JP2021104053A - 刺激胎盤幹細胞を使用した血管新生 - Google Patents

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Abstract

【課題】刺激胎盤幹細胞、及び刺激胎盤細胞を使用して循環系の疾患または障害を有する個体を処置する方法を提供する。【解決手段】組織培養プラスチックに接着し、ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+であり、インビトロで１つ以上の炎症促進性サイトカインと接触されており、内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の集団における芽もしくは管状構造の形成を促進し、又は内皮細胞の遊走を促進する、単離された刺激胎盤由来接着細胞、このような刺激細胞を含む細胞の集団を投与する、循環系の疾患または障害を有する個体を処置する方法を提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１５年５月２６日に出願された米国仮出願第６２／１６６，５０４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
１．分野
１つ以上のサイトカインで刺激された組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞（本明細書ではＰＤＡＣと称される）を使用して血管新生を促進し、循環系の疾患または障害、例えば不十分な血管形成もしくは血流に関連もしくは起因するかまたは血管新生の改善によって処置可能な疾患または障害を処置する方法が本明細書で提供される。
２．背景
胎盤は、特に魅力的な幹細胞源である。哺乳動物の胎盤は豊富にあり、通常は医療廃棄物として廃棄されるので、それらは、医療的に有用な幹細胞のユニークな供給源である。このような単離された胎盤幹細胞と、前記胎盤幹細胞の集団と、これらを使用して血管新生を促進し、循環系の疾患または障害、例えば血管新生の促進によって処置可能な疾患または障害を処置する方法とが本明細書で提供される。
３．概要
一態様では、１つ以上のサイトカインで刺激された組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞（本明細書では、ＰＤＡＣ（胎盤由来接着細胞、例えば以下のセクション５．２に記載されている胎盤由来接着細胞）とも称される）が本明細書で提供される。特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣは、炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される刺激ＰＤＡＣは、組織培養プラスチックに接着し、例えばフローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、非刺激ＰＤＡＣ（例えば、サイトカイン、例えば炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１βで刺激されていないＰＤＡＣ）よりも高いレベルで、血管新生促進因子を分泌する。具体的な実施形態では、前記分泌因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンおよび／またはＩＬ−８を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載される前記刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、血管新生促進特性を有する。
別の態様では、循環系の疾患または障害を有する個体を処置する方法であって、１つ以上のサイトカインで刺激された治療有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞（本明細書では、ＰＤＡＣ（胎盤由来接着細胞、例えば以下のセクション５．２に記載されている胎盤由来接着細胞）とも称される）を前記個体に投与することを含み、前記疾患または障害の１つ以上の症候の検出可能な改善のために十分な量および時間で、前記刺激ＰＤＡＣを前記個体に投与する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣは、炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
具体的な実施形態では、それを必要とする対象における疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+ＰＤＡＣを前記対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記刺激ＰＤＡＣは、医薬組成物として製剤化される。具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、心筋梗塞である。別の具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、鬱血性心不全である。別の具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、心筋症である。
別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+ＰＤＡＣで処置される疾患または障害は、糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）である。具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、Ｉ型糖尿病を有する。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置される対象は、複数のＤＦＵを有し、例えば、対象は、片足において複数のＤＦＵを有するか、または各足において少なくとも１つのＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、一方の足または両方の足の裏において１つ以上のＤＦＵを有する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置される対象は、末梢神経障害、例えば脚および／または足の神経の１つ以上に対する損傷を有する。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、対象の末梢血管系における血流の途絶を引き起こす症状を有するＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する。特定の実施形態では、前記ＤＦＵは、ＰＡＤによって引き起こされ、および／またはそれに関連する。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、本明細書で提供される方法に従って処置される対象におけるＤＦＵの１つ以上の症候の検出可能な改善をもたらす。ＤＦＵの例示的な症候としては、限定されないが、足および／または下腿における傷、潰瘍または水膨れ；足（または両足）および／または下腿における痛み；歩行困難；足（または両足）における変色、例えば足（または両足）の外観の黒色、青色および／または赤色：ならびに感染症の徴候（例えば、発熱、皮膚の発赤および／または腫脹）が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、改善の１つ以上の兆候の検出可能な改善のために十分な量および時間で、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を、ＤＦＵを有する対象に投与することを含み、前記改善の兆候としては、（ｉ）潰瘍サイズの減少；（ｉｉ）潰瘍閉鎖：排膿も包帯の必要性もない１つ以上の潰瘍の皮膚閉鎖；（ｉｉｉ）閉鎖後の特定期間、例えば閉鎖後２週間、３週間、４週間、５週間または６週間にわたる潰瘍閉鎖の保持；（ｉｖ）潰瘍閉鎖時間の増加；（ｖ）足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）（対象の静止中に足首および腕の血圧を測定し、次いで対象の動作中に（例えば、トレッドミルを歩行中に）これを繰り返す検査であり、ＰＡＤの重症度を予測／評価するために使用され得る）の改善；（ｖｉ）足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）（ＡＢＩと類似の検査であって、足首の血圧ではなく足趾の血圧を使用する検査である）の改善；（ｖｉｉ）経皮酸素レベル（すなわち、潰瘍の近くの皮膚の下にある組織における酸素レベル）の改善（例えば、Ｒｕａｎｇｓｅｔａｋｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｗｏｕｎｄ Ｃａｒｅ，２０１０，１９（５）：２０２−６を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）脈容量記録（これは、血液測定用カフおよび携帯超音波デバイスを使用して、腕および脚における動脈血流についての情報を得る非侵襲的血管検査である）の改善；（ｉｘ）大切断、例えば足首上部における切断の時間；（ｘ）ワーグナー評価尺度（これは、評価システムを使用して、潰瘍の深さと、骨髄炎または壊疽の存在とを評価する：グレード０（潰瘍性病変の前または後）、グレード１（部分的／完全な厚さの潰瘍）、グレード２（腱または被膜へのプロービング）、グレード３（深部が骨髄炎を伴う）、グレード４（部分的な足の壊疽）およびグレード５（全体的な足の壊疽））の改善；（ｘｉ）ラザフォード基準（これは、末梢動脈疾患の病期分類に使用され、７つの分類ステージを有する：ステージ０−無症候、ステージ１−軽度の跛行、ステージ２−中程度の跛行、ステージ３−重度の跛行、ステージ４−安静時疼痛、ステージ５−足の指の潰瘍を超えない虚血性潰瘍形成、およびステージ６−重度の虚血性潰瘍または明らかな壊疽）の改善：および（ｘｉｉ）脚の安静時疼痛スコア（０が無痛であり、１０が最大疼痛を表す０〜１０の疼痛尺度）の改善が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、例えば、（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（これは、生活の質に対する糖尿病性足部潰瘍の影響を測定する）（例えば、Ｂａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，２００３，２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）神経障害の経時的変化を評価するための患者全般変化印象尺度（例えば、Ｋａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｎ．Ｍａｎｉｐ．Ｔｈｅｒ．，２００９，１７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；ならびに／または（ｉｖ）ＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度（これは、患者の健康状態に関する記述プロファイルおよび単一指標値を得るために使用される健康調査表である）によって評価した場合の対象の生活の質の検出可能な改善のために十分な量および時間で、胎盤幹細胞（例えば、胎盤幹細胞を含む医薬組成物）を、ＤＦＵを有する対象に投与することを含む。
他の実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+ＰＤＡＣで処置される疾患または障害は、動脈瘤、アンギナ、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中隔肥大（ＡＳＨ）、アテローム動脈硬化症、心房細動および粗動、細菌性心内膜炎、バーロー症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心肥大、心臓炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄症、先天性心欠損、冠動脈疾患、アイゼンメンガー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑音、高血圧症、低血圧症、特発性乳児動脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎）、メタボリックシンドローム、微小血管狭心症、心筋炎、発作性心房頻拍（ＰＡＴ）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症肢虚血、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、レイノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧症、リウマチ性心臓疾患、糖尿病性血管症、中隔欠損、無症候性虚血、Ｘ症候群、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴症、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、静脈瘤、血管炎、心室中隔欠損、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、心内膜床欠損、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心臓疾患、僧帽弁の疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾患、虚血性心臓疾患（急性および亜急性）、狭心症、急性肺性心臓疾患、肺塞栓症、慢性肺性心臓疾患、脊柱後側弯性心臓疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、脳血管疾患、動脈、細動脈および毛細血管の疾患または静脈およびリンパ管の疾患である。
他の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+ＰＤＡＣで処置される疾患または障害は、前大脳動脈の閉塞および狭窄または大脳動脈の閉塞である。一実施形態では、個体の脳またはその周辺の血流の途絶を有する（例えば、個体の脳もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）またはそれらの周辺の血流の途絶に起因する症候または神経学的欠損を有する）個体を処置する方法であって、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、血流の途絶は、個体の脳またはＣＮＳに対する酸素欠乏傷害または低酸素傷害をもたらす。
他の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+ＰＤＡＣで処置される疾患または障害は、末梢動脈の閉塞および狭窄である。一実施形態では、手足またはその周辺の血流の途絶を有する（例えば、個体の末梢血管系またはその周辺の血流の途絶に起因する症候または血管欠損を有する）個体を処置する方法であって、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、血流の途絶は、個体の手足およびまたは四肢に対する酸素欠乏傷害または低酸素傷害をもたらす。
本明細書に記載される処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、注射によって投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、胎盤細胞を含むマトリックスまたは足場の前記対象への埋め込みによって、処置される対象に投与される。
本明細書に記載される処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、筋肉内投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、静脈内投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、皮下投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、局所投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、全身投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、処置される疾患、例えば潰瘍、例えば糖尿病性足部潰瘍の部位に直接投与される。本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、処置される疾患、例えば潰瘍、例えば糖尿病性足部潰瘍の部位の近傍または周辺に投与される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、約１×１０6、３×１０6、５×１０6、１×１０7、３×１０7、５×１０7、１×１０8、３×１０8、５×１０8、１×１０9、５×１０9または１×１０10個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物の一部として）を投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される処置の方法は、約１×１０6〜３×１０6、３×１０6〜５×１０6、５×１０6〜１×１０7、１×１０7〜３×１０7、３×１０7〜５×１０7、５×１０7〜１×１０8、１×１０8〜３×１０8、３×１０8〜５×１０8、５×１０8〜１×１０9、１×１０9〜５×１０9または５×１０9〜１×１０10個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物の一部として）を投与することを含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣを投与することを含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、約１×１０7個の刺激ＰＤＡＣを投与することを含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣを投与することを含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される処置方法は、約１×１０8個の刺激ＰＤＡＣを投与することを含む。
本明細書に記載される処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、１週間の投与間隔で対象に複数回筋肉内投与され、例えば、刺激ＰＤＡＣは１日目（最初の投与日）に投与され、第２の用量の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は１週間後に（すなわち、８日目に）に投与される。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約１×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約１×１０8個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、１週間の投与間隔で、少なくとも３回の異なる機会に対象に投与される。
本明細書に記載される処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、１カ月の投与間隔で対象に複数回投与され、例えば、刺激ＰＤＡＣは１日目（最初の投与日）に投与され、第２の用量の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は約１カ月後に（例えば、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目または３３日目に）に投与される。具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む（例えば、３×１０6個の刺激ＰＤＡＣは１日目に投与され、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は１日目の１カ月後に、例えば２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目または３３日目に投与される）。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む（例えば、３×１０7個の刺激ＰＤＡＣは１日目に投与され、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣは１日目の１カ月後に、例えば２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目または３３日目に投与される）。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に、約１×１０8個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む（例えば、１×１０8個の刺激ＰＤＡＣは１日目に投与され、約１×１０8個の刺激ＰＤＡＣは１日目の１カ月後に、例えば、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３１日目、３２日目または３３日目に投与される）。別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、約１カ月の投与間隔で、少なくとも３回の異なる機会に対象に投与される。
様々な実施形態では、本明細書に開示される方法において有用な刺激ＰＤＡＣは細胞の集団内に含まれ、このうちの細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、前記刺激ＰＤＡＣである。特定の実施形態では、前記細胞の集団における刺激ＰＤＡＣは、母親遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、前記集団における刺激ＰＤＡＣの少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、胎児遺伝子型を有する（すなわち、胎児起源のものである）。特定の実施形態では、前記刺激ＰＤＡＣを含む細胞の集団は、母親遺伝子型を有する細胞を含み；例えば、前記集団における細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、母親遺伝子型を有する（すなわち、母親起源のものである）。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される刺激ＰＤＡＣは、レシピエントにとって自己である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される刺激ＰＤＡＣは、レシピエントにとって異種である。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される刺激ＰＤＡＣは、対象への投与前に凍結保存される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される刺激ＰＤＡＣは、胎盤細胞バンク（例えば、ＰＤＡＣバンク）から得られる。
３．１ 定義
本明細書で使用される場合、記述されている数値について言及する際の「約」という用語は、記述されている数値の±１０％以内の値を示す。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載される胎盤由来接着細胞に関する「血管新生性」という用語は、細胞が血管もしくは血管様芽を形成し得ること、または細胞が別の細胞、例えば内皮細胞の集団における血管新生（例えば、血管または血管様構造の形成）を促進し得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「血管新生」という用語は、限定されないが、内皮細胞活性化、遊走、増殖、マトリックスリモデリングおよび細胞安定化を含む血管新生の過程を指す。
本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、単離されているかまたは別様に精製されていることを意味する。例えば、胎盤由来接着細胞は、胎盤から単離されている。「由来する」という用語は、組織、例えば胎盤から直接単離された細胞から培養される細胞と、初代単離株から培養またはエクスパンションされた細胞とを包含する。
本明細書で使用される場合、「免疫局在性決定」は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別、インサイチューハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば抗体またはその断片を使用して、化合物、例えば細胞マーカーを検出することを意味する。
本明細書で使用される場合、「ＳＨ２」という用語は、細胞マーカーＣＤ１０５上のエピトープに結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ２+と称される細胞は、ＣＤ１０５+である。
本明細書で使用される場合、「ＳＨ３」および「ＳＨ４」という用語は、細胞マーカーＣＤ７３上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３+および／またはＳＨ４+と称される細胞は、ＣＤ７３+である。
胎盤は、その中で発達する胎児の遺伝子型を有するが、妊娠中には母親組織と密接に物理的に接触してもいる。このようなものとして、本明細書で使用される場合、「胎児遺伝子型」という用語は、胎児を妊娠した母親の遺伝子型ではなく、胎児の遺伝子型（例えば、本明細書に記載される特定の単離された胎盤細胞が得られる胎盤に関連する胎児の遺伝子型）を意味する。本明細書で使用される場合、「母親遺伝子型」という用語は、胎児（例えば、本明細書に記載される特定の単離された胎盤細胞が得られる胎盤に関連する胎児）を妊娠した母親の遺伝子型を意味する。
本明細書で使用される場合、「単離された細胞」、例えば「単離された胎盤細胞」、「単離された胎盤幹細胞」などの用語は、幹細胞が由来する組織（例えば、胎盤）の他の異なる細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。例えば、幹細胞の回収および／または培養中に、幹細胞が天然に付随する細胞（例えば、非幹細胞）、または異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または少なくとも９９％が幹細胞から除去される場合、細胞は「単離されている」。
本明細書で使用される場合、細胞について言及する際の「多能性」は、細胞が、必ずしもすべてではないがいくつかの種類の体細胞に、またはすべてではないがいくつかの種類の体細胞の特徴を有する細胞に、または３つの胚葉の１つ以上の細胞に分化する能力を有することを意味する。特定の実施形態では、例えば、以下のセクション５．２に記載されている単離された胎盤細胞（ＰＤＡＣ）であって、神経形成細胞、軟骨形成細胞および／または骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する単離された胎盤細胞（ＰＤＡＣ）は、多能性細胞である。
本明細書で使用される場合、「単離された細胞の集団」という用語は、細胞の集団が由来する組織（例えば、胎盤）の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。
本明細書で使用される場合、「胎盤細胞」という用語は、初代培養後の継代数にかかわらず、初代単離株もしくは培養細胞のいずれかとして、例えば以下のセクション５．２に記載されているように哺乳動物胎盤から単離された幹細胞もしくは前駆細胞、または哺乳動物胎盤から単離された細胞（本明細書では「ＰＤＡＣ」とも称される）から培養された幹細胞もしくは前駆細胞を指す。特定の実施形態では、本明細書で使用される「胎盤細胞」という用語はしかしながら、および本明細書で提供される方法において使用される胎盤細胞はしかしながら、栄養芽層、細胞栄養芽層、合胞体栄養細胞層、アンジオブラスト、ヘマンジオブラスト、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、および後期胚の生殖隆起から得られる細胞、例えば胚性生殖細胞を指すものではなく、これらではない。本明細書に記載される胎盤細胞、例えばＰＤＡＣは、２００９年１１月１９日に出願された「Ａｍｎｉｏｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌｓ，」という表題の係属中の米国特許出願第１２／６２２，３５２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている羊膜由来接着細胞ではない。細胞が、幹細胞の特質、例えば１つ以上の種類の幹細胞に関連するマーカーまたは遺伝子発現プロファイル；培養で少なくとも１０〜４０回複製する能力、および３つの胚葉の１つ以上の分化細胞の特徴を示す細胞に分化する能力を示す場合、細胞は「幹細胞」とみなされる。本明細書では特に注記がない限り、「胎盤」という用語は、臍帯を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された胎盤細胞は、分化条件下においてインビトロで分化するか、インビボで分化するか、またはその両方である。
本明細書で使用される場合、胎盤細胞は、特定のマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能である場合、そのマーカーについて陽性である。特定のマーカーの検出は、例えば、抗体の使用によって、またはマーカーをコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡの配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーによって達成され得る。例えば、ＣＤ７３は、（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドよりも検出可能に大きい量で胎盤細胞上において検出可能であるので、例えば、胎盤細胞は、ＣＤ７３について陽性である。また、マーカーが、細胞によって提示または発現される場合に、細胞と少なくとも１つの他の細胞型とを区別するために使用され得るか、または細胞を選択もしくは単離するために使用され得る場合、細胞は、そのマーカーについて陽性である。例えば、抗体媒介性検出の文脈では、特定の細胞表面マーカーが存在することを示す「陽性」は、マーカーが、そのマーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を使用して検出可能であることを意味する；「陽性」はまた、例えばサイトメーターにおいて、バックグラウンドを検出可能に超えるシグナルを発生させる量でマーカーを示す細胞を指す。例えば、細胞が、ＣＤ２００に特異的な抗体で検出可能に標識され、抗体からのシグナルが、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のものよりも検出可能に高い場合、細胞は「ＣＤ２００+」である。逆に、同じ文脈における「陰性」は、細胞表面マーカーが、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）と比較して、そのマーカーに特異的な抗体を使用して検出可能ではないことを意味する。例えば、細胞が、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）よりも大きい程度に、ＣＤ３４に特異的な抗体で再現性良く検出可能に標識されない場合、細胞は「ＣＤ３４-」である。抗体を使用して検出されないおよび検出可能ではないマーカーは、適切な対照を使用して、同様の方法で陽性または陰性であると決定される。例えば、細胞または細胞の集団由来のＲＮＡ中で検出されるＯＣＴ−４ ＲＮＡの量が、例えば、ＲＮＡを検出する方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、スロットブロットなどによって決定した場合のバックグラウンドよりも検出可能に多い場合、細胞または細胞の集団は、ＯＣＴ−４+であると決定され得る。本明細書では特に注記がない限り、分化（「ＣＤ」）マーカーのクラスタは、抗体を使用して検出される。特定の実施形態では、ＯＣＴ−４が、ＲＴ−ＰＣＲを使用して検出可能である場合、ＯＣＴ−４は存在すると決定され、細胞は「ＯＣＴ−４+」である。
本明細書で使用される場合、フローサイトメトリーにおいて検出可能なマーカーの発現について言及する際の「低」という記号表示は、マーカーが、試験した細胞の１０％未満によって発現されていること、または例えばフローサイトメトリーにおいてマーカーに起因する蛍光がバックグラウンドを１ｌｏｇ未満だけ超えることを意味する。
本明細書で使用される場合、「処置する」は、疾患、障害もしくは症状またはそれらの任意のパラメータもしくは症候の矯正、改善、その重症度の軽減、またはその時間経過の減少を包含する。
本明細書で使用される場合、刺激胎盤幹細胞（例えば、刺激ＰＤＡＣ）との関連で使用される際の「刺激された」は、接触された細胞の表現型を変化させる１つ以上の分子と接触された細胞を指す。例えば、胎盤幹細胞は、いくつかの方法で細胞を変化させる１つ以上のサイトカインと接触され得る。刺激胎盤ＰＤＡＣにおいて観察される変化は、例えば、遺伝子発現、可溶性因子の分泌、または成長および／もしくは細胞分裂の速度の変化を包含し得る。具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、サイトカイン、例えば炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１βで刺激されたＰＤＡＣ）は、同じまたは類似の実験条件下において、非刺激ＰＤＡＣ（例えば、サイトカイン、例えば炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１βで刺激されていないＰＤＡＣ）よりも高いレベルで、血管新生促進因子を分泌する。具体的な実施形態では、前記分泌血管新生促進因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンおよび／またはＩＬ−８を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載される前記刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、血管新生促進特性を有する。
プラスチック接着性胎盤細胞（ＰＤＡＣ）によって分泌される特定の成長因子およびサイトカインのレベルを示す図である。
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の成長および生存（図２Ａ）、細胞ネットワークの長さ（図２Ｂ）ならびに形成された細胞チューブの数（図２Ｃ）に対するＰＤＡＣ細胞馴化培地（Ｐ−ＣＭ）の効果を示す図である。
培養ＨＵＶＥＣにおける複数のリン酸化シグナル伝達経路に対するＰ−ＣＭの時間依存的効果を示す図（１枚目）である。 培養ＨＵＶＥＣにおける複数のリン酸化シグナル伝達経路に対するＰ−ＣＭの時間依存的効果を示す図（２枚目）である。
４８時間にわたるＨＵＶＥＣ遺伝子発現に対するＰ−ＣＭ処置の効果を示す図（１枚目）である。 ４８時間にわたるＨＵＶＥＣ遺伝子発現に対するＰ−ＣＭ処置の効果を示す図（２枚目）である。 ４８時間にわたるＨＵＶＥＣ遺伝子発現に対するＰ−ＣＭ処置の効果を示す図（３枚目）である。
ＰＤＡＣによって分泌された様々な因子に対するＩＬ−１βの効果を示す図（１枚目）である。 ＰＤＡＣによって分泌された様々な因子に対するＩＬ−１βの効果を示す図（２枚目）である。 ＰＤＡＣによって分泌された様々な因子に対するＩＬ−１βの効果を示す図（３枚目）である。
ＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達経路に対する、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣから単離したＰ−ＣＭの効果を示す図（１枚目）である。 ＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達経路に対する、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣから単離したＰ−ＣＭの効果を示す図（２枚目）である。 ＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達経路に対する、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣから単離したＰ−ＣＭの効果を示す図（３枚目）である。
ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣから単離したＰ−ＣＭによるＨＵＶＥＣの処置における、ＭＥＫ（図７Ａ）、ＥＲＫ１／２（図７Ｂ）、ＳＴＡＴ３（図７Ｃ）およびＡｋｔ（図７Ｄ）経路に対する肝成長因子（ＨＧＦ）遮断の効果を示す図である。
５．詳細な説明
５．１ 血管新生および不十分血流に関連するかまたはそれに起因する疾患または症状の処置
循環系の疾患または障害を処置する方法であって、有効量の組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば以下のセクション５．２に記載されているＰＤＡＣを投与することを含み、前記ＰＤＡＣがサイトカインで刺激されている方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、前記ＰＤＡＣは、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。別の具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣは、血管新生性である。
５．１．１ 循環系疾患
本明細書で提供される刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣおよびこのような細胞の集団は、血管新生の増加によって利益を受ける様々な疾患状態または症状を示す個体を処置するために使用され得る。このような疾患状態または症状の例としては、心筋梗塞、末梢動脈疾患、左心低形成症候群、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、火傷、偽関節骨折、骨関節炎および顎顔面骨修復が挙げられる。特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣおよびこのような細胞の集団は、外傷性組織欠損を示す個体における血管新生を促進するために、または瘢痕形成を予防するために、または関節全置換もしくは義歯を有する個体において使用され得る。具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、鬱血性心不全である。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣおよびこのような細胞の集団は、循環系の不全を有する個体、例えば末梢血管疾患または冠動脈疾患を有する個体を処置するために使用され得る。
一態様では、心臓疾患または心臓傷害を有する患者を処置するための方法であって、治療用細胞組成物を、心臓または循環系の疾患または傷害を有する患者に投与すること、および心臓機能の改善について前記患者を評価することを含み、前記細胞組成物が、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、心臓疾患は、心筋症である。具体的な実施形態では、心筋症は、特発性のものであるか、または原因が既知の心筋症である。他の具体的な実施形態では、心筋症は、性質が虚血性または非虚血性のものである。別の実施形態では、心臓または循環系の疾患は、血管形成、動脈瘤、アンギナ（狭心症）、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中隔肥大（ＡＳＨ）、アテローム動脈硬化症、心房細動および粗動、細菌性心内膜炎、バーロー症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心肥大、心筋症、心臓炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄症、先天性心臓疾患（先天性心欠損）、冠動脈疾患、アイゼンメンガー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑音、高血圧症、低血圧症、特発性乳児動脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎）、メタボリックシンドローム、微小血管狭心症、心筋梗塞（心臓発作）、心筋炎、発作性心房頻拍（ＰＡＴ）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症肢虚血、糖尿病性血管症、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、レイノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧症、リウマチ性心臓疾患、中隔欠損、無症候性虚血、Ｘ症候群、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴症、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、静脈瘤、血管炎、心室中隔欠損、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群または心内膜床欠損の１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、心不全、例えば鬱血性心不全である。
他の実施形態では、心臓または循環系の疾患は、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心臓疾患、僧帽弁の疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾患、虚血性心臓疾患（急性および亜急性）、狭心症、肺循環の疾患（急性肺性心臓疾患、肺塞栓症、慢性肺性心臓疾患）、脊柱後側弯性心臓疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、循環系の疾患（脳血管疾患を含む）、前大脳動脈の閉塞および狭窄、大脳動脈の閉塞、動脈、細動脈および毛細血管の疾患（アテローム動脈硬化症、動脈瘤）または静脈およびリンパ管の疾患の１つ以上を含む。別の具体的な実施形態では、前記疾患または障害は、糖尿病性足部潰瘍である。
別の実施形態では、処置は、別の細胞型の有無にかかわらず刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む治療用細胞組成物で、心筋症を有する個体を処置することを含む。特定の実施形態では、個体は、治療から（例えば、心臓中に存在する他の細胞（幹細胞または前駆細胞を含む）の成長を支援する細胞の能力から、組織の内部成長または組織の血管形成から、および有益な細胞因子、ケモカイン、サイトカインなどの存在から）利益を受けるが、細胞は個体において取り込まれず、増加されない。別の実施形態では、患者は、細胞による治療処置から利益を受けるが、細胞は、患者において長期生存しない。一実施形態では、細胞は、数、生存率または生化学的活性が徐々に減少し、他の実施形態では、細胞の減少前に、一定期間の活性、例えば成長、分裂または生化学的活性があり得る。他の実施形態では、老化細胞、非生存細胞は、または死細胞でさえ、有益な治療効果を有することができる。
循環系の疾患または障害を有する個体であって、本明細書で提供される刺激ＰＤＡＣまたは治療用組成物を投与される個体の改善は、循環系の疾患または障害の１つ以上の症候の検出可能な改善によって評価または実証され得る。
別の実施形態では、循環系の疾患または障害を有する個体であって、刺激ＰＤＡＣまたは刺激ＰＤＡＣを含む治療用組成物を投与される個体の改善は、刺激ＰＤＡＣの投与前の個体と比較した、心臓機能の１つ以上の兆候の検出可能な改善、例えば、胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）および心係数（ＣＩ）、％短縮率（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）；左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮性（例えば、ｄＰ／ｄｔ）、圧力容量ループ、心仕事量の測定値、心房機能もしくは心室機能の増加；ポンプ効率の増加、ポンプ効率の損失率の減少、血行動態機能の喪失の減少；および心筋症に関連する合併症の減少の１つ以上の検出可能な改善の実証によって評価または実証され得る。
本明細書で提供される刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣまたは刺激ＰＤＡＣを含む治療用組成物を服用する個体の改善はまた、主観的な指標（例えば、投与後の彼または彼女の健康状態についての個人自己評価）によって評価され得る。
特定の実施形態では、細胞の投与の成功は、投与された刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣの個体における生存に基づくものではない。代わりに、成功は、上記心臓または循環の健康の改善の１つ以上の指標に基づくものである。したがって、細胞は、患者の心臓または血管に取り込まれる必要はなく、それらと混ざる必要もない。
それを必要とする個体への刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣまたはこのような細胞を含む治療用組成物の投与は、例えば、移植、（例えば、細胞自体、またはマトリックス−細胞組み合わせの一部としての細胞の）埋め込み、（例えば、疾患または症状の部位への直接的な、例えば、心筋梗塞を有している個体の心臓の虚血部位への直接的な）注射、注入、カテーテルを介した送達、または細胞療法を提供するための当技術分野で公知の任意の他の手段によって達成され得る。
一実施形態では、治療用細胞組成物は、例えば、個体における１つ以上の部位への注射によって、それを必要とする個体に提供される。具体的な実施形態では、治療用細胞組成物は、例えば、心臓における虚血領域への心腔内注射によって提供される。他の具体的な実施形態では、細胞は、心臓の表面に、隣接領域に、またはより遠隔領域にさえ注射される。好ましい実施形態では、細胞は、罹患領域または傷害領域にホーミングし得る。
冠動脈系または血管系の疾患または症状を有する個体は、細胞が治療的に有益である任意の時点において、刺激ＰＤＡＣを投与され得る。特定の実施形態では、例えば、本発明の刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣまたは治療用組成物は、心筋梗塞の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間もしくは２４時間または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日もしくは３０日以内に投与される。心筋梗塞に時間的に近い（例えば、１〜３または１〜７日以内の）投与は、時間的に遠い（例えば、心筋梗塞の３日後または７日後の）投与よりも好ましい。他の実施形態では、本発明の細胞または治療用組成物は、疾患または症状の初期診断の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間もしくは２４時間または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日もしくは３０日以内に投与される。
心筋梗塞の処置において使用するためのキットも本明細書で提供される。キットは、例えば、薬学的に許容され得る担体と混合することによって薬学的に許容され得る形態で調製され得る刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む治療用細胞組成物と、アプリケータとを、使用説明書と共に提供する。理想的には、キットは、心筋梗塞または同様の心イベントを有していると診断された患者に適用されるために、現場において、例えば診療室において、または救急医療提供者によって使用され得る。
本明細書で提供される処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、幹細胞（すなわち、ＰＤＡＣではない幹細胞）、筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞、心筋細胞または筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞および／もしくは心筋細胞の前駆体と共に投与される。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される処置方法は、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、例えば刺激細胞を含む治療用組成物を、心臓または循環系の疾患を有する患者に投与すること；および心臓機能の改善について前記患者を評価することを含み、前記治療用細胞組成物は、マトリックス−細胞複合体として投与される。特定の実施形態では、マトリックスは足場であり、好ましくは少なくとも細胞を含む生体吸収性足場である。
刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣおよびこのような細胞の集団は、個体（例えば、心臓もしくは循環系のまたはそれらを冒す疾患、障害または症状を有する個体）に治療的または予防的に提供され得る。このような疾患、障害または症状としては、アテローム動脈硬化症、心筋症または心臓傷害、例えば虚血性傷害による、例えば心筋梗塞または創傷（急性または慢性）による先天性心不全が挙げられ得る。
特定の実施形態では、個体は、例えば、ＰＤＡＣを含む刺激細胞の集団で、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを投与される。具体的な実施形態では、集団は、約５０％の刺激ＰＤＡＣを含む。別の具体的な実施形態では、集団は、刺激ＰＤＡＣの実質的に均一な集団である。他の実施形態では、集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の刺激ＰＤＡＣを含む。
刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、細胞と、別の治療剤、例えばインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−８）、抗血栓剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼまたはＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤および／または血小板阻害剤）、抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、Ｅｐｏ誘導体もしくは類似体またはそれらの塩、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）またはカスパーゼ阻害剤）、抗炎症剤（例えば、（例えば、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムスおよび／または非ステロイド抗炎症化合物（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、テポキサリン、トルメチン、もしくはスプロフェン））、免疫抑制剤または免疫調節剤（例えば、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばシロリムスまたはエベロリムス；抗増殖薬、例えばアザチオプリンおよび／またはミコフェノール酸モフェチル；コルチコステロイド、例えばプレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン；抗体、例えばモノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマ、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体、例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）および／またはモノクローナル抗Ｔ細胞抗体ＯＫＴ３または米国特許第７，４６８，２７６号および米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号（これらの各開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている接着性胎盤幹細胞、ならびに／または抗酸化剤（例えば、プロブコール；ビタミンＡ、Ｃおよび／もしくはＥ、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌシステイン、Ｎ−アセチルシステインまたは上記のいずれかの抗酸化誘導体、類似体もしくは塩）とを含む治療用組成物の形態で、個体に投与され得る。特定の実施形態では、ＰＤＡＣを含む治療用組成物は、１つ以上のさらなる細胞型、例えば成体細胞（例えば、線維芽細胞または内胚葉細胞）、幹細胞および／または前駆細胞をさらに含む。このような治療剤および／または１つ以上のさらなる細胞型は個別に、または２つ以上のこのような化合物もしくは薬剤と組み合わせてそれを必要とする個体に投与され得る。
特定の実施形態では、処置すべき個体は、哺乳動物である。具体的な実施形態では、処置すべき個体は、ヒトである。具体的な実施形態では、個体は、畜産動物または家畜である。他の具体的な実施形態では、処置すべき個体は、ウマ、ヒツジ、ウシもしくは去勢ウシ、ブタ、イヌまたはネコである。
５．１．２ 虚血性疾患の処置
特定の実施形態では、例えば末梢血管系における血流の途絶を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。特定の具体的な実施形態では、虚血は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）であり、例えば重症肢虚血（ＣＬＩ）である。特定の他の実施形態では、虚血は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心臓疾患または虚血性腎疾患である。
具体的な実施形態では、前記血流の途絶は、重症肢虚血である。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＬＩは、下肢の動脈における重症閉塞であって、血流を著しく減少させる重症閉塞である。別のより具体的な実施形態では、前記ＣＬＩは、虚血性安静時痛、個体の停止時の脚および足の重度の疼痛、足もしくは脚の治癒しない痛み、足の疼痛もしくは痺れ、脚もしくは足の皮膚の光沢、平滑、乾燥、足指の肥厚、脚もしくは足の脈拍の欠如もしくは減弱、開放創、治癒しない皮膚感染もしくは潰瘍および／または脚もしくは足の乾燥した壊疽（黒色の乾燥皮膚）を特徴とする。別の具体的な実施形態では、ＣＬＩを有する個体は、少なくとも１本の指および／または手足全体の喪失を経験している。前記方法の別の具体的な実施形態では、前記治療有効量は、前記個体の末梢血管系における血流の途絶に起因する手足の機能喪失および／または酸素欠乏（低酸素症／無酸素症）の１つ以上の症候の排除、検出可能な改善、その重症度の軽減またはその進行の遅延をもたらす刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣの数である。別の具体的な実施形態では、治療有効量の単離された刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、例えば、前記血流の途絶後の手足またはその周辺の血流の二次的または後続的途絶によって引き起こされる組織損傷を減少または排除するために、前記個体に予防的に投与される。
他の実施形態では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、脳卒中、例えば虚血性脳卒中の処置、例えばＣＮＳの虚血領域における血管新生の促進による脳卒中の処置において使用され得る。一態様では、個体の脳またはその周辺の血流の途絶を有する（例えば、個体の脳もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）またはそれらの周辺の血流の途絶に起因する症候または神経学的欠損を有する）個体を処置する方法であって、治療有効量の単離された組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞を前記個体に投与することを含み、前記単離された胎盤細胞が、多能性細胞または幹細胞の特徴を有する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、血流の途絶は、個体の脳またはＣＮＳに対する酸素欠乏傷害または低酸素傷害をもたらす。本明細書で企図されるように、個体の脳またはその周辺の血流の途絶に起因する個体の症候または神経学的欠損の処置は、個体の脳またはその周辺のこのような血流の途絶を伴い得る再灌流傷害に起因する症候または神経学的欠損の処置を含む。
血管新生性であることに加えて、本明細書で提供される刺激胎盤細胞（例えば、下記ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、神経保護的である。特定の実施形態では、刺激胎盤細胞は、低酸素環境で、例えば低酸素条件（例えば、約５％未満のＯ2）下で神経保護的である。特定の実施形態では、刺激胎盤幹細胞は、ニューロンもしくは他の神経細胞または星状細胞と接触された場合、例えば、ＰＤＡＣおよびニューロンのインビトロ共培養における神経突起長の増加によって分かるように、ニューロン、神経細胞または星状細胞の健康を高める。特定の他の実施形態では、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、低酸素環境で１つ以上の活性酸素種の濃度を減少させる。さらに、特定の実施形態では、刺激胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ）は、神経栄養性サイトカインＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）および／またはニューロトロフィン−３（ＮＴＦ３）の１つ以上を分泌する。このようなものとして、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、ＣＮＳおよびＰＮＳの両方に対する虚血性傷害、例えば脳卒中に起因するＣＮＳの神経系に対する虚血性傷害、または重症肢虚血もしくは末梢血管疾患に起因するＰＮＳの神経系に対する虚血性傷害の処置において有用である。他の実施形態では、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病および／または末梢神経障害、例えば糖尿病性神経障害を処置するために使用され得る。
５．１．３ 糖尿病性足部潰瘍の処置
それを必要とする対象における糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を処置する方法であって、治療有効量の刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを前記対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記刺激ＰＤＡＣは、医薬組成物として製剤化される。
具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、Ｉ型糖尿病を有する。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、ＩＩ型糖尿病を有する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置される対象は、複数のＤＦＵを有し、すなわち、対象は、片足において複数のＤＦＵを有するか、または各足において少なくとも１つのＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、一方の足または両方の足の裏において１つ以上のＤＦＵを有する。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、末梢神経障害、例えば脚および／または足の神経の１つ以上に対する損傷を有する。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って処置されるＤＦＵを有する対象は、対象の末梢血管系における血流の途絶を引き起こす症状を有するＤＦＵを有する。具体的な実施形態では、対象は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する。特定の実施形態では、前記ＤＦＵは、ＰＡＤによって引き起こされ、および／またはそれに関連する。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、本明細書で提供される方法に従って処置される対象におけるＤＦＵの１つ以上の症候の検出可能な改善をもたらす。ＤＦＵの例示的な症候としては、限定されないが、足および／または下腿における傷、潰瘍または水膨れ；足（または両足）および／または下腿における痛み；歩行困難；足（または両足）における変色、例えば足（または両足）の外観の黒色、青色および／または赤色：ならびに感染症の徴候（例えば、発熱、皮膚の発赤および／または腫脹）が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、改善の１つ以上の兆候の検出可能な改善のために十分な量および時間で、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣまたはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を、ＤＦＵを有する対象に投与することを含み、前記改善の兆候としては、（ｉ）潰瘍サイズの減少；（ｉｉ）潰瘍閉鎖：排膿も包帯の必要性もない１つ以上の潰瘍の皮膚閉鎖；（ｉｉｉ）閉鎖後の特定期間、例えば閉鎖後２週間、３週間、４週間、５週間または６週間にわたる潰瘍閉鎖の保持；（ｉｖ）潰瘍閉鎖時間；（ｖ）足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）（対象の静止中に足首および腕の血圧を測定し、次いで対象の動作中に（例えば、トレッドミルを歩行中に）これを繰り返す検査であり、ＰＡＤの重症度を予測／評価するために使用され得る）の改善；（ｖｉ）足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）（ＡＢＩと類似の検査であって、足首の血圧ではなく足趾の血圧を使用する検査である）の改善；（ｖｉｉ）経皮酸素（すなわち、潰瘍の近くの皮膚の下にある組織における酸素レベル）の改善（例えば、Ｒｕａｎｇｓｅｔａｋｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｗｏｕｎｄ Ｃａｒｅ，２０１０，１９（５）：２０２−６を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）脈容量記録（これは、血液測定用カフおよび携帯超音波デバイスを使用して、腕および脚における動脈血流についての情報を得る非侵襲的血管検査である）の改善；（ｉｘ）大切断、例えば足首上部における切断の時間；（ｘ）ワーグナー評価尺度（これは、評価システムを使用して、潰瘍の深さと、骨髄炎または壊疽の存在とを評価する：グレード０（潰瘍性病変の前または後）、グレード１（部分的／完全な厚さの潰瘍）、グレード２（腱または被膜へのプロービング）、グレード３（深部が骨髄炎を伴う）、グレード４（部分的な足の壊疽）およびグレード５（全体的な足の壊疽））の改善；（ｘｉ）ラザフォード基準（これは、末梢動脈疾患の病期分類に使用され、７つの分類ステージを有する：ステージ０−無症候、ステージ１−軽度の跛行、ステージ２−中程度の跛行、ステージ３−重度の跛行、ステージ４−安静時疼痛、ステージ５−足の指の潰瘍を超えない虚血性潰瘍形成、およびステージ６−重度の虚血性潰瘍または明らかな壊疽）の改善：および（ｘｉｉ）脚の安静時疼痛スコア（０が無痛であり、１０が最大疼痛を表す０〜１０の疼痛尺度）の改善が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＤＦＵの処置方法は、例えば、（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（これは、生活の質に対する糖尿病性足部潰瘍の影響を測定する）（例えば、Ｂａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，２００３，２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）神経障害の経時的変化を評価するための患者全般変化印象尺度（例えば、Ｋａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｎ．Ｍａｎｉｐ．Ｔｈｅｒ．，２００９，１７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；ならびに／または（ｉｖ）ＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度（これは、患者の健康状態に関する記述プロファイルおよび単一指標値を得るために使用される健康調査表である）によって評価した場合の対象の生活の質の検出可能な改善のために十分な量および時間で、刺激ＰＤＡＣ、例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣまたはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を、ＤＦＵを有する対象に投与することを含む。
本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、注射によって投与される。本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、胎盤細胞を含むマトリックスまたは足場の前記対象への埋め込みによって、処置される対象に投与される。
本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、筋肉内投与される。本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、静脈内投与される。本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、皮下投与される。本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、局所投与される。本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、全身投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法は、約１×１０6個、３×１０6個、５×１０6個、１×１０7個、３×１０7個、５×１０7個、１×１０8個、３×１０8個、５×１０8個、１×１０9個、５×１０9個または１×１０10個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法は、約１×１０6〜３×１０6個、３×１０6〜５×１０6個、５×１０6〜１×１０7個、１×１０7〜３×１０7個、３×１０7〜５×１０7個、５×１０7〜１×１０8個、１×１０8〜３×１０8個、３×１０8〜５×１０8個、５×１０8〜１×１０9個、１×１０9〜５×１０9個または５×１０9〜１×１０10個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）を投与することを含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法は、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法は、約１×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法は、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。
本明細書に記載されるＤＦＵの処置方法の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は、１週間の投与間隔で筋肉内投与され、例えば、刺激ＰＤＡＣは１日目（最初の投与日）に投与され、第２の用量の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ、またはＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む医薬組成物）は１週間後に（すなわち、８日目に）に投与される。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約３×１０6個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約１×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記方法は、各投与日に（すなわち、１日目および８日目に）、約３×１０7個の刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を投与される対象は、ＰＡＤを有する。
５．２ 単離された胎盤細胞および単離された胎盤細胞集団
刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを作製するための基礎となる胎盤細胞は、胎盤またはその一部から取得可能な細胞であって、組織培養基質に接着し、多能性細胞または幹細胞の特徴を有するが、トロホブラストではない細胞である。このセクション（５．２）では、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを作製するために使用され得る細胞源になる胎盤細胞について記載する。
刺激ＰＤＡＣを作製するための基礎となる胎盤細胞は、胎児起源または母親起源のいずれかであり得る（すなわち、それぞれ胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有し得る）。好ましくは、胎盤細胞およびその集団は、胎児起源のものである。本明細書で使用される場合、「胎児起源」または「非母親起源」という語句は、単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団が、胎児に関連する（すなわち、胎児遺伝子型を有する）臍帯または胎盤構造物から得られることを示す。本明細書で使用される場合、「母親起源」という語句は、細胞または細胞の集団が、母親に関連する（すなわち、母親遺伝子型を有する）胎盤構造物から得られることを示す。単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞を含む細胞の集団は、胎児起源もしくは母親起源のみの単離された胎盤細胞を含み得るか、または胎児起源および母親起源の両方の単離された胎盤細胞の混合集団を含み得る。単離された胎盤細胞および単離された刺激胎盤細胞を含む細胞の集団は、下記形態学的特徴、マーカー特徴および培養特徴によって同定および選択され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞はいずれも、レシピエント（例えば、循環系の疾患または障害を有する個体）にとって自己である。特定の他の実施形態では、本明細書に記載される胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞はいずれも、レシピエント（例えば、循環系の疾患または障害を有する個体）にとって異種である。
特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、以下のセクション５．２．１、５．２．２および５．２．３に記載されているＰＤＡＣ）を作製するための基礎となる本明細書に記載される胎盤幹細胞は、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。特定の実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、以下のセクション５．２．１、５．２．２および５．２．３に記載されているＰＤＡＣ）を作製するための基礎となる本明細書に記載される胎盤幹細胞は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−γの１つ以上で刺激されている。具体的な実施形態では、刺激ＰＤＡＣ（例えば、以下のセクション５．２．１、５．２．２および５．２．３に記載されているＰＤＡＣ）を作製するための基礎となる本明細書に記載される胎盤幹細胞は、ＩＬ−１βで刺激されている。
５．２．１ 物理的および形態学的な特徴
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、初代培養または細胞培養で培養される場合、組織培養基材、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）に、または細胞外マトリックスもしくはリガンド、例えばラミニン、コラーゲン（例えば、天然もしくは変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチンおよび細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．））でコーティングされた組織培養表面に接着する。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、培養中に線維芽細胞様の星状外観を一般に呈し、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から伸長している。しかしながら、単離された胎盤細胞は、線維芽細胞よりも多数のこのような突起を示すので、これらの細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態学的に区別可能である。形態学的には、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はまた、培養中により円形または敷石状の形態を一般に呈する造血幹細胞と区別可能である。
特定の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、成長培地中で培養される場合、胚様体様体を発達させる。胚様体様体は、増殖中の単離された胎盤細胞の接着層の先端上で成長し得る非連続的な細胞塊である。細胞塊は胚様体（胚性幹細胞の培養物から成長する細胞塊）に似ているので、「胚様体様」という用語が使用される。単離された胎盤細胞の増殖培養物中で胚様体様体が発達し得る成長培地としては、例えばＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏ製）；２％胎仔ウシ血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．製）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０-9Ｍデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；１０-4Ｍアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；上皮成長因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）；および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を含む培地が挙げられる。
５．２．２ 細胞表面マーカー、分子マーカーおよび遺伝子マーカー
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、多能性細胞または幹細胞の特徴を有する組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞であって、幹細胞を含む細胞または細胞の集団を同定および／または単離するために使用され得る複数のマーカーを発現する組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、例えば、インビトロまたはインビボで血管新生性である。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞および胎盤細胞集団としては、胎盤またはその任意の部分（例えば、絨毛膜、胎盤葉など）から直接得られる胎盤細胞および胎盤細胞含有細胞集団が挙げられる。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞集団としては、培養物中の単離された胎盤細胞の集団（すなわち、２つ以上の単離された胎盤細胞）、および容器（例えば、バッグ）中の集団も挙げられる。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、ならびに臍帯血、胎盤血および末梢血から得られる間葉系細胞ではない。本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞、例えば胎盤多能性細胞および胎盤細胞は本明細書に記載されており、例えば、米国特許第７，３１１，９０４号；米国特許第７，３１１，９０５号；および米国特許第７，４６８，２７６号；ならびに米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
特定の他の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、単離された胎盤多能性細胞である。一実施形態では、前記細胞、例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞は、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞および／または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性を有する。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ４５-またはＣＤ９０+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ４５-およびＣＤ９０+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+およびＣＤ４５-であり、すなわち、細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ４５-、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ４５-、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+細胞はさらに、ＣＤ８０-およびＣＤ８６-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、１つ以上のサイトカインによって刺激されている。具体的な実施形態では、前記サイトカインは、炎症促進性サイトカインである。別の具体的な実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−１βである。
特定の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+であり、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ１３３-、ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ-、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ７３+、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＰＤＬ１+、ＡＢＣ−ｐ+および／またはＯＣＴ−４+の１つ以上である。他の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用されるＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はいずれもさらに、ＣＤ２９+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＳＨ３+またはＳＨ４+の１つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ４４+である。上記単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ１１７-、ＣＤ１３３-、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+の１つ以上またはそれらの任意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤幹細胞は、１つ以上のサイトカインによって刺激されている。具体的な実施形態では、前記サイトカインは、炎症促進性サイトカインである。別の具体的な実施形態では、前記サイトカインは、ＩＬ−１βである。
別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用されるＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+の１つ以上またはそれらの任意の組み合わせである。他の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用されるＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+である。
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＡＢＣ−ｐ+であるか、またはＲＴ−ＰＣＲによって決定した場合、ＯＣＴ−４+（ＰＯＵ５Ｆ１+）であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的ＡＢＣ輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知である）であり、ＯＣＴ−４は、オクタマー−４タンパク質（ＰＯＵ５Ｆ１）である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリーによって決定した場合、ＳＳＥＡ３-またはＳＳＥＡ４-であり、ＳＳＥＡ３はステージ特異的胚抗原３であり、ＳＳＥＡ４はステージ特異的胚抗原４である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞はいずれもさらに、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-である。
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はいずれもさらに、ＭＨＣ−Ｉ+（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+）、ＭＨＣ−ＩＩ-（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-）またはＨＬＡ−Ｇ-の１つ以上である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤幹細胞はいずれもさらに、ＭＨＣ−Ｉ+（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+）、ＭＨＣ−ＩＩ-（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-）およびＨＬＡ−Ｇ-の１つ以上である。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞の集団、または本明細書に開示される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、胎盤細胞の集団）、例えば前記単離された胎盤細胞について濃縮されている胎盤幹細胞も本明細書で提供される。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を含む細胞の集団が好ましく、細胞の集団は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の単離されたＣＤ１０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ３４-胎盤細胞を含む；すなわち、前記集団における細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％は、単離されたＣＤ１０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ３４-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、上記単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はいずれもさらに、ＣＤ２９+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＳＨ３+またはＳＨ４+の１つ以上である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+単離された胎盤細胞、または本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ４４+である。上記単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+の１つ以上またはそれらの任意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用されるＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+である。
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＯＣＴ−４+およびＡＢＣ−ｐ+の１つ以上またはすべてであり、前記単離された胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素的破壊によって得られる。具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＡＢＣ−ｐ+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＣＤ３４-であり、前記単離された胎盤細胞は、以下の特徴の少なくとも１つを有する：ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-である。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＣＤ３４-であり、ＳＨ２+またはＳＨ３+のいずれかである。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＳＨ２+およびＳＨ３+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-であり、ＳＨ２+またはＳＨ３+のいずれかである。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＣＤ３４-であり、ＳＨ２+またはＳＨ３+のいずれかであり、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＳＥＡ３-またはＳＳＥＡ４-の少なくとも１つである。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-であり、ＳＨ２+またはＳＨ３+のいずれかである。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤幹細胞は、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+およびＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＣＤ３４-、ＣＤ４５-、ＳＳＥＡ３-またはＳＳＥＡ４-である。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-である。別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-であり、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-またはＣＤ４５-である。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+およびＳＨ４+であり；前記単離された胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-またはＳＳＥＡ４-の１つ以上である。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ２００+またはＨＬＡ−Ｇ-である。具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ２００+およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+またはＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団における胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、幹細胞および多能性細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-幹細胞を含む（例えば、前記幹細胞について濃縮されている）細胞の集団である。具体的な実施形態では、前記集団は、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。好ましくは、前記細胞集団における細胞の少なくとも約７０％は、単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。より好ましくは、前記細胞の少なくとも約９０％、９５％または９９％は、単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。細胞集団の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はまた、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はまた、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はまた、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の実施形態では、前記細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つ以上の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞は、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、単離された胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞を含む（例えば、前記胎盤細胞について濃縮されている）細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における前記細胞の少なくとも約７０％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約９０％、９５％または９９％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、前記細胞の集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つ以上の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞の集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
特定の他の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４-、ＯＣＴ−４+、ＨＬＡ−Ｇ-またはＡＢＣ−ｐ+の１つ以上である。具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４-およびＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＳＨ２+、ＳＨ３+およびＳＨ４+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+およびＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＨＬＡ−Ｇ-、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＡＢＣ−ｐ+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+およびＯＣＴ−４+である。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-である。具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記単離されたＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＳＳＥＡ３-およびＳＳＥＡ４-胎盤細胞はさらに、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+およびＳＨ４+である。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+およびＣＤ３４-であり、ＳＨ３+またはＳＨ４+のいずれかである。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はＣＤ３４-であり、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+またはＯＣＴ−４+のいずれかである。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ２００+およびＯＣＴ−４+である。具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記単離された胎盤細胞は、ＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤は、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、単離された細胞を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団による１つ以上の胚様体様体の産生を促進する。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、ＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞を含む（例えば、前記胎盤細胞について濃縮されている）本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団における細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％は、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞である。単離された集団の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、１つ以上の胚様体様体を産生する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、単離されたＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＯＣＴ−４+およびＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記細胞を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団における胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、前記胎盤細胞について濃縮されている集団）である。様々な実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約９０％、９５％または９９％は、単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＯＣＴ−４+およびＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記細胞集団は、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はＣＤ７３+およびＣＤ１０５+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+である単離された胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、前記単離された胎盤細胞について濃縮されている集団）であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。様々な実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約９０％、９５％または９９％は、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＯＣＴ−４+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４５-、ＯＣＴ−４+およびＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記単離されたＣＤ７３+、ＣＤ１０５+胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞はＯＣＴ−４+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞は、ＯＣＴ−４+胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、ＯＣＴ−４+である単離された胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、前記単離された胎盤細胞について濃縮されている集団）であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記細胞を含む単離された胎盤細胞の集団が培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。様々な実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％または少なくとも約６０％は、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％は、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％は、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞である。上記集団の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＯＣＴ−４+胎盤細胞はさらに、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、単離されたＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＣＤ４５-、ＣＤ１３３-およびＣＤ３４-胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記単離された細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＣＤ４５-、ＣＤ１３３-およびＣＤ３４-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＣＤ４５-、ＣＤ１３３-およびＣＤ３４-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞の集団は、母親成分を実質的に含まず；例えば、前記単離された胎盤細胞の集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５−０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、単離されたＣＤ１０+、ＣＤ１３+、ＣＤ３３+、ＣＤ４５-、ＣＤ１１７-およびＣＤ１３３-胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＣＤ１０+、ＣＤ１３+、ＣＤ３３+、ＣＤ４５-、ＣＤ１１７-およびＣＤ１３３-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、前記単離された胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離されたＣＤ１０+、ＣＤ１３+、ＣＤ３３+、ＣＤ４５-、ＣＤ１１７-およびＣＤ１３３-胎盤細胞は、非母親起源のものである（すなわち、胎児遺伝子型を有する）。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞の集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、単離されたＣＤ１０-、ＣＤ３３-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-およびＣＤ１１７-胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、単離された胎盤細胞について濃縮されている集団）であり、前記細胞の集団における細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、単離されたＣＤ１０-、ＣＤ３３-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-およびＣＤ１１７-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、単離されたＣＤ１０-、ＣＤ１３-、ＣＤ３３-、ＣＤ４５-およびＣＤ１１７-胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞集団は、単離されたＣＤ１０-、ＣＤ１３-、ＣＤ３３-、ＣＤ４５-およびＣＤ１１７-胎盤細胞を含む細胞の集団（例えば、前記単離された胎盤細胞について濃縮されている集団）であり、前記集団における細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％は、ＣＤ１０-、ＣＤ１３-、ＣＤ３３-、ＣＤ４５-およびＣＤ１１７-胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＨＬＡ Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＣＤ４５-、ＣＤ３４-およびＣＤ１３３-であり、さらにＣＤ１０+、ＣＤ１３+、ＣＤ３８+、ＣＤ４４+、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+および／もしくはＨＬＡ−Ｇ-であり、ならびに／またはＣＤ１１７について陰性である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法において有用な細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記集団における細胞の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％は、ＨＬＡ Ａ，Ｂ，Ｃ-、ＣＤ４５-、ＣＤ３４-、ＣＤ１３３-である単離された胎盤細胞であって、さらにＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００について陽性であり、ならびに／またはＣＤ１１７および／もしくはＨＬＡ−Ｇについて陰性である単離された胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、抗体結合によって決定した場合、ＣＤ２００+およびＣＤ１０+である単離された胎盤細胞であって、抗体結合およびＲＴ−ＰＣＲの両方によって決定した場合、ＣＤ１１７-である単離された胎盤細胞である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９-、ＣＤ５４+、ＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-、ＭＨＣクラスＩ+およびβ−２−ミクログロブリン+である単離された胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞）である。別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）の場合よりも少なくとも２倍高い胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団における前記細胞の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、非母親起源のものである。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ１０３-、ＣＤ１０４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、β２−ミクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ-、ＨＬＡ−Ｇ低および／またはＰＤＬ１低の１つ以上である単離された胎盤細胞（例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞）である。具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、少なくともＣＤ２９+およびＣＤ５４+である。別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、少なくともＣＤ４４+およびＣＤ１０６+である。別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は、少なくともＣＤ２９+である。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団は、単離された胎盤細胞を含み、前記細胞集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２−Ｅ-、ＣＤ６２−Ｌ-、ＣＤ６２−Ｐ-、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ１０３-、ＣＤ１０４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンdim、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、β２−ミクログロブリンdim、ＨＬＡ−Ｉdim、ＨＬＡ−ＩＩ-、ＨＬＡ−Ｇdimおよび／またはＰＤＬ１dimの１つ以上である単離された胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２−Ｅ-、ＣＤ６２−Ｌ-、ＣＤ６２−Ｐ-、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ１０３-、ＣＤ１０４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンdim、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、β２−ミクログロブリンdim、ＭＨＣ−Ｉdim、ＭＨＣ−ＩＩ-、ＨＬＡ−ＧdimおよびＰＤＬ１dimである。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、ＣＤ１０+、ＣＤ２９+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ９０+、ＳＨ２+、ＳＨ３+、ＳＨ４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＯＣＴ−４+およびＡＢＣ−ｐ+の１つ以上またはすべてである単離された胎盤細胞であり、ＡＢＣ−ｐは、胎盤特異的ＡＢＣ輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても公知である）であり、前記単離された胎盤細胞は、臍帯血が排出されており、灌流されて残留血液が除去されている哺乳動物（例えば、ヒト）胎盤の灌流によって得られる。
上記特徴のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞マーカー（例えば、分化マーカーまたは免疫学的マーカーのクラスタ）の発現は、フローサイトメトリーによって決定される；別の具体的な実施形態では、マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。
遺伝子プロファイリングは、単離された胎盤細胞および単離された胎盤細胞の集団（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞および単離された胎盤細胞の集団）が、他の細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞と区別可能であることを確認する。本明細書に記載される単離された胎盤細胞は、例えば、１つ以上の遺伝子であって、その発現が、単離された胎盤細胞または特定の単離された臍帯幹細胞において、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して有意に高い１つ以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細胞と区別され得る。特に、本明細書で提供される処置方法において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、１つ以上の遺伝子であって、その発現が、単離された胎盤細胞において、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも有意に高い（すなわち、少なくとも２倍高い）１つ以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細胞と区別され得、同等の条件下で細胞が成長される場合、１つ以上の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２Ａまたは上記のいずれかの組み合わせである。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。特定の具体的な実施形態では、前記１つ以上の遺伝子の前記発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイによって、例えばＵ１３３−Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して決定される。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えば、Ｇｉｂｃｏ製）；２％胎仔ウシ血清（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．製）；１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；１０-9Ｍデキサメタゾン（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；１０-4Ｍアスコルビン酸２−ホスフェート（例えば、Ｓｉｇｍａ製）；上皮成長因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）；および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を含む培地中で、多数回の集団倍加（例えば、約３〜約３５回の集団倍加）で培養される場合、前記１つ以上の遺伝子を発現する。別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞に特異的なまたは単離された臍帯細胞に特異的な遺伝子は、ＣＤ２００である。
２００８年３月現在、これらの遺伝子の具体的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＮＭ＿００１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬＴ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１ｏｒｆ９）、ＢＣ０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、ＡＦ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（ＥＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（ＩＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）ＫＲＴ１８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、ＢＣ００５０４６（ＶＴＮ）およびＢＣ００５００１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）で見られ得る。
特定の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記単離された胎盤細胞は、同等の条件下で細胞が成長される場合、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮおよびＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを発現する。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞ＢＭ−ＭＳＣよりも検出可能に高いレベルで、ＣＤ２００およびＡＲＴＳ１（１型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節因子）；ＡＲＴＳ−１およびＬＲＡＰ（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；ＩＬ６（インターロイキン−６）およびＴＧＦＢ２（形質転換成長因子、β２）；ＩＬ６およびＫＲＴ１８（ケラチン１８）；ＩＥＲ３（前初期応答３）、ＭＥＳＴ（中胚葉特異的転写産物ホモログ）およびＴＧＦＢ２；ＣＤ２００およびＩＥＲ３；ＣＤ２００およびＩＬ６；ＣＤ２００およびＫＲＴ１８；ＣＤ２００およびＬＲＡＰ；ＣＤ２００およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００およびＮＦＥ２Ｌ３（核因子（赤血球由来２）−様３）；またはＣＤ２００およびＴＧＦＢ２を発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤細胞が受けた継代数と同等の培養継代数を受けたものである。他の具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞ＢＭ−ＭＳＣよりも検出可能に高いレベルで、ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＬ６およびＬＲＡＰ；ＡＲＴＳ−１、ＩＬ６、ＴＧＦＢ２、ＩＥＲ３、ＫＲＴ１８およびＭＥＳＴ；ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３およびＴＧＦＢ２；ＡＲＴＳ−１、ＣＤ２００、ＩＥＲ３、ＩＬ６、ＫＲＴ１８、ＬＲＡＰ、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３およびＴＧＦＢ２；またはＩＥＲ３、ＭＥＳＴおよびＴＧＦＢ２を発現し、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離された胎盤細胞が受けた継代数と同等の培養継代数を受けたものである。
上記遺伝子の発現は、標準的な技術によって評価され得る。例えば、遺伝子の配列に基づくプローブは個々に選択され、従来技術によって構築され得る。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子の１つ以上に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ ａｒｒａｙまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって評価され得る。修正配列に特異的なプローブは、周知の標準的な技術を使用して容易に作製され得るので、特定のＧｅｎＢａｎｋ受託番号の配列が修正された場合であっても、これらの遺伝子の発現は評価され得る。
これらの遺伝子の発現のレベルは、単離された胎盤細胞の集団の同一性を確認するために、細胞の集団が少なくとも複数の単離された胎盤細胞を含むことを確認するためなどに使用され得る。その同一性が確認される単離された胎盤細胞の集団は、クローン性のもの（例えば、単一の単離された胎盤細胞からエクスパンションされた単離された胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、例えば、複数の単離された胎盤細胞からエクスパンションされた単離された胎盤細胞をのみ含む細胞の集団、もしくは本明細書に記載される単離された胎盤細胞と少なくとも１つの他の細胞型とを含む細胞の集団）であり得る。
これらの遺伝子の発現のレベルは、単離された胎盤細胞の集団を選択するために使用され得る。例えば、上記遺伝子の１つ以上の発現が、細胞の集団由来のサンプルにおいて、間葉系幹細胞の同等の集団よりも有意に高い場合、細胞の集団（例えば、エクスパンションされたクローン細胞）が選択され得る。このような選択は、複数の単離された胎盤細胞集団由来の（すなわち、その正体が不明の複数の細胞集団由来の）集団などのものであり得る。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、例えば、間葉系幹細胞対照における前記１つ以上の遺伝子の発現のレベル（例えば、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現のレベル）と比較した１つ以上のこのような遺伝子の発現のレベルに基づいて選択され得る。一実施形態では、同等数の間葉系幹細胞を含むサンプルにおける前記１つ以上の遺伝子の発現のレベルは、対照として使用される。別の実施形態では、特定の条件下で試験される本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞のための対照は、前記条件下の間葉系幹細胞における前記１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法において有用な胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ）は、１〜１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦに４〜２１日間曝露した後に免疫局在性決定によって検出した場合、ＣＤ３４を発現しない。具体的な実施形態では、前記胎盤接着細胞は、組織培養プラスチックに接着する。別の具体的な実施形態では、前記細胞の集団は、例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材上において、血管新生因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）または塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下で培養される場合、内皮細胞による芽または管状構造の形成を誘導する。
別の態様では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞、細胞の集団、例えばＰＤＡＣの集団、または前記単離された細胞の集団における細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％がＰＤＡＣである細胞の集団は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−３、ＦＧＦ２、フォリスタチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＩＭＰ−２、ｕＰＡＲまたはガレクチン−１の１つ以上またはすべてを、例えば、１つまたは複数の細胞が成長される培養培地中に分泌する。別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞は、低酸素条件（例えば、約５％未満のＯ2）下で、正常酸素条件（例えば、約２０％または約２１％のＯ2）と比較して増加したレベルのＣＤ２０２ｂ、ＩＬ−８および／またはＶＥＧＦを発現する。
別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞または前記胎盤細胞を含む細胞の集団はいずれも、前記胎盤由来接着細胞と接触した内皮細胞の集団における芽または管状構造の形成を引き起こし得る。具体的な実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞をヒト内皮細胞と共培養し、芽もしくは管状構造を形成させるか、または例えば胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材中またはその上において、例えば細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンＩ型およびＩＶ型ならびに／もしくは血管新生因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）もしくは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の存在下で少なくとも４日間培養する場合、内皮細胞芽の形成を支持する。別の実施形態では、本明細書に記載される胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団はいずれも、血管新生因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌し、それにより、例えば胎盤コラーゲンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの基材中またはその上において、細胞外マトリックスタンパク質、例えばコラーゲンＩ型およびＩＶ型の存在下で培養される場合、ヒト内皮細胞による芽または管状構造の形成を誘導し得る。
別の実施形態では、胎盤由来接着細胞（ＰＤＡＣ）を含む上記細胞の集団はいずれも、血管新生因子を分泌する。具体的な実施形態では、細胞の集団は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および／またはインターロイキン−８（ＩＬ−８）を分泌する。他の具体的な実施形態では、ＰＤＡＣを含む細胞の集団は、１つ以上の血管新生因子を分泌し、それにより、インビトロの創傷治癒アッセイにおいてヒト内皮細胞の遊走を誘導する。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆体、筋細胞または筋芽細胞の成熟、分化または増殖を誘導する。
本明細書に記載される単離された胎盤細胞は、初代培養中に、または例えばＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×レノレン酸（ｌｅｎｏｌｅｎｉｃ−ａｃｉｄ）−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０-9Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０-4Ｍアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地における増殖中に、上記特徴（例えば、細胞表面マーカーおよび／または遺伝子発現プロファイルの組み合わせ）を示す。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞のいずれかの特定の実施形態では、細胞は、ヒトのものである。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞のいずれかの特定の実施形態では、細胞マーカーの特徴または遺伝子発現の特徴は、ヒトマーカーまたはヒト遺伝子である。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞または前記細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記細胞または集団はエクスパンションされたものであり、例えば、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回もしくは少なくとも２０回、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回もしくは約２０回または１回以下、２回以下、３回以下、４回以下、５回以下、６回以下、７回以下、８回以下、９回以下、１０回以下、１１回以下、１２回以下、１３回以下、１４回以下、１５回以下、１６回以下、１７回以下、１８回以下、１９回以下もしくは２０回以下またはそれを超えて継代されたものであるか、または少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２１回、少なくとも２２回、少なくとも２３回、少なくとも２４回、少なくとも２５回、少なくとも２６回、少なくとも２７回、少なくとも２８回、少なくとも２９回、少なくとも３０回、少なくとも３１回、少なくとも３２回、少なくとも３３回、少なくとも３４回、少なくとも３５回、少なくとも３６回、少なくとも３７回、少なくとも３８回、少なくとも３９回、少なくとも４０回、少なくとも４１回、少なくとも４２回、少なくとも４３回、少なくとも４４回、少なくとも４５回、少なくとも４６回、少なくとも４７回、少なくとも４８回、少なくとも４９回もしくは少なくとも５０回、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、約３０回、約３１回、約３２回、約３３回、約３４回、約３５回、約３６回、約３７回、約３８回、約３９回、約４０回、約４１回、約４２回、約４３回、約４４回、約４５回、約４６回、約４７回、約４８回、約４９回もしくは約５０回または１回以下、２回以下、３回以下、４回以下、５回以下、６回以下、７回以下、８回以下、９回以下、１０回以下、１１回以下、１２回以下、１３回以下、１４回以下、１５回以下、１６回以下、１７回以下、１８回以下、１９回以下、２０回以下、２１回以下、２２回以下、２３回以下、２４回以下、２５回以下、２６回以下、２７回以下、２８回以下、２９回以下、３０回以下、３１回以下、３２回以下、３３回以下、３４回以下、３５回以下、３６回以下、３７回以下、３８回以下、３９回以下、４０回以下、４１回以下、４２回以下、４３回以下、４４回以下、４５回以下、４６回以下、４７回以下、４８回以下、４９回以下もしくは５０回以下の集団倍加で増殖されたものである。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記単離された胎盤細胞または前記細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記細胞または集団は、初代単離株である。本明細書に開示される単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、胎児起源のものである（すなわち、胎児遺伝子型を有する）。
特定の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される前記単離された胎盤細胞は、成長培地（すなわち、増殖を促進するように製剤化された培地）における培養中に（例えば、成長培地における増殖中に）、分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、フィーダー細胞層の欠如という理由のみにより、フィーダー層の非存在下における培養では分化しない。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞は、単離された胎盤細胞であり、複数の前記単離された胎盤細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイによって評価した場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）について陽性である。このようなアッセイは、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｏｓｔｉａｎ ａｎｄ Ｂｅｔｔｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３，７８７，（１９７８）を参照のこと）。具体的な実施形態では、前記ＡＬＤＨアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用する。具体的な実施形態では、前記複数は、前記細胞の集団における細胞の約３％〜約２５％である。別の実施形態では、単離された臍帯細胞（例えば、単離された多能性臍帯細胞）の集団であって、複数の前記単離された臍帯細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標としてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイによって評価した場合、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて陽性である集団が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記複数は、前記細胞の集団における細胞の約３％〜約２５％である。別の実施形態では、前記単離された胎盤細胞または単離された臍帯細胞の集団は、ほぼ同じ数の細胞を有する同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも少なくとも３倍または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の実施形態では、前記細胞の集団における胎盤細胞は、母親遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、前記集団における胎盤細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、胎児遺伝子型を有する。本明細書に記載される単離された胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の他の実施形態では、前記胎盤細胞を含む細胞の集団は、母親遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、前記集団における細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％は、胎児遺伝子型を有する。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される上記単離された胎盤細胞または細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では、細胞または前記集団における細胞の少なくとも約９５％もしくは約９９％の核型は、正常である。上記胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞または細胞の集団における細胞は、非母親起源のものである。
上記マーカーの組み合わせのいずれかを有する本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団は、任意の比で組み合わされ得る。上記単離された胎盤細胞集団のいずれか２つ以上の集団は、単離された胎盤細胞集団を形成するために組み合わされ得る。例えば、単離された胎盤細胞の集団は、上記マーカーの組み合わせの一方によって定義される単離された胎盤細胞の第１の集団と、上記マーカーの組み合わせの他方によって定義される単離された胎盤細胞の第２の集団とを含み得、前記第１の集団および第２の集団は、約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２または約９９：１の比で組み合わされる。同様にして、上記単離された胎盤細胞または単離された胎盤細胞集団のいずれか３つ、４つ、５つ以上が組み合わされ得る。
本明細書に記載される方法および組成物において有用な本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、例えば、酵素的破壊（セクション５．３．３を参照のこと）または灌流（セクション５．３．４を参照のこと）の有無にかかわらず、胎盤組織の破壊によって得られ得る。例えば、単離された胎盤細胞の集団は、臍帯血が排出されており、灌流されて残留血液が除去されている哺乳動物胎盤を灌流すること；前記胎盤を灌流溶液で灌流すること；および前記灌流溶液を回収すること（灌流後の前記灌流溶液は、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含む）；ならびに前記細胞の集団から複数の前記単離された胎盤細胞を単離することを含む方法によって生産され得る。具体的な実施形態では、灌流溶液を臍帯静脈および臍帯動脈の両方に通過させ、それが胎盤から浸出した後に回収する。別の具体的な実施形態では、灌流溶液を臍帯静脈に通過させて臍帯動脈から回収するか、または臍帯動脈に通過させて臍帯静脈から回収する。
様々な実施形態では、胎盤の灌流から得られる細胞の集団に含まれる本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞は、前記胎盤細胞の集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離された胎盤細胞は、胎児細胞および母親細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離された胎盤細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％の胎児細胞である。
別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞の集団を含む組成物であって、、前記単離された胎盤細胞を回収するために使用される灌流溶液の少なくとも一部を含む組成物が本明細書で提供される。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞の単離された集団は、胎盤組織を組織破壊酵素で消化して、細胞を含む胎盤細胞の集団を得ること、および前記胎盤細胞の残りから複数の胎盤細胞を単離または実質的に単離することによって生産され得る。胎盤の全部または任意の部分は、本明細書に記載される単離された胎盤細胞を得るために消化され得る。具体的な実施形態では、例えば、前記胎盤組織は、全胎盤、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組み合わせまたは上記のいずれかの組み合わせであり得る。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素は、トリプシンまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、胎盤の消化から得られる細胞の集団に含まれる単離された胎盤細胞は、前記胎盤細胞の集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される上記単離された胎盤細胞集団または単離された胎盤細胞の集団は、一般に、約１×１０2個、約５×１０2個、約１×１０3個、約５×１０3個、約１×１０4個、約５×１０4個、約１×１０5個、約５×１０5個、約１×１０6個、約５×１０6個、約１×１０7個、約５×１０7個、約１×１０8個、約５×１０8個、約１×１０9個、約５×１０9個、約１×１０10個、約５×１０10個、約１×１０11個、少なくとも１×１０2個、少なくとも５×１０2個、少なくとも１×１０3個、少なくとも５×１０3個、少なくとも１×１０4個、少なくとも５×１０4個、少なくとも１×１０5個、少なくとも５×１０5個、少なくとも１×１０6個、少なくとも５×１０6個、少なくとも１×１０7個、少なくとも５×１０7個、少なくとも１×１０8個、少なくとも５×１０8個、少なくとも１×１０9個、少なくとも５×１０9個、少なくとも１×１０10個、少なくとも５×１０10個、少なくとも１×１０11個または１×１０2個以下、５×１０2個以下、１×１０3個以下、５×１０3個以下、１×１０4個以下、５×１０4個以下、１×１０5個以下、５×１０5個以下、１×１０6個以下、５×１０6個以下、１×１０7個以下、５×１０7個以下、１×１０8個以下、５×１０8個以下、１×１０9個以下、５×１０9個以下、１×１０10個以下、５×１０10個以下、１×１０11個以下またはそれを超える単離された胎盤細胞を含み得る。本明細書に記載される処置方法において有用な単離された胎盤細胞の集団は、例えば、トリパンブルー排出などによって決定した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の単離された生存胎盤細胞を含む。
５．２．３ 培養による成長
任意の哺乳動物細胞に関して、本明細書のセクション５．２に記載されている単離された胎盤細胞（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞）の成長は、部分的には、成長のために選択される特定の培地に依存する。最適な条件下では、単離された胎盤細胞は、典型的には、約１日で数が２倍になる。培養中に、本明細書に記載される単離された胎盤細胞は、培養液中の基材、例えば組織培養容器（例えば、組織培養ディッシュプラスチック、フィブロネクチンコーティングプラスチックなど）の表面に接着し、単層を形成する。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養される場合、胚様体様体を形成し得る（すなわち、接着細胞層の先端において、細胞の三次元クラスタが成長する）。胚様体様体内の細胞は、非常に初期の幹細胞に関連するマーカー、例えばＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４を発現し得る。胚様体様体内の細胞は、典型的には、本明細書に記載される単離された胎盤細胞と同様に培養基材に接着しないが、培養中は、接着細胞に依然として付着する傾向がある。単離された接着性胎盤細胞の非存在下では、胚様体様体は形成しないので、胚様体様体細胞は、生存について、単離された接着性胎盤細胞に依存する。したがって、単離された接着性胎盤細胞は、単離された接着性胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の成長を促進する。理論に束縛されるものではないが、胚様体様体の細胞は、胚性幹細胞が細胞のフィーダー層上で成長するのと同じく、単離された接着性胎盤細胞上で成長すると考えられる。
５．３ 単離された胎盤細胞を得る方法
５．３．１ 幹細胞回収組成物
胎盤細胞、例えば上記セクション５．２．２に記載されている単離された胎盤細胞（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞）を回収および単離する方法が本明細書でさらに提供される。一般に、このような細胞は、生理的に許容され得る溶液、例えば細胞回収組成物を使用して、哺乳動物胎盤から得られる。例示的な細胞回収組成物は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｏｒｇａｎｓ」という表題の関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
細胞回収組成物は、細胞、例えば本明細書に記載される単離された胎盤細胞の回収および／または培養に適切な任意の生理的に許容され得る溶液、例えば生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含み得る。
細胞回収組成物は、回収時から培養時まで、単離された胎盤細胞を保存する（すなわち、単離された胎盤細胞の死を防止するか、または前記単離された胎盤細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞の集団における単離された胎盤細胞の数を減少させるなど）傾向がある１つ以上の成分を含み得る。このような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメートまたはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；および／または酸素担持ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど）であり得る。
細胞回収組成物は、１つ以上の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅなどを含み得る。このような酵素としては、限定されないが、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどが挙げられる。
細胞回収組成物は、殺菌または静菌有効量の抗生物質を含み得る。特定の非限定的な実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）またはキノロン（例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム陽性細菌および／またはグラム陰性細菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどに対して活性である。一実施形態では、抗生物質は、例えば、培養培地中、約０．００５％〜約０．０１％（ｗ／ｖ）のゲンタマイシンである。
細胞回収組成物はまた、以下の化合物の１つ以上を含み得る：アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；一実施形態では、内皮の完全性および細胞の生存能力を維持するために十分な量で存在する分子量２０，０００ダルトン超の巨大分子（例えば、合成または天然のコロイド、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌまたは約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在するデキストランまたはポリエチレングリコールなどの多糖）；抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）；一実施形態では、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライドまたはイソブチルアミロライド）。
５．３．２ 胎盤の回収および取扱い
一般に、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施形態では、インフォームドコンセント後、および患者の全病歴を取得して、前記胎盤に関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。このような病歴を使用して、胎盤またはそれから採取される単離された胎盤細胞のその後の使用を調整し得る。例えば、単離されたヒト胎盤細胞は、その病歴を考慮して、胎盤に関連する幼児のための、または幼児の親、兄弟姉妹もしくは他の血縁者のための個人医療に使用され得る。
単離された胎盤細胞の回収前に、臍帯血および胎盤血を除去することが好ましい。特定の実施形態では、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供され得る。典型的には、針またはカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌらの米国特許第５，４１５，６６５号を参照のこと）。針またはカニューレを、一般に、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助け得る。このような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ ＵＳＡ，Ｃｅｄａｒ Ｋｎｏｌｌｓ，Ｎ．Ｊによって実施され得る。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
典型的には、臍帯血の回収、および例えば、灌流または組織解離による幹細胞の回収のために、胎盤を、分娩室または出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、次いで、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を（胎盤の温度を２０〜２８℃に維持する）滅菌された断熱輸送装置で輸送することが好ましい。別の実施形態では、係属中の米国特許第７，１４７，６２６号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットで輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から４〜２４時間後に、実験室に移送する。特定の実施形態では、臍帯血の回収前に、胎盤への挿入部から４〜５ｃｍ（センチメートル）以内のところで、近位臍帯をクランプする。他の実施形態では、臍帯血の回収後、しかし胎盤のさらなる処理前に、近位臍帯をクランプする。
胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、室温または５〜２５℃の温度のいずれかで保存され得る。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、４〜２４時間、最大４８時間または４８時間よりも長い時間保存し得る。一実施形態では、胎盤は、娩出後、約０時間から約２時間で採取される。胎盤は、５〜２５℃の温度で、抗凝血剤溶液中に保存することが好ましい。適切な抗凝血剤溶液は、当技術分野で周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウム溶液を使用し得る。好ましい実施形態では、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液（例えば、１：１０００溶液中で１％ｗ／ｗ）を含む。放血された胎盤は、胎盤細胞を回収する前に、３６時間以下保存することが好ましい。
一般に上記のように回収および調製したら、哺乳動物胎盤またはその一部は、単離された胎盤細胞を得るために、任意の当技術分野で公知の方法で処理され得、例えば、灌流または破壊され得、例えば、１つ以上の組織破壊酵素で消化され得る。
５．３．３ 胎盤組織の物理的破壊および酵素的消化
一実施形態では、幹細胞を、哺乳動物胎盤の一部または全部の物理的破壊によって、この臓器から回収する。例えば、胎盤またはその一部を、例えば、圧搾、剪断、ミンス、ダイス、チョップ、浸軟などし得る。次いで、この組織を培養して、単離された胎盤細胞の集団を得ることができる。典型的には、胎盤組織を、例えば、培養培地、生理食塩水溶液または幹細胞回収組成物を使用して破壊する（セクション５．５．１および下記を参照のこと）。
物理的破壊および／または酵素的消化ならびに幹細胞回収の前に、胎盤を構成要素に解剖し得る。単離された胎盤細胞は、全胎盤を含む羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部から得られ得る。好ましくは、単離された胎盤細胞は、羊膜および絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。典型的には、単離された胎盤細胞は、胎盤組織の小さいブロック、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートルの体積の胎盤組織のブロックの破壊によって得られ得る。破壊方法が、例えば、トリパンブルー排出によって決定した場合、前記臓器内の細胞の複数、より好ましくは大部分、およびより好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％を生きた状態にとどめるという条件で、任意の物理的破壊方法を使用し得る。
単離された接着性胎盤細胞を、一般に、娩出後の最初の約３日以内の任意の時点で、しかし好ましくは、娩出後約８時間〜約１８時間で、胎盤またはその一部から回収し得る。
具体的な実施形態では、破壊された組織を、単離された胎盤細胞の増殖に適切な組織培養培地中で培養する（例えば、胎盤細胞、例えば、ＰＤＡＣの培養について記載されている以下のセクション５．６を参照のこと）。
別の具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞を、胎盤組織の物理的破壊によって回収し、物理的破壊は、１つ以上の組織消化酵素の使用によって達成され得る酵素的消化を含む。また、胎盤またはその一部を、１つ以上の酵素で物理的に破壊および消化し、次いで、得られた材料を細胞回収組成物に浸漬または混合し得る。
好ましい細胞回収組成物は、１つ以上の組織破壊酵素を含む。胎盤組織を破壊するために使用され得る酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはエラスターゼが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のα２ミクログロブリンによって阻害され得るので、消化に使用される培地は、一般に、無血清のものである。ＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅは、細胞回収効率を増加させるために、酵素的消化手順において一般に使用される。粘性の消化液内に細胞が捕捉されることを避けるために、消化物を希釈することが好ましい。
組織消化酵素の任意の組み合わせを使用し得る。トリプシンを使用する消化のための典型的な濃度は、０．１％〜約２％トリプシン、例えば、約０．２５％トリプシンを含む。胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞および胎盤多能性細胞を遊離させるために、プロテアーゼを併用するか（すなわち、同じ消化反応で２つ以上のプロテアーゼ）、または順次使用し得る。例えば、一実施形態では、胎盤またはその一部を、最初に、約１〜約２ｍｇ／ｍｌの適量のコラゲナーゼＩで、例えば３０分間消化し、次いで、約０．２５％の濃度のトリプシンで、例えば３７℃で１０分間消化する。セリンプロテアーゼを、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。
別の実施形態では、幹細胞回収組成物で幹細胞を単離する前に、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'Ｎ'−四酢酸（Ｅ
ＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、幹細胞を含む幹細胞回収組成物に、または組織を破壊および／もしくは消化する溶液に追加することにより、組織をさらに破壊し得る。
消化後、消化物を、例えば、培養培地で３回洗浄し、洗浄した細胞を培養フラスコ中に播種する。次いで、細胞を示差的接着により単離し、例えば、生存能力、細胞表面マーカー、分化などについて特性評価する。
胎盤全体または胎盤の一部が、胎児細胞および母親細胞の両方を含む場合（例えば、胎盤の一部が、絨毛膜または胎盤葉を含む場合）、単離された胎盤細胞は、胎児起源および母親起源の両方に由来する胎盤細胞の混合物を含み得ることが理解されるであろう。胎盤の一部が、母親細胞（例えば、羊膜）を全く含まないかまたはごくわずかな数しか含まない場合、それから単離される胎盤細胞は、ほとんど胎児性の胎盤細胞（すなわち、胎児の遺伝子型を有する胎盤細胞）しか含まないことになる。
胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている胎盤細胞を、示差的トリプシン処理（以下のセクション５．３．５を参照のこと）を行い、続いて、１つ以上の新たな培養容器を含む新鮮な増殖培地中で培養し、続いて場合により、第２の示差的トリプシン処理工程を行うことによって、破壊された胎盤組織から単離し得る。
５．３．４ 胎盤灌流
また、胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている胎盤細胞（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤細胞）は、哺乳動物胎盤の灌流によって得られ得る。哺乳動物胎盤を灌流して胎盤細胞を得る方法は、例えば、Ｈａｒｉｒｉの米国特許第７，０４５，１４８号および第７，２５５，７２９号ならびに米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号および第２００７／０１９００４２号（これらの各開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
胎盤細胞を、例えば細胞回収組成物を灌流溶液として使用して、例えば胎盤血管系を通した灌流によって回収し得る。一実施形態では、哺乳動物胎盤を、灌流溶液を臍帯動脈および臍帯静脈のいずれかまたは両方に通すことによって灌流する。胎盤を通る灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を使用して達成し得る。好ましくは、灌流溶液を、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して、胎盤に強制的に通す。臍帯静脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されているカニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレを挿入し得る。この滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。
灌流の準備では、臍帯動脈および臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に配置されるように、胎盤を配向させる（例えば、ぶら下げる）ことが好ましい。灌流液を胎盤血管系および周囲組織に通すことによって、胎盤を灌流し得る。また、灌流液を臍帯静脈に通して臍帯動脈から回収するか、または灌流液を臍帯動脈に通して臍帯静脈から回収することによって、胎盤を灌流し得る。
一実施形態では、例えば、臍帯動脈および臍帯静脈を、例えば、柔軟なコネクタを介して灌流溶液のリザーバに接続されたピペットに同時に接続する。灌流溶液を、臍帯静脈および臍帯動脈に通す。灌流溶液は血管壁から滲出し、および／または血管壁を通って胎盤の周囲組織中に入り、妊娠中の母親の子宮に付着していた胎盤表面から適切な開放容器中に回収される。また、灌流溶液を臍帯の開放部に通して導入し、母親の子宮壁と接合している胎盤壁の開口部から流出または浸出させ得る。「ｐａｎ」法と称され得るこの方法で回収される胎盤細胞は、典型的には、胎児細胞と母親細胞との混合物である。
別の実施形態では、灌流溶液を臍帯静脈に通して臍帯動脈から回収するか、または臍帯動脈に通して臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と称され得るこの方法で回収される胎盤細胞は、典型的には、ほとんど胎児のものしかない。
ｐａｎ法を使用する灌流では、灌流液が胎盤の母親側から滲出した後に灌流液を回収し、胎児細胞と母親細胞との混合物が得られることが理解されるだろう。結果として、この方法で回収された細胞は、胎児起源および母親起源の両方の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞の混合集団を含み得る。対照的に、専ら胎盤血管系を通した閉回路法による灌流では、灌流液を１つまたは２つの胎盤血管に通し、専ら残りの血管を通して回収し、ほぼ胎児起源のものしかない胎盤細胞の集団が回収される。
閉回路灌流法を、一実施形態では、以下のように実施し得る。出産後胎盤を、出産後約４８時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯は、廃棄され得るか、または例えば臍帯幹細胞を回収するために、および／もしくは生体材料の生産用に臍帯膜を処理するために処理され得る。羊膜を灌流中保持し得るか、または例えば指による鈍的剥離を使用して絨毛膜から分離し得る。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば廃棄するか、または例えば酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば羊膜生体材料、例えば米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている生体材料を生産するために処理し得る。例えば、滅菌ガーゼを使用して、すべての可視的な血塊および残留血液を胎盤から除去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させることにより、臍帯血管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲータークランプを各血管の切断端に通して前進させることによって広げる。次いで、装置、例えば、灌流装置または蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈のそれぞれに挿入する。ポンプは、この目的に適切な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであり得る。次いで、滅菌回収リザーバ、例えば、２５０ｍＬ回収バッグなどの血液バッグに接続されたプラスチックチューブを胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静脈に挿入し、回収リザーバに接続されたチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで、胎盤を、一定容量の灌流溶液、例えば、約７５０ｍｌの灌流溶液で灌流する。次いで、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収する。特定の実施形態では、灌流して、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞および／または胎盤多能性細胞を回収する前に残留血液を除去するために、胎盤を、灌流溶液、例えば、１００〜３００ｍＬの灌流溶液で灌流する。別の実施形態では、灌流して胎盤細胞を回収する前に残留血液を除去するために、胎盤を灌流溶液で灌流することはない。
一実施形態では、灌流中、近位臍帯をクランプし、より好ましくは、胎盤への臍帯挿入部から４〜５ｃｍ（センチメートル）以内のところで、近位臍帯をクランプする。
放血プロセスの間の哺乳動物胎盤からの灌流液の最初の回収物は、一般に、臍帯血および／または胎盤血の残留赤血球のために着色されている。灌流液は、灌流が進み、残留臍帯血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になる。一般に、最初に胎盤を放血するためには、３０〜１００ｍｌ（ミリリットル）の灌流液で十分であるが、観察結果に応じて、より多くのまたはより少ない灌流液を使用し得る。
胎盤細胞を単離するために使用される灌流液の容量は、回収すべき細胞の数、胎盤のサイズ、単一の胎盤から行なわれる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施形態では、灌流液の容量は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬまたは７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであり得る。典型的には、放血後、胎盤を７００〜８００ｍＬの灌流液で灌流する。
胎盤を、数時間から数日間かけて、複数回灌流し得る。胎盤を複数回灌流すべき場合、それを、容器または他の適切な容器中、無菌条件下で維持または培養し、細胞回収組成物または抗凝血剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むかもしくは含まない、および／または抗微生物剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌ）などの抗生物質を含むかもしくは含まない、標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）などの生理食塩水溶液）で灌流し得る。一実施形態では、胎盤を、灌流および灌流液の回収前に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間または２もしくは３日間以上維持または培養するように、単離された胎盤を、灌流液を回収せずに一定期間維持または培養する。灌流された胎盤を、さらにもう１回以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上維持し、例えば、７００〜８００ｍＬの灌流液で再び灌流し得る。胎盤を、１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５または６時間に１回灌流し得る。好ましい実施形態では、回収された有核細胞の数が細胞１００個／ｍｌを下回るまで、胎盤の灌流と、灌流溶液、例えば細胞回収組成物の回収とを繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、時間依存的な細胞、例えば、幹細胞の集団を回収し得る。また、異なる時点からの灌流液をプールし得る。好ましい実施形態では、娩出後約８時間〜約１８時間の１つまたは複数の時点で、胎盤細胞を回収する。
灌流は、好ましくは、前記溶液で灌流されていない哺乳動物胎盤であって、胎盤細胞を得るために別様に（例えば、組織破壊、例えば酵素的消化によって）処理されていない哺乳動物胎盤から得られ得る数よりも有意に多い胎盤細胞の回収をもたらす。この文脈において、「有意に多い」は、少なくとも１０％多いことを意味する。灌流によって、例えば、胎盤またはその一部が培養された培養培地から単離可能な胎盤細胞の数よりも有意に多い胎盤細胞が得られる。
胎盤細胞を、１つ以上のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素を含む溶液による灌流によって、胎盤から単離し得る。具体的な実施形態では、胎盤またはその一部（例えば、羊膜、羊膜と絨毛膜、胎盤小葉もしくは胎盤葉、臍帯または上記のいずれかの組み合わせ）を２５〜３７℃に置き、１つ以上の組織破壊酵素と共に、２００ｍＬの培養培地中、３０分間インキュベートする。灌流液由来の細胞を回収し、４℃に置き、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトールおよび２ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む冷たい阻害剤混合物で洗浄する。数分後、胎盤細胞を冷たい（例えば、４℃の）幹細胞回収組成物で洗浄する。
５．３．５ 胎盤細胞の単離、選別および特性評価
灌流または（例えば、酵素的消化による）物理的破壊によって得られるかにかかわらず、単離された胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている細胞（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞）を、最初に、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって、他の細胞から精製（すなわち、単離）し得る。このような遠心分離は、遠心分離速度などのための任意の標準的なプロトコールに従い得る。一実施形態では、例えば、胎盤から回収された細胞を、室温、５０００×ｇで１５分間遠心分離することによって灌流液から回収し、これにより、細胞は、例えば、夾雑残屑および血小板から分離される。別の実施形態では、胎盤灌流液を約２００ｍｌに濃縮し、Ｆｉｃｏｌｌ上で穏やかに層形成させ、２２℃、約１１００×ｇで２０分間遠心分離し、前記細胞の低密度界面層をさらなる処理のために回収する。
細胞ペレットを、新鮮な幹細胞回収組成物、または細胞維持、例えば、幹細胞維持に適切な培地、例えば、２Ｕ／ｍｌヘパリンおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＮＹ）を含むＩＭＤＭ無血清培地に再懸濁し得る。全単核細胞画分を、例えば、製造業者の推奨手順に従って、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して単離し得る。
灌流または消化によって得られた胎盤細胞を、例えば、０．２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を含む０．０５％トリプシン溶液を使用する示差的トリプシン処理によって、例えばさらにまたは最初に単離し得る。組織培養プラスチック接着性である単離された胎盤細胞は、典型的には、約５分以内にプラスチック表面から剥がれるが、他の接着性集団は、典型的には、２０〜３０分間を超えるインキュベーションを必要とするので、示差的トリプシン処理が可能である。トリプシン処理、および例えば、トリプシン中和溶液（ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用するトリプシン中和後、剥がれた胎盤細胞を採取し得る。接着細胞の単離の一実施形態では、一定分量の、例えば、約５〜１０×１０6個の細胞を、いくつかのＴ−７５フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンコーティングＴ７５フラスコのそれぞれに入れる。このような実施形態では、細胞を、市販の間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用して培養し、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）内に置き得る。１０〜１５日後、ＰＢＳで洗浄することにより、接着していない細胞をフラスコから除去する。次いで、ＰＢＳをＭＳＣＧＭに交換する。フラスコを、様々な接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞様細胞のクラスタの同定およびエクスパンションのために、毎日調べることが好ましい。
哺乳動物胎盤から回収された細胞の数および種類を、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的もしくは細胞マーカー特異的抗体による染色）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの標準的な細胞検出技術を使用して形態および細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡法を使用して細胞の形態を調べることにより、ならびに／またはＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイリングなどの当技術分野で周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングし得る。これらの技術を、１つ以上の特定のマーカーについて陽性の細胞を同定するためにも使用し得る。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、上記技術を使用して、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含むかを決定し得る；もしそうであるならば、細胞はＣＤ３４+である。同様に、細胞がＲＴ−ＰＣＲで検出されるのに十分なＯＣＴ−４ ＲＮＡ、または成体細胞よりも有意に多くのＯＣＴ−４ ＲＮＡを産生するならば、前記細胞は、ＯＣＴ−４+である。細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）に対する抗体およびＯＣＴ−４などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野で周知である。
胎盤細胞、特に、Ｆｉｃｏｌｌ分離、示差的接着または両方の組み合わせによって単離された細胞を、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を使用して選別し得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０−１６５）。個々の粒子中の蛍光部分のレーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子および陰性粒子の電磁分離が可能になる。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドを個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合するその能力に基づく細胞の分離を可能にする。ＦＡＣＳで選別された粒子を９６ウェルまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離およびクローニングを容易にし得る。
１つの選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば、ＰＤＡＣを、マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇの１つ以上の発現に基づいて選別する。これは、このような細胞を培養下のその接着特性に基づいて選択する手順との関連で達成し得る。例えば、組織培養プラスチック接着の選択を、マーカー発現に基づく選別の前または後に達成し得る。一実施形態では、例えば、細胞を、最初に、そのＣＤ３４発現に基づいて選別し；ＣＤ３４-細胞を保持し、さらにＣＤ２００+およびＨＬＡ−Ｇ-であるＣＤ３４-細胞を、他のすべてのＣＤ３４-細胞から分離する。別の実施形態では、胎盤由来の細胞をそのマーカーＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別し；例えば、ＣＤ２００を提示し、ＨＬＡ−Ｇを欠く細胞をさらなる使用のために単離する。例えば、ＣＤ２００を発現し、および／または例えば、ＨＬＡ−Ｇを欠く細胞を、具体的な実施形態では、ＣＤ７３および／もしくはＣＤ１０５または抗体ＳＨ２、ＳＨ３、もしくはＳＨ４によって認識されるエピトープの発現、あるいはＣＤ３４、ＣＤ３８またはＣＤ４５の発現の欠如に基づいてさらに選別し得る。例えば、別の実施形態では、胎盤細胞を、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現またはその欠如によって選別し、ＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-、ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ３４-、ＣＤ３８-およびＣＤ４５-である胎盤細胞を、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離する。
選別された胎盤細胞の上記実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、選別後に残存する細胞集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％は、前記単離された胎盤細胞である。胎盤細胞を、上記セクション５．２．２に記載されているマーカーのいずれかの１つ以上によって選別し得る。
具体的な実施形態では、例えば、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０+、ＣＤ３４-およびＣＤ１０５+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着性であり、（２）ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ４５-、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。
胎盤細胞のヌクレオチド配列ベースの検出に関して、本明細書に記載されるマーカーの配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどの公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。
胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞の抗体による検出および選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出および選別（例えば、蛍光活性化細胞選別）に適切な任意のフルオロフォアまたは他の標識と組み合わせて使用し得る。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組み合わせとしては、限定されないが、ＨＬＡ−Ｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから入手可能）、ＣＤ１０に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、ＣＤ４４に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）およびＣＤ１０５に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）；ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７およびＣＤ１３に対するフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ＣＤ３３およびＣＤ１０に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥ Ｃｙ７）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートストレプトアビジンおよびＣＤ３８に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ならびにビオチン化ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。使用され得る他の抗体としては、限定されないが、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｃａｍ）、サイトケラチンＫ−Ｆｉｔｃ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡ ＡＢＣ−Ｆｉｔｃ（ＢＤ）、ＨＬＡ ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β２−ミクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）が挙げられる。使用され得る他の抗体／標識の組み合わせとしては、限定されないが、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルタンパク質）；ＣＤ４４−ＰＥ；ＣＤ１９−ＰＥ；ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）；ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆ；などが挙げられる。このリストは網羅的なものではなく、他の供給業者からの他の抗体も市販されている。
本明細書で提供される単離された胎盤細胞を、例えば、フィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥ Ｃｙ５）コンジュゲートストレプトアビジンと、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体とを使用してＣＤ１１７またはＣＤ１３３についてアッセイし得る；しかしながら、このシステムを使用すると、バックグラウンドが比較的高いために、細胞は、それぞれＣＤ１１７またはＣＤ１３３について陽性であるように見え得る。
単離された胎盤細胞を単一のマーカーに対する抗体で標識し、検出および／選別し得る。また、胎盤細胞を異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識し得る。
別の実施形態では、磁気ビーズを使用して細胞を分離し得る。磁気ビーズ（直径０．５〜１００μｍ）に結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を使用して、細胞を選別し得る。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む様々な有用な修飾を、磁気マイクロスフェアに対して実施し得る。次いで、前記ビーズを細胞と混合して、結合を可能にする。次いで、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施形態では、次いで、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合し得る。細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。次いで、このような細胞を希釈して、別々のディッシュ、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れ得る。
また、単離された胎盤細胞を、細胞形態および成長特性に基づいて特性評価および／または選別し得る。例えば、単離された胎盤細胞を、例えば、培養下で線維芽細胞様の外観を有するものとして特性評価し、および／または培養下での線維芽細胞様の外観に基づいて選択し得る。また、単離された胎盤細胞を、胚様体様体を形成するその能力を有するものとして特性評価し、および／または胚様体様体を形成するその能力に基づいて選択し得る。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様の形状であり、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、培養下で１つ以上の胚様体様体を産生する胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離する。別の実施形態では、培養下で１つ以上の胚様体様体を産生するＯＣＴ−４+胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、コロニー形成単位アッセイによって同定および特性評価され得る。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）などのコロニー形成単位アッセイは、当技術分野で一般に公知である。
単離された胎盤細胞を、（生存を評価するための）トリパンブルー排出アッセイ、フルオレセインジアセテート取り込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ；および（増殖を評価するための）チミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイなどの、当技術分野で公知の標準的技術を使用して、生存能力、増殖能力および寿命について評価し得る。寿命は、当技術分野で周知の方法によって、例えば延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することによって決定され得る。
また、単離された胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている単離された胎盤細胞を、当技術分野で公知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長（陽性選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（陰性選択）；例えば、ダイズ凝集素を使用する混合集団における示差的細胞凝集力に基づく分離；凍結−解凍処置；ろ過；従来のゾーン遠心分離；遠心洗浄（向流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；などを使用して他の胎盤細胞から分離し得る。
５．３．６ 刺激胎盤細胞
１つ以上の刺激分子と接触させることによって刺激された単離された胎盤細胞、例えば上記セクション５．２．２に記載されている単離された胎盤細胞の集団も本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上のサイトカインで刺激される。別の具体的な実施形態では、前記細胞または細胞集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、前記１つ以上の炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γからなる群より選択される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＬ−１αで刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＬ−１βで刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＬ−６で刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＬ−８で刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＬ−１８で刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＴＮＦ−αで刺激される。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞または細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、ＩＮＦ−γで刺激される。
一実施形態では、本明細書に記載される細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上のサイトカインによって刺激され、前記サイトカインは、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１，０００ｐｇ／ｍＬ、１０，０００ｐｇ／ｍＬまたは１００，０００ｐｇ／ｍＬの濃度である。具体的な実施形態では、前記培養培地は、１ｐｇ／ｍＬ〜１０ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ〜１，０００ｐｇ／ｍＬ、１，０００ｐｇ／ｍＬ〜１０，０００ｐｇ／ｍＬまたは１０，０００ｐｇ／ｍＬ〜１００，０００ｐｇ／ｍＬの濃度の前記１つ以上のサイトカインを補充される。
別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上のサイトカインによって刺激され、前記刺激は、１分間、５分間、１５分間、３０分間、６０分間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間または６０時間行われる。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上のサイトカインによって刺激され、前記刺激は、１分間〜５分間、５分間〜１０分間、１０分間〜１５分間、１５分間〜３０分間、３０分間〜６０分間、６０分間〜２時間、２時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜１５時間、１５時間〜２０時間、２０時間〜２５時間、２５時間〜３０時間、３０時間〜３５時間、３５時間〜４０時間、４０時間〜４５時間、４５時間〜５０時間、５０時間〜５５時間または５５時間〜６０時間行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、非刺激ＰＤＡＣよりも高いレベルで分泌因子を産生する。具体的な実施形態では、前記分泌因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンおよび／またはＩＬ−８を含む。具体的な実施形態では、前記本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣ（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）は、血管新生促進特性を有する。
具体的な実施形態では、本明細書に記載される細胞の集団（例えば、ＰＤＡＣ）は、インビトロで刺激される。
５．４ 単離された胎盤細胞の培養
５．４．１ 培養培地
単離された胎盤細胞、または単離された胎盤細胞の集団、または胎盤細胞が生じる細胞もしくは胎盤組織を使用して、細胞培養物をイニシエートまたは播種し得る。一般に、細胞を、コーティングされていないか、あるいはラミニン、コラーゲン（例えば、天然物または変性物）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、ポリリジン、ＣＥＬＬＳＴＡＲＴ（商標）および／もしくは細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．））などの細胞外マトリックスもしくはリガンド、または他の適切な生体分子もしくは合成模倣剤でコーティングされているかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。
単離された胎盤細胞を、細胞、例えば、幹細胞の培養に許容され得るものとして当技術分野で認識されている任意の培地中および任意の条件下で培養し得る。好ましくは、培養培地は、血清を含む。単離された胎盤細胞を、例えば、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコの改変必須培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ ２０１（ニワトリ線維芽細胞基本培地）；１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）；１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ；１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（イスコフの改変ダルベッコ培地）；１％〜２０％ＦＢＳ、ＥＧＦおよびヘパリンを含むＭ１９９；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）；１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどの中で培養し得る。
胎盤細胞を培養するために使用され得る他の培地としては、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、イーグルの基本培地、ハムのＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムのＦ−１２培地（Ｆ１２）、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ライボヴィッツのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０、改良ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ ＦＲＥＥが挙げられる。
培養培地には、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは、約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））；β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは、約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つ以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；ならびに例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシンおよびナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための１つ以上の抗生物質および／または抗真菌剤を含む１つ以上の成分を単独で、または組み合わせて補充し得る。
単離された胎盤細胞を、標準的な組織培養条件で、例えば、組織培養ディッシュまたはマルチウェルプレート中で培養し得る。また、単離された胎盤細胞を、ハンギングドロップ法を使用して培養し得る。この方法では、単離された胎盤細胞を約５ｍＬの培地に細胞約１×１０4個／ｍＬで懸濁し、１滴以上の培地を組織培養容器、例えば、１００ｍＬペトリ皿の蓋の内側に置く。この滴は、例えば、単一の滴、または例えば、マルチチャネルピペッターからの複数の滴であり得る。蓋を慎重にひっくり返し、一定容量の液体、例えば、皿の雰囲気内の水分含量を維持するために十分な滅菌ＰＢＳを含む皿底の上部に置き、幹細胞を培養する。
具体的な実施形態では、単離された胎盤幹細胞は、炎症促進性サイトカインの存在下で培養される。炎症促進性サイトカインを含有する培養培地は任意の培地であり得、任意の条件下で、細胞、例えば幹細胞の培養に許容され得るものであると当技術分野で認められているものであり得、１つ以上の炎症促進性サイトカインをさらに含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＮＦ−γの１つ以上を含む。別の具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
炎症促進性サイトカインは、許容され得るものであると当技術分野で認められている任意の濃度で、培養培地に補充し得る。具体的な実施形態では、前記培養培地は、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１，０００ｐｇ／ｍＬ、１０，０００ｐｇ／ｍＬまたは１００，０００ｐｇ／ｍＬの濃度の前記１つ以上のサイトカインを補充される。具体的な実施形態では、前記培養培地は、１ｐｇ／ｍＬ〜１０ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ〜１，０００ｐｇ／ｍＬ、１，０００ｐｇ／ｍＬ〜１０，０００ｐｇ／ｍＬまたは１０，０００ｐｇ／ｍＬ〜１００，０００ｐｇ／ｍＬの濃度の前記１つ以上のサイトカインを補充される。
一実施形態では、単離された胎盤細胞を、単離された胎盤細胞における未分化な表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養する。具体的な実施形態では、化合物は、置換３，４−ジヒドロピリジモル［４，５−ｄ］ピリミジンである。別の具体的な実施形態では、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：
Figure 2021104053
化合物を、例えば、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、単離された胎盤細胞、または単離された胎盤細胞の集団と接触させ得る。
５．４．２ 胎盤細胞のエクスパンションおよび増殖
単離された胎盤細胞、または単離された胎盤細胞の集団を分離したら（例えば、胎盤細胞または胎盤細胞の集団が、幹細胞または幹細胞の集団が通常インビボで関連している胎盤細胞の少なくとも５０％から分離したら）、細胞または細胞の集団をインビトロで増殖およびエクスパンションし得る。例えば、単離された胎盤細胞の集団を、組織培養容器、例えば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、７０〜９０％コンフルエンスになるまで、すなわち、細胞およびその子孫が、組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占めるまで、細胞が増殖するために十分な時間培養し得る。
単離された胎盤細胞を、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種し得る。例えば、細胞を、低密度（細胞約１，０００〜約５，０００個／ｃｍ2）から高密度（例えば、細胞約５０，０００個／ｃｍ2以上）で播種し得る。好ましい実施形態では、細胞を、大気中、約０〜約５容積％のＣＯ2の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施形態では、細胞を、大気中、約２〜約２５％のＯ2、好ましくは、大気中、約５〜約２０％のＯ2で培養する。細胞を、約２５℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養することが好ましい。細胞をインキュベーター内で培養することが好ましい。培養培地を静止状態とするか、または例えば、バイオリアクターを使用して撹拌し得る。胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞を（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどの追加により）低酸化ストレス下で成長させることが好ましい。
１００％未満、例えば、７０〜９０％のコンフルエンスを得たら、細胞を継代し得る。例えば、細胞を、当技術分野で周知の技術を使用して酵素的に処理し、例えば、トリプシン処理し、それらを組織培養表面から分離し得る。細胞をピペッティングによって除去し、細胞を計数した後、細胞約１０，０００〜１００，０００個／ｃｍ2を、新鮮な培養培地を含む新たな培養容器に移動させる。典型的には、新たな培地は、単離された胎盤細胞が除去された培地と同じ種類である。単離された胎盤細胞を、約次の回数、少なくとも次の回数または次の回数以下継代し得る：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８または２０回以上。
５．４．３ 単離された胎盤細胞の集団
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている単離された胎盤細胞（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞）の集団も本明細書で提供される。本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞の集団を１つ以上の胎盤から直接単離し得る；すなわち、細胞集団は、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団であり得、単離された胎盤細胞は、灌流液から得られるか、またはその中に含まれるか、あるいは破壊された胎盤組織、例えば、胎盤組織消化物（すなわち、胎盤もしくはその部分の酵素的消化によって得られる細胞の集合体）から得られるか、またはその中に含まれる。また、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を培養およびエクスパンションして、単離された胎盤細胞の集団を生産し得る。また、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を培養およびエクスパンションして、胎盤細胞集団を生産し得る。一実施形態では、本明細書に記載される単離された胎盤細胞は、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
本明細書で提供される処置方法において有用な胎盤細胞集団は、単離された胎盤細胞、例えば、本明細書のセクション５．４．２に記載されている単離された胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む。様々な実施形態では、胎盤細胞集団における細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は、単離された胎盤細胞である。すなわち、単離された胎盤細胞の集団は、例えば、単離された胎盤細胞ではない１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％と同程度の量の細胞を含み得る。
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞集団を、例えば、酵素的消化によって得られたものであれ、灌流によって得られたものであれ、特定のマーカーおよび／または特定の培養特性もしくは形態特性を発現する単離された胎盤細胞を選択することによって生産し得る。一実施形態では、例えば、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠く胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって、細胞集団を生産する方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠く胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現する胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現する胎盤細胞を同定し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、（ｃ）前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠く胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇの発現を欠く胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を生産する方法は、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、（ｃ）前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択すること；および前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることを含む。別の実施形態では、細胞集団を、ＯＣＴ−４を発現し、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、前記集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。
別の実施形態では、細胞集団（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団）を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団）を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ１０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４を発現しない胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の具体的な実施形態では、細胞集団（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団）を、（ａ）基材に接着し、（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない胎盤細胞を選択し；前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。別の具体的な実施形態では、細胞集団（例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される細胞集団）を、ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない胎盤細胞を選択し、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生産される。
上記セクション５．２．２に記載されているマーカー組み合わせのいずれかを有する胎盤細胞を含む細胞集団の選択物は同様のやり方で単離され得るか、または得られ得る。
上記実施形態ではいずれも、単離された細胞集団の選択はさらに、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的ＡＢＣ輸送体タンパク質；例えば、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（２３）：５３３７−９（１９９８）を参照のこと）を発現する胎盤細胞を選択することを含み得る。前記方法はまた、例えば、間葉系幹細胞に特異的な少なくとも１つの特徴、例えば、ＣＤ４４の発現、ＣＤ９０の発現または上記の組み合わせの発現を示す細胞を選択することを含み得る。
上記実施形態では、基材は、細胞、例えば、単離された胎盤細胞の培養および／または選択を達成し得る任意の表面であり得る。典型的には、基材は、プラスチック、例えば、組織培養ディッシュまたはマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングし得る。
細胞、例えば、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞を、細胞選択の技術分野で公知の任意の手段によって、胎盤細胞集団について選択し得る。例えば、細胞を、例えば、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳにおいて１つ以上の細胞表面マーカーに対する１つ以上の抗体を使用して選択し得る。抗体を磁気ビーズと組み合わせて使用して、選択を達成し得る。特定の幹細胞関連マーカーに特異的である抗体は当技術分野で公知である。例えば、ＯＣＴ−４に対する抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＣＤ２００に対する抗体（Ａｂｃａｍ）、ＨＬＡ−Ｇに対する抗体（Ａｂｃａｍ）、ＣＤ７３に対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＤ１０５に対する抗体（Ａｂｃａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｃｏ，ＭＥ）など。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５に対する抗体が、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能である。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞、または胎盤細胞ではない細胞を含み得る。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される胎盤由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、第２の細胞型、例えば、胎盤由来接着細胞ではない胎盤細胞、または例えば、胎盤細胞ではない細胞を含み得る。例えば、単離された胎盤由来接着細胞集団は、第２の細胞型の集団を含み得、例えば、第２の細胞型の集団と組み合わせることができ、前記第２の細胞型は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞（例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎盤血、臍帯血または末梢血由来の有核細胞など）、血液から単離された幹細胞（例えば、胎盤血、臍帯血または末梢血から単離された幹細胞）、胎盤灌流液から単離された有核細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細胞；臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、骨髄由来造血幹細胞、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織に含まれる幹細胞の集団、培養された細胞、例えば、培養された幹細胞、完全に分化した細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞など）の集団、周皮細胞などである。具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、胎盤幹細胞または臍帯由来の幹細胞を含む。第２の細胞型が血液または血液細胞である特定の実施形態では、赤血球は、細胞の集団から除去されている。
具体的な実施形態では、第２の細胞型は、造血幹細胞である。このような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血または末梢血；胎盤血、臍帯血または末梢血由来の全有核細胞；胎盤血、臍帯血または末梢血由来の単離されたＣＤ３４+細胞集団；未処理の骨髄；骨髄由来の全有核細胞；骨髄由来の単離されたＣＤ３４+細胞集団などに含まれ得る。
別の実施形態では、本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される単離された胎盤由来接着細胞集団を、血管系由来の複数の成体細胞または前駆細胞と組み合わせる。様々な実施形態では、細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞または心筋芽細胞である。
別の実施形態では、第２の細胞型は、多能性のマーカーおよび胚性幹細胞に関連する機能を発現させるために培養下で操作された非胚細胞型である。
本明細書に記載される刺激ＰＤＡＣを作製するために使用される上記単離された胎盤由来接着細胞集団の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞と第２の細胞型のいずれかまたは両方は、細胞の意図されるレシピエントにとって、自己のものであるか、または同種異系のものである。
別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞および胚性幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞および間葉系間質細胞または間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質細胞または骨髄由来間葉系幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞、ならびに造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児血液、臍帯血、胎盤血および／または末梢血由来の造血前駆細胞を含む。別の具体的な実施形態では、組成物は、胎盤由来接着細胞および体性幹細胞を含む。より具体的な実施形態では、体性幹細胞は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞または筋肉幹細胞である。
他の具体的な実施形態では、第２の細胞型は、前記集団における細胞の約次の％、少なくとも次の％または次の％以下を含む：１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％。他の具体的な実施形態では、前記組成物中のＰＤＡＣは、前記組成物中の細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を含む。他の具体的な実施形態では、胎盤由来接着細胞は、前記集団における細胞の約次の％、少なくとも次の％または次の％以下を含む：１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％。
単離された胎盤由来接着細胞集団における細胞を、各集団における全有核細胞の数と比べて、約１００，０００，０００：１、５０，０００，０００：１、２０，０００，０００：１、１０，０００，０００：１、５，０００，０００：１、２，０００，０００：１、１，０００，０００：１、５００，０００：１、２００，０００：１、１００，０００：１，５０，０００：１、２０，０００：１、１０，０００：１、５，０００：１、２，０００：１、１，０００：１、５００：１、２００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１；１：２；１：５；１：１０；１：１００；１：２００；１：５００；１：１，０００；１：２，０００；１：５，０００；１：１０，０００；１：２０，０００；１：５０，０００；１：１００，０００；１：５００，０００；１：１，０００，０００；１：２，０００，０００；１：５，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：２０，０００，０００；１：５０，０００，０００；または約１：１００，０００，０００の比で、別の種類の複数の細胞、例えば、幹細胞の集団と組み合わせ得る。また、単離された胎盤由来接着細胞集団における細胞を複数の細胞型の複数の細胞と組み合わせ得る。
他の実施形態では、本明細書に記載される胎盤細胞、例えば、上記ＰＤＡＣの集団を、骨形成性胎盤接着細胞（ＯＰＡＣ）、例えば、２００９年８月２４日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｗｉｔｈ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」という表題の米国特許出願第１２／５４６，５５６号に記載されているＯＰＡＣと組み合わせるか、または羊膜由来血管新生細胞（ＡＭＤＡＣ）、例えば、「Ａｍｎｉｏｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｃｅｌｌｓ」という表題の米国特許出願第１２／６２２，３５２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＡＭＤＡＣと組み合わせる。
一実施形態では、本明細書に記載される単離された胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ）は、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
５．５ 胎盤細胞バンクの生産
分娩後の胎盤由来の単離された細胞、例えば、上記セクション５．２．２に記載されている単離された胎盤細胞をいくつかの異なる方法で培養して、単離された胎盤細胞のロットの組を生産し得、例えば、ロットは、個別投与可能な用量の組である。このようなロットは、例えば、胎盤灌流液由来の細胞または酵素的消化した胎盤組織由来の細胞から得られ得る。複数の胎盤から得られた胎盤細胞のロットの組は、例えば、長期保存用の単離された胎盤細胞のバンクに準備され得る。一般に、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を胎盤材料の初期培養物から得て、シード培養物を形成させ、これを制御条件下でエクスパンションして、ほぼ同等数の倍加から細胞の集団を形成させる。ロットは、単一の胎盤の組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤の組織に由来し得る。
一実施形態では、胎盤細胞ロットは、以下のように得られる。胎盤組織を最初に、例えば、細かく刻むことによって破壊し、適切な酵素、例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼで消化する（上記セクション５．３．３を参照のこと）。胎盤組織は、例えば、単一の胎盤由来の羊膜全体、絨毛膜全体または両方を含むことが好ましいが、羊膜または絨毛膜のいずれかの一部のみを含み得る。消化した組織を、例えば、約１〜３週間、好ましくは、約２週間培養する。接着していない細胞を除去した後、形成される高密度コロニーを、例えば、トリプシン処理によって回収する。これらの細胞を回収し、好都合な容量の培養培地に再懸濁し、次いで、それを使用して、エクスパンション培養物を播種する。エクスパンション培養物は、個別の細胞培養装置、例えば、ＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙに配置されたものであり得る。エクスパンション培養物を、例えば、細胞１×１０3個、２×１０3個、３×１０3個、４×１０3個、５×１０3個、６×１０3個、７×１０3個、８×１０3個、９×１０3個、１×１０4個、１×１０4個、２×１０4個、３×１０4個、４×１０4個、５×１０4個、６×１０4個、７×１０4個、８×１０4個、９×１０4個または１０×１０4個／ｃｍ2で播種するために、細胞を任意の程度に細分し得る。好ましくは、細胞約１×１０3〜約１×１０4個／ｃｍ2を使用して、それぞれのエクスパンション培養物を播種する。エクスパンション培養物の数は、前記細胞が得られる特定の胎盤によって、数がより多いことも、より少ないこともあり得る。
培養下の細胞の密度が、一定のレベル、例えば、細胞約１×１０5個／ｃｍ2に達するまで、エクスパンション培養物を成長させる。細胞をこの時点で回収して凍結保存するか、または上記のような新たなエクスパンション培養物へと継代し得る。使用前に、細胞を、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回継代し得る。エクスパンション培養中、集団倍加の累積数の記録を保持することが好ましい。培養物由来の細胞を、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、もしくは４０回の倍加または最大６０回の倍加の間、エクスパンションし得る。しかしながら、細胞の集団を個々の用量に分割する前の集団倍加の数は、約１５〜約３０回であることが好ましい。細胞を、エクスパンション過程を通して連続的に培養し得るか、またはエクスパンションの間の１つ以上の時点で凍結し得る。
個々の用量のために使用すべき細胞は、その後の使用のために凍結され得る（例えば、凍結保存され得る）。個々の用量は、例えば、細胞約１，０００，０００〜約５０，０００，０００個／ｍｌを含み得、全体で約１０6〜約１０10個の細胞を含み得る。
一実施形態では、したがって、胎盤細胞バンクは、第１の複数の集団倍加の間、ヒトの分娩後の胎盤から初代培養胎盤細胞をエクスパンションし；前記胎盤細胞を凍結保存して、マスター細胞バンクを形成させ；第２の複数の集団倍加の間、前記マスター細胞バンクから複数の胎盤細胞をエクスパンションし；前記胎盤細胞を凍結保存して、ワーキング細胞バンクを形成させ；第３の複数の集団倍加の間、前記ワーキング細胞バンクから複数の胎盤細胞をエクスパンションし；前記胎盤細胞を個々の用量で凍結保存することを含む方法によって作製し得、前記個々の用量は、胎盤細胞バンクを集合的に構成する。場合により、前記第３の複数の集団倍加からの複数の胎盤細胞を第４の複数の集団倍加の間、エクスパンションして、個々の用量で凍結保存し得、前記個々の用量は、胎盤細胞バンクを集合的に構成する。
別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、消化した胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来および消化した胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞初代培養物中の前記胎盤細胞はすべて、同じ胎盤由来のものである。別の具体的な実施形態では、前記方法はさらに、前記ワーキング細胞バンク由来の前記複数の前記胎盤細胞からＣＤ２００+またはＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞を選択して、個々の用量を形成させる工程を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０4〜約１０5個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０5〜約１０6個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０6〜約１０7個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０7〜約１０8個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０8〜約１０9個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は、約１０9〜約１０10個の胎盤細胞を含む。
好ましい実施形態では、胎盤が得られるドナー（例えば、母親）を少なくとも１つの病原体について検査する。母親が、検査した病原体について陽性反応を示す場合、前記胎盤由来の全ロットを廃棄する。このような検査は、胎盤細胞ロットの生産中、例えば、エクスパンション培養中のいつでも実施し得る。その存在を検査する病原体としては、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどが挙げられ得る。
一実施形態では、本明細書に記載される方法に従ってバンキングされる胎盤幹細胞は、バンキング前に、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
５．６ 胎盤細胞の保存
単離された胎盤細胞、例えば、上記セクション５．３．２に記載されている単離された胎盤細胞を保存し得る（すなわち、長期保存を可能にする条件下、または例えば、アポトーシスもしくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置き得る）。
胎盤細胞を、例えば、関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素担持ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存し得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物において有用な細胞の集団を保存する方法は、前記細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤および酸素担持ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と接触させることを含み、前記アポトーシスの阻害剤は、前記アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比較したとき、前記細胞の集団のアポトーシスを減少させるかまたは防止するために十分な量で、前記細胞の集団のアポトーシスを減少させるかまたは防止するために十分な時間存在する。具体的な実施形態では、前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシスの阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は、前記細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、分離相中に前記アポトーシスの阻害剤および前記酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、エマルジョン中に前記アポトーシスの阻害剤および前記酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、乳化剤、例えば、レシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、前記細胞と接触させる時点において、約０℃〜約２５℃である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、前記細胞と接触させる時点において、約２℃〜１０℃または約２℃〜約５℃である。別の具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞の集団の輸送の間に行なわれる。別の具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞の集団の凍結および解凍の間に行なわれる。
胎盤細胞の集団を、例えば、前記細胞の集団をアポトーシスの阻害剤および臓器保存化合物と接触させることを含む方法によって保存し得、前記アポトーシスの阻害剤は、前記アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比較したとき、前記細胞の集団のアポトーシスを減少させるかまたは防止するために十分な量で、前記細胞の集団のアポトーシスを減少させるかまたは防止するために十分な時間存在する。具体的な実施形態では、臓器保存化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載されており；ＶｉａＳｐａｎとしても公知であるもの；Ｓｏｕｔｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４９（２）：２５１−２５７（１９９０）も参照のこと）またはＳｔｅｒｎらの米国特許第５，５５２，２６７号に記載されている溶液である（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、前記臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノースまたはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、細胞回収組成物は、２相状態にあるかまたはエマルジョンとしてかのいずれかの酸素担持ペルフルオロカーボンをさらに含む。
前記方法の別の実施形態では、胎盤細胞を、灌流の間に、アポトーシス阻害剤および酸素担持ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物またはそれらの組み合わせを含む細胞回収組成物と接触させる。別の実施形態では、前記細胞を、組織破壊、例えば、酵素的消化のプロセスの間に、接触させる。別の実施形態では、胎盤細胞を、灌流による回収の後に、または組織破壊、例えば、酵素的消化による回収の後に、前記細胞回収化合物と接触させる。
典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮および単離時に、低酸素および機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、またはそれらを排除することが好ましい。前記方法の別の実施形態では、したがって、細胞または細胞の集団は、回収、濃縮または単離時に、前記保存時に６時間未満の間、低酸素状態に曝露され、低酸素状態は、正常な血中酸素濃度を下回る酸素濃度である。別の具体的な実施形態では、前記細胞の集団は、前記保存時に２時間未満の間、前記低酸素状態に曝露される。別の具体的な実施形態では、前記細胞の集団は、回収、濃縮または単離時に、１時間未満、もしくは３０分未満の間、前記低酸素状態に曝露されるか、または低酸素状態に曝露されない。別の具体的な実施形態では、前記細胞の集団は、回収、濃縮または単離時に、剪断ストレスに曝露されない。
胎盤細胞を、例えば、小型の容器、例えば、アンプル中の凍結保存培地で凍結保存し得る。適切な凍結保存培地としては、例えば限定されないが、成長培地または細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、Ｃ２６９５、Ｃ２６３９、もしくはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）をはじめとする培養培地が挙げられる。凍結保存培地は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むことが好ましい。凍結保存培地は、さらなる作用物質、例えば、メチルセルロースおよび／またはグリセロールを含み得る。胎盤細胞を、凍結保存時に、約１℃／分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存された細胞を液体窒素に移した後、使用のために解凍し得る。いくつかの実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達したら、それを液体窒素保存領域に移す。また、速度制御フリーザーを使用して凍結保存を行い得る。凍結保存された細胞は、約２５℃〜約４０℃、好ましくは約３７℃の温度で解凍することが好ましい。
一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って凍結保存される胎盤幹細胞は、凍結保存の前に、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
５．７ 単離された胎盤細胞を含む組成物
本明細書、例えば、セクション５．３．６に記載されている刺激胎盤細胞を、本明細書に記載される方法および組成物において使用するための任意の生理的に許容され得るまたは医学的に許容され得る化合物、組成物または装置と組み合わせ得る。本明細書で提供される処置方法において有用な組成物は、本明細書に記載される刺激胎盤細胞のいずれか１つ以上を含み得る（上記セクション５．３．６を参照のこと）。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る組成物、例えば、薬学的に許容され得る担体中に刺激胎盤細胞を含む組成物である。
特定の実施形態では、単離された刺激胎盤細胞を含む組成物は、マトリックス、例えば、脱細胞化マトリックスまたは合成マトリックスをさらに含む。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、三次元足場である。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態（ａｎｏｔｈｅｒ ｏｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）では、前記マトリックスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、合成化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記マトリックスは、生体活性化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記生体活性化合物は、５，０００ダルトン未満の成長因子、サイトカイン、抗体または有機分子である。
別の実施形態では、本明細書で提供される処置方法において有用な組成物は、上記胎盤細胞のいずれか、または上記胎盤細胞集団のいずれかによって馴化された培地を含む。
５．７．１ 凍結保存された単離された胎盤細胞
本明細書に記載される方法および組成物において有用な単離された胎盤細胞集団を、後で使用するために保存し得る（例えば、凍結保存し得る）。幹細胞などの細胞の凍結保存方法は当技術分野で周知である。単離された胎盤細胞集団を、個体に容易に投与し得る形態、例えば、医療用途に適切な容器中に含まれる単離された胎盤細胞集団として調製し得る。このような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、瓶、または単離された胎盤細胞集団を容易に分注し得る他の容器であり得る。例えば、容器は、血液バッグまたはレシピエントへの液体の静脈内投与に適切な他のプラスチック製の、医療用に許容され得るバッグであり得る。容器は、特定の実施形態では、組み合わされた細胞集団の凍結保存を可能にする容器である。
一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って凍結保存される胎盤幹細胞は、凍結保存の前に、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。別の実施形態では、前記胎盤幹細胞は、前記凍結保存された胎盤幹細胞を解凍した後に、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。具体的な実施形態では、前記炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
凍結保存された単離された胎盤細胞集団は、単一のドナーまたは複数のドナーに由来する単離された胎盤細胞を含み得る。単離された胎盤細胞集団は、意図されるレシピエントと完全にＨＬＡが一致するものであり得るか、または一部もしくは完全にＨＬＡが一致しないものであり得る。
したがって、一実施形態では、単離された胎盤細胞を、本明細書に記載される方法において、容器中に組織培養プラスチック接着性胎盤細胞集団を含む組成物の形態で使用し得る。具体的な実施形態では、単離された胎盤細胞は凍結保存されている。別の具体的な実施形態では、容器は、バッグ、フラスコまたは瓶である。別の具体的な実施形態では、前記バッグは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施形態では、前記バッグは、例えば、静脈内注入による前記単離された胎盤細胞集団の静脈内投与に適切であるか、前記静脈内投与を可能にするか、または前記静脈内投与を容易にする。バッグは、投与の前または投与の間に、単離された胎盤細胞と１つ以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互接続されている複数の内腔または区画を含み得る。別の具体的な実施形態では、組成物は、組み合わされた細胞集団の凍結保存を容易にする１つ以上の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞集団は、生理的に許容され得る水溶液に含まれる。別の具体的な実施形態では、前記生理的に許容され得る水溶液は、０．９％ＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントとＨＬＡが一致する胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組み合わされた細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントと少なくとも一部ＨＬＡが一致しない胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、複数のドナーに由来する。
特定の実施形態では、容器中の単離された胎盤細胞は、単離されたＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+胎盤細胞であり、前記細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されている。具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+胎盤細胞はまた、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はまた、ＣＤ４５-またはＣＤ９０+である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はまた、ＣＤ４５-およびＣＤ９０+である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンdim、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+の１つ以上またはそれらの任意の組み合わせである。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ１３+、ＣＤ２９+、ＣＤ３３+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ４５-、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ+、ＣＤ６２Ｅ-、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ６２Ｐ-、ＳＨ３+（ＣＤ７３+）、ＳＨ４+（ＣＤ７３+）、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＣＤ９０+、ＳＨ２+（ＣＤ１０５+）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ+、ＣＤ１１７-、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンdim、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４-、ＣＤ２００+、ＣＤ１３３-、ＯＣＴ−４+、ＳＳＥＡ３-、ＳＳＥＡ４-、ＡＢＣ−ｐ+、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-、ＨＬＡ−Ｇ-およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）+である。
特定の他の実施形態では、上記単離された胎盤細胞は、単離されたＣＤ２００+、ＨＬＡ−Ｇ-胎盤細胞であり、前記細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されている。別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されているＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+細胞である。別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されているＣＤ２００+、ＯＣＴ−４+幹細胞である。別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されているＣＤ７３+、ＣＤ１０５+細胞であり、前記単離された胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と共に培養される場合、１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されているＣＤ７３+、ＣＤ１０５+、ＨＬＡ−Ｇ-細胞である。別の実施形態では、単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、容器に収容されているＯＣＴ−４+胎盤細胞であり、前記細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と共に培養される場合、１つ以上の胚様体様体の形成を促進する。
別の具体的な実施形態では、上記単離された胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+およびＣＤ１０５+である胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞（例えば、ＰＤＡＣ）である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、または軟骨形成表現型の細胞に分化する可能性を有する。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、ＣＤ２００+である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+またはＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ９０+およびＣＤ４５-である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ９０+、ＣＤ４５-細胞はさらに、フローサイトメトリーによって検出した場合、ＣＤ８０-およびＣＤ８６-である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+細胞はさらに、ＣＤ２９+、ＣＤ３８-、ＣＤ４４+、ＣＤ５４+、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＳＨ３+またはＳＨ４+の１つ以上である。別の具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ４４+である。上記単離されたＣＤ３４-、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、細胞はさらに、ＣＤ１１７-、ＣＤ１３３-、ＫＤＲ-（ＶＥＧＦＲ２-）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-および／またはＰＤＬ１+の１つ以上である。
上記凍結保存された単離された胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、前記容器はバッグである。様々な具体的な実施形態では、前記容器は、約、少なくともまたは多くとも１×１０6個の前記単離された胎盤細胞、５×１０6個の前記単離された胎盤細胞、１×１０7個の前記単離された胎盤細胞、５×１０7個の前記単離された胎盤細胞、１×１０8個の前記単離された胎盤細胞、５×１０8個の前記単離された胎盤細胞、１×１０9個の前記単離された胎盤細胞、５×１０9個の前記単離された胎盤細胞、１×１０10個の前記単離された胎盤細胞、または１×１０10個の前記単離された胎盤細胞を含む。上記凍結保存された集団のいずれかの他の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、約５回、少なくとも５回または５回以下、１０回以下、１５回以下または２０回以下継代されたものである。上記凍結保存された単離された胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、前記単離された胎盤細胞は、前記容器内でエクスパンションされたものである。
特定の実施形態では、胎盤由来接着細胞の単回単位用量は、様々な実施形態では、約１×１０5個、約５×１０5個、約１×１０6個、約５×１０6個、約１×１０7個、約５×１０7個、約１×１０8個、約５×１０8個、約１×１０9個、約５×１０9個、約１×１０10個、約５×１０10個、約１×１０11個、少なくとも１×１０5個、少なくとも５×１０5個、少なくとも１×１０6個、少なくとも５×１０6個、少なくとも１×１０7個、少なくとも５×１０7個、少なくとも１×１０8個、少なくとも５×１０8個、少なくとも１×１０9個、少なくとも５×１０9個、少なくとも１×１０10個、少なくとも５×１０10個、少なくとも１×１０11個もしくは１×１０5個以下、５×１０5個以下、１×１０6個以下、５×１０6個以下、１×１０7個以下、５×１０7個以下、１×１０8個以下、５×１０8個以下、１×１０9個以下、５×１０9個以下、１×１０10個以下、５×１０10個以下、１×１０11個以下またはそれを超える胎盤由来接着細胞を含み得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、５０％以上の生細胞を含む胎盤由来接着細胞の集団を含む（すなわち、集団における細胞の少なくとも５０％は機能的であるかまたは生きている）。好ましくは、集団における細胞の少なくとも６０％は生きている。より好ましくは、医薬組成物中の集団における細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は生きている。
５．７．２ 遺伝子操作された胎盤細胞
胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２．２および５．３．６に記載されている胎盤多能性細胞もしくは胎盤細胞のいずれか、またはこのような胎盤細胞を含む医薬組成物が本明細書でさらに提供され、前記胎盤細胞は、血管新生に関連するか、またはそれを促進する組換えまたは外因性サイトカインを産生するように遺伝子操作されている。特定の実施形態では、血管新生を促進する前記タンパク質は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦＤ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ２）、アンジオジェニン（ＡＮＧ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ＥＮＡ−７８）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長調節癌遺伝子タンパク質（ＧＲＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、レプチン、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−３、血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ランテス、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター１（ＴＩＭＰ１）、ＴＩＭＰ２および／またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の１つ以上である。
例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリエチレングリコール、または当業者に公知の他の方法によって、細胞を遺伝子操作する方法を使用し得る。これらは、細胞内に核酸分子を運び、細胞内で核酸分子を発現させる発現ベクターを使用することを含む。（Ｇｅｏｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照のこと）。ベクターＤＮＡを、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核生物または真核生物細胞に導入し得る。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９）および他の実験用教科書に見られ得る。
例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、シンドビスウイルスおよびウシパピローマウイルスなどのＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターの使用を含むウイルスによる移入；リン酸カルシウムトランスフェクションおよびＤＥＡＥデキストラントランスフェクション法を含む、化学的移入；例えば、リポソーム、赤血球ゴーストおよびプロトプラストなどのＤＮＡをローディングする膜小胞を使用する膜融合移入；またはマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、もしくは裸のＤＮＡの移入などの物理的移入技術をはじめとする方法によって、細胞にＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、胎盤細胞、例えば、上記セクション５．２に記載されているＰＤＡＣを遺伝子修飾し得る。外因性ＤＮＡの挿入によるか、または細胞ゲノムのセグメントと外因性ＤＮＡとの置換によって、胎盤細胞を遺伝子改変し得る。例えば、相同組換えによるか、または宿主細胞ゲノムへのウイルスの組み込みによるか、またはプラスミド発現ベクターおよび核局在化配列を使用して、細胞、特に、その核にＤＮＡを取り込ませることによって、外因性ＤＮＡ配列の挿入を達成し得る。ＤＮＡは、特定の化学物質／薬物、例えば、テトラサイクリンを使用して、目的のタンパク質の正または負の発現誘導を可能にする１つ以上のプロモーターを含み得る；プロモーターは、他の実施形態では、構成的であり得る。
リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、例えば、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡを細胞に導入し得る。特定の実施形態では、ＤＮＡを塩化カルシウム溶液と組み合わせ、次いで、リン酸緩衝溶液に追加する。沈殿が形成されたら、この溶液を培養細胞に直接追加する。ＤＭＳＯまたはグリセロールによる処理を使用して、トランスフェクション効率を向上させることができ、ビス−ヒドロキシエチルアミノエタンスルホネート（ＢＥＳ）を使用して、安定なトランスフェクタントのレベルを向上し得る。リン酸カルシウムトランスフェクションシステムは、市販されている（例えば、ＰＲＯＦＥＣＴＩＯＮ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションも使用し得る。
また、単離された胎盤細胞を、マイクロインジェクションによって遺伝子操作し得る。特定の実施形態では、ガラスマイクロピペットを光学顕微鏡下で細胞の核にガイドして、ＤＮＡまたはＲＮＡを注入する。
また、胎盤細胞を、エレクトロポレーションを使用して遺伝子改変し得る。特定の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡを培養細胞の懸濁液に追加し、ＤＮＡ／ＲＮＡ−細胞懸濁液を２本の電極の間に配置し、電気パルスにかけて、膜を横断する孔の出現により明らかになる細胞外膜における一過性の透過性を引き起こす。
細胞を遺伝子改変するためのＤＮＡまたはＲＮＡのリポソーム送達を、任意にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含むカチオン性リポソーム、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して実施し得る。他の市販の送達系としては、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）、ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＦＵＧＥＮＥ ６（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
ウイルスベクターを使用して、例えば、標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子またはリボザイム配列の細胞への送達により、胎盤細胞を遺伝子改変し得る。レトロウイルスベクターは、迅速に分裂する細胞に形質導入するのに有効であるが、ＤＮＡを非分裂細胞にも同じく有効に移入するように、いくつかのレトロウイルスベクターが開発されている。レトロウイルスベクター用のパッケージング細胞株は当業者に公知である。特定の実施形態では、レトロウイルスＤＮＡベクターは、第１のＬＴＲが、マルチクローニング部位にクローニングされた標的遺伝子配列に機能的に連結されるＳＶ４０プロモーターの５'に位置し、マルチクローニング部位の後に３'の第２のＬＴＲが位置するように
、２つのレトロウイルスＬＴＲを含む。形成されたら、先に記載されているように、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションを使用して、レトロウイルスＤＮＡベクターをパッケージング細胞株に移入する。ウイルス産生の約４８時間後、標的遺伝子配列を含むウイルスベクターを採取する。レンチウイルスベクター、組換えヘルペスウイルス、アデノウイルスベクターまたはアルファウイルスベクターを使用して細胞をトランスフェクトする方法は、当技術分野で公知である。
標的細胞のトランスフェクションまたは形質導入の成功を、当業者に公知の技術において、遺伝子マーカーを使用して示し得る。例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質は、遺伝子改変された造血細胞の同定および追跡のための有効なマーカーであることが示されている。別の選択マーカーとしては、β−Ｇａｌ遺伝子、切断型の神経成長因子受容体または薬物選択マーカー（限定されないが、ＮＥＯ、ＭＴＸまたはハイグロマイシンを含む）が挙げられ得る。
５．７．３ 医薬組成物
単離された刺激胎盤細胞（例えば、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）または単離された刺激胎盤細胞を含む細胞の集団を、インビボにおいて、例えば本明細書で提供される処置方法において使用するための医薬組成物に製剤化し得る。このような医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、例えば、生理食塩水溶液またはインビボ投与のための他の認められている生理的に許容され得る溶液中に、単離された刺激胎盤細胞の集団または単離された刺激胎盤細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載される単離された刺激胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書の別所に記載される単離された刺激胎盤細胞集団もしくは単離された刺激胎盤細胞のいずれかまたは任意の組み合わせを含み得る。医薬組成物は、胎児の、母親のまたは胎児および母親の両方の単離された刺激胎盤細胞を含み得る。本明細書で提供される医薬組成物は、単一の個体もしくは胎盤から、または複数の個体もしくは胎盤から得られた単離された刺激胎盤細胞をさらに含み得る。
本明細書で提供される医薬組成物は、任意の数の単離された刺激胎盤細胞を含み得る。例えば、単離された刺激胎盤細胞の単回単位用量は、様々な実施形態では、約１×１０2個、約５×１０2個、約１×１０3個、約５×１０3個、約１×１０4個、約５×１０4個、約１×１０5個、約５×１０5個、約１×１０6個、約５×１０6個、約１×１０7個、約５×１０7個、約１×１０8個、約５×１０8個、約１×１０9個、約５×１０9個、約１×１０10個、約５×１０10個、約１×１０11個、少なくとも１×１０2個、少なくとも５×１０2個、少なくとも１×１０3個、少なくとも５×１０3個、少なくとも１×１０4個、少なくとも５×１０4個、少なくとも１×１０5個、少なくとも５×１０5個、少なくとも１×１０6個、少なくとも５×１０6個、少なくとも１×１０7個、少なくとも５×１０7個、少なくとも１×１０8個、少なくとも５×１０8個、少なくとも１×１０9個、少なくとも５×１０9個、少なくとも１×１０10個、少なくとも５×１０10個、少なくとも１×１０11個もしくは１×１０2個以下、５×１０2個以下、１×１０3個以下、５×１０3個以下、１×１０4個以下、５×１０4個以下、１×１０5個以下、５×１０5個以下、１×１０6個以下、５×１０6個以下、１×１０7個以下、５×１０7個以下、１×１０8個以下、５×１０8個以下、１×１０9個以下、５×１０9個以下、１×１０10個以下、５×１０10個以下、１×１０11個以下またはそれを超える単離された胎盤細胞を含み得る。他の実施形態では、単離された刺激胎盤細胞の単回単位用量は、約１×１０2〜５×１０2個、約５×１０2〜１×１０3個、約１×１０3〜５×１０3個、約５×１０3〜１×１０4個、約１×１０4〜５×１０4個、約５×１０4〜１×１０5個、約１×１０5〜５×１０5個、約５×１０5〜１×１０6個、約１×１０6〜５×１０6個、約５×１０6〜１×１０7個、約１×１０7〜５×１０7個、約５×１０7〜１×１０8個、約１×１０8〜５×１０8個、約５×１０8〜１×１０9個、約１×１０9〜５×１０9個、約５×１０9〜１×１０10個、約１×１０10〜５×１０10個、約５×１０10〜１×１０11個もしくは約１×１０11〜５×１０11個、少なくとも１×１０2〜５×１０2個、少なくとも５×１０2〜１×１０3個、少なくとも１×１０3〜５×１０3個、少なくとも５×１０3〜１×１０4個、少なくとも１×１０4〜５×１０4個、少なくとも５×１０4〜１×１０5個、少なくとも１×１０5〜５×１０5個、少なくとも５×１０5〜１×１０6個、少なくとも１×１０6〜５×１０6個、少なくとも５×１０6〜１×１０7個、少なくとも１×１０7〜５×１０7個、少なくとも５×１０7〜１×１０8個、少なくとも１×１０8〜５×１０8個、少なくとも５×１０8〜１×１０9個、少なくとも１×１０9〜５×１０9個、少なくとも５×１０9〜１×１０10個、少なくとも１×１０10〜５×１０10個、少なくとも５×１０10〜１×１０11個もしくは少なくとも１×１０11〜５×１０11個、１×１０2〜５×１０2個以下、５×１０2〜１×１０3個以下、１×１０3〜５×１０3個以下、５×１０3〜１×１０4個以下、１×１０4〜５×１０4個以下、５×１０4〜１×１０5個以下、１×１０5〜５×１０5個以下、５×１０5〜１×１０6個以下、１×１０6〜５×１０6個以下、５×１０6〜１×１０7個以下、１×１０7〜５×１０7個以下、５×１０7〜１×１０8個以下、１×１０8〜５×１０8個以下、５×１０8〜１×１０9個以下、１×１０9〜５×１０9個以下、５×１０9〜１×１０10個以下、１×１０10〜５×１０10個以下、５×１０10〜１×１０11個以下もしくは１×１０11〜５×１０11個以下またはそれを超える単離された胎盤細胞を含み得る。
本明細書で提供される医薬組成物は、５０％以上の生存細胞を含む細胞の集団を含む（すなわち、集団における細胞の少なくとも５０％は機能的であるか、または生存している）。好ましくは、集団における細胞の少なくとも６０％が生存している。より好ましくは、医薬組成物中の前記集団における細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が生存している。
本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を促進する１つ以上の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；アルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、プラズマライトなどの安定化剤などを含み得る。
注射用溶液として製剤化される場合、一実施形態では、医薬組成物は、約１％〜１．５％のＨＳＡおよび約２．５％のデキストランを含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、５％ＨＳＡおよび１０％デキストランを含む溶液であって、場合により例えば１０ｍｇ／ｋｇの免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンＡ）を含む溶液中に、細胞約５×１０6個／ミリリットル〜細胞約２×１０7個／ミリリットルを含む。
他の実施形態では、医薬組成物、例えば溶液は、複数の細胞、例えば、単離された刺激胎盤細胞、例えば、ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含み、前記医薬組成物は、細胞約１．０±０．３×１０6個／ミリリットル〜細胞約５．０±１．５×１０6個／ミリリットルを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、細胞約１．５×１０6個／ミリリットル〜細胞約３．７５×１０6個／ミリリットルを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約５０×１０6個／ｍＬ、細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約４０×１０6個／ｍＬ、細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約３０×１０6個／ｍＬ、細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約２０×１０6個／ｍＬ、細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約１５×１０6個／ｍＬまたは細胞約１×１０6個／ｍＬ〜約１０×１０6個／ｍＬを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、可視的な細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）か、またはこのような可視的な細胞塊を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「巨大な細胞塊」は、拡大せずに可視的な、例えば、裸眼で可視的な細胞の凝集体を意味し、一般に、約１５０ミクロンよりも大きい細胞凝集体を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％のデキストラン、例えば、デキストラン−４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は、約７．５％〜約９％のデキストラン−４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は、約５．５％のデキストラン−４０を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、約１％〜約１５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約１％、２％、３％、４％、５％、６５、７５、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＨＳＡを含む。具体的な実施形態では、前記細胞は、凍結保存および解凍されたものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞は、７０μＭ〜１００μＭのフィルタに通してろ過されたものである。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、可視的な細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、細胞１０6個当たり約２００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下においてのみ可視的である。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、細胞１０6個当たり約１５０個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下においてのみ可視的である。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、細胞１０6個当たり約１００個未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下においてのみ可視的である。
具体的な実施形態では、医薬組成物は、細胞約１．０±０．３×１０6個／ミリリットル、約５．５％デキストラン−４０（ｗ／ｖ）、約１０％ＨＳＡ（ｗ／ｖ）および約５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。
他の実施形態では、医薬組成物は、１０％デキストラン−４０を含む溶液中に複数の刺激細胞、例えば、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含み、医薬組成物は、細胞約１．０±０．３×１０6個／ミリリットル〜細胞約５．０±１．５×１０6個／ミリリットルを含み、前記組成物は、肉眼で見える細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、細胞約１．５×１０6個／ミリリットル〜細胞約３．７５×１０6個／ミリリットルを含む。具体的な実施形態では、前記細胞は、凍結保存され、解凍されたものである。別の具体的な実施形態では、前記細胞は、７０μＭ〜１００μＭのフィルタに通してろ過されたものである。別の具体的な実施形態では、前記組成物は、細胞１０6個当たり約２００個未満の微小な細胞塊（すなわち、拡大した場合にのみ可視的な細胞塊）を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、細胞１０6個当たり約１５０個未満の微小な細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、細胞１０6個当たり約１００個未満の微小な細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％もしくは２％未満のＤＭＳＯまたは１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％もしくは０．１％未満のＤＭＳＯを含む。
刺激細胞、例えば刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む組成物であって、本明細書に開示される方法の１つによって生産される組成物が本明細書でさらに提供される。例えば、一実施形態では、医薬組成物は細胞を含み、医薬組成物は、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多能性細胞を含む溶液をろ過して、ろ過された細胞含有溶液を形成させること；前記ろ過された細胞含有溶液を、例えば、凍結保存前に、第１の溶液で細胞約１〜５０×１０6個、１〜４０×１０6個、１〜３０×１０6個、１〜２０×１０6個、１〜１５×１０6個または１〜１０×１０6個／ミリリットルに希釈すること；および得られたろ過された細胞含有溶液を、デキストランを含むがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まない第２の溶液で希釈して、前記組成物を生産することを含む方法によって生産される。特定の実施形態では、前記希釈は、細胞約１５×１０6個／ミリリットル以下にする。特定の実施形態では、前記希釈は、細胞約１０±３×１０6個／ミリリットル以下にする。特定の実施形態では、前記希釈は、細胞約７．５×１０6個／ミリリットル以下にする。他の特定の実施形態では、希釈前の前記ろ過された細胞含有溶液が、細胞約１５×１０6個／ミリリットルを含む場合、ろ過は任意選択である。他の特定の実施形態では、希釈前の前記ろ過された細胞含有溶液が、細胞約１０±３×１０6個／ミリリットルを含む場合、ろ過は任意選択である。他の特定の実施形態では、希釈前の前記ろ過された細胞含有溶液が、細胞約７．５×１０6個／ミリリットルを含む場合、ろ過は任意選択である。
具体的な実施形態では、刺激細胞、例えば刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣは、前記第１の希釈溶液による希釈と前記第２の希釈溶液による希釈の間に凍結保存される。別の具体的な実施形態では、第１の希釈溶液は、デキストランおよびＨＳＡを含む。第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中のデキストランは、任意の分子量のデキストラン、例えば、約１０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有するデキストランであり得る。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の溶液中の前記デキストランは、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％デキストランである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中のデキストランは、デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中のデキストランは、デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、５．０％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、５．５％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、１０％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記ＨＳＡを含む溶液中の前記ＨＳＡは、１〜１５％ＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記ＨＳＡを含む溶液中の前記ＨＳＡは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％ＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記ＨＳＡを含む溶液中の前記ＨＳＡは、１０％ＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は、ＨＳＡを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは、１０％ＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は、凍結保存剤を含む。別の具体的な実施形態では、前記凍結保存剤は、ＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は、約１０％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記細胞を含む組成物は、約７．５％〜約９％デキストランを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、細胞約１．０±０．３×１０6個／ミリリットル〜細胞約５．０±１．５×１０6個／ミリリットルを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、細胞約１．５×１０6個／ミリリットル〜細胞約３．７５×１０6個／ミリリットルを含む。
別の実施形態では、医薬組成物を、（ａ）凍結保存前に、刺激胎盤細胞、例えば刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを含む細胞含有溶液をろ過して、ろ過された細胞含有溶液を生産すること；（ｂ）前記ろ過された細胞含有溶液中の細胞を、細胞約１〜５０×１０6個、１〜４０×１０6個、１〜３０×１０6個、１〜２０×１０6個、１〜１５×１０6個または１〜１０×１０6個／ミリリットルで凍結保存すること；（ｃ）前記細胞を解凍すること；および（ｄ）前記ろ過された細胞含有溶液をデキストラン−４０溶液で約１：１〜約１：１１（ｖ／ｖ）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、細胞の数が、工程（ａ）の前に、細胞約１０±３×１０6個／ミリリットル未満である場合、ろ過は任意選択である。別の具体的な実施形態では、工程（ｂ）の細胞を、細胞約１０±３×１０6個／ミリリットルで凍結保存する。別の具体的な実施形態では、工程（ｂ）の細胞を、約５％〜約１０％デキストラン−４０とＨＳＡとを含む溶液中で凍結保存する。特定の実施形態では、前記工程（ｂ）の希釈は、細胞約１５×１０6個／ミリリットル以下にする。
別の実施形態では、医薬組成物を、（ａ）１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン−４０溶液に刺激胎盤細胞、例えば刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣを懸濁して、細胞含有溶液を形成させること；（ｂ）前記細胞含有溶液を７０μＭフィルタに通してろ過すること；（ｃ）前記細胞含有溶液を、５．５％デキストラン−４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯを含む溶液で、細胞約１〜５０×１０6個、１〜４０×１０6個、１〜３０×１０6個、１〜２０×１０6個、１〜１５×１０6個または１〜１０×１０6個／ミリリットルに希釈すること；（ｄ）前記細胞を凍結保存すること；（ｅ）前記細胞を解凍すること；ならびに（ｆ）前記細胞含有溶液を１０％デキストラン−４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、前記工程（ｃ）の希釈は、細胞約１５×１０6個／ミリリットル以下にする。特定の実施形態では、前記工程（ｃ）の希釈は、細胞約１０±３×１０6個／ｍＬ以下にする。特定の実施形態では、前記工程（ｃ）の希釈は、細胞約７．５×１０6個／ｍＬ以下にする。
別の実施形態では、刺激細胞を含む組成物を、（ａ）複数の細胞を遠心分離して、前記細胞を回収すること；（ｂ）前記細胞を５．５％デキストラン−４０に再懸濁すること；（ｃ）前記細胞を遠心分離して、前記細胞を回収すること；（ｄ）前記細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン−４０溶液に再懸濁すること；（ｅ）前記細胞を７０μＭフィルタに通してろ過すること；（ｆ）前記細胞を、細胞約１〜５０×１０6個、１〜４０×１０6個、１〜３０×１０6個、１〜２０×１０6個、１〜１５×１０6個または１〜１０×１０6個／ミリリットルになるまで５．５％デキストラン−４０、１０％ＨＳＡおよび５％ＤＭＳＯに希釈すること；（ｇ）前記細胞を凍結保存すること；（ｈ）前記細胞を解凍すること；ならびに（ｉ）前記細胞を１０％デキストラン−４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈することを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、前記工程（ｆ）の希釈は、細胞約１５×１０6個／ミリリットル以下にする。特定の実施形態では、前記工程（ｆ）の希釈は、細胞約１０±３×１０6個／ｍＬ以下にする。特定の実施形態では、前記工程（ｆ）の希釈は、細胞約７．５×１０6個／ｍＬ以下にする。他の特定の実施形態では、細胞の数が、細胞約１０±３×１０6個／ミリリットル未満である場合、ろ過は任意選択である。
本明細書に記載される組成物、例えば、単離された刺激胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書に記載される単離された胎盤細胞のいずれかを含み得る。
細胞産物の投与に適切な他の注射用製剤が使用され得る。
一実施形態では、医薬組成物は、実質的にまたは完全に非母親起源のものである（すなわち、胎児の遺伝子型を有する）単離された刺激胎盤細胞を含み；例えば、少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または約１００％は、非母親起源のものである。例えば、一実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ２００+およびＨＬＡ−Ｇ-；ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+；ＣＤ２００+およびＯＣＴ−４+；ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-；ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記単離された胎盤細胞の集団を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進するか；またはＯＣＴ−４+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記単離された胎盤細胞の集団を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進するか；または上記の組み合わせである単離された刺激胎盤細胞の集団を含み、前記単離された胎盤細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は、非母親起源のものである。別の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+およびＣＤ３４-；ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+およびＣＤ３４-；ＣＤ１０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ３４-およびＣＤ９０+またはＣＤ４５-の少なくとも１つ；ＣＤ１０+、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ３４-およびＣＤ４５-；ＣＤ１０+、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+、ＣＤ３４-およびＣＤ４５-；ＣＤ２００+およびＨＬＡ−Ｇ-；ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+；ＣＤ２００+およびＯＣＴ−４+；ＣＤ７３+、ＣＤ１０５+およびＨＬＡ−Ｇ-；ＣＤ７３+およびＣＤ１０５+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進するか；ＯＣＴ−４+であり、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、前記単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団が培養される場合、前記胎盤細胞の集団における１つ以上の胚様体様体の形成を促進するか；またはＣＤ１１７-、ＣＤ１３３-、ＫＤＲ-、ＣＤ８０-、ＣＤ８６-、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ+、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ-および／またはＰＤＬ１+の１つ以上であるか；または上記の組み合わせである単離された胎盤細胞の集団を含み、前記単離された胎盤細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％は、非母親起源のものである。具体的な実施形態では、医薬組成物は、胎盤から得られない幹細胞をさらに含む。別の実施形態では、単離された胎盤幹細胞は、１つ以上の炎症促進性サイトカインで刺激される。具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γの１つ以上を含む。他の具体的な実施形態では、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１βである。
本明細書で提供される組成物、例えば医薬組成物中の単離された胎盤細胞は、単一のドナーに由来するか、または複数のドナーに由来する胎盤細胞を含み得る。単離された胎盤細胞は、意図されるレシピエントと完全にＨＬＡが一致するものであり得るか、または一部もしくは完全にＨＬＡが一致しないものであり得る。
５．７．４ 単離された胎盤細胞を含むマトリックス
胎盤細胞または単離された胎盤細胞の集団を含むマトリックス、ハイドロゲル、足場などを含む組成物が本明細書でさらに提供される。このような組成物を、液体懸濁液中の細胞の代わりにまたはそれに加えて使用し得る。
本明細書に記載される単離された刺激胎盤細胞を、天然マトリックス、例えば、羊膜材料などの胎盤生体材料に播種し得る。このような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接解剖された羊膜；固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥している（すなわち、２０％未満Ｈ2Ｏの）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜と絨毛膜などであり得る。単離された胎盤細胞を播種し得る好ましい胎盤生体材料は、Ｈａｒｉｒｉの米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書に記載される単離された刺激胎盤細胞を、例えば、注射に適切なハイドロゲル溶液に懸濁し得る。このような組成物のための適切なハイドロゲルは、ＲＡＤ１６などの自己集合ペプチドを含む。一実施形態では、細胞を含むハイドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリックスを形成し得る。また、このようなマトリックス中の単離された胎盤細胞を、前記細胞が埋め込み前に有糸分裂でエクスパンションされるように培養し得る。ハイドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合によって架橋されて、三次元開放格子構造を生成する有機ポリマー（天然物または合成物）であり、これが水分子を捕捉してゲルを形成する。ハイドロゲル形成材料としては、多糖、例えばアルギネートおよびその塩ペプチド、ポリホスファジンおよびポリアクリレート（これらは、イオンによって架橋される）またはブロックポリマー、例えばポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー（これらは、それぞれ温度またはｐＨによって架橋される）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルまたはマトリックスは、生体分解性である。
いくつかの実施形態では、製剤は、インサイチューで重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；Ａｎｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１−３）：１９９−２０９（２００２）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９−８０（２００３）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、荷電側基またはその一価イオン塩を有する水、緩衝塩溶液または水性アルコール溶液などの水溶液において少なくとも部分的に可溶性である。カチオンと反応し得る酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはビニルエーテルポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーも使用し得る。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。
具体的な実施形態では、マトリックスは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンドまたはヒアルロン酸でできたマルチフィラメント糸から構成され得るフェルトである。クリンピング、裁断、カーディングおよびニードリングからなる標準的な繊維加工技術を使用して、前記糸をフェルトにする。別の好ましい実施形態では、本発明の細胞を、複合構造物であり得る発泡体足場上に播種する。さらに、三次元フレームワークを、有用な形状、例えば、修復、置換または強化すべき体内の特定の構造に成形し得る。使用され得る足場の他の例としては、不織マット、多孔性発泡体または自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ，Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）から構成される繊維を使用して形成され得る。また、フリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成される発泡体（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照のこと）を足場として使用し得る。
本明細書に記載される単離された刺激胎盤細胞またはその共培養物を三次元フレームワークまたは足場に播種し、インビボで埋め込み得る。このようなフレームワークを、任意の１つ以上の成長因子、細胞、薬物または例えば、組織形成を刺激する他の成分と組み合わせて埋め込み得る。
使用され得る足場の例としては、不織マット、多孔性発泡体または自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ，Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）から構成される繊維を使用して形成され得る。また、フリーズドライまたは凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成される発泡体（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号を参照のこと）を足場として使用し得る。
別の実施形態では、単離された刺激胎盤細胞を、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンドまたはヒアルロン酸などの生体吸収性材料でできたマルチフィラメント糸から構成され得るフェルトに播種するか、あるいはそれと接触させ得る。
本明細書で提供される単離された刺激胎盤細胞を、別の実施形態では、複合構造物であり得る発泡体足場に播種し得る。このような発泡体足場を、有用な形状、例えば、修復、置換または強化すべき体内の特定の構造物の一部の形状に成形し得る。いくつかの実施形態では、フレームワークを、例えば、０．１Ｍ酢酸で処理し、次いで、細胞接着を強化するために、細胞の接種前に、ポリリジン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリックスのプラズマコーティングまたは１つ以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリックス、ならびに／もしくは限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物ゴムなどの他の材料の追加によって、マトリックスの外部表面を修飾し、細胞の接着または成長および組織の分化を改善し得る。
いくつかの実施形態では、足場は、それを抗血栓性にする材料を含むか、または前記材料で処理される。これらの処理および材料はまた、内皮成長、移動および細胞外マトリックス沈着を促進および持続し得る。これらの材料および処理の例としては、限定されないが、天然材料、例えば、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えば、ＥＰＴＦＥ、ならびにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。足場はまた、ヘパリンなどの抗血栓剤を含み得る；また、単離された刺激胎盤細胞の播種の前に、足場を、表面電荷を変化させるように処理し得る（例えば、プラズマでコーティングし得る）。
また、本明細書で提供される刺激胎盤細胞（例えば、刺激ＰＤＡＣ、例えばＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）を、限定されないが、モノリン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、α−トリリン酸カルシウム、β−トリリン酸カルシウムおよびテトラリン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムマグネシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生体活性ガラス、ならびにそれらの混合物を含む生理的に許容され得るセラミック材料に播種し得るか、またはそれと接触させ得る。現在市販されている多孔性の生体適合性セラミック材料としては、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｎａｄａ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ Ｆｒａｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ，Ｂｅｔｔｌａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ならびに石灰化コラーゲンの骨移植用製品、ＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｙｎｈａｍ，ＭＡ）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．）が挙げられる。フレームワークは、天然材料および／または合成材料の混合物、ブレンドまたは複合物であり得る。
一実施形態では、単離された刺激胎盤細胞を、細胞約０．５×１０6〜約８×１０6個／ｍＬで、適切な足場に播種するか、またはそれと接触させる。
５．８ キット
別の態様では、循環系の疾患または障害を有する個体の処置に適切なキットであって、残りのキット内容物とは別の容器中に、刺激ＰＤＡＣ、例えば、上記セクション５．２に記載されている細胞（例えば、ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ）と、使用説明書とを含むキットが本明細書で提供される。好ましくは、刺激胎盤細胞は、薬学的に許容され得る溶液、例えば、病変内投与に適切な溶液または静脈内投与に適切な溶液で提供される。特定の実施形態では、刺激胎盤幹細胞または刺激胎盤多能性細胞は、本明細書に記載されるＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+胎盤細胞のいずれか、例えば、ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞またはＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ４５-、ＣＤ９０+、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤細胞である。
特定の実施形態では、キットは、個体への刺激胎盤細胞の送達を容易にする１つ以上の構成要素を含む。例えば、特定の実施形態では、キットは、個体への刺激胎盤細胞の病変内送達を容易にする構成要素を含む。このような実施形態では、キットは、例えば、個体への細胞の送達に適切な注射器および針などを含み得る。このような実施形態では、刺激胎盤細胞は、バッグに、または１つ以上のバイアル中のキットに含まれ得る。特定の他の実施形態では、キットは、個体への刺激胎盤細胞の静脈内または動脈内送達を容易にする構成要素を含む。このような実施形態では、刺激胎盤細胞は、例えば、ボトルまたはバッグ（例えば、血液バッグもしくは細胞を含む最大約１．５Ｌの溶液を含み得る同様のバッグ）に含まれ得、キットは、個体への細胞の送達に適切なチューブおよび針をさらに含む。
加えて、キットは、個体の疼痛または炎症を軽減する１つ以上の化合物（例えば、鎮痛薬、ステロイド性または非ステロイド性抗炎症化合物など）を含み得る。キットはまた、抗菌化合物または抗ウイルス化合物（例えば、１つ以上の抗生物質）、個体の不安を軽減する化合物（例えば、アラプラゾラム）、個体の免疫応答を減少させる化合物（例えば、シクロスポリンＡ）、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、クロレフェニラミン、レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジンなど）を含み得る。
加えて、キットは、個体の送達への準備を促進するか、または刺激胎盤細胞の投与の結果としての個体の感染の可能性を減少させる使い捨て品、例えば、滅菌ワイプ、使い捨て紙製品、手袋などを含み得る。
６．実施例
６．１ 実施例１：血管細胞の生存、増殖および形態に対する分泌ＰＤＡＣ因子の効果
６．１．１ ＰＤＡＣ成長因子およびサイトカインの分泌
胎盤由来接着幹細胞（ＰＤＡＣ）の凍結アリコートを解凍し、完全成長培地（１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中でエクスパンションした。次いで、無血清ＤＭＥＭ中で、培養ＰＤＡＣを２４時間インキュベートし、ＰＤＡＣ細胞馴化培地サンプル（Ｐ−ＣＭ）を収集した。２つのＭｉｌｌｉｐｉｘ（登録商標）ＭＡＰイムノアッセイパネル（ヒト血管新生／成長因子パネル１およびヒトサイトカイン／ケモカインパネル）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、Ｐ−ＣＭ中の分泌栄養因子の濃度を決定した。この実験の結果は、図１に示されている。Ｐ−ＣＭは、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ−ａ、フォリスタチン、ＧＲＯ、ＨＧＦおよびＩＬ−６を含む検出可能なレベルの様々な栄養血管新生因子を含有することが決定されたが、これは、培養ＰＤＡＣが血管新生因子を分泌することができることを示している。
６．１．２ 分泌ＰＤＡＣ因子はＨＵＶＥＣ生存および管形成を変化させる
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を解凍し、完全内皮成長培地（ＥＧＭ（商標）−２）（Ｌｏｎｚａ）中のフィブロネクチンコーティングプレート上に一晩プレーティングした。無血清内皮基礎培地（ＥＢＭ（商標）−２）（Ｌｏｎｚａ）中でＨＵＶＥＣを６時間培養し、続いて、Ｐ−ＣＭ濃度０．１０４ｍＬ／ｃｍ2の培養フラスコにおいて、ＰＤＡＣ細胞馴化培地サンプル（Ｐ−ＣＭ）中で１６時間インキュベートした。ヘキスト染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いてＩｎＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した定量的画像分析によって、処置ＨＵＶＥＣ細胞の生存率を決定した。図２Ａに示されているように、ＤＭＥＭのみで処置したＨＵＶＥＣと比較した場合、Ｐ−ＣＭと共にインキュベートしたＨＵＶＥＣは、有意に高い増殖／生存率を有していた。
別の実験では、ＥＢＭ（商標）−２中で、ＨＵＶＥＣを３時間血清飢餓状態にし、採取した。Ｐ−ＣＭまたはＤＭＥＭのみのいずれかの存在下で、ＨＵＶＥＣをプレコーティング成長因子−還元Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）プレートに再プレーティングした。次いで、再プレーティングしたＨＵＶＥＣをＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって１６時間分析して、ＨＵＶＥＣ管形成の程度を決定した。血管新生分析ツールキットを使用したＩｍａｇｅＪを使用して、画像を分析した。Ｐ−ＣＭ処置ＨＵＶＥＣは、対照ＨＵＶＥｃよりも有意に長いネットワーク（図２Ｂ）および有意に多くの管（図２Ｃ）を形成した。これらのデータは、Ｐ−ＣＭが、血管新生の血管細胞モデルにおいて管形成および分岐を促進することを示している。
６．２ 実施例２：分泌ＰＤＡＣ因子はＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達および発現に影響を与える
６．２．１ ＰＤＡＣ馴化培地はＨＵＶＥＣシグナル伝達経路を変化させる
上記セクション６．１に記載されているように、ＨＵＶＥＣを解凍し、２日間培養した。次いで、無血清ＥＢＭ（商標）−２中で、ＨＵＶＥＣを６時間血清飢餓状態にし、続いて、Ｐ−ＣＭの存在下または非存在下で５分間、１５分間または３０分間培養した。Ｍｉｌｌｉｐｉｘ（登録商標）ＭＡＰ多経路細胞シグナル伝達多重分析（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達に対するＰ−ＣＭの効果を評価した。
図３に示されているように、Ｐ−ＣＭで処置したＨＵＶＥＣ（「Ｔｘ」レーン）は、試験したすべての時点において、培養培地対照（「培地対照」レーン）と比較して劇的に高いレベルのリン酸化ＭＥＫ、リン酸化ＥＲＫ１／２、リン酸化Ａｋｔおよびリン酸化ＳＴＡＴ３レベルを示した。これらの結果は、ＰＤＡＣ馴化培地で処置した血管細胞が、細胞増殖（ＭＥＫ１、ＥＲＫ１／２）、生存（Ａｋｔ）および分枝（ＳＴＡＴ３）に関与することが公知の異なる細胞シグナル伝達経路を促進することができることを示している。
６．２．２ ＰＤＡＣ馴化培地はＨＵＶＥＣ遺伝子発現を変化させる
上記セクション６．２．１のように、ＨＵＶＥＣを培養し、血清飢餓状態にした。次いで、Ｐ−ＣＭの存在下で、ＨＵＶＥＣを４時間、２４時間または４８時間培養し、分析のために収集した。製造業者のプロトコールに従ってＴａｑｍａｎ Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｐａｔｈｗａｙ ＡｒｒａｙｓおよびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＶＥＧＦ遺伝子発現を測定した。図４に示されているように、Ｐ−ＣＭ中でＨＵＶＥＣを培養すると、４８時間の時間経過と共に、多数の遺伝子が誘導された。Ｐ−ＣＭ処置ＨＵＶＥＣ（「Ｐ−ＣＭ」）では、培地処置対照（「ＳＦ ＥＢＭ−２」）と比べて、シグナル伝達、増殖および生存（上段）；細胞運動性、構造および完全性（中段）；ならびに酸化窒素合成および血管新生（下段）に関与する遺伝子がすべて増加した。図４に示されている遺伝子は、それらの機能に従って以下の表１に列挙されている。
Figure 2021104053
６．３ 実施例３：分泌されたＰＤＡＣ栄養因子に対するＩＬ−１ベータ効果
成長培地中で、ＰＤＡＣを２４時間培養した。ＩＬ−１βを１０ｐｇ／ｍＬ〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲の濃度で成長培地に追加し、２つのＭｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）ＭＡＰイムノアッセイパネル（ヒト血管新生／成長因子パネル１およびヒトサイトカイン／ケモカインパネル）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、分泌ＰＤＡＣ因子を測定した。
図５に示されているように、ＩＬ−１βで刺激したＰＤＡＣは、いくつかの栄養因子を用量依存的に産生した。これらの因子としては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンおよびＩＬ−８が挙げられる。逆に、いくつかの他の栄養因子の産生は、ＩＬ−１βによるＰＤＡＣの刺激後に変化しなかったが、これは、ＩＬ−１βが、培養ＰＤＡＣにおける特定の一部の栄養因子の分泌を促進することを示している。
６．４ 実施例４：ＩＬ−１β刺激ＰＤＡＣ馴化培地はＨＵＶＥＣ細胞シグナル伝達を変化させる
図６に示されているように、ＩＬ−１β刺激Ｐ−ＣＭの存在下で培養したＨＵＶＥＣは、ＤＭＥＭのみまたは非刺激Ｐ−ＣＭの存在下で培養した細胞と比較して高いレベルのシグナル伝達を示した。重要なことに、ＩＬ−１βでスパイクしたＰ−ＣＭもまた、ＩＬ−１β刺激Ｐ−ＣＭよりも低いシグナル伝達をもたらしたが、これは、ＨＵＶＥＣに対する刺激Ｐ−ＣＭの効果が、ＩＬ−１βを直接介したものではないことを示唆している。増殖（ＭＥＫ１、ＥＲＫ１／２）および分枝形態（ＳＴＡＴ３）に関与する細胞シグナル伝達経路についても、同様の傾向が観察された。総合すると、これらのデータは、炎症促進性サイトカインによるＰＤＡＣの刺激が、内皮細胞における増殖および形態のシグナル伝達経路を促進し得ることを示唆している。
６．５ 実施例５：ＩＬ−１β刺激効果は、肝成長因子経路を介してシグナル伝達する
ＰＤＡＣは、Ｐ−ＣＭについて観察された増殖効果に寄与し得る多数の可溶性因子を分泌する。これらの因子の１つである肝成長因子（ＨＧＦ）は、ＰＤＡＣによって構成的に分泌される。加えて、ＨＵＶＥＣは、ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ。ｃ−Ｍｅｔとしても公知である）を発現する。Ｐ−ＣＭの血管新生効果におけるＨＧＦシグナル伝達経路の役割を決定するために、ＩＬ−１β刺激Ｐ−ＣＭを、５００ｎｇ／ｍＬ抗ＨＧＦ中和抗体（Ａｂｃａｍ）と共に４０分間インキュベートしてから、血清飢餓ＨＵＶＥＣに追加した。同様に、上記セクション６．２．１に記載されているように、６時間の血清飢餓工程において、ＨＵＶＥＣを２０ｎＭ ＰＨＡ６６５７５２（ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔの阻害剤）と共にインキュベートした。
図７に示されているように、抗ＨＧＦ中和抗体またはＰＨＡ６６５７２のいずれかによるＨＧＦシグナル伝達の遮断は、ＭＥＫ、ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ３シグナル伝達経路のＰ−ＣＭ誘導性増加を完全に逆転させ（図７Ａ〜Ｃ）、Ａｋｔシグナル伝達経路におけるこの効果を部分的に逆転させた（図７Ｄ）。これらのデータは、培養ＨＵＶＥＣにおける増殖経路および血管新生経路のＰ−ＣＭ媒介性誘導が、少なくとも部分的には、肝成長因子シグナル伝達経路を介して媒介されることを示している。
６．６ 実施例６：糖尿病性足部潰瘍の処置プロトコール
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を伴う糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する１８〜８０歳の対象を、ＩＬ−１βで刺激されたＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞で処置する。１日目（最初の処置日）および８日目に、以下の用量で、ＩＬ−１β刺激胎盤幹細胞を筋肉内投与する：（ｉ）：３×１０6個のＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞；（ｉｉ）：１×１０7個のＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞；または（ｉｉｉ）３×１０7個のＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞。
臨床エンドポイント
ＤＦＵの処置に関するＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性の主要臨床エンドポイントは、処置されている１つまたは複数のＤＦＵの閉鎖であり得る。潰瘍閉鎖は、排膿も包帯の必要性もない皮膚閉鎖によって表され得る。完全閉鎖は、閉鎖の決定後少なくとも４週間にわたる潰瘍閉鎖の保持によって表され得る。潰瘍閉鎖は、胎盤幹細胞による処置後３カ月の時点において評価され得る。
ＤＦＵの処置に関するＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性の他の臨床エンドポイントとしては、（ｉ）有害事象の頻度および重症度の減少（これは、処置後最大２４カ月評価され得る）；（ｉｉ）潰瘍閉鎖時間（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；（ｉｉ）足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）の改善（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；（ｉｉｉ）足趾上腕血圧比（ＴＢＩ）の改善（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；（ｉｖ）ＤＦＵのサイズおよび数の減少（これは、処置後最大２４カ月評価され得る）；（ｖ）経皮酸素レベルの改善（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；（ｖｉ）脈容量記録の改善（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；（ｖｉｉ）大切断時間（これは、処置後最大２４カ月評価され得る）；（ｖｉｉｉ）ワーグナー評価尺度の改善（これは、処置後最大２４カ月評価され得る）；（ｉｘ）ラザフォード基準の改善（これは、処置後６カ月の時点において評価され得る）；ならびに（ｘ）脚の安静時疼痛スコアの改善（これは、処置後最大２４カ月評価され得る）；ならびに（ｘｉ）（ｉ）３６項目簡易健康調査（ＳＦ−３６）（例えば、Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ ３０（６）：４７３−４８３を参照のこと）；（ｉｉ）糖尿病性足部潰瘍尺度簡易版（ＤＦＳ−ＳＦ）（例えば、Ｂａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，２００３，２１（１７）：１２７７−９０を参照のこと）；（ｉｉｉ）患者全般変化印象尺度（例えば、Ｋａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｎ．Ｍａｎｉｐ．Ｔｈｅｒ．，２００９，１７（３）：１６３−１７０を参照のこと）；および／または（ｉｖ）ＥｕｒｏＱｏｌ５Ｄ（ＥＱ−５Ｄ（商標））尺度によって評価した場合の対象の生活の質の改善が挙げられ得る。
対象の選択
以下の適格基準を使用して、ＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞による処置が適切であると考えられる対象を選択し得る。この処置プロトコールが特定の対象に適切であるかを決定する場合、すべての関連病状および非病状を考慮する。
処置プロトコールに適格であるためには、対象は、以下の条件を満たさなければならない：
・少なくとも１８歳以上の男性および女性。
・評価／手順に関連する任意の試験を行う前に、インフォームドコンセント文書を理解して自発的に署名する。
・試験訪問スケジュールおよび他のプロトコール要件を厳守することができる。
・１型または２型真性糖尿病。
・ワーグナー評価尺度のグレード１（全層のみ）またはグレード２の重症度の１カ月間を超える糖尿病性足部潰瘍であって、従来の潰瘍処置に適切に応答しておらず、足趾上に存在する場合を除いて、少なくとも１ｃｍ2のサイズを有する糖尿病性足部潰瘍。指標潰瘍の最大病変サイズの範囲は、６．２５ｃｍ2以下である。指標潰瘍の測定は、スクリーニング訪問時における（必要な場合には）創面切除後に評価および測定すべきである。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の以下の基準の１つ以上を満たす対象。
ａ．０．４以上０．８以下のＡＢＩまたは０．３０超０．６５以下のＴＢＩを有する末梢動脈疾患：
ｂ．２０〜４０ｍｍＨｇの経皮酸素（ＴｃＰＯ２）測定値。ＴｃＰＯ２で測定した領域は、浮腫および肥厚皮膚を含まないものでなければならない。
・スクリーニング訪問後の翌３カ月間は、血管再生または切断の予定がないこと。
・再灌流介入の失敗後少なくとも１４日および再灌流介入の成功後少なくとも３０日まで、スクリーニングを開始すべきではない。
・高血圧と、糖尿病と、継続的なケアを必要とする任意の他の慢性症状とについて、対象は適切な医学療法を受けなければならない。
・妊娠の可能性がある女性（ＦＣＢＰ）は、スクリーニング時の血清妊娠検査が陰性であり、試験療法による処置前の尿妊娠検査が陰性でなければならない。加えて、試験期間および経過観察期間中、性的に活発なＦＣＢＰは、以下の適切な形態の避妊方法、例えば経口、注射または移植ホルモン避妊；卵管結紮；ＩＵＤ；殺精子剤によるバリア避妊具；またはパートナーの精管切除の２つを同時に使用することに同意しなければならない。
・試験期間および経過観察期間中、男性（精管切除術を受けた者を含む）は、ＦＣＢＰとの生殖性的行為において避妊（ラテックスコンドーム）を行う場合、バリア避妊（ラテックスコンドーム）を使用することに同意しなければならない。
以下の症状の１つ以上を有する対象は、処置プロトコールから除外され得る：
・対象の試験参加を妨げる任意の重大な症状、検査異常または精神病。
・対象が試験に参加した場合、対象を許容不可能なリスクにさらす任意の症状（検査異常の存在を含む）。
・試験からのデータを解釈する能力を混乱させる任意の症状。
・ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、またはＢ型肝炎ウイルスの活動性感染について陽性であることが公知であること。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において、対象が４０超の肥満度指数を有すること。
・スクリーニング時において、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）またはＡＬＴ（ＳＧＰＴ）が正常上限（ＵＬＮ）の２．５倍超であること。
・スクリーニング時において腎疾患食事療法試験式（Ｌｅｖｅｙ，２００６）を使用して計算した推定糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）が３０ｍＬ／分／１．７３ｍ2未満であるか、または過去１年以内に１５ｍＬ／分／１．７３ｍ2超のｅＧＦＲ減少の病歴があること。
・スクリーニング時において、アルカリホスファターゼがＵＬＮの２．５倍超であること。
・スクリーニング時において、（対象が既知のギルバート病を有しない限り）ビリルビンレベルが２ｍｇ／ｄＬ超であること。
・慢性感染症が未処置であるか、または全身性抗生物質による任意の感染症の処置（潰瘍部位を含む）が、腹腔内投与前１週間以内に抗生物質を含まないものでなければならないこと。
・指標潰瘍またはこれに隣接する活動性骨髄炎、感染症または蜂巣炎。
・スクリーニング／導入期間中において、指標潰瘍のサイズが３０％以上減少または増加すること。
・肢虚血による安静時疼痛。
・指標潰瘍を有する足における経皮酸素測定値が２０ｍｍＨｇ以下であること。
・踵潰瘍。
・非管理高血圧（スクリーニング中、対象が座っており少なくとも５分間安静にしている間に行われた２回の独立した測定において、拡張期血圧が１００ｍｍＨｇ超であるか、または収縮期血圧が１８０ｍｍＨｇ超であると定義される）。
・管理不良の真性糖尿病（ヘモグロビンＡ１ｃが１２％超であるか、またはスクリーニング時血清グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ以上である）。
・未処置の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）への署名前６カ月における悪性心室性不整脈、ＣＣＳクラスＩＩＩ−ＩＶ狭心症、心筋梗塞／経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）／冠状動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）、その後の３カ月における保留中の冠動脈血行再建、ＩＣＦへの署名前６カ月における一過性虚血発作／脳血管障害、および／またはニューヨーク心臓協会［ＮＹＨＡ］ステージＩＩＩもしくはＩＶ鬱血性心不全の病歴。
・ＩＣＦへの署名前３カ月における異常なＥＣＧ（新たな右脚ブロック（ＢＢＢ）が１２０ミリ秒以上である）。
・非管理の凝固亢進。
・ＩＣＦへの署名時において、平均余命が、合併症により２年未満であること。
・責任医師の意見では、対象が細胞療法に不適切であること。
・ＩＣＦへの署名前５年以内における悪性腫瘍の病歴（皮膚の基底細胞または扁平上皮癌を除く）、または現在は治癒したと考えられる癌の既往歴、またはその後の陰性経過観察による陽性パップスメア。
・製品製剤の成分（ウシまたはブタ生成物、デキストラン４０およびジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を含む）のいずれかに対する過敏症の病歴。
・試験治療による処置前９０日以内に（または５半減期のいずれか長い方）、対象が治験薬（任意の適応症における商業的使用について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されていない薬剤またはデバイス）を投与されているか、またはこの試験の終了前に別の治療試験への参加が予定されていること。
・対象が、過去の治験遺伝子療法または細胞療法を受けていること。
臨床転帰
１つ以上の臨床エンドポイントの改善を実証する場合、ＤＦＵの処置におけるＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性を確認する。
６．７ 実施例７：代替ＤＦＵ処置プロトコール
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を伴う糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）を有する少なくとも１８歳の対象を、ＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞で処置する。対象群Ｉ：１日目（最初の処置日）、２９日目および５７日目に、３×１０6個のＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞を筋肉内投与する。対象群ＩＩ：１日目（最初の処置日）、２９日目および５７日目に、３×１０7個のＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞を筋肉内投与する。対象群ＩＩＩ：１日目（最初の処置日）、２９日目および５７日目に、プラセボを筋肉内投与する。
臨床エンドポイント
ＤＦＵの処置に関するＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性の主要臨床エンドポイントは、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）；経皮酸素測定（ＴＣＯＭ）、近赤外線分光法、フルデオキシグルコース陽電子放出断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＦＧＤ ＰＥＴ／ＣＴ）、ドップラー超音波、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、血管造影法および／または酸素測定の測定によって評価した場合、手足の血管機能の改善であり得る。手足の血管機能の改善は、処置後約１年の時点において評価され得る。
ＤＦＵの処置に関するＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性の他の臨床エンドポイントとしては、（ｉ）指標潰瘍の潰瘍閉鎖および完全な創傷閉鎖（潰瘍閉鎖は、排膿も包帯の必要性もない皮膚閉鎖によって表され得る；完全閉鎖は、閉鎖の決定後少なくとも４週間にわたる潰瘍閉鎖の保持によって表され得る）（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｉｉ）有害事象の頻度および重症度の減少（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｉｉｉ）すべての潰瘍の数、サイズの減少および指標潰瘍の５０％の閉鎖（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｉｖ）処置された脚の大切断までの時間の減少（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｖ）ワーグナー評価尺度の改善（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｖｉ）ラザフォード基準の改善（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；（ｖｉｉ）脚の安静時疼痛スコアの改善（これは、処置後約１年の時点において評価され得る）；ならびに（ｖｉｉｉ）神経障害の患者全般変化印象（ＰＧＩＣＮ）を使用して評価した場合の対象の生活の質の改善が挙げられ得る。
対象の選択
以下の適格基準を使用して、ＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞による処置が適切であると考えられる対象を選択し得る。この処置プロトコールが特定の対象に適切であるかを決定する場合、すべての関連病状および非病状を考慮する。
処置プロトコールに適格であるためには、対象は、以下の条件を満たさなければならない：
・少なくとも１８歳以上の男性および女性。
・１型または２型真性糖尿病。
・ワーグナー評価尺度のグレード１（全層のみ）またはグレード２の重症度の１カ月間を超える糖尿病性足部潰瘍であって、従来の潰瘍処置に適切に応答していない糖尿病性足部潰瘍。
・指標潰瘍を有する足における動脈循環不全の以下の基準の１つ以上を満たす対象。
ａ．０．４以上０．８以下のＡＢＩまたは０．３０超０．６５以下のＴＢＩを有する末梢動脈疾患：
ｂ．２０〜４０ｍｍＨｇの経皮酸素（ＴｃＰＯ２）測定値。
・スクリーニング訪問後の翌３カ月間は、血管再生または切断の予定がないこと。
・再灌流介入の失敗後少なくとも１４日および再灌流介入の成功後少なくとも３０日まで、投与を開始すべきではない。
以下の症状の１つ以上を有する対象は、処置プロトコールから除外され得る：
・対象の試験参加を妨げる任意の重大な症状、検査異常または精神病。
・対象が試験に参加した場合、対象を許容不可能なリスクにさらす任意の症状（検査異常の存在を含む）。
・妊娠中または授乳中の女性。
・スクリーニング時において、対象が４０超の肥満度指数を有すること。
・スクリーニング時において腎疾患食事療法試験式（Ｌｅｖｅｙ，２００６）を使用して計算した推定糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）が３０ｍＬ／分／１．７３ｍ2未満であるか、または過去１年以内に１５ｍＬ／分／１．７３ｍ2超のｅＧＦＲ減少の病歴があること。
・慢性感染症が未処置であるか、または全身性抗生物質による任意の感染症の処置（潰瘍部位を含む）が、腹腔内投与前１週間以内に抗生物質を含まないものでなければならないこと。
・指標潰瘍またはこれに隣接する既知の骨髄炎、感染症または蜂巣炎。
・肢虚血による下肢痛。
・非管理高血圧（スクリーニング中、対象が座っており少なくとも５分間安静にしている間に行われた２回の独立した測定において、拡張期血圧が１００ｍｍＨｇ超であるか、または収縮期血圧が１８０ｍｍＨｇ超であると定義される）。
・管理不良の真性糖尿病（ヘモグロビンＡ１ｃが１２％超であるか、またはスクリーニング時血清グルコースが３００ｍｇ／ｄｌ以上である）。
・未処置の増殖性網膜症。
・インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）への署名前６カ月における悪性心室性不整脈、ＣＣＳクラスＩＩＩ−ＩＶ狭心症、心筋梗塞／経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）／冠状動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）、その後の３カ月における保留中の冠動脈血行再建、ＩＣＦへの署名前６カ月における一過性虚血発作／脳血管障害、および／またはニューヨーク心臓協会［ＮＹＨＡ］ステージＩＩＩもしくはＩＶ鬱血性心不全の病歴。
・ＩＣＦへの署名前３カ月における異常なＥＣＧ（新たな右脚ブロック（ＢＢＢ）が１２０ミリ秒以上である）。
・非管理の凝固亢進。
・ＩＣＦへの署名時において、平均余命が、合併症により２年未満であること。
・責任医師の意見では、対象が細胞療法に不適切であること。
・ＩＣＦへの署名前５年以内における悪性腫瘍の病歴（皮膚の基底細胞または扁平上皮癌を除く）、または現在は治癒したと考えられる癌の既往歴、またはその後の陰性経過観察による陽性パップスメア。
・製品製剤の成分（ウシまたはブタ生成物、デキストラン４０およびジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］を含む）のいずれかに対する過敏症の病歴。
・試験治療による処置前９０日以内に（または５半減期のいずれか長い方）、対象が治験薬（任意の適応症における商業的使用について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されていない薬剤またはデバイス）を投与されているか、またはこの試験の終了前に別の治療試験への参加が予定されていること。
・対象が、過去の治験遺伝子療法または細胞療法を受けていること。
臨床転帰
１つ以上の臨床エンドポイントの改善を実証する場合、ＤＦＵの処置におけるＩＬ−１β刺激ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+、ＣＤ２００+胎盤幹細胞の有効性を確認する。

Claims (34)

  1. 単離された刺激胎盤由来接着細胞であって、組織培養プラスチックに接着し、ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+であり、インビトロで１つ以上の炎症促進性サイトカインと接触されており、（１）内皮細胞の増殖を促進し；（２）内皮細胞の集団における芽もしくは管状構造の形成を促進し；または（３）内皮細胞の遊走を促進する、単離された刺激胎盤由来接着細胞。
  2. フローサイトメトリーによって決定した場合、ＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+である、請求項１に記載の単離された細胞。
  3. 前記炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−γの１つ以上である、請求項１に記載の単離された細胞。
  4. 前記炎症促進性サイトカインがＩＬ−１βである、請求項３に記載の単離された細胞。
  5. 前記１つ以上の炎症促進性サイトカインと接触されていない単離された胎盤由来接着細胞よりも高いレベルで、栄養因子を分泌する、請求項１から４のいずれかに記載の単離された細胞。
  6. 前記栄養因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンまたはＩＬ−８の少なくとも１つを含む、請求項５に記載の単離された細胞。
  7. 前記栄養因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１、フォリスタチンおよびＩＬ−８を含む、請求項５に記載の単離された細胞。
  8. 請求項１から７のいずれかに記載の細胞を含む、単離された細胞の集団。
  9. 前記集団における細胞の少なくとも５０％が、請求項１に記載の細胞である、請求項８に記載の単離された細胞の集団。
  10. 前記集団における細胞の少なくとも９０％が、請求項１に記載の細胞である、請求項８に記載の単離された細胞の集団。
  11. 循環系の疾患または障害を有する個体を処置する方法であって、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞の集団を前記個体に投与することを含む、方法。
  12. 前記疾患または障害の１つ以上の症候の検出可能な改善のために十分な量および時間で、請求項１に記載の細胞の集団を前記個体に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記疾患または障害が糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記ＤＦＵが、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）によって引き起こされ、および／またはそれに関連する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記循環系の疾患または障害が、心臓疾患または心臓傷害である、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記疾患または障害が、手足またはその周辺の血流の途絶である、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記手足またはその周辺の血流の途絶が、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）または末梢血管疾患（ＰＶＤ）によって引き起こされる、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記疾患または障害が末梢動脈疾患（ＰＡＤ）である、請求項１１から１３に記載の方法。
  19. 前記疾患または障害が末梢血管疾患（ＰＶＤ）である、請求項１１から１３に記載の方法。
  20. １日目および８日目に、（ｉ）３×１０6個；（ｉｉ）：１×１０7個；または（ｉｉｉ）３×１０7個の前記細胞の濃度で、請求項１に記載の細胞の集団を前記個体に筋肉内投与することを含む、請求項１１から１９に記載の方法。
  21. １日目、２９日目および５７日目に、３×１０6個；または３×１０7個の前記細胞の濃度で、請求項１に記載の細胞の集団を前記個体に筋肉内投与することを含む、請求項１１から１９に記載の方法。
  22. 心臓機能の１つ以上の兆候が検出可能に改善され、前記心臓機能の兆候が、胎盤由来接着細胞の投与前の個体と比較した、胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）、心係数（ＣＩ）、％短縮率（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）；左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮性（ｄＰ／ｄｔ）、心房機能もしくは心室機能の低下、ポンプ効率の増加、ポンプ効率の損失率の減少、血行動態機能の喪失の減少、または心筋症に関連する合併症の減少である、請求項１１から２１に記載の方法。
  23. 循環系の疾患または障害を有する個体を処置する方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団を前記個体に投与することを含み、心臓機能の１つ以上の兆候が検出可能に改善され、前記心臓機能の兆候が、胎盤由来接着細胞の投与前の個体と比較した、胸部心拍出量（ＣＯ）、心係数（ＣＩ）、肺動脈楔入圧（ＰＡＷＰ）、心係数（ＣＩ）、％短縮率（％ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）；左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、収縮性（ｄＰ／ｄｔ）、心房機能もしくは心室機能の低下、ポンプ効率の増加、ポンプ効率の損失率の減少、血行動態機能の喪失の減少、または心筋症に関連する合併症の減少である、方法。
  24. 前記心臓機能の１つ以上の兆候の検出可能な改善のために十分な量および時間で、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団を前記個体に投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記循環系の疾患または障害が、心臓疾患または心臓傷害である、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 手足またはその周辺の血流の途絶を有する個体を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む、方法。
  27. 前記手足またはその周辺の血流の途絶が、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）または末梢血管疾患（ＰＶＤ）である、請求項２６に記載の方法。
  28. さらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項１１から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記投与が、移植、埋め込み、注射、注入、またはカテーテルを介した送達によるものである、請求項１１から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 刺激胎盤由来接着細胞を生産する方法であって、前記細胞がＣＤ１０+、ＣＤ３４-、ＣＤ１０５+およびＣＤ２００+であり、インビトロで胎盤由来接着細胞と１つ以上の炎症促進性サイトカインとを接触させることを含む、方法。
  31. 前記炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−γの１つ以上である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記炎症促進性サイトカインがＩＬ−１βである、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  34. 請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団を含む、キットオブパーツ。
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