高细胞回收的效率。优选将消化物稀释以避免将细胞捕获在粘性消化物内。

可以使用组织消化酶的任意组合。使用胰蛋白酶消化的典型浓度包括，0.1％至约2％胰蛋白酶，例如，约0.25％胰蛋白酶。蛋白酶可以组合地使用在同一消化反应中，即，两种或更多种蛋白酶，或可以按序使用以释放胎盘细胞，例如，胎盘干细胞和胎盘多能细胞。例如，在一个实施方式中，首先用合适量的约1至约2mg/ml胶原蛋白酶I消化胎盘或其部分例如30分钟，接着用约0.25％浓度的胰蛋白酶在37℃下消化例如10分钟。丝氨酸蛋白酶优选在使用其他酶后连续地使用。

在另一个实施方式中，可以通过将螯合剂加入包含干细胞的干细胞收集组合物中，或在用干细胞收集组合物分离干细胞前加入在其中破坏和/或消化组织的溶液中，来进一步破坏所述组织，所述螯合剂例如为乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

消化后，洗涤消化物(digestate)，例如，用培养基洗涤三次，并且将洗过的细胞接种至培养瓶中。随后通过差异粘附来分离细胞，并且针对例如生活力、细胞表面标志物、分化等来表征。

将认识到，在包括胎儿和母体细胞两者的完整胎盘或胎盘的一部分的情况中(例如，其中胎盘的部分包括绒毛膜或绒毛叶)，分离的胎盘细胞可以包括源自胎儿或母体来源两者的胎盘细胞的混合物。在胎盘的部分不包括或包括可忽略数量的母体细胞的情况中(例如，羊膜)，从其分离的胎盘细胞将几乎只包括胎儿胎盘细胞(即，具有胎儿基因型的胎盘细胞)。

可以通过差异胰蛋白酶化(参见以下的5.2.5节)，接着在一个或多个新的培养容器中的新鲜增殖培养基中培养，任选地接着第二差异胰蛋白酶化步骤，从破坏的胎盘组织分离胎盘细胞，例如，以上5.1节中所述的胎盘细胞。

5.2.4胎盘灌注

还可以通过哺乳动物胎盘的灌注获得胎盘细胞，例如，以上5.1节中所述的胎盘细胞。灌注哺乳动物胎盘以获得胎盘细胞的方法公开于例如Hariri，美国专利No.7,045,148和7,255,729，以及在美国专利申请公开No.2007/0275362和2007/0190042中，将其公开内容整体按引用并入本文中。

可以通过使用例如细胞收集组合物作为灌注溶液灌注(例如，通过胎盘脉管系统)来收集胎盘细胞。在一个实施方案中，通过使灌注溶液流经脐动脉和脐静脉之一或两者来灌注哺乳动物胎盘。可以使用例如进入胎盘的重力流来完成通过胎盘的灌注溶液流动。优选地，使用泵，例如，蠕动泵，迫使灌注溶液通过胎盘。例如，可以将脐静脉插入套管，例如，或塑料套管，其连接于无菌连接装置，如无菌管道。所述无菌连接装置连接灌注歧管。

在准备用于灌注时，优选以使得脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式使胎盘定向(例如，悬挂)。可以通过将灌注流体流过胎盘脉管系统和周围组织来灌注胎盘。还可以通过将灌注流体流入脐静脉并从脐动脉收集，或将灌注流体流入脐动脉并从脐静脉收集来灌注胎盘。

例如，在一个实施方式中，同时将脐动脉和脐静脉连接于例如移液管，所述移液管经由柔性连接器连接于灌注溶液的储器。将灌注溶液通入脐静脉和动脉中。灌注溶液从血管壁排出和/或通过血管壁流入胎盘的周围组织中，并且从在妊娠过程中附接于母体子宫的胎盘表面在合适的开放血管中收集。灌注溶液还可以通过脐带开口引入并使其流动或在与母体子宫壁接界的胎盘壁中的开口渗滤出。通过这种可以称为“淘洗(pan)”方法收集的胎盘细胞通常是胎儿和母体细胞的混合物。

在另一个实施方式中，将灌注溶液流过脐静脉并从脐动脉收集，或流过脐动脉并从脐静脉收集。通过可以称为“闭路”方法的这种方法收集的胎盘细胞通常几乎仅仅是胎儿的。

将认识到使用淘选方法的灌注，即，由此在灌注液从胎盘的母体侧排出后收集灌注液，得到胎儿和母体细胞的混合物。因此，通过这种方法收集的细胞可以包括胎儿和母体来源的混合胎盘细胞群体，例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞。相反，闭路方法中仅通过胎盘脉管系统的灌注(由此灌注流体通过一个或两个胎盘血管并且仅通过剩余血管收集)得到几乎仅仅是胎儿来源的胎盘细胞群体的集合。

在一个实施方式中，闭路灌注方法可以如下进行。在出生后约48小时内获得产后的胎盘。将脐带夹紧并在夹子上方切断。可以将脐带丢弃，或可以处理以回收例如脐带干细胞，和/或处理脐带膜用于生物材料的生产。在灌注过程中可以保留羊膜，或可以例如使用手指的钝性分离从绒毛膜分离。如果羊膜在灌注前与绒毛膜分离，其可以例如丢弃或处理，例如，以通过酶消化获得干细胞，或产生例如羊膜生物材料，例如，美国申请公开No.2004/0048796中描述的生物材料，其公开内容整体按引用并入本文中。例如，使用无菌纱布清洗掉胎盘的全部可见血块和残余血液后，将脐带血管暴露，例如，通过部分切开脐带膜以暴露脐带的横截面。确认血管，并打开，例如，通过将闭合的鳄鱼钳通过每根血管的切开端推进。随后将器械(例如，连接到灌注装置或蠕动泵的塑料管道)插入每根胎盘动脉中。泵可以是适合于该目的的任何泵，例如蠕动泵。随后将连接于无菌收集储器(例如，血袋，如250mL收集袋)的塑料管道插入胎盘静脉中。或者，将连接于泵的管道插入胎盘静脉中，并且将连接于收集储器的管插入一根或两根胎盘动脉中。随后用一定体积的灌注溶液，例如，约750ml灌注溶液，灌注胎盘。随后收集灌注液中的细胞，例如，通过离心收集。在某些实施方式中，用灌注溶液灌注胎盘，例如，100-300mL灌注溶液，以在灌注收集胎盘细胞(例如，胎盘干细胞和/或胎盘多能细胞)前除去残留的血液。在另一个实施方式中，在灌注以收集胎盘细胞前，胎盘没有用灌注溶液灌注来除去残留血液。

在一个实施方式中，在灌注过程中将近端脐带夹紧，并且更优选地，在脐带插入胎盘中的4-5cm(厘米)内夹紧。

在放血过程中从哺乳动物胎盘第一次收集的灌注流体通常被脐带血和/或胎盘血的残留红细胞染色。随着灌注进行并且残余的脐带血细胞被洗出胎盘，灌注流体变得更无色。通常，30至100ml(毫升)灌注流体足以对胎盘初始放血，但可以根据观察的结果使用或多或少的灌注流体。

用于分离胎盘细胞的灌注流体的体积可以根据待收集的细胞数量、胎盘大小、从单个胎盘制得的集合数量等而改变。在各种不同的实施方式中，灌注流体的体积可以为50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL，或750mL至2000mL。通常，胎盘在放血后用700-800mL灌注液体灌注。

在数小时或数天过程中，可以多次灌注胎盘。在胎盘多次灌注的情况中，其可以在容器或其他合适器皿中无菌条件下维持或培养，并且用细胞收集组合物或标准灌注溶液(例如，生理盐水溶液，如磷酸盐缓冲盐水(“PBS”))，在具有或没有抗凝剂(例如，肝素、华法令钠、香豆素、双羟基香豆素)，和/或具有或没有抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(例如，40-100μg/ml)、青霉素(例如，40U/ml)、两性霉素B(例如，0.5μg/ml))灌注。在一个实施方式中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌注液，使得在灌注和收集灌注液之前，将胎盘维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者2或3天或更多天。灌注的胎盘可以再维持一个或多个另外的时间，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并且用例如700-800mL灌注流体灌注第二次。可以将胎盘灌注1、2、3、4、5或更多次，例如，每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选实施方式中，重复胎盘的灌注和灌注溶液(例如，细胞收集组合物)的收集，直至回收的有核细胞的数量低于100个细胞/ml。不同时间点的灌注液可以进一步单独处理以回收时间依赖性的细胞群体，例如，干细胞。还可以将来自不同时间点的灌注液合并。在优选实施方式中，在排出后约8小时至约18小时之间的一个或多个时间收集胎盘细胞。

灌注优选导致收集明显比从没有用所述溶液灌注且没有另外处理来获得胎盘细胞(例如，通过组织破坏，例如，酶消化)的哺乳动物胎盘可获得的数量显著更多的胎盘细胞。在这种情况中，“显著更多”表示至少多10％。灌注产生比例如从胎盘或其部分已经在其中培养的培养基可分离的胎盘细胞数量明显更多的胎盘细胞。

可以使用包含一种或多种蛋白酶或其他组织破坏酶的溶液通过灌注从胎盘分离胎盘细胞。在特定实施方式中，使胎盘或其部分(例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或绒毛叶、脐带，或任何上述部分的组合)达到25-37℃，并且用200mL培养基中的一种或多种组织破坏酶孵育30分钟。收集来自灌注液的细胞，使其达到4℃，并且用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷的抑制剂混合物洗涤。几分钟后，用冷的(例如，4℃)干细胞收集组合物洗涤胎盘细胞。

5.2.5胎盘细胞的分离、分选和表征

分离的胎盘细胞，例如，以上5.1节中描述的细胞，不管是通过灌注或物理破坏获得，例如，通过酶消化获得，最初可以通过Ficoll梯度离心从其他细胞纯化(即，与其他细胞分离)。这样的离心可以对于离心速度等遵循任何标准方案。在一个实施方式中，例如，可以通过在室温下以5000×g下离心15分钟从灌注液回收从胎盘收集的细胞，这将细胞从例如污染碎片和血小板分离。在另一个实施方式中，将胎盘灌注液浓缩至约200ml，在Ficoll上温和分层，并且在22℃下以约1100×g离心20分钟，并且收集低密度界面层的细胞用于进一步处理。

可以将细胞沉淀物重悬浮于新鲜干细胞收集组合物中，或适用于细胞维持(例如，干细胞维持)的培养基中，例如，含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基(GibcoBRL，NY)。例如，可以根据制造商推荐的程序，使用Lymphoprep(Nycomed Pharma，奥斯陆，挪威)分离总单核细胞部分。

例如，通过灌注或消化获得的胎盘细胞可以使用例如含有0.2％EDTA的0.05％胰蛋白酶溶液(Sigma，St.Louis MO)进一步或最初通过差异胰蛋白酶化来分离。差异胰蛋白酶化是可能的，因为分离的胎盘细胞(其是组织培养贴壁的)通常在约五分钟内从塑料表面脱离，而其他粘附群体通常需要超过20-30分钟的孵育。可以在胰蛋白酶化和胰蛋白酶中和(使用例如胰蛋白酶中和溶液(TNS，Cambrex))后收集脱离的胎盘细胞。在粘附细胞分离的一个实施方式中，将等份的(例如，约5-10×10⁶个)细胞置于几个T-75烧瓶中的每一个，优选地纤连蛋白-涂覆的T75烧瓶。在这样的实施方式中，可以用商业上可购得的间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex)培养细胞，并置于组织培养温箱(37℃，5％CO₂)中。10至15天后，通过用PBS洗涤从烧瓶除去非粘附细胞。随后用MSCGM替换PBS。烧瓶优选每日检查各种粘附细胞类型的存在，并且特别地，检查成纤维细胞样细胞簇的鉴定和扩增。

例如，可以通过使用标准细胞检测技术，如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如，使用组织特异性或细胞标志物特异性抗体的染色)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)，通过使用光学或共焦显微镜检查细胞的形态学，和/或通过使用本领域公知的技术(如PCR和基因表达谱)测量基因表达的变化，监测从哺乳动物胎盘收集的细胞的数量和类型。这些技术也可以用于鉴定对于一个或多个特定标志物阳性的细胞。例如，使用CD34的抗体，可以使用以上技术确定细胞是否包含可检测量的CD34；如果是，则细胞是CD34+。同样，如果细胞产生通过RT-PCR可检测的足够的OCT-4RNA，或比成体细胞明显更多的OCT-4RNA，则细胞是OCT-4+。细胞表面标志物(例如，CD标志物，如CD34)的抗体和干细胞特异性基因(如OCT-4)的序列是本领域公知的。

胎盘细胞，特别是已经通过Ficoll分离、差异粘附或两者的组合分离的细胞，可以使用荧光激活细胞分选仪(FACS)来分选。荧光激活细胞分选(FACS)是基于颗粒的荧光特性用于分离颗粒(包括细胞)的公知方法(Kamarch，1987，Methods Enzymol，151:150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发导致小的电荷，从而允许阳性和阴性颗粒从混合物的电磁分离。在一个实施方式中，用不同的荧光标记物来标记细胞表面标志物特异性的抗体或配体。细胞通过细胞分选器处理，从而允许基于其结合所用抗体的能力来分离细胞。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96-孔或384-孔平板的单个孔中以促进分离和克隆。

在一个分选方案中，基于标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G中的一种或多种的表达来分选来自胎盘的细胞，例如PDAC。这可以结合基于其在培养物中的粘附性质来选择这些细胞的程序来完成。例如，可以在基于标志物表达分选之前或之后完成组织培养塑料粘附选择。例如，在一个实施方式中，首先基于其CD34的表达来分选细胞；保留CD34-细胞，且从所有其他CD34-细胞分离另外是CD200+和HLA-G-的CD34-细胞。在另一个实施方式中，基于其标志物CD200和/或HLA-G的表达来分选来自胎盘的细胞；例如，分离展示CD200和缺乏HLA-G的细胞用于进一步的使用。在特定实施方式中，可以基于其CD73和/或CD105的表达，或通过抗体SH2、SH3或SH4识别的表位，或缺乏CD34、CD38或CD45的表达，进一步分选表达例如CD200和/或缺乏例如HLA-G的细胞。例如，在另一个实施方式中，通过CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或其缺乏来分选胎盘细胞，并且从其他胎盘细胞分离是CD200+、HLA-G-、CD73+、CD105+、CD34-、CD38-和CD45-的胎盘细胞用于进一步的使用。

在以上分选的胎盘细胞的任何实施方式的特定实施方式中，分选后保留的细胞群体中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是所述分离的胎盘细胞。可以通过以上5.1节中描述的任意标志物中的一种或多种来分选胎盘细胞。

在特定实施方式中，例如，将(1)粘附于组织培养塑料和(2)为CD10+、CD34-和CD105+的胎盘细胞从其他胎盘细胞分选(即，分离)。在另一个特定实施方式中，将(1)粘附于组织培养塑料和(2)为CD10+、CD34-、CD105+和CD200+的胎盘细胞从其他胎盘细胞分选(即，分离)。在另一个特定实施方式中，将(1)粘附于组织培养塑料和(2)为CD10+、CD34-、CD90+、CD105+和CD200+的胎盘细胞从其他胎盘细胞分选(即，分离)。

关于胎盘细胞的基于核苷酸序列的检测，用于本文中所列标志物的序列可以在公众可得的数据库(如GenBank或EMBL)中容易地获得。

关于胎盘细胞(例如，胎盘干细胞或胎盘多能细胞)的抗体介导的检测和分选，可以结合任意荧光团或其他适用于细胞的检测和分选的标记物(例如，荧光激活的细胞分选)使用对特定标志物特异性的任何抗体。针对特定标志物的抗体/荧光团组合包括，但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗HLA-G(获自Serotec，Raleigh，North Carolina)、CD10(获自BD Immunogytometry Systems，San Jose，加利福尼亚)、CD44(获自BD BiosciencesPharmingen，San Jose，加利福尼亚)和CD105(获自R&D Systems Inc.，Minneapolis，Minnesota)的单克隆抗体；藻红蛋白(PE)缀合的抗CD44、CD200、CD117和CD13的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；藻红蛋白-Cy7(PE Cy7)缀合的抗CD33和CD10的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗生物素蛋白链菌素和抗CD38的单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)；和生物素化的CD90(BD BiosciencesPharmingen)。可以使用的其他抗体包括，但不限于，CD133-APC(Miltenyi)、KDR-生物素(CD309，Abcam)、细胞角蛋白K-Fitc(Sigma或Dako)、HLA ABC-Fitc(BD)、HLA DR,DQ,DP-PE(BD)、β-2-微管蛋白-PE(BD)、CD80-PE(BD)和CD86-APC(BD)。可以使用的其他抗体/标记物组合包括，但不限于，CD45-PerCP(peridin叶绿素蛋白)；CD44-PE；CD19-PE；CD10-F(荧光素)；HLA-G-F和7-氨基-放线菌素-D(7-AAD)；HLA-ABC-F；等等。这个列表不是穷举性的，并且来自其他供应商的其他抗体也可以在商业上购得。

可以使用例如藻红蛋白-Cy5(PE Cy5)缀合的抗生物素蛋白链菌素和生物素缀合的抗CD117或CD133的单克隆抗体，针对CD117或CD133分析本文提供的分离的胎盘细胞；然而，使用这种系统，细胞可能由于相对高的背景而分别表现为对CD117或CD133是阳性的。

可以用单一标志物的抗体标记分离的胎盘细胞，并检测和/分选。胎盘细胞还可以用对不同标志物的多种抗体同时标记。

在另一个实施方式中，可以使用磁珠来分离细胞。可以使用磁激活细胞分选(MACS)技术来分选细胞，MACS是一种基于其结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力来分离颗粒的方法。可以对磁性微球进行多种有用的修饰，包括特异性地识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体的共价添加。随后将珠粒与细胞混合以允许结合。随后将细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个实施方式中，这些细胞随后可以分离并与偶联于抗另外的细胞表面标志物的抗体的磁珠重新混合。将所述细胞再次通过磁场，从而分离结合两种抗体的细胞。随后可以将这些细胞稀释至单独的盘中，如微量滴定盘，用于克隆分离。

还可以基于细胞形态学和生长特征来表征和/或分选分离的胎盘细胞。例如，可以将分离的胎盘细胞表征为具有例如在培养物的成纤维细胞样外观和/或基于此来进行选择。还可以将分离的胎盘细胞表征为具有形成类胚样体的能力和/或基于此来选择。在一个实施方式中，例如，将成纤维细胞样形状、表达CD73和CD105，并且在培养中产生一个或多个类胚样体的胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。在另一个实施方式中，将在培养中产生一个或多个类胚样体的OCT-4+胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。

在另一个实施方式中，可以通过集落形成单位测试来鉴定和表征分离的胎盘细胞。集落形成单位测试是本领域公知的，如MesenCult^TM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver British Columbia)。

可以使用本领域已知的标准技术，如锥虫蓝拒染测试、二乙酸荧光素摄取测试、碘化丙啶摄取测试(用于评价生活力)；和胸腺嘧啶摄取测试、MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴)细胞增殖测试(用于评价增殖)，针对生活力、增殖潜力和寿命来评价分离的胎盘细胞。可以通过本领域公知的方法，如通过测定扩展的培养中最大群体倍增数，来测定寿命。

还可以使用本领域已知的其他技术，例如，所需细胞的选择性生长(正向选择)、不需要的细胞的选择性破坏(负向选择)；基于混合群体中的差异细胞凝集性的分离，例如，使用大豆凝集素；冻-融程序；过滤；常规和区带离心；离心淘析(逆流离心)；单位重力分离；逆流分布；电泳等，将分离的胎盘细胞(例如，以上5.1节中描述的分离的胎盘细胞)与其他胎盘细胞分离。

5.2.6低温保存的分离的胎盘细胞

在某些实施方式中，在用于本文中所述的方法之前，本文所述方法中有用的分离的胎盘细胞群体已经被保存，例如，低温保存。用于细胞(如干细胞)的低温保存的方法是本领域公知的。在某些实施方式中，以易于施用于个体的形式来制备胎盘细胞，例如，包含在适合于医疗用途的容器内的分离的胎盘细胞群体。这样的容器可以是，例如，注射器、无菌塑料袋、烧瓶、罐或从其可以容易地分配分离的胎盘细胞群体的其他容器。例如，所述容器可以是血袋或其他适用于将液体静脉内施用于接受者的塑料的医学上可接受的袋子。在某些实施方式中，所述容器是允许组合的细胞群体低温保存的容器。

低温保存的分离的胎盘细胞群体可以包含源自单一供体或多个供体的分离的胎盘细胞。所述分离的胎盘细胞群体可以与计划的接受者是完全HLA-匹配的，或者是部分或完全HLA-错配的。

因此，在一个实施方式中，分离的胎盘细胞可以在容器中以包含组织培养贴壁胎盘细胞群体的组合物的形式用于本文中描述的方法中。在特定的实施方式中，将分离的胎盘细胞低温保存。在另一个特定实施方式中，所述容器是袋子、烧瓶或罐。在另一个特定实施方式中，所述组合物包含一种或多种有助于组合的细胞群体低温保存的化合物。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体包含在生理上可接受的水性溶液内。在另一个特定实施方式中，所述生理上可接受的水性溶液为0.9％NaCl溶液。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体包含与所述细胞群体的接受者HLA-匹配的胎盘细胞。在另一个特定实施方式中，所述组合的细胞群体包含与所述细胞群体的接受者至少部分地HLA-错配的胎盘细胞。在另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞源自多个供体。

在某些实施方式中，容器中的分离的胎盘细胞是分离的CD10+、CD34-、CD105+胎盘细胞，其中所述细胞已经低温保存，并且容纳在容器内。在特定实施方式中，所述CD10+、CD34-、CD105+胎盘细胞还是CD200+。在另一个特定实施方式中，所述CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盘细胞还是CD45-或CD90+。在另一个特定实施方式中，所述CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盘细胞还是CD45-和CD90+。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-cadherindim、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-或程序化死亡-1配体(PDL1)+或其任意组合中的一个或多个。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38-、CD44+、CD45-、CD54/ICAM+、CD62E-、CD62L-、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80-、CD86-、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117-、CD144/VE-cadherindim、CD184/CXCR4-、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3-、SSEA4-、ABC-p+、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-、HLA-G-和程序化死亡-1配体(PDL1)+。

在某些其他实施方式中，上述分离的胎盘细胞是分离的CD200+、HLA-G-胎盘细胞，其中所述细胞已经低温保存，并且容纳在容器内。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是已经低温保存并且容纳在容器内的CD73+、CD105+、CD200+细胞。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是已经低温保存并且容纳在容器内的CD200+、OCT-4+干细胞。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是已经低温保存并且容纳在容器内的CD73+、CD105+细胞，并且其中所述分离的胎盘细胞在允许类胚样体形成的条件下与胎盘细胞群体一起培养时有助于一个或多个类胚样体的形成。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是已经低温保存并且容纳在容器内的CD73+、CD105+、HLA-G-细胞。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞是已经低温保存并且容纳在容器内的OCT-4+胎盘细胞，并且其中所述细胞在允许类胚样体形成的条件下与胎盘细胞群体一起培养时有助于一个或多个类胚样体的形成。

在另一个特定实施方式中，上述分离的胎盘细胞是为CD34-、CD10+和CD105+的胎盘干细胞或胎盘多能细胞，如通过流式细胞术检测的(例如，PDAC)。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化成神经表型的细胞、成骨表型的细胞或成软骨表型的细胞的潜能。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD90+或CD45-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD90+或CD45-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞另外是CD90+或CD45-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+细胞另外是CD90+和CD45-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+、CD200+、CD90+、CD45-细胞另外是CD80-和CD86-，如通过流式细胞术检测的。在另一个特定实施方式中，所述CD34-、CD10+、CD105+细胞另外是CD29+、CD38-、CD44+、CD54+、CD80-、CD86-、SH3+或SH4+中的一个或多个。在另一个特定实施方式中，所述细胞另外是CD44+。在以上任何分离的CD34-、CD10+、CD105+胎盘细胞的特定实施方式中，所述细胞另外是CD117-、CD133-、KDR-(VEGFR2-)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR-和/或PDL1+中的一个或多个。

在上述任何低温保存的分离的胎盘细胞的特定实施方式中，所述容器是袋子或试管。在各种不同的特定实施方式中，所述容器包含约、至少或至多1×10⁶个所述分离的胎盘细胞、5×10⁶个所述分离的胎盘细胞、1×10⁷个所述分离的胎盘细胞、5×10⁷个所述分离的胎盘细胞、1×10⁸个所述分离的胎盘细胞、5×10⁸个所述分离的胎盘细胞、1×10⁹个所述分离的胎盘细胞、5×10⁹个所述分离的胎盘细胞、1×10¹⁰个所述分离的胎盘细胞或1×10¹⁰个所述分离的胎盘细胞。在上述任何低温保存群体的其他特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞已经传代约、至少或不超过5次、不超过10次、不超过15次或不超过20次。在上述任何低温保存的分离的胎盘细胞的另一个特定实施方式中，所述分离的胎盘细胞在所述容器内扩增。

在其他实施方式中，用于本文所述的方法中的胎盘衍生的粘附细胞的单一单位剂量在各种不同的实施方式中可以包含约、至少或不超过1×10³、3×10³、5×10³、1×10⁴、3×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、3×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、3×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹或1×10¹⁰个胎盘细胞。在某些实施方式中，胎盘衍生的粘附细胞的单一单位剂量可以包含1×10³至3×10³、3×10³至5×10³、5×10³至1×10⁴、1×10⁴至3×10⁴、3×10⁴至5×10⁴、5×10⁴至1×10⁵、1×10⁵至3×10⁵、3×10⁵至5×10⁵、5×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至3×10⁶、3×10⁶至5×10⁶、5×10⁶至1×10⁷、1×10⁷至3×10⁷、3×10⁷至5×10⁷、5×10⁷至1×10⁸、1×10⁸至3×10⁸、3×10⁸至5×10⁸、5×10⁸至1×10⁹、1×10⁹至5×10⁹或5×10⁹至1×10¹⁰个胎盘细胞。

6.实施例

6.1实施例1：细胞效能分析

这个实施例描述了使用CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盘干细胞的细胞效能分析。

将三个不同批次的低温保存的CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盘干细胞用于实验中。从每个批次中，获得三个单独的细胞制备物。将来自每个细胞制备物的四个等份以10,000细胞/cm²接种于48-孔平板中(9200个总细胞/孔)。

随后将细胞在相同标准细胞培养基(基础DMEM)中培养24小时或48小时(“恢复培养”)。使用IncuCyte培养箱内成像和图像分析系统，以每小时通过视觉观察评价恢复培养期过程中细胞的百分汇合。24小时或48小时恢复期后，将细胞在包含白细胞介素-1β的培养基中培养以诱导PGE2产生，并且再培养24小时。24小时诱导培养后，从细胞培养物收集条件培养基，并且通过ELISA评价条件培养基中的PGE2量。

如图1中所示，使用48小时恢复培养期，与24小时恢复培养期相反，改善了分析间以及分析内变异性，如通过细胞的百分汇合测量的。在每种情况中，培养48小时的细胞制备物的变异系数(％CV)低于培养24小时的细胞制备物的变异系数。重复实验时，观察到了相同的结果。参见图2。

如图3中所示，利用48小时恢复培养的细胞效能分析优于使用24小时恢复培养的细胞效能分析。通过PGE2的测量测定了分析变异性的改善，PGE2是用于CD10+、CD34-、CD105+、CD200+胎盘干细胞的细胞效能的代理因子。特别地，PGE2表达作为用于胎盘干细胞的免疫抑制活性的代理发挥作用。在测试的三个独立批次的胎盘干细胞的每一个中，使用来自48小时恢复培养的细胞测量的PGE2水平的变异系数(％CV)低于使用来自24小时恢复培养的细胞测量的PGE2水平的变异系数。

为了进一步证实利用48小时恢复培养的细胞效能分析的优越性，进行了使用许多细胞制备物的大规模实验。参见图4。再次证明了与利用24小时恢复培养的细胞效能分析相比，将恢复培养时间延长至48小时降低了分析内变异性(图4A)和降低的分析间变异性(图4B)。此外，证明了将恢复培养长度延长至48小时不影响动态范围(图4C)，但利用48小时恢复时间的细胞效能分析具有提高的统计功效(图4D)。

总之，这个实施例证明了细胞效能分析中使用的恢复培养时间段是关键参数。

等同：

本发明公开内容不限于本文中描述的特定实施方式限定的范围。实际上，除了描述的那些外，本领域技术人员从之前的描述将清楚本文提供的所述主题的各种改变。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

本文中引用了各种出版物、专利和专利申请，将其公开内容整体按引用并入本文中。

Claims

1.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养所述细胞一定时间段，该时间段使得在所述细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；和(iii)进行分析以确定所述细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

2.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养所述细胞约48小时；和(iii)进行分析以确定所述细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

3.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养所述细胞约48小时；和(iii)进行分析以确定所述细胞是否产生前列腺素E2(PGE2)，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。

4.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养细胞一定时间段，该时间段使得所述细胞在所述细胞已经培养所述时间段时细胞数量的变异性最小化；(iii)在包含能够诱导所述细胞中一种或多种基因的产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养所述细胞；和(iv)进行分析以确定所述细胞是否产生用作细胞效能代理的标志物。

5.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养所述细胞约48小时；(iii)在包含能够诱导所述细胞中一种或多种基因的产生的一种或多种试剂的培养基中进一步培养所述细胞；和(iv)进行分析以确定所述细胞是否产生用作细胞效能的代理的标志物。

6.一种用于评价细胞效能的方法，所述方法包括以下步骤：(i)获得细胞群体；(ii)培养所述细胞约48小时；(iii)进一步在包含能够诱导所述细胞产生前列腺素E2(PGE2)的试剂的培养基中培养所述细胞；和(iv)进行分析以确定所述细胞是否产生PGE2，其中PGE2的表达是细胞效能的代理。

7.权利要求6的方法，其中所述能够诱导所述细胞产生PGE2的试剂是白细胞介素-1(IL-1)β。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述细胞群体适合用作细胞疗法。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述细胞群体包括间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)，组织培养贴壁CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞，胚胎干细胞，胚胎生殖细胞，诱导的多能干细胞，间充质干细胞，骨髓衍生的间充质干细胞，骨髓衍生的间质基质细胞，组织贴壁胎盘干细胞(PDAC)，脐带干细胞，羊水干细胞，羊膜衍生的粘附细胞(AMDAC)，成骨胎盘粘附细胞(OPAC)，脂肪干细胞，角膜缘干细胞，牙髓干细胞，成肌细胞，内皮祖细胞，神经干细胞，脱落的牙齿衍生的干细胞，毛囊干细胞，真皮干细胞，孤雌生殖衍生的干细胞，重编程的干细胞，羊膜衍生的粘附细胞或侧群干细胞。

10.权利要求1-8任一项的方法，其中所述细胞是人类细胞。

11.权利要求1-8任一项的方法，其中所述细胞群体包括胎盘干细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述胎盘细胞粘附于组织培养塑料并且是CD34^-、CD10⁺、CD105⁺和CD200⁺，如通过流式细胞术可检测的。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述细胞群体获自之前已经低温保存的一批细胞。

14.权利要求1或4的方法，其中所述最小化细胞数量的变异性的时间段长于24小时。

15.权利要求14的方法，其中所述最小化细胞数量的变异性的时间段为48小时或约48小时。

16.权利要求14的方法，其中所述最小化细胞数量的变异性的时间段为或约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约54小时、约60小时或约66小时。

17.权利要求14的方法，其中所述最小化细胞数量的变异性的时间段为或在30小时至36小时、36小时至42小时、42小时至48小时、48小时至54小时、54小时至60小时，或60小时至66小时之间。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述用作所述细胞群体中的细胞效能的代理的标志物与所述细胞的免疫抑制活性相关。

19.权利要求1、2、4、5或7-18任一项的方法，其中所述用作所述细胞群体中的细胞效能的代理的标志物是PGE2。

20.权利要求1-18任一项的方法，其中所述用作所述细胞群体中的细胞效能的代理的标志物是ANG、EGF、ENA-78、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、GRO、HGF、IL-6、IL-8、瘦素、MCP-1、MCP-3、PDGFB、PLGF、Rantes、TGFB1、血小板生成素、TIMP1、TIMP2、uPAR、VEGF、VEGFD、血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮细胞粘附分子)、层粘连蛋白和/或纤连蛋白。

21.权利要求1-20任一项的方法，其中通过ELISA来检测所述用作细胞效能的代理的标志物。

22.权利要求1-20任一项的方法，其中通过MulitplexBead分析来检测所述用作细胞效能的代理的标志物。

23.权利要求1-20任一项的方法，其中通过测量基因表达的分析来检测所述用作细胞效能的代理的标志物。

24.权利要求23的方法，其中所述测量基因表达的分析是RT-PCR。

25.权利要求1-24任一项的方法，进一步包括从细胞培养物收集条件培养基。

26.权利要求1-25任一项的方法，其中如果所述细胞产生用作细胞效能的代理的标志物，则将初始的未培养细胞群体分成适合施用于人类受试者的一批细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述批次是低温保存的。

28.权利要求1-25任一项的方法，其中所述细胞群体是来自一批细胞。

29.权利要求28的方法，其中所述细胞批次是低温保存的。

30.权利要求28或29的方法，其中如果所述细胞产生用作细胞效能的代理的标志物，则将来自该批次的细胞施用于受试者。

31.权利要求30的方法，其中所述受试者是人类。