JP5950577B2 - 単離胎盤細胞を使用した脳卒中の治療 - Google Patents

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Description

本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年８月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／０９０，５６５号の利益を主張するものである。
低酸素障害または脳内または脳周辺の血流の混乱、例えば、脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の症状または欠陥、例えば、神経障害を有する個体の治療における、単離胎盤細胞、例えば、胎盤多分化能細胞、このような単離胎盤細胞の集団、および／または細胞を含む組成物の使用方法が本明細書で提供される。
脳卒中は、「脳発作」、脳血管障害（ＣＶＡ）または急性虚血性脳血管症候群としても知られ、脳または脳幹に血液を供給する血管の混乱が原因である、通常急速に進行する（１つまたは複数の）脳機能の喪失である。この混乱は、例えば血栓症または塞栓症によって引き起こされる虚血（血液の欠如）である可能性があり、または出血が原因である可能性がある。世界保健機構によれば、脳卒中は、「２４時間を超えて持続する、または２４時間以内の死によって中断される、脳血管が原因の神経障害」である。２４時間を超える症状の持続によって、症状が２４時間未満で持続する一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）と脳卒中は分けられる。
現在、虚血性脳卒中の治療は、虚血を引き起こす閉塞を低減または緩和するための、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモールなどの抗血小板薬、ワルファリンなどの抗凝固薬を典型的に含む。さらに、血糖レベルを可能な限り正常にし、脳卒中患者には十分な酸素および静脈内輸液を与える。出血性脳卒中の治療は、血圧降下剤の１回または複数回の投与、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）以外の鎮痛薬の投与、カルシウムチャネルブロッカー（例えば、ニモジピン）の投与、および示される場合、出血の原因である血管破裂を修復するための外科手術を一般に含む。
しかしながら、このような治療は進行中の神経損傷の軽減を試みるだけで、失われた機能の回復とは全く関係がない。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体アンタゴニスト、ナルメフェン、ルベルゾール、クロメチアゾール、カルシウムチャネルブロッカー（ａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸アンタゴニスト、セロトニンアゴニスト（例えば、レピノタン）、および膜貫通カリウムチャネルモジュレーターを含む）、チリラザド、抗ＩＣＡＭ−１抗体、ヒト抗白血球抗体（Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ）、抗血小板抗体（例えば、アブシキシマブ）、シチコリン（シチジン−５’−ジホスホコリンの外因型）、および塩基性線維芽細胞増殖因子を含めた、多数の非細胞性神経保護薬が脳卒中の治療における有効性に関して試験されており、失敗している。
脳卒中に有効な治療法は存在しない。したがって、いずれかの状態から生じる神経損傷を軽減するだけでなく、神経機能および予後を改善する療法が必要とされている。
一態様では、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）、例えば脳または脊髄内または周辺の血流の混乱を有する個体の治療における、単離胎盤細胞、単離胎盤細胞の集団、単離胎盤幹細胞を含む細胞の集団、および単離胎盤細胞を含む組成物の使用方法が本明細書で提供される。これらの方法は、例えば、低酸素障害、酸素欠乏障害、脳卒中（例えば、虚血性または出血性脳卒中）、非脳卒中出血またはＴＩＡなどの、個体の脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の個体中の症状または神経障害の治療を含む。本明細書で企図するように、個体の脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の個体中の症状または神経障害の治療は、このような個体の脳内または脳周辺の血流の混乱を伴う可能性がある、再灌流障害が原因の症状または神経障害の治療を含む。虚血性脳卒中、例えば酸素欠乏障害または低酸素障害の成功した治療は、承認された動物脳卒中モデルで本明細書において実証している。実施例１および実施例２を参照。
一態様では、個体の脳内または脳周辺の血流の混乱を有する個体、例えば個体の脳または中枢神経系（ＣＮＳ）内またはその周辺の血流の混乱が原因の症状または神経障害を有する個体を治療する方法であって、治療有効量の単離組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞を前記個体に投与することを含み、前記単離胎盤細胞が多分化能細胞または幹細胞の特性を有する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、血流の混乱は、個体の脳またはＣＮＳに酸素欠乏障害または低酸素障害をもたらす。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。別の実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、さらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。さらに具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、さらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
他の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体またはＯＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体またはその任意の組合せの形成を可能にする条件下で集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。他の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋であり、さらにＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋；集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記単離胎盤細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にするＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋；または集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、単離胎盤細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にするＯＣＴ−４＋；またはそれらの任意の組合せである。
具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋幹細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記細胞はＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＭＨＣ−Ｉ＋、またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数であり、この場合ＡＢＣ−ｐは胎盤特異的ＡＢＣ輸送タンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）としておよびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られる）である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−１＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。具体的な実施形態では、前記ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−細胞はさらにＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−、およびＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、およびＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである。特定の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。
別の実施形態では、本明細書に記載の治療法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ−、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、および／またはＰＤＬ１低の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９−およびＣＤ５４−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ４４＋およびＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９＋である。
別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、前記１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞は、前記単離胎盤細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、（例えばＧｉｂｃｏからの）６０％のＤＭＥＭ−ＬＧおよび（例えばＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣＤＢ−２０１；（例えばＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（例えばＳｉｇｍａからの）１０−９Ｍのデキサメタゾン；（例えばＳｉｇｍａからの）１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、（例えばＧｉｂｃｏからの）６０％のＤＭＥＭ−ＬＧおよび（例えばＳｉｇｍａからの）４０％のＭＣＤＢ−２０１；（例えばＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．からの）２％ウシ胎児血清；１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）；１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）；（例えばＳｉｇｍａからの）１０−９Ｍのデキサメタゾン；（Ｓｉｇｍａ）１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート；（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ；および（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬを含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞は、神経栄養増殖因子グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を発現する。
別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも５０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも７０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも８０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、その細胞の少なくとも９０％が前記単離胎盤細胞である細胞の集団内に含有される。特定の他の実施形態では、前記細胞集団中の胎盤細胞は、母方の遺伝子型を有する細胞は実質的に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の胎盤細胞が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。特定の他の実施形態では、前記胎盤細胞を含む細胞の集団は、母方の遺伝子型を有する細胞は実質的に含まず、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が胎児の遺伝子型を有する、すなわち胎児起源である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、レシピエント、例えば脳卒中を有する個体、または脳卒中の症状を有する個体と同種である。特定の他の実施形態では、本明細書に記載の任意の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、レシピエント、例えば脳卒中を有する個体、または脳卒中の症状を有する個体と異種である。
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は前記投与前に凍結保存する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は胎盤幹細胞塊から得る。
単離胎盤細胞の任意の前述の実施形態では、単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖を促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に一般に分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、フィーダー細胞層の不在下での培養の結果として培養中に分化しない。
別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、血液が流出しており灌流させて残留血液を除去した、血液が流出しているが灌流させて残留血液を除去することはない、または血液が流出しておらず灌流させて残留血液を除去することもない産後胎盤の灌流によって得る。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。
本明細書で提供する方法に有用である、胎盤細胞の細胞表面、分子および遺伝子マーカーは、以下のセクション５．４．２に詳細に記載する。
別の具体的な実施形態では、前記血流の混乱は脳卒中である。より具体的な実施形態では、前記脳卒中は虚血性脳卒中である。別のより具体的な実施形態では、前記脳卒中は出血性脳卒中、例えば頭蓋内出血または自然発症くも膜下出血である。別の具体的な実施形態では、前記混乱は血腫である。より具体的な実施形態では、前記血腫は硬膜血腫、硬膜下血腫またはくも膜下血腫である。別の具体的な実施形態では、前記血腫は、頭蓋骨における外力、例えば頭部外傷によって引き起こされる。別の具体的な実施形態では、前記混乱は一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、例えば再発性ＴＩＡである。別の具体的な実施形態では、前記混乱は血管痙攣、例えば出血性脳卒中後の血管痙攣である。
方法の別の具体的な実施形態では、前記治療有効量が、前記個体によって示される脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱が原因の神経障害、例えば、酸素欠乏障害もしくは低酸素障害、またはその１つまたは複数の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす単離胎盤細胞の数である。別の具体的な実施形態では、前記治療有効量の単離胎盤細胞を、例えば、前記血流の混乱後に、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の第２または後の血流の混乱によって引き起こされる神経障害を低減または排除するために、予防的に前記個体に投与する。
別の具体的な実施形態では、脳内または脳周辺の血流の混乱の前記症状、例えば脳卒中、酸素欠乏障害または低酸素障害は、片麻痺（身体の片側の麻痺）、片側不全麻痺（身体の片側の弱化）、顔面の筋力低下、しびれ、感覚の低下、嗅覚、味覚、聴覚、または視覚の変化、嗅覚、味覚、聴覚、または視覚の消失、眼瞼下垂（下垂症）、眼筋の検出可能な低下、咽頭反射の低下、飲み込む能力の低下、光に対する瞳孔反応性の低下、顔面の感覚低下、バランスの低下、眼振、呼吸数の変化、心拍数の変化、頭部を片側に向ける能力が低いまたはそれが不可能な胸鎖乳突筋の弱化、舌の弱化、失語症（言語を話すまたは理解することができないこと）、失行症（随意運動の変化）、視野欠損、記憶障害、半側無視または半側空間無視（損傷反対の視野側の空間に対する配慮の障害）、支離滅裂な思考、混乱状態、性欲過剰行為の発生、疾病失認（障害の存在が絶えず認識できないこと）、歩行困難、運動協調の変化、めまい、不均衡、意識失調、頭痛、および／または嘔吐の１つまたは複数である。
前に記載した治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞をボーラス注射によって投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を静脈内注入によって投与する。具体的な実施形態では、前記静脈内注入は約１〜約８時間にわたる静脈内注入である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を頭蓋内に投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を腹腔内に投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を動脈内に投与する。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を虚血領域内に投与する。別のより具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を虚血周辺領域に投与する。治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を筋肉内、皮内、皮下、または眼内に投与する。
前に記載した治療方法の別の実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記単離胎盤細胞を含む組成物の前記個体への外科的移植によって投与する。より具体的な実施形態では、前記組成物はマトリクスまたは骨格である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスまたは骨格はヒドロゲルである。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスまたは骨格は脱細胞化組織である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスまたは骨格は合成生分解性組成物である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスまたは骨格は発泡体である。
前に記載した治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を前記個体に１回投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を前記個体に２回以上の別個の投与で投与する。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０４個と１×１０５個の間の単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０５個と１×１０６個の間の単離胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０６個と１×１０７個の間の単離胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０７個と１×１０８個の間の単離胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０６個と約２×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約２×１０６個と約３×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約３×１０６個と約４×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約４×１０６個と約５×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約５×１０６個と約６×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約６×１０６個と約７×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約７×１０６個と約８×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約８×１０６個と約９×１０６個の間の単離胎盤細胞、または前記個体１キログラム当たり約９×１０６個と約１×１０７個の間の単離胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０７個と約２×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１．３×１０７個と約１．５×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり最大約３×１０７個の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。具体的な実施形態では、前記投与は、約５×１０６個と約２×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、溶液約２０ミリリットル中の約１５０×１０６個の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。
具体的な実施形態では、前記投与は、約５×１０６個と約２×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含み、前記細胞は１０％デキストラン、例えばデキストラン−４０、５％ヒト血清アルブミン、および場合によっては免疫抑制剤を含む溶液中に含有される。
別の具体的な実施形態では、前記投与は、約５×１０７個と３×１０９個の間の単離胎盤細胞を静脈内に投与することを含む。より具体的な実施形態では、前記投与は、約９×１０８個の単離胎盤細胞または約１．８×１０９個の単離胎盤細胞を静脈内に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、約５×１０７個と１×１０８個の間の単離胎盤細胞を頭蓋内に投与することを含む。より具体的な実施形態では、前記投与は、約９×１０７個の単離胎盤細胞を頭蓋内に投与することを含む。
別の具体的な実施形態では、前に記載した治療方法は、第２の治療剤を前記個体に投与することを含む。より具体的な実施形態では、前記第２の治療剤は神経保護薬である。より具体的な実施形態では、前記第２の治療剤は、ＮＸＹ−０５９（フェニルブチルニトロンのジスルホニル誘導体：２ナトリウム４−（（ｔｅｒｔ−ブチリミノ）−メチル）ベンゼン−１，３−ジスルホネートＮ−オキシド、または２ナトリウム４−（（オキシド−ｔｅｒｔ−ブチル−アザニウミリデン）メチル）ベンゼン−１，３−ジスルホネート；ジスフェントンとしても知られる）である。別のより具体的な実施形態では、第２の治療剤は血栓溶解薬である。より具体的な実施形態では、前記血栓溶解薬は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である。脳内または脳周辺の血流の混乱が出血である実施形態では、第２の治療剤は、降圧薬、例えばβ遮断薬または利尿薬、利尿薬とカリウム保持性利尿薬の組合せ、β遮断薬と利尿薬の組合せ、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿薬、アンギオテンシン−ＩＩアンタゴニストおよび利尿薬、および／またはカルシウムチャネルブロッカーとＡＣＥ阻害剤の組合せであってよい。別のより具体的な実施形態では、第２の治療剤は、カルシウムチャネルブロッカー、グルタミン酸アンタゴニスト、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーである。
治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の２１〜３０日以内、例えば第２１日に、例えば脳卒中、酸素欠乏障害または低酸素障害の症状の発生の２１〜３０日以内、例えば第２１日に、前記個体に投与する。治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の１４日以内に、前記個体に投与する。治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の７日以内に、前記個体に投与する。治療方法の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の４８時間以内に、前記個体に投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の２４時間以内に、前記個体に投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の１２時間以内に、前記個体に投与する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞を、前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の３時間以内に、前記個体に投与する。
３．１ 定義
本明細書で使用する用語「約」は、言及する数値を指すとき、その言及する数値のプラスマイナス２０％以内の値を示す。
本明細書で使用する用語「酸素欠乏障害」は、脳またはＣＮＳの領域への酸素の全体的欠如によって引き起こされる障害、例えば神経障害または症状障害を指す。
本明細書で使用する用語「低酸素障害」は、脳またはＣＮＳの領域への酸素の部分的欠如によって引き起こされる障害、例えば神経障害または症状障害を指す。
本明細書で使用する用語「ＳＨ２」は、細胞マーカーＣＤ１０５上のエピトープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ２＋と呼ぶ細胞はＣＤ１０５＋である。
本明細書で使用する用語「ＳＨ３」および「ＳＨ４」は、細胞マーカーＣＤ７３上のエピトープと結合する抗体を指す。したがって、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と呼ぶ細胞はＣＤ７３＋である。
胎盤はその中で発育する胎児の遺伝子型を有するが、妊娠中母親の組織とも物理的に近接している。このように、本明細書で使用する用語「胎児の遺伝子型」は、胎児の遺伝子型、例えば胎児を有する母親の遺伝子型ではなく、そこから本明細書に記載の特定の単離胎盤細胞を得る胎盤と関係がある胎児の遺伝子型を意味する。本明細書で使用する用語「母方の遺伝子型」は、胎児、例えばそこから本明細書に記載の特定の単離胎盤細胞を得る胎盤と関係がある胎児を有する母親の遺伝子型を意味する。
本明細書で使用する用語「単離細胞」、例えば「単離幹細胞」は、幹細胞が由来する組織、例えば胎盤の、他の異なる細胞から実質的に分離された細胞を意味する。細胞、例えば幹細胞と本来結合していた非幹細胞、または異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が、幹細胞の回収および／または培養中にその幹細胞から除去される場合、細胞は「単離」されている。
本明細書で使用する「多分化能」は、細胞を指すとき、細胞が、必ずしも全てではないがいくつかの身体の細胞型、または全てではないがいくつかの身体の細胞型の特性を有する細胞に、分化する能力を有することを意味する。特定の実施形態では、例えば、神経形成、軟骨形成または骨形成原細胞の特性を有する細胞に分化する能力を有する単離胎盤細胞が、多分化能細胞である。
本明細書で使用する用語「単離細胞の集団」は、細胞の集団が由来する組織、例えば胎盤の他の細胞から実質的に分離された細胞の集団を意味する。
本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」は、形態、細胞表面マーカー、または初代培養後の継代数とは無関係に、哺乳動物の胎盤に由来する幹細胞または前駆細胞を指す。しかしながら、本明細書で使用する用語「胎盤幹細胞」は、栄養膜細胞、血管芽細胞、血液芽細胞、胚生殖細胞、胚幹細胞、胚盤胞の内部細胞塊から得られる細胞、または後期胚の胚生殖隆起から得られる細胞、例えば胚生殖細胞を指さず、しかしながら、胎盤幹細胞はこれらではない。細胞が幹細胞の属性、例えば、１つまたは複数の型の幹細胞と関係があるマーカーまたは遺伝子発現プロファイル、培養中に少なくとも１０〜４０回複製する能力、および３つの生殖層の１つまたは複数の分化細胞の特性を示す細胞に分化する能力を示す場合、細胞は「幹細胞」であると考えられる。用語「胎盤幹細胞」と「胎盤由来幹細胞」は交互に使用することができる。本明細書で他に記さない限り、用語「胎盤」は臍帯を含む。本明細書で開示する単離胎盤細胞は、特定の実施形態では、分化条件下でのｉｎ ｖｉｔｒｏで分化する、ｉｎ ｖｉｖｏで分化する、または両方である。
本明細書で使用するように、胎盤細胞は、そのマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能であるとき特定のマーカーに「陽性」である。例えば、胎盤細胞は例えばＣＤ７３に陽性である。ＣＤ７３は、（例えば、アイソタイプ対照と比較して）バックグラウンドを超える検出可能な量で、胎盤細胞において検出可能であるからである。マーカーを使用して少なくとも１つの他の細胞型と細胞を区別することができるとき、または、存在時または細胞によって発現されるとき、マーカーを使用して細胞を選択または単離することができるときも、細胞はそのマーカーに陽性である。例えば抗体仲介の検出の状況で、特定の細胞表面マーカーが存在する指標としての「陽性」は、そのマーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を使用してマーカーが検出可能であることを意味する。「陽性」は、例えばサイトメーターにおいて、バックグラウンドを超えて検出可能であるシグナルを生成する量で、そのマーカーを示す細胞も指す。例えば、ＣＤ２００に特異的な抗体で細胞が検出可能に標識され、抗体からのシグナルが対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）のそれより検出可能に高い場合、細胞は「ＣＤ２００＋」である。逆に、同じ状況での「陰性」は、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）と比較して、そのマーカーに特異的な抗体を使用して細胞表面マーカーが検出不能であることを意味する。例えば、対照（例えば、バックグラウンドまたはアイソタイプ対照）より高い程度でＣＤ３４に特異的な抗体を用いて細胞を再現的に検出可能に標識できない場合、細胞は「ＣＤ３４−」である。抗体を使用して検出されない、または検出不能なマーカーは、適切な対照を使用する同様の形式で、陽性または陰性であると決定する。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、スロットブロットなどのＲＮＡを検出する方法によって決定される、細胞または細胞集団由来のＲＮＡ中で検出されるＯＣＴ−４のＲＮＡの量が、バックグラウンドを超えて検出可能である場合、その細胞または細胞集団はＯＣＴ−４＋であると決定することができる。本明細書で他に記さない限り、分化集団（「ＣＤ」）マーカーは抗体を使用して検出する。特定の実施形態では、ＯＣＴ−４がＲＴ−ＰＣＲを使用して検出可能である場合、ＯＣＴ−４が存在すると決定され、細胞は「ＯＣＴ−４＋」である。
本明細書で使用する「治療」は、疾患、障害または状態、またはその任意のパラメーターもしくは症状の治癒、修復、改善、重度低下、または経時変化の低減を含む。
高度身体変動試験の結果の図である。垂直軸：バイアス率の変動活性。水平軸：変動活性を評価する日にち。ベースラインは、虚血誘導前のバイアス率の変動活性である。バイアス率の変動活性は、単離胎盤細胞を頭蓋内に投与する前に梗塞後第２日で、ならびに再度梗塞後第７日および第１４日でも評価した。生存４００Ｋ：４×１０５個の生存単離胎盤細胞。非生存：非生存胎盤幹細胞。ＣｓＡ：シクロスポリンＡ。 ベダーソン試験の結果の図である。垂直軸：平均神経障害値。水平軸：神経障害を評価する日にち。ベースラインは虚血誘導前の神経障害であり、０は障害がないことを示す。平均神経活性は、単離胎盤細胞投与時の梗塞後第２日で、ならびに再度梗塞後第７日および第１４日でも評価した。生存４００Ｋ：４×１０５個の生存単離胎盤細胞。非生存：非生存胎盤幹細胞。ＣｓＡ：シクロスポリンＡ。 高度身体変動試験の結果の図である。垂直軸：バイアス率の変動活性。水平軸：変動活性を評価する日にち。ベースラインは、虚血誘導前のバイアス率の変動活性である。バイアス率の変動活性は、単離胎盤細胞を静脈内に投与時の梗塞後第２日で、ならびに再度梗塞後第７日および第１４日でも評価した。非生存：非生存胎盤幹細胞。４×１０５、１×１０６、４×１０６または８×１０６個の生存単離胎盤細胞を投与した（凡例）。 ベダーソン試験の結果の図である。垂直軸：平均神経障害値。水平軸：神経障害を評価する日にち。ベースラインは虚血誘導前の神経障害であり、０は障害がないことを示す。平均神経活性は、単離胎盤細胞の静脈内投与時の梗塞後第２日で、ならびに再度梗塞後第７日および第１４日でも評価した。非生存：非生存胎盤幹細胞。４×１０５、１×１０６、４×１０６または８×１０６個の生存単離胎盤細胞を投与した（凡例）。 修正神経系重度値の試験の結果の図である。Ｙ軸：値（スコアリング法に関しては表１参照）。Ｘ軸：中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）外科手術後の日数。ＰＤＡ：胎盤幹細胞；ＦＢＣ−対照：線維芽細胞対照；デキストラン、細胞を含まない対照；１ＰＤＡ、１×１０６個の細胞；４ＰＤＡ、４×１０６個の細胞；８ＰＤＡ、８×１０６個の細胞。Ｒｘ：細胞またはデキストランの投与。 接着性除去の体性感覚試験の結果の図である。Ｙ軸：接着性被験物質の除去に関する秒数。Ｘ軸：中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）外科手術後の日数。ＰＤＡ：胎盤幹細胞；ＦＢＣ−対照：線維芽細胞対照；デキストラン、細胞を含まない対照；１ＰＤＡ、１×１０６個の細胞；４ＰＤＡ、４×１０６個の細胞；８ＰＤＡ、８×１０６個の細胞。Ｒｘ：細胞またはデキストランの投与。 フットフォルト試験の結果の図である。Ｙ軸：金属製グリッド上での１００ステップ中のフットフォルト率。Ｘ軸：治療（Ｒｘ）、フットフォルト試験実施後の日数。＊：４×１０６個の胎盤幹細胞（ＰＤＡ−４Ｍ）および賦形剤対照を与えた動物に関するフットフォルト試験の有意な（ｐ＜０．０５）改善。＃：４×１０６個の胎盤幹細胞（ＰＤＡ−４Ｍ）および線維芽細胞対照を与えた動物に関するフットフォルト試験の有意な（ｐ＜０．０５）改善。 中大脳動脈閉塞後、治療後第５６日での血管新生測定の図である。胎盤幹細胞治療は、虚血境界域（ＩＢＺ）中の内皮細胞増殖、ならびに血管密度および血管周辺の長さを有意に増大させる。Ｎ＝１０／群。 （Ａ）パラフィン処理した脳切片で検出した抗ＢｒｄＵ抗体染色の図である。Ｙ軸：虚血性病変の境界域におけるＢｒｄＵ陽性内皮細胞（ＥＣ）の割合。Ｘ軸：実験条件（ＭＣＡｏ−Ｄｅｘ：中大脳動脈閉塞−デキストラン（初期条件、前治療）；細胞−対照：線維芽細胞の投与；ＰＤＡ−４Ｍ：４×１０６個の胎盤幹細胞の投与）。＃：ＰＤＡ−４Ｍ条件および線維芽細胞対照における内皮細胞増殖の有意な（ｐ＜０．０５）増大。＊：ＰＤＡ−４Ｍ条件およびデキストラン（賦形剤）対照における内皮細胞増殖の有意な（ｐ＜０．０５）増大。 （Ｂ）胎盤幹細胞を用いた治療後の、虚血境界域中の血管密度の図である。Ｙ軸：１ｍｍ３当たりの血管数。Ｘ軸：実験条件（ＭＣＡｏ−Ｄｅｘ：中大脳動脈閉塞−デキストラン（初期条件、前治療）；細胞−対照：線維芽細胞の投与；ＰＤＡ−４Ｍ：４×１０６個の胎盤幹細胞の投与）。＃：ＰＤＡ−４Ｍ条件および線維芽細胞対照における血管密度の有意な（ｐ＜０．０５）増大。＊：ＰＤＡ−４Ｍ条件およびデキストラン（賦形剤）対照における血管密度の有意な（ｐ＜０．０５）増大。 （Ｃ）虚血境界域近辺の血管周辺の長さの増大の図である。Ｙ軸：血管周辺の長さ、ミリメートル単位；Ｘ軸：実験条件（ＭＣＡｏ−Ｄｅｘ：中大脳動脈閉塞−デキストラン（初期条件、前治療）；細胞−対照：線維芽細胞の投与；ＰＤＡ−４Ｍ：４×１０６個の胎盤幹細胞の投与）。＃：ＰＤＡ−４Ｍ条件および線維芽細胞対照における血管周辺の長さの有意な（ｐ＜０．０５）増大。＊：ＰＤＡ−４Ｍ条件およびデキストラン（賦形剤）対照における血管周辺の長さの有意な（ｐ＜０．０５）増大。 胎盤幹細胞治療が、虚血脳の虚血境界域におけるシナプトフィジン発現を有意に増大させる図である。Ｎ＝１０／群。Ｙ軸：シナプトフィジンを検出するパラフィン処理した脳切片中の調べた領域の割合。Ｘ軸：実験条件。ＭＣＡｏ：中大脳動脈閉塞時のシナプトフィジン発現；細胞−対照：線維芽細胞の投与；ＰＤＡ−４Ｍ：４×１０６個の胎盤幹細胞の投与）。＊：ＰＤＡ−４Ｍおよび線維芽細胞対照におけるシナプトフィジン発現領域の有意な増大。
５．詳細な説明
５．１ 脳内または脳周辺の血流の混乱の治療
個体の脳内または脳周辺の血流の混乱を有する個体を治療する方法、例えば個体の脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の１つまたは複数の症状または神経障害を治療する方法であって、治療有効量の単離組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞を個体に投与することを含み、前記単離胎盤細胞が多分化能細胞または幹細胞の特性を有し、前記単離胎盤細胞が骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、または臍帯血、胎盤血、または末梢血から得られる間葉系細胞ではない方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、障害は低酸素障害または酸素欠乏障害である。特定の実施形態では、本明細書で提供するように、前記治療有効量は、前記個体によって示される個体の脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の１つまたは複数の症状または神経障害の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす量である。
具体的な実施形態では、１つまたは複数の症状または神経障害、例えば脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害の症状は、少なくとも部分的に、または完全に、血流の混乱後の再灌流障害が原因である。本明細書で使用する「再灌流障害」は、中断された血液供給が虚血期後に組織に戻るときに引き起こされる組織損傷を指す。虚血中の血液によって運ばれる酸素および栄養素の不在は、循環の回復が正常機能の回復ではなく、炎症および酸化ストレスの誘導による酸化損傷をもたらす条件を生み出す。
本明細書で使用する用語「脳内または脳周辺の血流の混乱」は、このような混乱の治療の文脈において、混乱を有する個体によって示される１つまたは複数の症状の治療、および混乱が原因である個体における神経障害、例えば脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害の１つまたは複数の症状の治療を含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の症状は、虚血自体が主に、または完全に原因である１つまたは複数の症状である。特定の他の実施形態では、１つまたは複数の症状は、例えば虚血と関係がある再灌流障害が、主に、または完全に原因である１つまたは複数の症状である。
５．２ 脳卒中
本明細書で提供する方法によって治療可能である、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱は、罹患した個体において１つまたは複数の検出可能な症状または神経障害を引き起こす任意の血流の混乱であり得る（以下参照）。特定の実施形態では、血流の混乱は、脳卒中、例えば虚血性脳卒中または出血性脳卒中、例えば頭蓋内出血である。特定の他の実施形態では、血流の混乱は、脳の外側の出血、例えば硬膜血腫、硬膜下血腫またはくも膜下血腫である。特定の他の実施形態では、血流の混乱は一過性、例えば一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）である。特定の他の実施形態では、血流の混乱は血管痙攣である。具体的な実施形態では、脳内の血流の混乱は大脳内で起こる。より具体的な実施形態では、混乱は大脳の頭頂葉、前頭葉、側頭葉、または後頭葉内で起こる。別の具体的な実施形態では、混乱は小脳内で起こる。別の具体的な実施形態では、混乱は脳幹または脊柱内で起こる。特定の実施形態では、混乱は低酸素障害または酸素欠乏障害を引き起こす。
一実施形態では、本明細書、例えば以下のセクション５．４．２に記載の、治療有効量の単離組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を前記個体に投与することを含む、低酸素障害または酸素欠乏障害、例えば脳卒中（例えば、脳卒中犠牲者）に罹患した個体を治療する方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記治療有効量は、前記個体によって示される脳卒中の１つまたは複数の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす量である。単離胎盤細胞、例えば、複数の単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の単離集団は、本明細書の他の箇所、例えば以下のセクション５．４．２に記載の任意の単離胎盤細胞であってよい。
本明細書で提供する方法によって治療可能である脳卒中は、任意の原因に起因し得る脳卒中であってよい。具体的な実施形態では、脳卒中は虚血性脳卒中である。より具体的な実施形態では、虚血性脳卒中は血栓性脳卒中または塞栓性脳卒中である。別の具体的な実施形態では、脳卒中は全身灌流低下、すなわち身体の全部分への血流の低下によるものであり、または静脈血栓症によるものである。他の具体的な実施形態では、虚血性脳卒中は、心臓の細動、例えば心房細動、発作性心房細動、リウマチ性疾患、僧帽弁または大動脈弁疾患、人工心臓弁、心臓の心房または心室血栓、洞不全症候群、持続性心房細動、心筋梗塞、２８パーセント未満の駆出率を伴う慢性心筋梗塞、３０パーセント未満の駆出率を伴う症候性うっ血性心不全、心筋症、心内膜炎、例えばリブマンサックス心内膜炎、マランティック心内膜炎または感染性心内膜炎、乳頭状弾性線維腫、左房粘液腫、冠動脈バイパス移植術、僧帽弁輪石灰化、卵円孔開存症、心房中隔動脈瘤、血栓がない左心室動脈瘤、僧帽弁狭窄症または心房細動がない心エコー検査における単離左心房の「スモーク」、および／または上行大動脈または近位大動脈における複合アテロームによって引き起こされる。
別の具体的な実施形態では、脳卒中は出血性脳卒中である。より具体的な実施形態では、出血性脳卒中は、脳実質内出血（脳内の血液漏出）によって引き起こされる。別のより具体的な実施形態では、前記出血性脳卒中は、脳実質外出血（頭蓋骨内、ただし脳外の出血）によって引き起こされる。より具体的な実施形態では、脳卒中は、実質内出血、脳室内出血（心室系における出血）、硬膜外血腫（硬膜と頭蓋骨の間の出血）、硬膜下血腫（硬膜下腔における出血）、またはくも膜下出血（くも膜と軟膜の間）によって引き起こされる。大部分の出血性脳卒中症候群は特異的症状（例えば、頭痛、前頭障害）を有する。他のより具体的な実施形態では、出血性脳卒中は、高血圧、外傷、出血障害、アミロイド血管症、違法薬物使用（例えば、アンフェタミンまたはコカイン）、または血管奇形によって引き起こされる、またはそれらと関係がある。
別の実施形態では、個体の脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体を治療する方法、例えば個体の脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱が原因の１つまたは複数の症状または神経障害を治療する方法であって、治療有効量の単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を前記個体に投与することを含み、前記血流の混乱が、脳卒中以外の直接原因、例えば閉鎖性頭部外傷または非衝撃関連血腫から生じる方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、前記治療有効量は、前記個体によって示される１つまたは複数の混乱の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす量である。脳卒中に関して、単離胎盤細胞は、本明細書の他の箇所、例えば以下のセクション５．４．２に記載の任意の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞であってよい。
前述のように、特定の実施形態では、本明細書で提供する治療方法は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱、または脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱が原因の神経障害、例えば、脳卒中、例えば低酸素障害もしくは酸素欠乏障害を引き起こす血腫の１つまたは複数の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす。具体的な実施形態では、前記症状または神経障害は、片麻痺（身体の片側の麻痺）、片側不全麻痺（身体の片側の弱化）、顔面の筋力低下、しびれ、感覚の低下、嗅覚、味覚、聴覚、または視覚の変化、嗅覚、味覚、聴覚、または視覚の消失、眼瞼下垂（下垂症）、眼筋の弱化、咽頭反射の低下、飲み込む能力の低下、光に対する瞳孔反応性の低下、顔面の感覚低下、バランスの低下、眼振、呼吸数の変化、心拍数の変化、頭部を片側に向ける能力が低いまたはそれが不可能な胸鎖乳突筋の弱化、舌の弱化、失語症（言語を話すまたは理解することができないこと）、失行症（随意運動の変化）、視野欠損、記憶障害、半側無視または半側空間無視（損傷反対の視野側の空間に対する配慮の障害）、支離滅裂な思考、混乱状態、性欲過剰行為の発生、疾病失認（障害の存在が絶えず認識できないこと）、歩行困難、運動協調の変化、めまい、不均衡、意識失調、頭痛、および／または嘔吐を含む。
脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の重度、例えば脳卒中、または脳卒中症状および／または脳卒中が原因である神経障害の重度は、１つまたは複数の広く容認されている神経機能スケールを使用して評価することができる。
例えば、一実施形態では、本明細書で提供するのは、個体の脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体、例えば個体の脳内または脳周辺の血流の混乱が原因の症状または神経障害、例えば低酸素障害または酸素欠乏障害を有する個体を治療する方法であって、治療有効量の単離ヒト接着性胎盤細胞を前記個体に投与することを含み、前記治療有効量は、修正ランキンスケール、ＮＩＨ脳卒中スケール、カナダ神経スケール（ＣＮＳ）、グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）、ヘンピスフェリック脳卒中スケール、Ｈｕｎｔ ＆ Ｈｅｓｓのスケール、マシュー脳卒中スケール、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、オルゴゴゾ脳卒中スケール、オクスフォードシャーコミュニティ脳卒中プロジェクト分類（Ｂａｍｆｏｒｄ）、スカンジナビア脳卒中スケール、日本式昏睡尺度（ＪＣＳ）、バーセルインデックスおよび／または日本脳卒中スケール（ＪＳＳ）の１つまたは複数により評価して、個体の神経機能の検出可能な、または検出可能かつ持続的な改善をもたらすのに十分な胎盤細胞の量である方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、改善は、初期評価後、および単離胎盤細胞の１回または複数回の投与後、１、２、３、４、５、または６日以内、または１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１または１２週間以内に検出可能である。他の具体的な実施形態では、前記初期評価は、脳卒中の１つまたは複数の症状の発生後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３時間以内、または１、２、３、４または５日以内に実施する。しかしながら他の実施形態では、測定される改善は、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月、または１、２、３、４、５年以上にわたり持続する。
５．３ 単離胎盤細胞の投与
本明細書で提供する治療方法において使用する単離胎盤細胞は、任意の医学的に認められている方法または経路によって、個体の脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱によって引き起こされる、またはそれが原因である１つまたは複数の症状または神経障害を示す個体に投与することができる。一実施形態では、治療有効量の単離胎盤細胞を個体の頭蓋内、例えば個体の罹患した脳またはＣＮＳ中の虚血または出血部位に投与する。頭蓋内投与用に、脳卒中部位（例えば患部）を、例えばＣＴスキャン、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）（例えばＴ１−、Ｔ２−、拡散−および／または灌流加重ＭＲ）、コバルト−５５ポジトロン放射断層撮影法、または類似の技法によって目に見える状態にすることができる。別の実施形態では、前記単離胎盤細胞を個体に静脈内または動脈内投与する。他の実施形態では、治療有効量の単離胎盤細胞を個体に筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、眼内または非経口投与する。単離胎盤細胞はボーラス注射によって、または静脈内注入によって投与することができる。具体的な実施形態では、前記静脈内注入は約１〜約８時間にわたる静脈内注入である。特定の実施形態では、経路の組合せ、例えば頭蓋内と静脈内注入によって単離胎盤細胞を個体に投与する。
単離胎盤細胞の治療有効量は、個体の年齢および／または大きさ、および虚血領域の概算体積に応じて変わる可能性がある。虚血領域の概算体積および位置は、例えば、一連の磁気共鳴映像法の映像またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャンによって推定することができる。
例えば一回用量で投与する単離胎盤細胞の数は、投与当たり、例えば約、または少なくとも１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１もしくは５×１０１１個またはそれより多くの単離胎盤細胞であってよい。具体的な実施形態では、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱に罹患した個体、例えば脳卒中、酸素欠乏障害または低酸素障害に罹患した個体に、約５×１０７個と約３×１０９個の間の単離胎盤細胞を静脈内投与することができる。より具体的な実施形態では、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱に罹患した個体、例えば脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害に罹患した個体に、約９×１０７個の単離胎盤細胞、約３．６×１０８個の単離胎盤細胞、約９×１０８個の単離胎盤細胞、または約１．８×１０９個の単離胎盤細胞を静脈内投与することができる。別の具体的な実施形態では、一回用量の約２×１０８個の単離胎盤細胞を個体に静脈内投与する。別の具体的な実施形態では、一回用量の約８×１０８個の単離胎盤細胞を個体に静脈内投与する。別の具体的な実施形態では、それぞれが約２×１０８個の単離胎盤細胞を含む二回用量を、個体に静脈内投与する。別の具体的な実施形態では、それぞれが約８×１０８個の単離胎盤細胞を含む二回用量を、個体に静脈内投与する。他のより具体的な実施形態では、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱に罹患した個体、例えば脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害に罹患した個体に、約５×１０７個と１×１０８個の間の単離胎盤細胞を頭蓋内投与することができる。より具体的な実施形態では、約９×１０７個の単離胎盤細胞を前記個体に頭蓋内投与する。
脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱、混乱、および／または混乱が原因である神経障害の症状に罹患した個体には、治療の行程中１回、または１回より多く、例えば２回以上、単離胎盤細胞を投与することができる。単離胎盤細胞は、例えば約１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１０００μＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、３．５ｍＬ、４ｍＬ、４．５ｍＬ、５ｍＬ、５．５ｍＬ、６．０ｍＬ、６．５ｍＬ、７ｍＬ、７．５ｍＬ、８ｍＬ、８．５ｍＬ、９ｍＬ、９．５ｍＬ、１０ｍＬ、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬ、１５ｍＬ、１６ｍＬ、１７ｍＬ、１８ｍＬ、１９ｍＬ、２０ｍＬ、２１ｍＬ、２２ｍＬ、２３ｍＬ、２４ｍＬ、２５ｍＬ、２６ｍＬ、２７ｍＬ、２８ｍＬ、２９ｍＬ、または約３０ｍＬの薬剤として許容される溶液中に、頭蓋内投与に適した体積で投与することができる。静脈内投与用に、複数の単離胎盤細胞（例えば、約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１もしくは５×１０１１個の）単離胎盤細胞を、例えば静脈内注入によって、例えば約、または最大１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬ、５５０ｍＬ、６００ｍＬ、６５０ｍＬ、７００ｍＬ、７５０ｍＬ、８００ｍＬ、８５０ｍＬ、９００ｍＬ、９５０ｍＬ、１０００ｍＬ、１．１Ｌ、１．２Ｌ、１．３Ｌ、１．４Ｌ、または１．５Ｌ中に送達することができる。
他の実施形態では、個体（例えば、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱、または再灌流障害によって引き起こされる、またはそれが原因である１つまたは複数の症状または神経障害を有する個体）１キログラム当たり約１×１０６個と約２×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約２×１０６個と約３×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約３×１０６個と約４×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約４×１０６個と約５×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約５×１０６個と約６×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約６×１０６個と約７×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約７×１０６個と約８×１０６個の間の単離胎盤細胞、前記個体１キログラム当たり約８×１０６個と約９×１０６個の間の単離胎盤細胞、または前記個体１キログラム当たり約９×１０６個と約１×１０７個の間の単離胎盤細胞を、前記個体に投与する。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１×１０７個と約２×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり約１．３×１０７個と約１．５×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、前記個体１キログラム当たり最大約３×１０７個の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。別の具体的な実施形態では、前記投与は、約２０ミリリットル溶液中に約１５×１０７個の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。好ましい実施形態では、単離胎盤細胞の投与は、最大約１リットル溶液中にレシピエント１キログラム当たり最大７．５×１０６個の単離胎盤細胞を投与することを含む。具体的な実施形態では、前記投与は、約５×１０６個と約２×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に、例えば頭蓋内投与することを含む。具体的な実施形態では、前記投与は、１キログラム当たり約５×１０６個と約３×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に例えば頭蓋内投与することを含み、前記細胞は１０％デキストラン、５％ヒト血清アルブミン、および場合によっては免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡを含む溶液中に含有される。別の具体的な実施形態では、前記投与は、約１×１０９個と約３×１０９個の間の胎盤多分化能細胞を前記個体に投与することを含み、前記細胞は１０％デキストラン、５％ヒト血清アルブミン、および場合によっては免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡを含む溶液中に含有される。別の具体的な実施形態では、前記投与は、約２０ミリリットル溶液中に約１５×１０７個と約２５×１０７個の間の単離胎盤細胞を前記個体に投与することを含む。任意の前述の実施形態では、例えばボーラスまたは点滴として、単離胎盤細胞を静脈内または頭蓋内投与することができる。さらに別の具体的な実施形態では、前記投与は、約２０ミリリットル溶液中に約２億個の細胞を前記個体に投与することを含む。
単離胎盤細胞は、任意の医学的に認められている時間の間注入することができる。様々な実施形態では、例えば、前に記載した数の単離胎盤細胞を、約、または最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５分の行程にわたり、または約、または最大１時間、または１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５もしくは６時間の行程にわたり、例えば静脈内または頭蓋内投与、例えば注入することができる。
単離胎盤細胞は、個体中の個体の混乱が原因である、神経障害、例えば低酸素障害または酸素欠乏障害の１つまたは複数の症状の発生後の任意の時間で、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体に投与することができる。様々な実施形態では、単離胎盤細胞は、個体によって示される第一の症状または神経障害発生の最初の２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日以内に投与し、好ましくは、単離胎盤細胞は、個体における第一の検出可能な症状または神経障害発生の最初の４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、２１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２時間以内、または個体における第一の検出可能な症状または神経障害発生の最初の１時間以内に投与する。
他の実施形態では、単離胎盤細胞を予防的に、例えば脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の前記混乱の１つまたは複数の症状、脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害の症状の前に投与する、または検出可能である。
個体に単離胎盤細胞を投与することを含む、個体の脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体の治療は、１つまたは複数の第２の治療剤を個体に投与することをさらに含むことができる。このような第２の治療剤は、単離胎盤細胞の投与前、単離胎盤細胞の投与中、または単離胎盤細胞の投与後に投与することができる。前記第２の治療剤は、単離胎盤細胞を投与する回数より少ない、より多い、または同数を投与することができる。
第２の治療剤は、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体に対して治療的有効性がある、任意の作用物質であってよい。一実施形態では、治療剤は、脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害を治療するために使用する作用物質、例えば薬剤である。具体的な実施形態では、第２の治療剤は神経保護薬である。具体的な実施形態では、神経保護薬はジスフェントンナトリウム（ＮＸＹ−０５９；フェニルブチルニトロンのジスルホニル誘導体）であり、その構造は以下に示す：
Figure 0005950577
個体が出血性脳卒中に罹患している別の実施形態では、第２の治療剤は、前記個体の血圧を低下させる治療剤である。別の実施形態では、第２の治療剤は血栓溶解薬である。具体的な実施形態では、血栓溶解薬は組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である。ｔＰＡは天然源由来または組換え体であってよい。より具体的な実施形態では、個体における１つまたは複数の症状または神経障害の発生後の、最初の３時間以内にｔＰＡを投与する。別のより具体的な実施形態では、脳卒中犠牲者における脳卒中の１つまたは複数の症状の発生後の、最初の３時間後にｔＰＡを投与する。特定の実施形態では、血栓溶解薬の使用は、例えば脳卒中犠牲者が頭部障害を有するとき、または脳卒中が頭部障害によって引き起こされるとき禁忌である。別の具体的な実施形態では、第２の治療剤は抗凝固薬または抗血小板薬である。脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱が出血である実施形態では、第２の治療剤は、降圧薬、例えばβ遮断薬または利尿薬、利尿薬とカリウム保持性利尿薬の組合せ、β遮断薬と利尿薬の組合せ、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿薬、アンギオテンシン−ＩＩアンタゴニストおよび利尿薬、および／またはカルシウムチャネルブロッカーとＡＣＥ阻害剤の組合せであってよい。別の実施形態では、第２の治療剤を投与して頭蓋内圧を低下させる。より具体的な実施形態では、第２の治療剤は利尿薬である。
投与する単離胎盤細胞が脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体と同種ではない実施形態では、第２の治療剤は免疫抑制剤であってよい。免疫抑制剤は当技術分野でよく知られており、例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル、またはその抗体断片もしくは誘導体、例えばムロモナブ−ＣＤ３）、抗ＩＬ−２受容体抗体（例えばバシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））またはダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ）（登録商標））、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノレートモフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤などを含む。具体的な実施形態では、免疫抑制剤は、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１αまたはＭＩＰ−１βに対する中和抗体である。好ましくは、抗ＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１β抗体は、例えば投与時に、前記個体中のＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βの量の検出可能な低減を引き起こすのに十分な量で投与する。
５．４ 単離胎盤細胞および単離胎盤細胞集団
血流の混乱が原因の症状および神経障害を含めた、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体の治療に有用な単離胎盤細胞は、組織培養基質と接着し多分化能細胞または幹細胞の特性を有するが、トロホブラストではない、胎盤またはその一部分から入手可能な細胞である。特定の実施形態では、本明細書で開示する方法において有用な単離胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。本明細書で開示する方法において有用な単離胎盤細胞は、胎児起源または母方起源のいずれかであってよい（すなわち、それぞれ胎児または母親のいずれかの遺伝子型を有してよい）。単離胎盤細胞および単離胎盤細胞の集団は胎児起源であることが好ましい。本明細書で使用する語句「胎児起源」または「非母方起源」は、単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団が、胎児と関係がある、すなわち胎児の遺伝子型を有する臍帯または胎盤構造から得られることを示す。本明細書で使用する語句「母方起源」は、細胞または細胞の集団が、母親と関係がある、例えば母方の遺伝子型を有する胎盤構造から得られることを示す。単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、胎児または母方起源のみである単離胎盤細胞を含むことができ、または胎児と母方両方の起源の単離胎盤細胞の混合集団を含むことができる。単離胎盤細胞、および単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、以下で論じる形態、マーカー、および培養特性によって同定および選択することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、レシピエント、例えば脳卒中を有する個体、または脳卒中の症状を有する個体と同種である。特定の他の実施形態では、本明細書に記載の任意の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、レシピエント、例えば脳卒中を有する個体、または脳卒中の症状を有する個体と異種である。
５．４．１ 物理的および形態特性
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、初代培養または細胞培養において培養すると、組織培養基質、例えば組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）、または細胞外マトリクスまたはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチンなどのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーティングした組織培養表面と接着する。培養中の単離胎盤細胞は一般に線維芽細胞様、星状の外見を呈し、いくつかの細胞質突起が中心細胞体から広がる。しかしながら、これらの細胞は、同じ条件下で培養した線維芽細胞と形態学的に区別することができる。単離胎盤細胞は、線維芽細胞より多数のこのような突起を示すからである。形態学的に、単離胎盤細胞は、一般に培養中により円形の、または敷石状の形態を呈する造血幹細胞とも区別することができる。
特定の実施形態では、本明細書で開示する治療方法に有用な単離胎盤細胞は、増殖培地で培養すると、胚様体を発生する。胚様体は、増殖する単離胎盤細胞の接着層の上部で増殖することができる不連続な細胞塊である。細胞の塊、胚性幹細胞の培養物から増殖する細胞の塊は胚様体と似ているので、用語「胚様」を使用する。増殖する単離胎盤細胞の培養物において胚様体が発生し得る増殖培地には、例えば、（例えばＧｉｂｃｏからの）ＤＭＥＭ−ＬＧ、（例えばＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓからの）２％ウシ胎児血清、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、（例えばＳｉｇｍａからの）１０−９Ｍのデキサメタゾン、（例えばＳｉｇｍａからの）１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート、（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ、および（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬを含む培地がある。
５．４．２ 細胞表面、分子および遺伝子マーカー
本明細書で開示する治療方法に有用な、単離胎盤細胞、例えば多分化能細胞または幹細胞、および単離胎盤細胞の集団は、多分化能細胞または幹細胞の特性を有する組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞であり、細胞、または幹細胞を含む細胞の集団を同定および／または単離するために使用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書に記載の単離胎盤細胞、および胎盤細胞集団（すなわち、２つ以上の単離胎盤細胞）は、胎盤、またはその任意の一部分（例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉など）から直接得られる、胎盤細胞および胎盤細胞含有細胞集団を含む。単離胎盤細胞集団は、培養中の単離胎盤細胞の集団（すなわち、２つ以上）、および容器、例えばバッグ中の集団も含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞は、骨髄由来間葉系細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、または臍帯血、胎盤血、または末梢血から得られる間葉系細胞ではない。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤幹細胞である。特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤多分化能細胞である。一実施形態では、単離胎盤細胞はフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ４５−およびＣＤ９０＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である、すなわち、細胞はＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらにＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。
具体的な実施形態では、前に記載したＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のいずれかはさらにＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、もしくはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。
別の実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、さらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの１つまたは複数である。別の実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
特定の実施形態では、細胞はＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−またはＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数である。単離胎盤細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）を発現することもできる。これらのマーカーは任意の組合せで使用して、単離胎盤細胞、例えば、単離胎盤幹細胞または単離多分化能細胞を同定すること、および単離胎盤細胞と他の細胞型を区別することができる。単離胎盤細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現することができるので、それらは間葉系幹細胞様の特性を有する可能性がある。例えばＣＤ３４、ＣＤ３８および／またはＣＤ４５の発現の欠如によって、非造血幹細胞として単離胎盤細胞を同定する。
本明細書でさらに提供するのは、本明細書で開示する治療方法に有用である、単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団である。単離胎盤細胞を含む好ましい細胞集団であって、本明細書で開示する治療方法に有用である細胞集団は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−胎盤細胞を含む、すなわち、前記集団中の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の細胞が単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前に記載したＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のいずれかはさらにＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞、または単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにＣＤ４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞を含む細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの、１つまたは複数である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、およびＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数、または全部である単離胎盤細胞であり、前記単離胎盤細胞は、胎盤組織の物理的および／または酵素による破壊によって得る。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、前記単離胎盤細胞は、以下の特性、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−の少なくとも１つを有する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋である。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−であり、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、ＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかであり、かつＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−の少なくとも１つである。別のより具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−であり、かつＳＨ２＋またはＳＨ３＋のいずれかである。
別の実施形態では、本明細書で開示する治療法に有用である単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、またはＣＤ４５−である。
別の実施形態では、本明細書で開示する治療法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋であり、前記単離胎盤細胞は、さらにＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、またはＳＳＥＡ４−である。
特定の実施形態では、本明細書で開示する治療方法、例えば、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療、脳卒中の治療に有用な単離胎盤細胞は、ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記幹細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋またはＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下での、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、幹細胞または多分化能細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤幹細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋幹細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。具体的な実施形態では、前記集団は、胎盤細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％が、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞であることが好ましい。前記細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞であることがより好ましい。単離集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の実施形態では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養したとき１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞集団は幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下でその集団を培養すると、単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約７０％が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％、９５％、または９９％が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。前記集団の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記胎盤幹細胞集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
特定の他の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、ＭＨＣ−Ｉ＋およびＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、およびＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋およびＡＢＣ−ｐ＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋およびＯＣＴ−４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−である。具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＳＳＥＡ３−、およびＳＳＥＡ４−胎盤細胞はさらにＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、およびＳＨ４＋である。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＯＣＴ−４＋およびＣＤ３４−であり、かつＳＨ３＋またはＳＨ４＋のいずれかである。別の実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ３４−であり、かつＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、またはＯＣＴ−４＋のいずれかである。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞はＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で単離細胞を含む胎盤細胞の集団を培養すると、この集団による１つまたは複数の胚様体の生成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。単離集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、細胞集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると１つまたは複数の胚様体を生成する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、単離ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下でその集団を培養すると、前記細胞を含む胎盤細胞の集団中の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団である。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＯＣＴ−４＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＯＣＴ−４＋およびＣＤ２００＋である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記単離ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋であり、胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、ＯＣＴ−４＋胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は、ＯＣＴ−４＋である単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、胚様体の形成を可能にする条件下で前記集団を培養すると、前記細胞を含む単離胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。様々な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団の少なくとも約７０％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。別の実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞である。前述の集団の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−またはＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ３４−、ＣＤ３８−およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記単離ＯＣＴ−４＋胎盤細胞はさらにＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記単離細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ１３３−およびＣＤ３４−胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団は母方の構成成分は実質的に含まず、例えば、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、９０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。
別の実施形態では、本明細書に記載治療方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−胎盤細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記単離胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離ＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ４５−、ＣＤ１１７−およびＣＤ１３３−胎盤細胞は非母方起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞の集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である、単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞が単離ＣＤ１０−、ＣＤ３３−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞集団は、単離ＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞を含む、例えばそれらが豊富である細胞の集団であり、前記細胞集団の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の細胞がＣＤ１０−、ＣＤ１３−、ＣＤ３３−、ＣＤ４５−、およびＣＤ１１７−胎盤細胞を含む。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらの特性を示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞はＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、およびＣＤ１３３−であり、さらにＣＤ１０＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋および／またはＨＬＡ−Ｇ＋、および／またはＣＤ１１７に陰性である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞集団は、単離胎盤細胞を含む細胞の集団であり、前記集団中の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％の細胞が、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ−、ＣＤ４５−、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３−であり、さらにＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇに陽性であり、および／またはＣＤ１１７に陰性である単離胎盤細胞である。具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、前記細胞ではない胎盤細胞から単離する。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、抗体結合により決定してＣＤ２００＋およびＣＤ１０＋である単離胎盤細胞、ならびに抗体結合とＲＴ−ＰＣＲの両方により決定してＣＤ１１７−である単離胎盤細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９−、ＣＤ５４＋、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＨＬＡクラス１−およびβ−２−マイクログロブリン−である単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である単離胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞マーカーの発現が間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）より少なくとも２倍高い胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は非母方起源である。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の前記細胞が非母方起源である。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、および／またはＰＤＬ１低の１つまたは複数である単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９＋およびＣＤ５４＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ４４＋およびＣＤ１０６＋である。別の具体的な実施形態では、単離胎盤細胞は少なくともＣＤ２９＋である。
別の実施形態では、本明細書に記載する治療方法に有用である細胞集団は単離胎盤細胞を含み、かつ前記細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＨＬＡ−Ｉ低、ＨＬＡ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、および／またはＰＤＬ１低の１つまたは複数である単離胎盤細胞である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２−Ｅ−、ＣＤ６２−Ｌ−、ＣＤ６２−Ｐ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１０３−、ＣＤ１０４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、β２−マイクログロブリン低、ＭＨＣ−Ｉ低、ＭＨＣ−ＩＩ−、ＨＬＡ−Ｇ低、およびＰＤＬ１低である。
別の実施形態では、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療において有用である単離胎盤細胞は、ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、およびＡＢＣ−ｐ＋の１つまたは複数、または全部である単離胎盤細胞であり、ＡＢＣ−ｐは胎盤特異的ＡＢＣ輸送タンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）としておよびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られる）であり、前記単離胎盤細胞は、哺乳動物、例えばヒト、臍帯血が流出しており灌流させて残留血液を除去した胎盤の灌流によって得られる。
遺伝子プロファイリングによって、単離胎盤細胞、および単離胎盤細胞の集団は、他の細胞、例えば間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞と区別することができることを確認する。本明細書で記載する単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づいて、例えば間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、単離胎盤細胞中、または特定の単離臍帯幹細胞中において有意に高い。特に、本明細書で提供す治療方法に有用である単離胎盤細胞は、１つまたは複数の遺伝子の発現に基づいて間葉系幹細胞と区別することができ、その発現は、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より単離胎盤細胞中で有意に高く（すなわち、少なくとも２倍高い）、細胞を同等条件下で増殖するとき、１つまたは複数の遺伝子は、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、ＺＣ３Ｈ１２Ａまたは前述の任意の組合せである。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号を参照のこと。より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、ＤＭＥＭ−ＬＧ（例えばＧｉｂｃｏからの）、２％ウシ胎児血清（例えばＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ．からの）、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（例えばＳｉｇｍａからの）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（例えばＳｉｇｍａからの）、表皮増殖因子１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの）を含む培地において約３〜約３５の集団倍加で培養すると、前記１つまたは複数の遺伝子を発現する。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞特異的または単離臍帯細胞特異的な遺伝子はＣＤ２００である。
これらの遺伝子に関する具体的な配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６１５（ＡＣＴＧ２）、ＢＣ０６５５４５（ＡＤＡＲＢ１）、（ＮＭ＿１８１８４７（ＡＭＩＧＯ２）、ＡＹ３５８５９０（ＡＲＴＳ−１）、ＢＣ０７４８８４（Ｂ４ＧＡＬＴ６）、ＢＣ００８３９６（ＢＣＨＥ）、ＢＣ０２０１９６（Ｃ１１またはｆ９）、ＢＣ０３１１０３（ＣＤ２００）、ＮＭ＿００１８４５（ＣＯＬ４Ａ１）、ＮＭ＿００１８４６（ＣＯＬ４Ａ２）、ＢＣ０５２２８９（ＣＰＡ４）、ＢＣ０９４７５８（ＤＭＤ）、ＡＦ２９３３５９（ＤＳＣ３）、ＮＭ＿００１９４３（ＤＳＧ２）、ＡＦ３３８２４１（ＥＬＯＶＬ２）、ＡＹ３３６１０５（Ｆ２ＲＬ１）、ＮＭ＿０１８２１５（ＦＬＪ１０７８１）、ＡＹ４１６７９９（ＧＡＴＡ６）、ＢＣ０７５７９８（ＧＰＲ１２６）、ＮＭ＿０１６２３５（ＧＰＲＣ５Ｂ）、ＡＦ３４００３８（ＩＣＡＭ１）、ＢＣ０００８４４（ＩＥＲ３）、ＢＣ０６６３３９（ＩＧＦＢＰ７）、ＢＣ０１３１４２（ＩＬ１Ａ）、ＢＴ０１９７４９（ＩＬ６）、ＢＣ００７４６１（ＩＬ１８）、（ＢＣ０７２０１７）ＫＲＴ１８、ＢＣ０７５８３９（ＫＲＴ８）、ＢＣ０６０８２５（ＬＩＰＧ）、ＢＣ０６５２４０（ＬＲＡＰ）、ＢＣ０１０４４４（ＭＡＴＮ２）、ＢＣ０１１９０８（ＭＥＳＴ）、ＢＣ０６８４５５（ＮＦＥ２Ｌ３）、ＮＭ＿０１４８４０（ＮＵＡＫ１）、ＡＢ００６７５５（ＰＣＤＨ７）、ＮＭ＿０１４４７６（ＰＤＬＩＭ３）、ＢＣ１２６１９９（ＰＫＰ−２）、ＢＣ０９０８６２（ＲＴＮ１）、ＢＣ００２５３８（ＳＥＲＰＩＮＢ９）、ＢＣ０２３３１２（ＳＴ３ＧＡＬ６）、ＢＣ００１２０１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５）、ＢＣ１２６１６０またはＢＣ０６５３２８（ＳＬＣ１２Ａ８）、ＢＣ０２５６９７（ＴＣＦ２１）、ＢＣ０９６２３５（ＴＧＦＢ２）、Ｂ０００５０４６（ＶＴＮ）、およびＢ０００５００１（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）（２００８年３月現在）において見ることができる。
より具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、細胞を同等条件下で増殖するとき、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１またはｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＣＡＭＩ、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣＩ２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａのそれぞれを、同数の骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで発現する。
前述の遺伝子の発現は、標準的な技法によって評価することができる。例えば、（１つまたは複数の）遺伝子の配列に基づくプローブを個別に選択することができ、従来の技法によって構築することができる。遺伝子の発現は、例えば、１つまたは複数の遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイ、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０アレイ、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で評価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列が改正される場合でさえ評価することができる。改正された配列に特異的なプローブは、よく知られている標準的な技法を使用して容易に作製することができるからである。
これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団の同一性を確認することができ、少なくとも複数の単離胎盤細胞を含む細胞の集団などを同定することができる。その同一性が確認される単離胎盤細胞の集団は、クローン、例えば単一の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞の集団、または幹細胞の混合集団、例えば、多数の単離胎盤細胞から拡大した単離胎盤細胞のみを含む細胞の集団、または本明細書に記載する単離胎盤細胞、および少なくとも１つの他型の細胞を含む細胞の集団であり得る。
これらの遺伝子の発現レベルを使用して、単離胎盤細胞の集団を選択することができる。例えば、前述の１つまたは複数の遺伝子の発現が、同等の間葉系幹細胞の集団中よりその細胞集団由来のサンプル中で有意に高い場合、細胞、例えばクローン増殖細胞の集団を選択することができる。このような選択は、複数の単離胎盤細胞集団由来、その同一性が知られていない複数の細胞集団由来の集団などの選択であってよい。
単離胎盤細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子、例えば間葉系幹細胞対照中での発現レベル、例えば、同数の骨髄由来間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して、１つまたは複数のこのような遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。一実施形態では、同数の間葉系幹細胞を含むサンプル中の前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを、対照として使用する。別の実施形態では、特定条件下で試験する単離胎盤細胞の対照は、前記条件下における間葉系幹細胞中での前記１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを表す数値である。
本明細書に記載する単離胎盤細胞は、例えば、ＤＭＥＭ−ＬＧ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１×インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、１×リノール酸−ウシ血清アルブミン（ＬＡ−ＢＳＡ）、１０−９Ｍのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０−４Ｍのアスコルビン酸２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）１０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１００Ｕペニシリン／１０００Ｕストレプトマイシンを含む培地中での初代培養中、または増殖中に、前述の特性（例えば、細胞表面マーカーおよび／または遺伝子発現プロファイルの組合せ）を示す。
前記単離胎盤細胞または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記細胞または集団は拡大状態であり、例えば、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回継代しており、少なくとも、約、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０の集団倍化で増殖状態である。本明細書で開示する、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は胎児起源である（すなわち胎児の遺伝子型を有する）。
単離胎盤細胞の特定の実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖培地、すなわち増殖を促進するように処方した培地における培養中に、例えば増殖培地における増殖中に分化しない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、増殖するためのフィーダー層を必要としない。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、単にフィーダー細胞層の欠如のため、フィーダー層の不在下での培養中に分化しない。
別の実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である細胞は単離胎盤細胞であり、複数の前記単離胎盤細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価してアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）に陽性である。このようなアッセイは当技術分野で知られている（例えば、Ｂｏｓｔｉａｎ ａｎｄ Ｂｅｔｔｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３、７８７、（１９７８）を参照）。具体的な実施形態では、前記ＡＬＤＨアッセイは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のマーカーとしてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ａｌｄａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用する。具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間の細胞である。別の実施形態では、単離臍帯細胞、例えば多分化能単離臍帯細胞の集団が本明細書で提供され、複数の前記単離臍帯細胞が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標としてＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）を使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイにより評価して、アルデヒドデヒドロゲナーゼに陽性である。具体的な実施形態では、前記複数の細胞は、前記細胞集団中の約３％と約２５％の間の細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞または単離臍帯細胞の前記集団は、ほぼ同じ数の細胞を有し同じ条件下で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の集団より、少なくとも３倍、または少なくとも５倍高いＡＬＤＨ活性を示す。
本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む任意の細胞集団の特定の実施形態において、前記細胞集団中の胎盤細胞は、母方の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まない、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の胎盤細胞が胎児の遺伝子型を有する。本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む任意の細胞集団の特定の他の実施形態では、前記胎盤細胞を含む細胞集団は、母方の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まない、例えば、前記集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の細胞が胎児の遺伝子型を有する。
前述の単離胎盤細胞または単離胎盤細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実施形態では、前記集団中の細胞、または少なくとも約９５％もしくは約９９％の細胞の核型は正常である。前述の胎盤細胞または細胞集団のいずれかの別の具体的な実施形態では、細胞、または細胞の集団中の細胞は非母方起源である。
任意の前述のマーカーの組合せを有する、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団は、任意の比で組み合わせることができる。任意の２つ以上の前述の単離胎盤細胞集団を組合せて、１つの単離胎盤細胞集団を形成することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、前に記載したマーカーの組合せの１つによって定義される単離胎盤細胞の第１集団、および前に記載した別のマーカーの組合せによって定義される単離胎盤細胞の第２集団を含むことができ、前記第１集団と第２集団は約１：９９、２：９８、３：９７、４：９６、５：９５、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、または約９９：１の比で組み合わせる。同様の形式で、任意の３個、４個、５個またはそれより多くの前に記載した単離胎盤細胞または単離胎盤細胞集団を組み合わせることができる。
脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用である単離胎盤細胞は、例えば、酵素による消化（セクション５．４．３参照）または灌流（セクション５．４．４参照）ありまたはなしで、胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、臍帯血が流出しており灌流させて残留血液を除去した哺乳動物胎盤を灌流するステップ、灌流溶液で前記胎盤を灌流するステップ、および前記灌流溶液を回収するステップであって、灌流後の前記灌流溶液が単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含むステップ、および前記細胞集団から複数の前記単離胎盤細胞を単離するステップを含む方法に従って生成することができる。具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍動脈の両方を通過させ、それが胎盤から滲出した後に回収する。別の具体的な実施形態では、灌流溶液は臍静脈と臍動脈を通過させ臍動脈から回収し、または臍動脈を通過させ臍静脈から回収する。
様々な実施形態では、胎盤の灌流から得る細胞の集団中に含有される単離胎盤細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離胎盤細胞は、胎児および母親細胞を含む。別の具体的な実施形態では、灌流によって回収される単離胎盤細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％胎児細胞である。
別の具体的な実施形態では、本明細書で提供するのは、灌流によって回収される、本明細書で記載する単離胎盤細胞の集団を含む組成物であり、前記組成物は、単離胎盤細胞を回収するために使用する灌流溶液の少なくとも一部分を含む。
本明細書で記載する単離胎盤細胞の単離集団は、組織破壊酵素で胎盤組織を消化して細胞を含む胎盤細胞の集団を得ること、および前記胎盤細胞の残りから複数の胎盤細胞を単離、または実質的に単離することによって生成することができる。胎盤の全部、または任意の一部分を消化して、本明細書で記載する単離胎盤細胞を得ることができる。具体的な実施形態では、例えば、前記胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組合せ、または任意の前述の組合せであってよい。他の具体的な実施形態では、組織破壊酵素はトリプシンまたはコラゲナーゼである。様々な実施形態では、胎盤の消化から得る細胞の集団中に含有される単離胎盤細胞は、前記胎盤細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または少なくとも９９．５％である。
前に記載した単離細胞の単離集団、および単離胎盤細胞の集団は、約、少なくとも、または最大１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１またはそれより多くの単離胎盤細胞を一般に含むことができる。本明細書に記載する治療方法に有用である単離胎盤細胞の集団は、例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の生存状態の単離胎盤細胞を含む。
５．４．３ 培養中の増殖
本明細書のセクション５．４．２に記載する単離胎盤細胞の増殖は、任意の哺乳動物細胞に関して、増殖用に選択する個々の培地に一部分は依存する。最適条件下において、単離胎盤細胞は、典型的には約１日で数が倍になる。培養中、本明細書で記載する単離胎盤細胞は、培養基質、例えば、組織培養容器の表面（例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコーティングプラスチックなど）に接着し、単層を形成する。
本明細書で記載する単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養すると、胚様体、すなわち接着性細胞層上で増殖した細胞の三次元集合体を形成することができる。胚様体内の細胞は、非常に初期の幹細胞、例えばＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４と関係があるマーカーを発現する。胚様体内の細胞は、本明細書で記載する単離胎盤細胞と同様に、典型的には培養基質に接着しないが、培養中に接着性細胞に接着した状態である。胚様体細胞は生存が接着性単離胎盤細胞に依存する。胚様体は、接着性単離胎盤細胞の不在下で形成しないからである。したがって接着性単離胎盤細胞は、接着性単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団中での１つまたは複数の胚様体の増殖を容易にする。理論によって縛られることは望まずに、胚様体の細胞は、胚幹細胞が細胞のフィーダー層で増殖するのと同程度に接着性単離胎盤細胞で増殖すると考えられる。
５．５ 単離胎盤細胞を得る方法
５．５．１ 幹細胞回収組成物
本明細書でさらに提供するのは、胎盤細胞、例えば前のセクション５．４．２に記載した単離胎盤細胞を回収および単離する方法である。一般に、このような細胞は、生理的に許容される溶液、例えば幹細胞回収組成物を使用して哺乳動物胎盤から得る。例示的な細胞回収組成物は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｏｒｇａｎｓ」という表題の関連米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号中に詳細に記載される。
細胞回収組成物は、細胞、例えば本明細書に記載する単離胎盤細胞の回収および／または培養に適した任意の生理的に許容される溶液、例えば生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス液、改変クレブス液、イーグル液、０．９％のＮａＣｌなど）、培養培地（例えば、ＤＭＥＭ、Ｈ．ＤＭＥＭなど）などを含むことができる。
細胞回収組成物は、回収時から培養時まで、単離胎盤細胞を保存する傾向がある、すなわち、単離胎盤細胞が死ぬのを防ぐ、または単離胎盤細胞の死を遅延させる、死滅する細胞集団中の単離胎盤細胞の数を減らすなどの、１つまたは複数の構成成分を含むことができる。このような構成成分は、例えば、アポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤またはＪＮＫ阻害剤）、血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アドレノコルチコトロピン、コルチコトロピン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など）、壊死阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、またはクロナゼパム）、ＴＮＦ−α阻害剤、および／または酸素含有ペルフルオロカーボン（例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化ペルフルオロデシルなど）であってよい。
細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅなどを含むことができる。このような酵素には、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼなど）、ディスパーゼ、テルモリシン、エラスターゼ、トリプシン、ＬＩＢＥＲＡＳＥ、ヒアルロニダーゼなどがあるが、これらだけには限られない。
細胞回収組成物は、殺菌的または静菌的に有効な量の抗生物質を含むことができる。特定の非制限的な実施形態では、抗生物質はマクロライド（例えばトブラマイシン）、セファロスポリン（例えばセファレキシン、セファラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、セフィキシムまたはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン（例えばペニシリンＶ）またはキノロン（例えばオフロキサシン、シプロフロキサシンまたはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質はグラム（＋）および／またはグラム（−）細菌、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどに対して活性がある。一実施形態では、抗生物質は例えば培養培地中に約０．００５％〜約０．０１％（ｗ／ｖ）のゲンタマイシンである。
細胞回収組成物は、１つまたは複数の以下の化合物、アデノシン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）、マグネシウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）、一実施形態では、内皮完全性および細胞生存性を維持するのに十分な量で存在する、分子量２０，０００ダルトン超えの高分子（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在する、合成または天然に存在するコロイド、デキストランまたはポリエチレングリコールなどの多糖）、抗酸化剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在する、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣまたはビタミンＥ）、還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステイン）、細胞へのカルシウムの進入を妨げる作用物質（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存在するベラパミル）、ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）、一実施形態では、残留血液の凝固の妨げを手助けするのに十分な量で存在する、抗凝固剤（例えば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒルジン）、またはアミロリド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する、アミロリド、エチルイソプロピルアミロリド、ヘキサメチレンアミロリド、ジメチルアミロリドまたはイソブチルアミロリド）を含むこともできる。
５．５．２ 胎盤の回収および処理
一般に、ヒト胎盤は生後のその娩出直後に回収する。好ましい実施形態では、胎盤は、インフォームドコンセント後に患者から、および患者の完全な病歴を得て胎盤と関連付けた後に回収する。病歴は送達後に続くことが好ましい。このような病歴を使用して、胎盤またはそこから採取した単離胎盤細胞の二次的使用を調節することができる。例えば、病歴を鑑みて、胎盤に関する幼児のオーダーメイド医療に、または幼児の両親、兄弟または他の親戚に、単離ヒト胎盤幹細胞を使用することができる。
単離胎盤細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血を除去することが好ましい。特定の実施形態では、送達後、胎盤中の臍帯血を回収する。胎盤には従来の臍帯血回収プロセスを施すことができる。典型的には、流注下でニードルまたはカニューレを使用して胎盤から採血する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照）。ニードルまたはカニューレは通常臍静脈中に配置し、胎盤を軽くマッサージして胎盤からの臍帯血の流出を容易にすることができる。このような臍帯血の回収は市販用に実施することができる、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ ＵＳＡ、Ｃｅｄａｒ Ｋｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ。胎盤はさらなる操作なしで流注により出血して、臍帯血回収中の組織破壊を最小にすることが好ましい。
典型的には、胎盤は、例えば灌流または組織解離による臍帯血の回収および幹細胞の回収のため、分娩室または出生室から別の場所、例えば実験室に運ばれる。胎盤は、例えば、胎盤、および固定した近位臍帯を滅菌状態のジップロック式プラスチックバッグ中に置き、次いでそれを断熱容器中に置くことによって、（胎盤の温度を２０℃と２８℃の間に維持する）滅菌状態の、断熱輸送デバイスに運ばれることが好ましい。別の実施形態では、その開示が参照により本明細書に組み込まれる係属中の米国特許第７，１４７，６２６号に実質的に記載されたように臍帯血回収キットに胎盤を運ぶ。送達後４〜２４時間で胎盤は実験室に送達することが好ましい。特定の実施形態では、近位臍帯を、好ましくは臍帯血回収前に胎盤ディスクの挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定する。他の実施形態では、近位臍帯を、臍帯血回収後ただし胎盤のさらなる処理前に固定する。
胎盤は細胞回収前に、滅菌条件下において、室温または５℃〜２５℃の温度のいずれかで保存することができる。胎盤は、胎盤を灌流させて任意の残留臍帯血を除去する前に、４〜２４時間、最大４８時間、または４８時間より長い時間の間保存することができる。一実施形態では、娩出後約０時間と約２時間の間に胎盤を採取する。胎盤は５℃〜２５℃の温度で抗凝固剤溶液中に保存することが好ましい。適切な抗凝固剤溶液は当技術分野でよく知られている。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウムの溶液を使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固剤溶液はヘパリンの溶液を含む（例えば、１：１０００溶液中に１％ｗ／ｗ）。採血した胎盤は、胎盤細胞を回収する前に最大３６時間保存することが好ましい。
哺乳動物胎盤またはその一部分は、概して前述のように回収し調製した後、任意の当技術分野で知られている方法で処理することができる、例えば、灌流または破壊することができ、例えば、１つまたは複数の組織破壊酵素で消化して単離胎盤細胞を得ることができる。
５．５．３ 胎盤組織の物理的破壊および酵素による破壊
一実施形態では、器官の一部または全部の物理的破壊によって、哺乳動物胎盤から幹細胞を回収する。例えば、胎盤、またはその一部分は、例えば、破砕する、せん断する、細分する、さいの目に切る、細切れにする、細かく砕くなどすることができる。次いで組織を培養して、単離胎盤細胞の集団を得ることができる。典型的には、胎盤組織は、例えば、培地、生理食塩水、または幹細胞回収組成物に使用して破壊する（セクション５．５．１および以下参照）。
物理的破壊および／または酵素による消化および幹細胞回収の前に、胎盤をいくつかの成分に切断することができる。単離胎盤細胞は、完全胎盤由来のものを含めて、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉、またはこれらの任意の組合せの全部または一部から得ることができる。単離胎盤細胞は、羊膜および絨毛膜を含む胎盤組織から得ることが好ましい。典型的には、単離胎盤細胞は、胎盤組織の小さな塊、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートル体積である胎盤組織の塊の破壊によって得ることができる。例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、破壊法が複数、より好ましくは大部分、およびより好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の前記器官中の細胞を生存状態にするという条件で、任意の物理的破壊法を使用することができる。
単離接着性胎盤細胞は一般に、娩出後の最初の約３日以内の任意の時間で、胎盤、またはその一部分から回収することができるが、娩出後約８時間と約１８時間の間が好ましい。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞の増殖に適した組織培養培地中で、破壊した組織を培養する（例えば、胎盤幹細胞の培養を記載する以下のセクション５．５を参照）。
別の特定の実施形態では、単離胎盤細胞は胎盤組織の物理的破壊によって回収し、この場合物理的破壊は酵素による消化を含み、これは１つまたは複数の組織消化酵素を使用することによって実施することができる。胎盤、またはその一部分は物理的に破壊し、１つまたは複数の酵素で消化し、次いで生成した物質を細胞回収組成物に含浸、または混合することもできる。
好ましい細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織破壊酵素を含む。胎盤組織を破壊するために使用することができる酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはエラスターゼなどがある。セリンプロテアーゼは血清中でアルファ２マイクログロブリンによって阻害される可能性があり、したがって、消化に使用する培地は通常無血清である。一般にＥＤＴＡおよびＤＮａｓｅを酵素による消化の手順中で使用して、細胞回収の効率を増大させる。消化剤を希釈して、粘性消化物内の細胞の捕捉を避けることが好ましい。
組織消化酵素の任意の組合せを使用することができる。トリプシンを使用する消化に関する典型的な濃度は、トリプシン０．１％〜約２％、例えば、トリプシン約０．２５％を含む。プロテアーゼは組合せで、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消化反応中で使用することができ、または同時に使用して胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞および胎盤多分化能細胞を切り離すことができる。例えば、一実施形態では、胎盤、またはその一部分を、例えば３０分間約１〜約２ｍｇ／ｍｌで適量のコラゲナーゼＩを用いて最初に消化して、次に３７℃において例えば１０分間約０．２５％の濃度で、トリプシンを用いて消化する。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。
別の実施形態では、幹細胞を含む幹細胞回収組成物に、または幹細胞回収組成物を用いた幹細胞の単離前に、その中で組織を破壊および／または消化する溶液に、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を加えることによって、組織をさらに破壊することができる。
消化後、消化物を例えば培養培地で三回洗浄し、洗浄した細胞は培養フラスコに接種する。次いで細胞は差次的接着によって単離し、例えば、生存性、細胞表面マーカー、分化などを特徴付ける。
胎盤全体、または胎盤の一部分が胎児細胞と母親細胞の両方を含む場合（例えば、この場合胎盤の一部分は絨毛膜または胎盤葉を含む）、単離する胎盤細胞は、胎児源と母親源の両方由来の胎盤細胞の混合物を含み得ることを理解することができる。胎盤の一部分が、母親細胞を含まない、または無視できる程度数の母親細胞を含む場合（例えば羊膜）、そこから単離する胎盤細胞は、ほぼ胎児胎盤細胞（つまり、胎児の遺伝子型を有する胎盤細胞）のみを含み得る。
胎盤細胞、例えば上のセクション５．４．２に記載した胎盤細胞は、差次的トリプシン処理（以下のセクション５．５．５を参照）、次に１つまたは複数の新たな培養容器、新たな増殖培地中での培養、場合によって、次に第２の差次的トリプシン処理ステップによって、破壊した胎盤組織から単離することができる。
５．５．４ 胎盤灌流
胎盤細胞、例えば上のセクション５．４．２で記載した胎盤細胞は、哺乳動物胎盤の灌流によって得ることもできる。胎盤細胞を得るための哺乳動物胎盤の灌流法は、例えば、それぞれその開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｉｒｉ、米国特許第７，０４５，１４８号および米国特許第７，２５５，７２９号、および米国特許出願公開第２００７／０２７５３６２号および第２００７／０１９００４２号に開示されている。
例えば灌流溶液として細胞回収組成物を使用する、例えば胎盤血管系を介した灌流によって、胎盤細胞を回収することができる。一実施形態では、臍動脈と臍静脈の一方または両方を介して灌流溶液を通すことにより哺乳動物胎盤を灌流する。胎盤を介した灌流溶液の流入は、例えば胎盤への流注を使用して実施することができる。灌流溶液は、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して胎盤に送ることが好ましい。例えば臍静脈は、滅菌済みチューブなどの滅菌済み接続装置に接続した、カニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレでカニューレ処理することができる。滅菌済み接続装置は灌流マニホールドに接続する。
灌流のための調製では、臍動脈と臍静脈が胎盤の最高点に位置するような形式で、胎盤を配向する（例えば懸垂状態にする）ことが好ましい。胎盤血管系および周辺組織を介して灌流液を通すことにより、胎盤を灌流することができる。臍静脈への灌流液の通過および臍動脈からの回収、または臍動脈への灌流液の通過および臍静脈からの回収によって、胎盤を灌流することもできる。
一実施形態では、例えば、臍動脈と臍静脈を、例えば灌流溶液の貯蔵容器と柔軟なコネクターを介して接続したピペットに同時に接続する。灌流溶液は臍静脈および臍動脈に通す。灌流溶液は血管壁から胎盤の周辺組織に滲出および／またはそこを介して通過し、妊娠中の母親の子宮と結合した胎盤の表面から適切な開放容器中で回収する。灌流溶液を臍帯の隙間に導入し、母親の子宮壁と連結した胎盤壁中の隙間から流出または浸透させることも可能である。「パンニング」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型的には胎児細胞と母親細胞の混合物である。
別の実施形態では、灌流溶液は臍静脈を通過させ臍動脈からの回収し、または臍動脈を通過させ臍静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型的にはほぼ全てが胎児細胞である。
それによって灌流液が母親側の胎盤から滲出した後にそれを回収する、すなわちパンニング法を使用する灌流は、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらすことは理解されよう。結果として、この方法によって回収される細胞は、胎児と母親の両方の起源の胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の混合集団を含むことができる。対照的に、それによって灌流液を１つまたは２つの胎盤血管に通し（１つまたは複数の）残りの血管を介してのみ回収する、閉回路法での胎盤血管系のみを介した灌流は、ほぼ全てが胎児起源である胎盤細胞集団の回収をもたらす。
閉回路灌流法は、一実施形態では、以下のように実施することができる。出生後約４８時間以内に産後の胎盤を得る。臍帯は固定しクランプで切断する。臍帯は廃棄することができ、または処理して例えば臍帯血幹細胞を回収することができ、および／または生体材料の生成用に臍帯膜を処理することができる。羊膜は灌流中に保持することができ、または例えば指による鈍的剥離を使用して、絨毛膜から分離することができる。灌流前に羊膜を絨毛膜から分離する場合、それを例えば廃棄、または処理して、例えば酵素による消化によって幹細胞を得ることができ、または例えば羊膜の生体材料、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国出願公開第２００４／００４８７９６号に記載された生体材料を生成することができる。例えば滅菌済みガーゼを使用して、胎盤の全ての目に見える血塊および残留血液を清掃した後、臍帯血管を、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯の断面を露出させることによって露出させる。血管を確認し、例えば各血管の切断末端に閉鎖型アリゲータクランプを挿入することによって開く。灌流デバイスまたは蠕動ポンプと接続した装置、例えばプラスチックチューブを、次いで胎盤動脈のそれぞれに挿入する。ポンプは目的に適した任意のポンプ、例えば蠕動ポンプであってよい。滅菌済み回収貯蔵容器、例えば２５０ｍＬ回収バッグなどの血液バッグと接続したプラスチックチューブを、次いで胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプと接続したチューブを胎盤静脈に挿入し、（１つまたは複数の）回収貯蔵容器に対するチューブを胎盤動脈の一方または両方に挿入する。次いで胎盤を一定体積の灌流溶液、例えば約７５０ｍｌの灌流溶液で灌流する。次いで灌流液中の細胞を、例えば遠心分離によって回収する。特定の実施形態では、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞および／または胎盤多分化能細胞を回収するための灌流前に、胎盤を灌流溶液、例えば１００〜３００ｍＬの灌流溶液で灌流して残留血液を除去する。別の実施形態では、胎盤細胞を回収するための灌流前に、胎盤を灌流溶液で灌流して残留血液を除去することはない。
一実施形態では、近位臍帯を灌流中に固定し、およびより好ましくは胎盤ディスク中への胎盤挿入の４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に固定する。
採血プロセス中の哺乳動物胎盤からの灌流液の最初の回収は、一般に臍帯血および／または胎盤血の残留赤血球細胞の着色である。灌流液は灌流が進行するとさらに無色になり、残留臍帯血細胞は胎盤から洗浄除去する。一般に３０〜１００ｍｌ（ミリリットル）の灌流液は胎盤から最初に採血するのに十分であるが、観察する結果に応じて、より多いまたは少ない灌流液を使用することができる。
胎盤細胞を単離するために使用する灌流液の体積は、回収する細胞の数、胎盤の大きさ、１つの胎盤から行う回収の数などに応じて変わる可能性がある。様々な実施形態では、灌流液の体積は、５０ｍＬ〜５０００ｍＬ、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってよい。典型的には、胎盤は採血後に７００〜８００ｍＬの灌流液で灌流する。
数時間または数日間の行程にわたり複数回、胎盤を灌流することができる。胎盤を複数回灌流する場合、それを容器または他の適切な器中で無菌条件下に維持または培養することができ、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むまたは含まない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；ストレプトマイシン（例えば、４０〜１００μｇ／ｍｌで）、ペニシリン（例えば、４０Ｕ／ｍｌで）、アンホテリシンＢ（例えば、０．５μｇ／ｍｌで）などの抗生物質）を含むまたは含まない、細胞回収組成物、または標準的な灌流溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」などの正常生理食塩水溶液））で灌流することができる。一実施形態では、灌流および灌流液の回収前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、または２もしくは３日間以上、胎盤が維持または培養されるように、灌流液を回収せずに単離胎盤を一定時間維持または培養する。灌流胎盤はさらに１回または複数回、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間より長く維持することができ、例えば７００〜８００ｍＬの灌流液で２回目に灌流することができる。胎盤は１、２、３、４、５回以上、例えば、１、２、３、４、５または６時間毎に一度灌流することができる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流および灌流溶液、例えば細胞回収組成物の回収を、回収する有核細胞の数が１００細胞／ｍｌ未満の範囲になるまで繰り返す。異なる時間地点における灌流液をさらに個別に処理して、時間依存性の細胞集団、例えば幹細胞を回収することができる。異なる時間地点からの灌流液をプールすることもできる。好ましい実施形態では、娩出後約８時間と約１８時間の間に１回または複数回胎盤細胞を回収する。
灌流は、前記溶液で灌流せず、かつ胎盤細胞を得るために（例えば、組織破壊、例えば酵素による消化によって）他に処理しなかった哺乳動物胎盤から入手可能な数より、有意に多い胎盤細胞の回収をもたらすことが好ましい。この文脈において、「有意に多い」は少なくとも１０％を超えることを意味する。灌流は、例えば胎盤、またはその一部分を培養した培養培地から単離可能な胎盤細胞の数より、有意に多い胎盤細胞をもたらす。
１つまたは複数のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によって、胎盤から胎盤細胞を単離することができる。具体的な実施形態では、胎盤またはその一部分（例えば、羊膜、羊膜および絨毛膜、胎盤小葉または胎盤葉、臍帯、または前述の任意の組合せ）を２５〜３７℃にし、３０分間２００ｍＬの培養培地中で１つまたは複数の組織破壊酵素と共にインキュベートする。灌流液からの細胞を回収し、４℃にし、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレイトールおよび２ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む低温の阻害剤混合物で洗浄する。胎盤細胞は、低温の（例えば４℃）幹細胞回収組成物で数分後に洗浄する。
５．５．５ 胎盤細胞の単離、選別、および特徴付け
単離胎盤細胞、例えば、前のセクション５．４．２に記載した細胞は、灌流によって、または物理的破壊によって、例えば酵素による消化によって得ようと、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって他の細胞から初期に精製する（すなわち、それらから単離する）ことができる。このような遠心分離は、遠心分離速度などに関する任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施形態では、例えば、胎盤から回収した細胞を、室温で１５分間５０００×ｇでの遠心分離によって灌流液から回収し、これは例えば汚染細胞片および血小板から細胞を分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液を約２００ｍｌに濃縮し、Ｆｉｃｏｌｌで軽く層状にし、２２℃において室温で２０分間約１１００×ｇで遠心分離にかけ、細胞の低密度界面層をさらなる処理用に回収する。
細胞ペレットは、新たな幹細胞回収組成物、または細胞の維持、例えば幹細胞の維持に適した培地、例えば２Ｕ／ｍｌのヘパリンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ）中に再懸濁することができる。全単核細胞分画は、例えば製造者の勧める手順に従いＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用して単離することができる。
灌流または消化によって得られる胎盤細胞は、例えばさらに、または初期に、例えば０．０５％トリプシンおよび０．２％ＥＤＴＡの溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を使用して、差次的トリプシン処理によって単離することができる。組織培養プラスチック接着性の単離胎盤細胞は典型的には約５分以内にプラスチック表面から脱着し、一方他の接着性集団は典型的には２０〜３０分を超えるインキュベーションを必要とするので、差次的トリプシン処理は可能である。脱着した胎盤細胞は、トリプシン処理、および例えばトリプシン中和溶液（ＴＮＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）を使用したトリプシン中和後に採取することができる。接着性細胞の単離の一実施形態では、例えば約５〜１０×１０６個の細胞のアリコートを、いくつかのＴ−７５フラスコ、好ましくはフィブロネクチンコーティングＴ７５フラスコのそれぞれに置く。このような実施形態では、細胞は市販の間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養し、組織培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中に置くことができる。１０〜１５日後、ＰＢＳで洗浄することにより非接着性細胞をフラスコから除去する。次いでＰＢＳをＭＳＣＧＭと交換する。フラスコは様々な接着性細胞型の存在に関して、特に線維芽細胞様細胞の塊の同定および増殖用に毎日調べることが好ましい。
哺乳動物胎盤から回収する細胞の数および型は、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫組織化学法（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体を用いた染色）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの標準的な細胞検出技法を使用して形態および細胞表面マーカーの変化を測定すること、光学または共焦点顕微鏡を使用して細胞の形態を調べることによって、および／またはＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイルなどの当技術分野でよく知られている技法を使用して、遺伝子発現の変化を測定することによってモニターすることができる。これらの技法を使用して、１つまたは複数の特定マーカーに陽性である細胞を同定することもできる。例えば、ＣＤ３４に対する抗体を使用して、前述の技法を使用して、細胞が検出可能な量のＣＤ３４を含むかどうか決定することができ、その場合細胞はＣＤ３４＋である。同様に、細胞がＲＴ−ＰＣＲによって検出するのに十分なＯＣＴ−４のＲＮＡ、または成体細胞より有意に多いＯＣＴ−４のＲＮＡを生成する場合、その細胞はＯＣＴ−４＋である。細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３４などのＣＤマーカー）に対する抗体、およびＯＣＴ−４などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野でよく知られている。
胎盤細胞、特にＦｉｃｏｌｌ分離、差次的接着、または両方の組合せによって単離した細胞は、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して選別することができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、粒子の蛍光性に基づいて細胞を含めた粒子を分離するための、よく知られている方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０〜１６５）。個々の粒子における蛍光成分のレーザー励起はわずかな電荷をもたらし、混合物からのプラスの粒子とマイナスの粒子の電磁気的分離を可能にする。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的抗体またはリガンドを異なる蛍光標識で標識する。細胞は細胞選別器によって処理し、使用する抗体と結合するそれらの能力に基づく細胞の分離を可能にする。ＦＡＣＳにより選別した粒子は、９６ウエルまたは３８４ウエルプレートの個々のウエル中に直接置いて、分離およびクローニングを容易にすることができる。
一選別スキームでは、胎盤由来の細胞を、例えばマーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ−４および／またはＨＬＡ−Ｇの１つまたは複数の発現に基づいて選別する。培養中のそれらの接着性に基づいてこのような細胞を選択するための手順と関連して、これを実施することができる。例えば、組織培養プラスチック接着性に基づく選択は、マーカーの発現に基づいた選別の前後に実施することができる。一実施形態では、例えば、それらのＣＤ３４の発現に基づき細胞を最初に選別し、ＣＤ３４−細胞は保持し、さらにＣＤ２００＋ＨＬＡ−Ｇ＋であるＣＤ３４−細胞は全ての他のＣＤ３４−細胞から分離する。別の実施形態では、胎盤由来の細胞をそれらのマーカーＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇの発現に基づいて選別し、例えば、これらのマーカーのいずれかを示す細胞はさらなる使用のために単離する。例えば、ＣＤ２００および／またはＨＬＡ−Ｇを発現する細胞は、具体的な実施形態では、それらのＣＤ７３および／またはＣＤ１０５の発現、または抗体ＳＨ２、ＳＨ３もしくはＳＨ４によって認識されるエピトープ、またはＣＤ３４、ＣＤ３８またはＣＤ４５の発現の欠如に基づいてさらに選別することができる。例えば、別の実施形態では、胎盤細胞は、ＣＤ２００、ＨＬＡ−Ｇ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５の発現、またはその欠如によって選別し、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である胎盤細胞は、さらなる使用のため他の胎盤細胞から単離する。
選別胎盤細胞の前述の実施形態のいずれかの具体的な実施形態では、選別後に残った細胞集団中の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の細胞が前記単離胎盤細胞である。前のセクション５．４．２に記載の１つまたは複数の任意のマーカーによって、胎盤細胞を選別することができる。
具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着し、かつ（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、およびＣＤ１０５＋である胎盤細胞を、他の胎盤細胞から選別する（すなわち、それらから単離する）。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着し、かつ（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である胎盤細胞を、他の胎盤細胞から選別する（すなわち、それらから単離する）。別の具体的な実施形態では、（１）組織培養プラスチックに接着し、かつ（２）ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋である胎盤細胞を、他の胎盤細胞から選別する（すなわち、それらから単離する）。
胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞の抗体介在の検出および選別に関して、特定マーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出および選別に適した任意のフルオロフォアまたは他の標識と組み合わせて使用することができる（例えば、蛍光活性化細胞選別）。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せには、ＨＬＡ−Ｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合モノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａから入手可能）、ＣＤ１０（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、ＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）、およびＣＤ１０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）、ＣＤ４４、ＣＤ２００、ＣＤ１１７、およびＣＤ１３に対するフィコエリスリン（ＰＥ）結合モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３３およびＣＤ１０に対するフィコエリスリン−Ｃｙ７（ＰＥＣｙ７）結合モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジンおよびＣＤ３８に対するモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、およびビオチニル化ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）があるが、これらだけには限られない。使用することができる他の抗体には、ＣＤ１３３−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＫＤＲ−ビオチン（ＣＤ３０９、Ａｂｅａｍ）、サイトケラチンＫ−ＦＩＴＣ（ＳｉｇｍａまたはＤａｋｏ）、ＨＬＡＡＢＣ−Ｆｉｔｃ（ＢＤ）、ＨＬＡＤＲ、ＤＱ、ＤＰ−ＰＥ（ＢＤ）、β−２−マイクログロブリン−ＰＥ（ＢＤ）、ＣＤ８０−ＰＥ（ＢＤ）およびＣＤ８６−ＡＰＣ（ＢＤ）があるが、これらだけには限られない。
使用することができる他の抗体／標識の組合せには、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルタンパク質）、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ１０−Ｆ（フルオレセイン）；ＨＬＡ−Ｇ−Ｆおよび７−アミノ−アクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）、ＨＬＡ−ＡＢＣ−Ｆなどがあるが、これらだけには限られない。
本明細書で提供する単離胎盤細胞は、例えばＣＤ１１７またはＣＤ１３３に対するフィコエリスリン−Ｃｙ５（ＰＥＣｙ５）結合ストレプトアビジンおよびビオチン結合モノクローナル抗体を使用して、ＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関してアッセイすることができるが、しかしながら、このシステムを使用すると、比較的高いバックグラウンドのため、細胞がそれぞれＣＤ１１７またはＣＤ１３３に関して陽性に見える可能性がある。
単離胎盤細胞は、１つのマーカーに対する抗体で標識し、検出および／選別することができる。胎盤細胞は、異なるマーカーに対する多数の抗体で同時に標識することもできる。
別の実施形態では、磁気ビーズを使用して細胞を分離することができる。細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技法、磁気ビーズ（０．５〜１００μｍ径）と結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離するための方法を使用して選別することができる。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含めた、様々な有用な修飾を磁性ミクロスフェアに実施することができる。次いでビーズを細胞と混合して結合を可能にする。次いで細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施形態では、これらの細胞を次いで単離して、他の細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再度混合することができる。再度細胞を磁場に通して、両抗体と結合した細胞を単離する。次いでこのような細胞を、クローン単離用のマイクロタイター皿などの別々の皿中に希釈することができる。
単離胎盤細胞は、細胞形態および増殖特性に基づいて特徴付けおよび／または選別することもできる。例えば、単離胎盤細胞は、例えば培養中の線維芽細胞様の外見を有するとして特徴付けすることができ、および／またはそれに基づいて選択することができる。単離胎盤細胞は、胚様体を形成するその能力を有するとして特徴付けすることができ、および／またはそれに基づいて選択することもできる。一実施形態では、例えば、線維芽細胞様の形状である胎盤細胞はＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、培養中に１つまたは複数の胚様体を生成し、他の胎盤細胞から単離する。別の実施形態では、培養中に１つまたは複数の胚様体を生成するＯＣＴ−４＋胎盤細胞を、他の胎盤細胞から単離する。
別の実施形態では、コロニー形成単位アッセイによって、単離胎盤細胞を同定および特徴付けすることができる。ＭＥＳＥＮＣＵＬＴ（商標）培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）などのコロニー形成単位アッセイは当技術分野で一般に知られている。
単離胎盤細胞は、トリパンブルー色素排除アッセイ、フルオレセイン二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取り込みアッセイ（生存率を評価するため）およびチミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（増殖を評価するため）などの、当技術分野で知られている標準的な技法を使用して、生存率、増殖能力、および寿命に関して評価することができる。長期培養中の集団倍化の最大数の決定などの、当技術分野でよく知られている方法によって寿命を決定することができる。
単離胎盤細胞、例えば上のセクション５．４．２で記載する単離胎盤細胞は、当技術分野で知られている他の技法、例えば望ましい細胞の選択的増殖（陽性選択）、望ましくない細胞の選択的破壊（陰性選択）、例えばダイズ凝集素を用いた混合集団中の差次的細胞凝集に基づいた分離、凍結−解凍手順、濾過、従来型およびゾーン遠心分離、遠心分離洗浄（カウンターストリーミング遠心分離）、単位重力による分離、向流分配、電気泳動などを使用して、他の胎盤細胞から分離することもできる。
５．６ 単離胎盤細胞の培養
５．６．１ 培養培地
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団、またはそこから胎盤幹細胞が増殖する細胞もしくは胎盤組織を使用して、細胞培養を開始する、または接種することができる。細胞は一般に、非コーティング状態、または細胞外マトリクスまたはラミニン、コラーゲン（例えば、天然または変性）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチンなどのリガンド、および細胞外膜タンパク質（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（ＢＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）でコーティング状態のいずれかの滅菌済み組織培養容器に移す。
単離胎盤細胞は、細胞、例えば幹細胞を培養するのに許容できるとして当技術分野で認められている、任意の培地中、および任意の条件下で培養することができる。培養培地は血清を含むことが好ましい。単離胎盤細胞は、例えば、ＩＴＳ（インシュリン−トランスフェリン−セレン）、ＬＡ＋ＢＳＡ（リノール酸−ウシ血清アルブミン）、デキサメタゾンＬ−アスコルビン酸、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ＬＧ（ダルベッコ改変最小培地、低グルコース）／ＭＣＤＢ２０１（ヒヨコ線維芽細胞基礎培地）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−ＨＧ（高グルコース）、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＧ、１％〜２０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、およびヒドロコルチゾンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地）、１０％ＦＢＳ、ＥＧＦ、およびヘパリンを含むＭ１９９、１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むα−ＭＥＭ（最小必須培地）、１０％ＦＢＳ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）およびゲンタマイシンを含むＤＭＥＭなどにおいて培養することができる。
胎盤細胞を培養するために使用することができる他の培地には、ＤＭＥＭ（高または低グルコース）、イーグルの基礎培地、ＨａｍのＦ１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、ＭＣＤＢ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、最新ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１（Ｓｉｇｍａ）、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ ＦＲＥＥがある。
例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ（馬）血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ））、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）、１つまたは複数の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、Ｌ−バリンを含めたアミノ酸、および細菌汚染を調節するための１つまたは複数の抗菌剤および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチンなどを含めた１つまたは複数の成分を、単独または組合せで培養培地に補充することができる。
単離胎盤細胞は、標準的な組織培養条件において、例えば組織培養皿またはマルチウエルプレートにおいて培養することができる。単離胎盤細胞は、懸滴法を使用して培養することもできる。この方法では、単離胎盤細胞を約５ｍＬの培地に１ｍＬ当たり約１×１０４個の細胞で懸濁し、一滴または複数滴の培地を、組織培養容器、例えば１００ｍＬペトリ皿の蓋の内側に置く。滴は、例えばマルチチャネルピペッターからの、一滴、または複数滴であってよい。蓋を注意深く反転させ、一定体積の液体、例えば皿雰囲気中の水分含量を維持するのに十分な滅菌済みＰＢＳを含有する、皿の底部表面に置き、幹細胞を培養する。
一実施形態では、単離胎盤細胞は、単離胎盤細胞において未分化状態の表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養する。具体的な実施形態では、化合物は置換３，４−ジヒドロピリジモール［４，５−ｄ］ピリミジンである。より具体的な実施形態では、化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：
Figure 0005950577
化合物は、例えば、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団と接触させることが可能である。
５．６．２ 胎盤細胞の拡大および増殖
単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団（例えば、幹細胞または幹細胞の集団と通常ｉｎ ｖｉｖｏで関係がある胎盤細胞の、少なくとも５０％から分離した胎盤細胞または胎盤細胞の集団）を得た後、細胞または細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖および拡大することができる。例えば、単離胎盤細胞の集団を、細胞が７０〜９０％の集合状態に増殖するのに十分な時間、すなわち細胞およびそれらの子孫が組織培養容器の培養表面積の７０〜９０％を占めるまで、組織培養容器、例えば皿、フラスコ、マルチウエルプレートなどにおいて培養することができる。
単離胎盤細胞は、細胞増殖を可能にする密度で培養容器に接種することができる。例えば、細胞は低密度（例えば、約１，０００〜約５，０００個の細胞／ｃｍ２）〜高密度（例えば、約５０，０００個以上の細胞／ｃｍ２）で接種することができる。好ましい実施形態では、空気中に約０〜約５体積パーセントのＣＯ２の存在下で細胞を培養する。いくつかの好ましい実施形態では、空気中に約２〜約２５体積パーセントのＯ２、好ましくは空気中に約５〜約２０体積パーセントのＯ２で細胞を培養する。細胞は好ましくは約２５℃〜約４０℃、好ましくは３７℃で培養する。細胞はインキュベーター内で培養するのが好ましい。培養培地は固定状態であってよく、または例えばバイオリアクターを使用して攪拌してよい。胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなどを加えて）低い酸化ストレス下で増殖させるのが好ましい。
１００％未満、例えば７０〜９０％の集合状態を得た後、細胞を継代することができる。例えば、当技術分野でよく知られている技法を使用して、細胞を酵素により処理、例えばトリプシン処理して、組織培養表面からそれらを分離することができる。除去後、細胞をピペッティングし、細胞を計数し、約１０，０００〜１００，０００個の細胞／ｃｍ２を、新たな培養培地を含有する新しい培養容器に継代する。典型的には、新しい培地は、そこから単離胎盤細胞を除去した同じ型の培地である。単離胎盤細胞は、約、少なくとも、またはせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０回以上継代することができる。
５．６．３ 単離胎盤細胞の集団
本明細書でさらに提供するのは、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療において有用である、単離胎盤細胞、例えば前のセクション５．４．２に記載の単離胎盤細胞の集団である。単離胎盤細胞の集団は１つまたは複数の胎盤から直接単離することができ、すなわち、細胞集団は単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団であってよく、単離胎盤細胞は、灌流液から得られる、もしくはその中に含有される、または混乱胎盤組織、例えば胎盤組織消化物から得られる、もしくはその中に含有される（すなわち、胎盤またはその一部分の酵素による消化によって得られた細胞の回収）。本明細書に記載の単離胎盤細胞を培養および増殖して、単離胎盤細胞の集団を生成することもできる。単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を培養および増殖して、胎盤細胞集団を生成することもできる。
本明細書で提供する治療方法に有用である胎盤細胞集団は、単離胎盤細胞、例えば本明細書のセクション５．４．２に記載の単離胎盤細胞を含む。様々な実施形態において、胎盤細胞集団中の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が単離胎盤細胞である。すなわち、単離胎盤細胞の集団は、例えば、単離胎盤細胞ではない最大１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の細胞を含むことができる。
脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療において有用である単離胎盤細胞集団は、例えば、特定マーカーおよび／または特定培養もしくは形状特性を発現する、酵素による消化または灌流のいずれかに由来する単離胎盤細胞を選択することによって生成することができる。一実施形態では、例えば、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する胎盤細胞を同定すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって細胞集団を生成する。別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、かつ（ｃ）集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記幹細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記幹細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−Ｇを発現する胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、細胞集団を生成する方法は、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＯＣＴ−４を発現し、かつ（ｃ）集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記幹細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することを含む。別の実施形態では、ＯＣＴ−４を発現し、集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養すると、前記幹細胞を含む前記胎盤細胞の集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。
別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ１０およびＣＤ１０５を発現し、ＣＤ３４は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別の実施形態では、ＣＤ１０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別のより具体的な実施形態では、（ａ）基質に接着し、かつ（ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現し、ＣＤ３４およびＣＤ４５は発現しない胎盤細胞を選択すること、および他の細胞から前記細胞を単離して細胞集団を形成することによって、細胞集団を生成する。
このような細胞集団、またはその組合せを使用して、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱、例えば混乱の症状またはこのような混乱が原因である神経障害を治療することができる。
任意の前述の実施形態において、単離細胞集団の選択は、ＡＢＣ−ｐ（胎盤特異的ＡＢＣ輸送タンパク質、例えば、Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（２３）：５３３７〜９（１９９８）を参照）を発現する胎盤細胞を選択することをさらに含むことができる。方法は、例えば間葉系幹細胞に特異的な少なくとも１つの特性、例えばＣＤ４４の発現、ＣＤ９０の発現、または前述の組合せの発現を示す細胞を選択することも含むことができる。
前述の実施形態において、基質はその上で細胞、例えば単離胎盤細胞の培養および／または選択を実施することができる任意の表面であってよい。典型的には、基質はプラスチック、例えば組織培養皿またはマルチウエルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、生物分子、例えばラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングすることができる。
細胞、例えば単離胎盤細胞を、細胞選択の当技術分野で知られている任意の手段によって、胎盤細胞集団用に選択することができる。例えば、例えばフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳにおいて、１つまたは複数の細胞表面マーカーに対する１つまたは複数の抗体を使用して、細胞を選択することができる。磁気ビーズと共に抗体を使用して選択を実施することができる。特定の幹細胞関連マーカーに特異的である抗体は当技術分野で知られている。例えば、ＯＣＴ−４（Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＣＤ２００（Ａｂｅａｍ）、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｅａｍ）、ＣＤ７３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＤ１０５（Ａｂｅａｍ；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）などに対する抗体。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えばＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ４５は、例えばＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販されている。
単離胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞、または胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。
本明細書で提供する単離胎盤細胞集団は、非幹細胞または非胎盤細胞の１つまたは複数の集団と組み合わせることができる。例えば、単離胎盤細胞の集団は、血液（例えば、胎盤血または臍帯血）、血液由来幹細胞（例えば、胎盤血または臍帯血由来の幹細胞）、臍帯幹細胞、の集団、血液由来有核細胞、骨膜由来間葉系細胞、骨由来幹細胞集団、粗製骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含有される幹細胞の集団、培養幹細胞、完全に分化した細胞の集団（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、破骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞など）などと組み合わせることができる。具体的な実施形態では、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療に有用な細胞の集団は、単離胎盤細胞および単離臍帯細胞を含む。単離胎盤細胞集団中の細胞は、各集団中の全有核細胞の数と比較して、約１００，０００，０００：１，５０，０００，０００：１，２０，０００，０００：１，１０，０００，０００：１，５，０００，０００：１，２，０００，０００：１，１，０００，０００：１，５００，０００：１，２００，０００：１，１００，０００：１，５０，０００：１，２０，０００：１，１０，０００：１，５，０００：１，２，０００：１，１，０００：１，５００：１，２００：１，１００：１，５０：１，２０：１，１０：１，５：１，２：１，１：１；１：２；１：５；１：１０；１：１００；１：２００；１：５００；１：１，０００；１：２，０００；１：５，０００；１：１０，０００；１：２０，０００；１：５０，０００；１：１００，０００；１：５００，０００；１：１，０００，０００；１：２，０００，０００；１：５，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：２０，０００，０００；１：５０，０００，０００；または約１：１００，０００，０００の比で他型の複数の細胞と組み合わせることができる。単離胎盤細胞集団中の細胞は、複数の細胞型の複数の細胞とも組み合わせることができる。
一実施形態では、胎盤細胞の単離集団は複数の造血幹細胞と組み合わせる。このような造血幹細胞は、例えば、未処理胎盤、臍帯血または末梢血内、胎盤血、臍帯血または末梢血由来の全有核細胞中、胎盤血、臍帯血または末梢血由来のＣＤ３４＋細胞の単離集団中、未処理骨髄中、骨髄由来の全有核細胞中、骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の単離集団などに含有され得る。
５．７ 胎盤細胞塊の生成
産後胎盤から単離した細胞、例えば、前のセクション５．４．２に記載した単離胎盤細胞をいくつかの異なる方法で培養して、例えば、ロットが一組の個別に投与可能な用量の単離胎盤細胞である一組のロットを生成することができる。このようなロットは、例えば、胎盤灌流液由来の細胞から、または酵素により消化した胎盤組織由来の細胞から得ることができる。複数の胎盤から得た数組の胎盤細胞のロットは、例えば長期の貯蔵用に、単離胎盤細胞の塊に並べることができる。一般に、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を胎盤材料の初期培養から得て接種培養物を形成し、それを制御条件下で増殖してほぼ同数の倍化から細胞の集団を形成する。ロットは一胎盤の組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤の組織に由来してよい。
一実施形態では、胎盤細胞のロットを以下のように得る。最初に胎盤組織を、例えば切断によって破壊し、適切な酵素、例えばトリプシンまたはコラゲナーゼで消化する（前のセクション５．５．３を参照）。胎盤組織は、例えば一胎盤由来の羊膜全体、絨毛膜全体、または両方を含むことが好ましいが、羊膜または絨毛膜のいずれかの一部分のみを含むことができる。消化した組織は、例えば、約１〜３週間、好ましくは約２週間培養する。非接着性細胞を除去した後、形成する高密度コロニーは、例えばトリプシン処理によって回収する。これらの細胞を回収し、好都合な体積の培養培地に再懸濁し、次いでこれらを使用して増殖培養物を接種する。増殖培養物は、別の細胞培養装置、例えばＮＵＮＣ（商標）によるＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙの任意の配列であってよい。細胞は例えば１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、または１０×１０４個／ｃｍ２で増殖培養物を接種する任意の程度に細分することができる。約１×１０３〜約１×１０４個の細胞／ｃｍ２を使用して、それぞれの増殖培養物を接種することが好ましい。増殖培養物の数は、そこから細胞を得る個々の（１つまたは複数の）胎盤に応じて、これより多数または少数であってよい。
増殖培養物は、培養中の細胞の密度が特定の値、例えば約１×１０５個の細胞／ｃｍ２に達するまで増殖する。細胞はこの時点で回収および凍結保存のいずれかが可能であり、または前に記載したように新しい増殖培養物に継代することができる。細胞は使用前に例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回継代することができる。集団倍化の累積数の記録は（１回または複数回の）増殖培養中維持されることが好ましい。培養物からの細胞は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０の倍化、または最大６０の倍化で増殖することができる。しかしながら、細胞集団を個々の用量に分ける前の集団倍化の数は、約１５〜約３０であることが好ましい。細胞は増殖プロセスを通じて連続的に培養することができ、または増殖中に１つまたは複数の地点で凍結することができる。
個々の用量で使用する細胞は、後の使用のために凍結、例えば凍結保存することができる。個々の用量は、例えば１ｍｌ当たり約１００万個〜約５０００万個の細胞を含むことができ、合計で約１０６個と約１０１０個の間の細胞を含むことができる。
一実施形態では、したがって胎盤細胞塊は、第１の複数集団倍化でヒト産後胎盤由来の初代培養胎盤細胞を増殖すること、前記胎盤細胞を凍結保存してマスター細胞塊を形成すること、第２の複数集団倍化でマスター細胞塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、前記胎盤細胞を凍結保存して作業用細胞塊を形成すること、第３の複数集団倍化で作業用細胞塊から複数の胎盤細胞を増殖すること、および前記胎盤細胞を個々の用量で凍結保存することを含み、前記個々の用量が胎盤細胞塊を集合的に構成する方法によって作製することができる。場合によっては、前記第三の複数集団倍化から複数の胎盤細胞は第四の複数集団倍化用に増殖し、個々の用量で凍結保存することができ、前記個々の用量は胎盤幹細胞バンクを集合的に構成する。
別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、消化胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来および消化胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記胎盤細胞初代培養物中の前記胎盤細胞の全てが同じ胎盤に由来する。別の具体的な実施形態では、この方法は、前記作業用細胞塊由来の前記複数の前記胎盤細胞からＣＤ２００＋もしくはＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞を選択して、個々の用量を形成するステップをさらに含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０４個〜約１０５個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０５個〜約１０６個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０６個〜約１０７個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０７個〜約１０８個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０８個〜約１０９個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記個々の用量は約１０９個〜約１０１０個の胎盤細胞を含む。
好ましい実施形態では、そこから胎盤を得るドナー（例えば母親）を少なくとも１つの病原体に関して試験する。母親が試験病原体に陽性反応を示す場合、胎盤由来の全ロットを廃棄する。このような試験は、胎盤細胞ロットの生成中、例えば増殖培養中の任意の時間で実施することができる。その存在に関して試験する病原体は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＩおよびＩＩ型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを非制限的に含むことができる。
５．８ 胎盤細胞の保存
単離胎盤細胞、例えば前のセクション５．４．２に記載した単離胎盤細胞は、保存することができる、すなわち、長期の貯蔵を可能にする条件下、または例えばアポトーシスまたは壊死による細胞死を抑制する条件下に置くことができる。
胎盤細胞は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる関連米国出願公開第２００７／０１９００４２号に記載されたように、例えばアポトーシス阻害剤、壊死阻害剤および／または酸素含有ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施形態では、脳またはＣＮＳ中、またはその周りの血流の中断の治療に有用な細胞集団を保存する方法は、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と前記細胞集団を接触させることを含み、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記ＪＮＫ阻害剤は前記細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボンを分離相で含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素含有ペルフルオロカーボンをエマルジョン中に含む。別の実施形態では、前記細胞回収組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは細胞との接触時は約０℃と約２５℃の間である。別のより具体的な実施形態では、前記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、細胞との接触時は約２℃と１０℃の間、または約２℃と約５℃の間である。別のより具体的な実施形態では、前記接触は前記細胞集団の輸送中に実施する。別のより具体的な実施形態では、前記接触は、前記細胞集団の凍結および解凍中に実施する。
胎盤細胞の集団は、例えば、アポトーシス阻害剤および臓器保存用化合物と前記細胞集団を接触させることを含む方法によって保存することができ、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触していない細胞集団と比較して、前記細胞集団中のアポトーシスを低減または予防するのに十分な量および時間存在する。具体的な実施形態では、臓器保存用化合物は、ＵＷ溶液（米国特許第４，７９８，８２４号に記載される；ＶｉａＳｐａｎとしても知られる；Ｓｏｕｔｈａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ４９（２）：２５１〜２５７（１９９０）も参照）またはＳｔｅｍら、米国特許第５，５５２，２６７号に記載される溶液である。別の実施形態では、前記臓器保存用化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、またはこれらの組合せである。別の実施形態では、細胞回収組成物は、２相中またはエマルジョンとしてのいずれかで酸素含有ペルフルオロカーボンをさらに含む。
方法の別の実施形態では、灌流中に、アポトーシス阻害剤および酸素含有ペルフルオロカーボン、臓器保存用化合物、またはこれらの組合せを含む細胞回収組成物と胎盤細胞を接触させる。別の実施形態では、前記細胞は、組織破壊、例えば酵素による消化のプロセス中に接触させる。別の実施形態では、灌流による回収後、または組織破壊、例えば酵素による消化による回収後に、胎盤細胞を前記細胞回収化合物と接触させる。
典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮および単離中は、低酸素および機械的ストレスによる細胞ストレスを最小化または排除することが好ましい。したがって、方法の別の実施形態では、細胞、または細胞集団を、前記保存中に６時間未満、回収、濃縮または単離中に低酸素状態に曝し、低酸素状態は正常血中酸素濃度未満である酸素濃度である。より具体的な実施形態では、前記細胞集団を、前記保存中に２時間未満前記低酸素状態に曝す。別のより具体的な実施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中に１時間未満、または３０分未満前記低酸素状態に曝す、または低酸素状態に曝さない。別の具体的な実施形態では、前記細胞集団を、回収、濃縮または単離中にせん断応力に曝さない。
胎盤細胞は、小容器、例えばアンプル内の凍結保存培地中に、例えば凍結保存することができる。適切な凍結保存培地には、例えば増殖培地を含めた培養培地、または細胞凍結培地、例えば市販の細胞凍結培地、例えばＣ２６９５、Ｃ２６３９またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ）があるが、これらだけには限られない。凍結保存培地は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）の濃度でＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むことが好ましい。凍結保存培地は追加的な作用物質、例えばメチルセルロースおよび／またはグリセロールを含むことができる。胎盤細胞は、凍結保存中約１℃／分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は約−８０℃〜約−１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４０℃である。凍結保存した細胞は、使用するために解凍直前に液体窒素に移すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、アンプルが約−９０℃に達した後、それらを液体窒素貯蔵領域に移す。速度制御フリーザーを使用して凍結保存を行うこともできる。凍結保存した細胞は、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃の温度まで解凍する。
５．９ 単離胎盤細胞を含む組成物
本明細書、例えばセクション５．４．２に記載の胎盤細胞は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療において使用するための、任意の生理的に許容されるまたは医学的に許容される化合物、組成物またはデバイスと組み合わせることができる。本明細書で提供する治療方法に有用な組成物は、本明細書に記載の任意の１つまたは複数の胎盤細胞を含むことができる（前のセクション５．４．２を参照）。特定の実施形態では、組成物は薬剤として許容される組成物、例えば薬剤として許容される担体中に胎盤細胞を含む組成物である。以下のセクション５．９．２を参照。
特定の実施形態では、単離胎盤細胞を含む組成物はマトリクス、例えば脱細胞化マトリクスまたは合成マトリクスをさらに含む。より具体的な実施形態では、前記マトリクスは三次元骨格である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチンまたはビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施形態では、マトリクスは、羊膜または羊膜由来生体材料である。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは合成化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記マトリクスは生物活性化合物を含む。別のより具体的な実施形態では、前記生物活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、または５，０００ダルトン未満の有機分子である。
別の実施形態では、本明細書で提供する治療方法に有用な組成物は、任意の前述の胎盤細胞、または任意の前述の胎盤細胞集団によって条件付けした培地を含む。
５．９．１ 凍結保存した単離胎盤細胞
脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療に有用である単離胎盤細胞集団は、後の使用のために保存、例えば凍結保存することができる。幹細胞などの細胞を凍結保存するための方法は、当技術分野でよく知られている。単離胎盤細胞集団は、個体に容易に投与可能である形、例えば、医学用途に適した容器内に含有される単離胎盤細胞集団に調製することができる。このような容器は、例えば、シリンジ、滅菌済みプラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、またはそこから胎盤幹細胞集団を容易に分配することができる他の容器であってよい。例えば容器は、レシピエントへの液体の静脈内投与に適した、血液バッグ、または他のプラスチック製の、医学的に許容されるバッグであってよい。容器は、組合せ細胞集団の凍結保存を可能にする容器であることが好ましい。
凍結保存した単離胎盤細胞集団は、１ドナー由来、または複数のドナー由来の単離胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、目的のレシピエントと完全にＨＬＡ適合状態、または部分的もしくは完全にＨＬＡミスマッチであってよい。
したがって、一実施形態では、単離胎盤細胞は、容器中で組織培養プラスチック接着性胎盤細胞集団を含む組成物の形で、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療に使用することができる。具体的な実施形態では、単離胎盤細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、容器はバッグ、フラスコ、またはジャーである。より具体的な実施形態では、前記バッグは滅菌済みプラスチックバッグである。より具体的な実施形態では、前記バッグは、例えば、静脈内注入による前記単離胎盤細胞集団の静脈内投与に適している、それを可能にするまたは容易にする。バッグは、相互接続して投与前または最中の単離胎盤細胞と１つまたは複数の他の溶液、例えば薬剤の混合を可能にする、多数の内腔または区画を含むことができる。別の具体的な実施形態では、組成物は、組合せ細胞集団の凍結保存を容易にする１つまたは複数の化合物を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞集団は生理的に許容される水溶液中に含有される。より具体的な実施形態では、前記生理的に許容される水溶液は０．９％のＮａＣｌ溶液である。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントとＨＬＡ適合状態である胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記組合せ細胞集団は、前記細胞集団のレシピエントと少なくとも部分的にＨＬＡミスマッチである胎盤細胞を含む。別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は複数のドナーに由来する。
特定の実施形態では、容器中の単離胎盤細胞は単離ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤細胞であり、前記細胞は凍結保存されており、かつ容器内に含有される。具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにＣＤ４５−またはＣＤ９０＋である。より具体的な実施形態では、前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにＣＤ４５−およびＣＤ９０＋である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、またはプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋、またはこれらの任意の組合せの、１つまたは複数である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリン低、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ＋、およびプログラム死−１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
特定の他の実施形態では、前に参照した単離胎盤細胞は単離ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋胎盤細胞であり、前記細胞は凍結保存されており、かつ容器内に含有される。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存されており、かつ容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存されており、かつ容器内に含有されるＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋幹細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存されており、容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋細胞であり、かつ前記単離胎盤細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と培養すると１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存されており、かつ容器内に含有されるＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ｇ＋細胞である。別の実施形態では、単離胎盤細胞は、凍結保存されており、容器内に含有されるＯＣＴ−４＋胎盤細胞であり、かつ前記細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団と培養すると１つまたは複数の胚様体の形成を容易にする。
別の具体的な実施形態では、前に参照した単離胎盤細胞は、フローサイトメトリーによって検出されるＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋である、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞である。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は胎盤幹細胞である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は多分化能胎盤細胞である。別の具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞は、神経系の表現型の細胞、骨形成原の表現型の細胞、または軟骨形成の表現型の細胞に分化する能力を有する。より具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにＣＤ２００＋である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋およびＣＤ１０５＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋またはＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ９０＋およびＣＤ４５−である。別のより具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５−細胞はさらにフローサイトメトリーによって検出されるＣＤ８０−およびＣＤ８６−である。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞はさらにＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＳＨ３＋またはＳＨ４＋の１つまたは複数である。別のより具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ４４＋である。前述の単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、細胞はさらにＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ−、および／またはＰＤＬ１＋の１つまたは複数である。
前述の凍結保存単離胎盤細胞のいずれかの具体的な実施形態では、前記容器はバッグである。様々な具体的な実施形態では、前記容器は、約、少なくとも、または最大１×１０６個の前記単離胎盤細胞、５×１０６個の前記単離胎盤細胞、１×１０７個の前記単離胎盤細胞、５×１０７個の前記単離胎盤細胞、１×１０８個の前記単離胎盤細胞、５×１０８個の前記単離胎盤細胞、１×１０９個の前記単離胎盤細胞、５×１０９個の前記単離胎盤細胞、１×１０１０個の前記単離胎盤細胞、１×１０１０個の前記単離胎盤細胞を含む。任意の前述の凍結保存集団の他の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は、約、少なくとも、または最大５回、最大１０回、最大１５回、または最大２０回継代した。任意の前述の凍結保存単離胎盤細胞の別の具体的な実施形態では、前記単離胎盤細胞は前記容器内で増殖させた。
５．９．２ 医薬組成物
単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団は、例えば本明細書で提供する治療方法において、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するための医薬組成物に製剤化することができる。このような医薬組成物は、薬剤として許容される担体、例えば生理食塩水溶液または他のｉｎ ｖｉｖｏ投与に認められる生理的に許容される溶液中に、単離胎盤細胞の集団、または単離胎盤細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に記載の単離胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書で他の箇所に記載する、任意の単離胎盤細胞集団、または単離胎盤細胞、または任意の組合せを含むことができる。医薬組成物は、胎児、母親、または胎児と母親両方の胎盤細胞を含むことができる。本明細書で提供する医薬組成物は、一個体または胎盤から、または複数の個体または胎盤から得る単離胎盤細胞をさらに含むことができる。
本明細書で提供する医薬組成物は、任意の数の単離胎盤細胞を含むことができる。例えば、単離胎盤細胞の１回の単位用量は、様々な実施形態において、約、少なくとも、または最大１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１またはそれより多くの単離胎盤細胞を含むことができる。
本明細書で提供する医薬組成物は、５０％以上生存状態である細胞（すなわち、集団中の少なくとも５０％の細胞が機能的または生存している）を含む細胞の集団を含む。集団中の少なくとも６０％の細胞が生存状態であることが好ましい。医薬組成物内の集団中の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の細胞が生存状態であることがより好ましい。
本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生着を容易にする１つまたは複数の化合物（例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）、例えばアルブミン、デキストラン４０、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅなどの安定剤を含むことができる。
注射溶液として製剤化するとき、一実施形態において、医薬組成物は、約１％〜１．５％のＨＳＡおよび約２．５％のデキストランを含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、５％ＨＳＡおよび１０％デキストランを含み、場合によっては免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡを、例えば１０ｍｇ／ｋｇで含む溶液中に、１ミリリットル当たり約５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約２×１０７個の細胞を含む。
他の実施形態では、医薬組成物、例えば溶液は、複数の細胞、例えば単離胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含み、前記医薬組成物は１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の細胞を含む。他の実施形態では、医薬組成物は１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。他の実施形態では、医薬組成物は約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約５０×１０６個の細胞／ｍＬ、約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約４０×１０６個の細胞／ｍＬ、約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約３０×１０６個の細胞／ｍＬ、約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約２０×１０６個の細胞／ｍＬ、約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約１５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約１×１０６個の細胞／ｍＬ〜約１０×１０６個の細胞／ｍＬを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は目に見える細胞塊を含まない（すなわち、マクロ細胞塊を含まない）、またはこのような目に見える塊を実質的に含まない。本明細書で使用する「マクロ細胞塊」は、拡大せずに目に見える、例えば裸眼で見える細胞の凝集を意味し、一般に約１５０ミクロンより大きい細胞凝集を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％のデキストラン、例えばデキストラン−４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストラン−４０を含む。具体的な実施形態では、前記組成物は約５．５％のデキストラン−４０を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は約１％〜約１５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は約１％、２％、３％、４％、５％、６５、７５、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＨＳＡを含む。具体的な実施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍済みである。別の具体的な実施形態では、前記細胞は７０μＭ〜１００μＭフィルターによって濾過済みである。別の具体的な実施形態では、前記組成物は目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０６個の細胞当たり約２００未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０６個の細胞当たり約１５０未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０６個の細胞当たり約１００未満の細胞塊を含み、前記細胞塊は顕微鏡、例えば光学顕微鏡下でのみ目に見える。
具体的な実施形態では、医薬組成物は１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞、約５．５％デキストラン−４０（ｗ／ｖ）、約１０％のＨＳＡ（ｗ／ｖ）、および約５％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を含む。
他の実施形態では、医薬組成物は、１０％デキストラン−４０を含む溶液中に複数の細胞、例えば複数の単離胎盤細胞を含み、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の細胞を含み、かつ前記組成物は、肉眼で見える細胞塊を含まない（すなわち、マクロ細胞塊を含まない）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。具体的な実施形態では、前記細胞は凍結保存および解凍済みである。別の具体的な実施形態では、前記細胞は７０μＭ〜１００μＭフィルターによって濾過済みである。別の具体的な実施形態では、前記組成物は１０６個の細胞当たり約２００未満のミクロ細胞塊（すなわち、拡大してのみ目に見える細胞塊）を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は１０６個の細胞当たり約１５０未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は１０６個の細胞当たり約１００未満のミクロ細胞塊を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、もしくは２％未満のＤＭＳＯ、または１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、もしくは０．１％未満のＤＭＳＯを含む。
本明細書でさらに提供するのは細胞を含む組成物であり、前記組成物は本明細書で開示する方法の１つによって生成する。例えば、一実施形態では、医薬組成物は細胞を含み、医薬組成物は、胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む溶液を濾過して濾過済み細胞含有溶液を形成すること、例えば凍結保存前に、濾過済み細胞含有溶液を、第１の希釈溶液で１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈すること、および生成した濾過済み細胞含有溶液をデキストランは含むがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は含まない第２の溶液で希釈して前記組成物を生成することを含む方法によって生成する。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、前記希釈は１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。他の特定の実施形態では、希釈前に濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１５×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。他の特定の実施形態では、希釈前に濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。他の特定の実施形態では、希釈前に濾過済み細胞含有溶液が１ミリリットル当たり約７．５×１０６個未満の細胞を含む場合、濾過は任意選択である。
具体的な実施形態では、第１の希釈溶液を用いた前記希釈と前記第２の溶液を用いた前記希釈の間に、細胞を凍結保存する。別の具体的な実施形態では、第１の希釈溶液はデキストランおよびＨＳＡを含む。第１の希釈溶液または第２の希釈溶液中のデキストランは、任意の分子量のデキストラン、例えば約１０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有するデキストランであってよい。いくつかの実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中の前記デキストランは、約２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％または１０％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液または前記第２の希釈溶液中のデキストランはデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液および前記第２の希釈溶液中のデキストランはデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は５．０％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は５．５％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は１０％デキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは１〜１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、ＨＳＡを含む前記溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液はＨＳＡを含む。より具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液中の前記ＨＳＡは１０％のＨＳＡである。別の具体的な実施形態では、前記第１の希釈溶液は凍結保護剤を含む。より具体的な実施形態では、前記凍結保護剤はＤＭＳＯである。別の具体的な実施形態では、前記第２の希釈溶液中の前記デキストラン−４０は約１０％のデキストラン−４０である。別の具体的な実施形態では、細胞を含む前記組成物は約７．５％〜約９％のデキストランを含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．０±０．３×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約５．０±１．５×１０６個の細胞を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物は、１ミリリットル当たり約１．５×１０６個の細胞〜１ミリリットル当たり約３．７５×１０６個の細胞を含む。
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）凍結保存前に胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を含む細胞含有溶液を濾過して、濾過済み細胞含有溶液を生成するステップ、（ｂ）１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞で濾過済み細胞含有溶液中に細胞を凍結保存するステップ、（ｃ）細胞を解凍するステップ、および（ｄ）デキストラン４０溶液を用いて約１：１〜約１：１１（ｖ／ｖ）に濾過済み細胞含有溶液を希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、ステップ（ａ）前に細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）中の細胞は１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞で凍結保存する。より具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）中の細胞は、約５％〜約１０％のデキストラン４０およびＨＳＡを含む溶液中に凍結保存する。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）中の前記希釈は１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。
別の実施形態では、医薬組成物は、（ａ）胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に懸濁して細胞含有溶液を形成するステップ、（ｂ）細胞含有溶液を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｃ）細胞含有溶液を、５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯを含む溶液で、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｄ）細胞を凍結保存するステップ、（ｅ）細胞を解凍するステップ、および（ｆ）細胞含有溶液を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。
別の実施形態では、細胞を含む組成物は、（ａ）複数の細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｂ）細胞を５．５％デキストラン４０に再懸濁するステップ、（ｃ）細胞を遠心分離にかけて細胞を回収するステップ、（ｄ）細胞を、１０％ＨＳＡを含む５．５％デキストラン４０溶液に再懸濁するステップ、（ｅ）細胞を７０μＭフィルターで濾過するステップ、（ｆ）、細胞を５．５％デキストラン４０、１０％ＨＳＡ、および５％ＤＭＳＯで、１ミリリットル当たり約１〜５０×１０６、１〜４０×１０６、１〜３０×１０６、１〜２０×１０６、１〜１５×１０６、または１〜１０×１０６個の細胞に希釈するステップ、（ｇ）細胞を凍結保存するステップ、（ｈ）細胞を解凍するステップ、および（ｉ）細胞を１０％デキストラン４０で１：１〜１：１１（ｖ／ｖ）に希釈するステップを含む方法によって作製する。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約１５×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個の細胞である。特定の実施形態では、ステップ（ｆ）の前記希釈は、１ミリリットル当たり約７．５×１０６個の細胞である。他の特定の実施形態では、細胞数が１ミリリットル当たり約１０±３×１０６個未満の細胞である場合、濾過は任意選択である。
本明細書に記載の組成物、例えば単離胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書に記載の任意の単離胎盤細胞を含むことができる
細胞製品の投与に適した他の注射可能な製剤を使用することができる。
一実施形態では、医薬組成物は、実質的、または完全に非母型起源である、すなわち胎児の遺伝子型を有する、例えば少なくとも約９０％、９５％、９８％、９９％または約１００％が非母型起源である、単離胎盤細胞を含む。例えば、一実施形態では、医薬組成物は単離胎盤細胞の集団を含み、それらはＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋、ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体またはＯＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞集団を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体または前述の任意の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記胎盤細胞集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記胎盤細胞は非母型起源である。別の実施形態では、医薬組成物は単離胎盤細胞の集団を含み、それらはＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋およびＣＤ３４−；ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ９０＋またはＣＤ４５−の少なくとも１つ；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ１０＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−；ＣＤ２００＋およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＣＤ２００＋；ＣＤ２００＋およびＯＣＴ−４＋；ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−Ｇ＋；ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋であり、胚様体；ＯＣＴ−４＋の形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、胚様体；ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−および／またはＰＤＬ１＋の１つまたは複数；または前述の組合せの形成を可能にする条件下で前記胎盤細胞集団を培養すると、前記単離胎盤細胞を含む胎盤細胞の前記集団中の１つまたは複数の胚様体の形成を容易にし、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の前記単離胎盤細胞は非母型起源である。具体的な実施形態では、医薬組成物は、胎盤から得られない幹細胞をさらに含む。
本明細書で提供する組成物、例えば医薬組成物中の単離胎盤細胞は、１ドナー由来、または複数のドナー由来の胎盤細胞を含むことができる。単離胎盤細胞は、目的のレシピエントと完全にＨＬＡ適合状態、または部分的もしくは完全にＨＬＡミスマッチであってよい。
５．９．３． 単離胎盤細胞を含むマトリクス
本明細書でさらに提供するのは、マトリクス、ヒドロゲル、骨格などを含み、単離胎盤細胞、または単離胎盤細胞の集団を含む組成物である。このような組成物は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱の治療用に、液体懸濁液中の細胞の代わりに、またはそれらに加えて使用することができる。
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、天然マトリクス、例えば羊膜材料などの胎盤生体材料に接種することができる。このような羊膜材料は、例えば、哺乳動物胎盤から直接切開した羊膜、固定または熱処理した羊膜、実質的に乾燥した（すなわち２０％未満のＨ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜などであってよい。その上に単離胎盤細胞を接種することができる好ましい胎盤生体材料は、参照によりその開示が全て本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｉｒｉ、米国出願公開第２００４／００４８７９６号に記載されている。
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、例えば注射に適したヒドロゲル溶液中に懸濁することができる。このような組成物に適したヒドロゲルには、ＲＡＤ１６などの自己集合性ペプチドがある。一実施形態では、これらの細胞を含むヒドロゲル溶液は、例えばモールド中に硬化させて、移植用にその中に分散した細胞を有するマトリクスを形成することが可能である。このようなマトリクス中の単離胎盤細胞は、移植前に細胞が分裂によって増殖するように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有、イオン、または水素結合を介して架橋してゲルを形成する水分子を捕捉する三次元開放面格子構造を生成する有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲル形成物質には、イオンによって架橋する、アルギン酸およびその塩、ペプチド、ポリホスファジン、およびポリアクリレートなどの多糖、またはそれぞれ温度またはｐＨによって架橋する、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーがある。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルまたはマトリクスは生分解性である。
いくつかの実施形態では、製剤はｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲルを含む（例えば、参照によりその開示が全て本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開２００２／００２２６７６、Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、７８（１〜３）：１９９〜２０９（２００２）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４（２２）：３９６９〜８０（２００３を参照）。
いくつかの実施形態では、荷電側基を有するポリマー、その一価イオン塩は、水、緩衝塩溶液、またはアルコール水溶液などの水溶液に少なくとも一部分が溶ける。カチオンと反応することができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸およびメタクリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを使用することもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノールＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。
本明細書に記載の単離胎盤細胞またはその同時培養物は、三次元構造または骨格に接種しｉｎ ｖｉｖｏに移植することができる。例えば組織形成を刺激する、任意の１つまたは複数の増殖因子、細胞、薬剤または他の成分と組み合わせて、このような構造に移植することができる。
使用することができる骨格の例には、不織マット、多孔質発泡体、または自己集合性ペプチドがある。不織マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）からなる線維を使用して形成することができる。凍結−乾燥、または凍結乾燥（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号参照）などの方法によって形成される、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーで構成される発泡体を、骨格として使用することもできる。
別の実施形態では、単離胎盤細胞を、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーまたはブレンド、またはヒアルロン酸などの生体吸収性材料からできたマルチフィラメント糸であってよいフェルトに接種する、またはそれと接触させることが可能である。
本明細書に記載の単離胎盤細胞は、別の実施形態において、複合構造であってよい発泡体骨格に接種することができる。このような発泡体骨格は、修復、交換または増強される身体中の特異的構造の一部分の形状などの、有用な形状に成形することができる。いくつかの実施形態では、細胞の接種の前に、構造を例えば０．１Ｍの酢酸、次にポリリシン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲンでのインキュベーションで処理して細胞接着性を高める。マトリクスの外部表面を修飾して、マトリクスをプラズマコーティングすること、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラゲナーゼ、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）、細胞マトリクス、および／またはゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどだけには限らないが、これらなどの他の物質の添加などによって、細胞の接着もしくは増殖および組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施形態では、骨格は、それを非血液凝固性にする物質を含む、またはそれらで処理する。これらの処理および物質は、内皮増殖、移動、および細胞外マトリクス沈着を促進および持続することもできる。これらの物質および処理の例には、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンなどの基底膜タンパク質などの天然物質、ＥＰＴＦＥ、およびＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などのセグメント化ポリウレタンウレアシリコーンなどの合成物質があるが、これらだけには限られない。骨格はヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき、単離胎盤細胞を接種する前に、骨格を処理して表面電荷を変えることもできる（例えば、プラズマコーティング）。
一実施形態では、単離胎盤細胞を、約０．５×１０６個〜約８×１０６個の細胞／ｍＬで適切な骨格に接種する、またはそれと接触させる。
５．１０ 不死化胎盤細胞系
哺乳動物胎盤細胞は、増殖促進遺伝子、すなわち適切な条件下で、増殖促進タンパク質の生成および／または活性が外部因子により制御可能であるように、トランスフェクト細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含有する、任意の適切なベクターを用いたトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができる。好ましい実施形態では、増殖促進遺伝子は、ｖ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、ＳＶ４０高分子Ｔ抗原、ポリオーマ高分子Ｔ抗原、Ｅ１ａアデノウイルスまたはヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質だけには限られないが、これらなどの癌遺伝子である。
増殖促進タンパク質の外部制御は、外部制御可能なプロモーター、例えばトランスフェクト細胞の温度または細胞と接触する培地の組成を改変することによって、その活性を制御することができるプロモーターの制御下に、増殖促進遺伝子を置くことによって実施することができる。一実施形態では、テトラサイクリン（ｔｅｔ）制御遺伝子発現系を利用することができる（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７〜５５５１、１９９２；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１５１８〜１５２３、１９９６を参照）。ｔｅｔの不在下において、このベクター内のｔｅｔ制御転写活性化因子（ｔＴＡ）は、ｐｈＣＭＶ−１、ｔｅｔオペレーター配列と融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターからの転写を強く活性化する。ｔＴＡは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌのトランスポゾン−１０由来ｔｅｔ耐性オペロンのリプレッサー（ｔｅｔＲ）と単純ヘルペスウイルスのＶＰ１６の酸性ドメインの融合タンパク質である。低い、非毒性濃度のｔｅｔ（例えば、０．０１〜１．０μｇ／ｍＬ）は、ｔＴＡによる転写活性化をほぼ完全になくす。
一実施形態では、ベクターは、選択可能マーカー、例えば薬剤耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含有する。細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）は、本発明の方法内で利用することができる１つのこのようなマーカーである。ｎｅｏＲを有する細胞は、例えば増殖培地に１００〜２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えることなどの、当業者に知られている手段によって選択することができる。
レトロウイルス感染だけには限らないが、これを含めた当業者に知られている様々な手段のいずれかによって、トランスフェクションを実施することができる。一般に、ベクター用に生産者細胞系から回収した条件付き培地とＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２の混合物とのインキュベーションによって、細胞培養物をトランスフェクトすることができる。例えば、前に記載したように調製した胎盤細胞培養物は、１体積の条件付き培地および２体積のＮ２サプリメント含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２における約２０時間のインキュベーションによって、例えば５日後にｉｎ ｖｉｔｒｏで感染させることが可能である。次いで選択可能マーカーを有するトランスフェクト細胞を、前に記載したように選択することができる。
トランスフェクション後、増殖を可能にする、例えば少なくとも３０％の細胞が２４時間の間に倍化するのが可能である表面で培養物を継代する。基質は、ポリオルニチン（１０μｇ／ｍＬ）および／またはラミニン（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基質、ポリリシン／ラミニン基質またはフィブロネクチンで処理した表面であることが好ましい。次いで培養物を３〜４日毎に増殖培地に供給し、増殖培地には１つまたは複数の増殖促進因子を補充してよい、または補充しなくてよい。培養物が５０％未満の集合状態であるとき、増殖促進因子を増殖培地に加えることができる。
条件付き不死化胎盤細胞系は、８０〜９５％の集合状態時に、標準的な技法を使用して、トリプシン処理などによって継代することができる。いくつかの実施形態では、約２０代の継代まで、（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する細胞にＧ４１８を加えることによって）選択を維持することが有益である。細胞は長期の貯蔵用に液体窒素中に凍結することもできる。
クローン細胞系は、前に記載したように調製した条件付き不死化ヒト胎盤細胞系から単離することができる。一般に、このようなクローン細胞系は、標準的な技法を使用して、限界希釈またはクローニングリングの使用などによって単離し、増殖することができる。クローン細胞系は、一般に前に記載したように供給し継代することができる。
必要はないがクローンであってよい、条件付き不死化ヒト胎盤細胞系は、分化を容易にする培養条件下で増殖促進タンパク質の生成および／または活性を抑制することによって、一般に分化を誘導することができる。例えば、増殖促進タンパク質をコードする遺伝子が外部制御可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば温度または培地の組成を改変して、増殖促進遺伝子の転写を抑制することができる。前に論じたテトラサイクリン制御型遺伝子発現系に関して、テトラサイクリンを加えて増殖促進遺伝子の転写を抑制することによって、分化を実施することができる。一般に、４〜５日間で１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンが分化を開始するのに十分である。さらなる分化を促進するために、追加的な作用物質を増殖培地に含めることができる。
５．１１ キット
別の態様において、本明細書で提供するのは、ＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱を有する個体、例えば脳卒中を有する個体の治療に適したキットであって、残りのキット含有物とは別に容器中に、組織培養プラスチック接着性多分化能胎盤細胞、例えば胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞、およびそれらの単離集団、例えば、前のセクション５．４．２に記載の細胞、および使用説明書を含むキットである。胎盤幹細胞は、薬剤として許容される溶液、例えば頭蓋内投与に適した溶液または静脈内投与に適した溶液中に与えることが好ましい。特定の実施形態では、胎盤幹細胞または胎盤多分化能細胞は、本明細書に記載のＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋胎盤細胞のいずれか、例えばＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤細胞である。
特定の実施形態では、キットは、個体への胎盤細胞の送達を容易にする１つまたは複数の成分を含む。例えば、特定の実施形態では、キットは、個体への胎盤細胞の頭蓋内送達を容易にする成分を含む。このような実施形態では、キットは、例えば、個体への細胞の送達に適したシリンジおよびニードル、罹患したＣＮＳ組織を目に見える状態にすることができる放射性または非放射性化合物（例えばコバルト５５）などを含むことができる。このような実施形態では、胎盤細胞はバッグ中のキット内、または１つまたは複数のバイアル中に含有することができる。特定の他の実施形態では、キットは、個体への胎盤細胞の静脈内または動脈内送達を容易にする成分を含む。このような実施形態では、胎盤細胞は例えばボトルまたはバッグ（例えば、最大約１．５Ｌの細胞含有溶液を含有することができる血液バッグまたは類似のバッグ）内に含有することができ、キットはさらに、個体への細胞の送達に適したチューブおよびニードルを含む。
さらにキットは、個体における痛みまたは炎症を低減する１つまたは複数の化合物（例えば、鎮痛剤、ステロイドまたは非ステロイド系抗炎症化合物など）を含むことができる。キットは、抗菌または抗ウイルス化合物（例えば、１つまたは複数の抗生物質）、個体における不安を低減する化合物（例えば、アルプラゾラム）、個体における免疫応答を低減する化合物（例えば、シクロスポリンＡ）、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン、ロラタジン、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、クロルフェニラミン、レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジンなど）を含むこともできる。
さらにキットは、送達用の個体の調製を容易にする、または胎盤細胞を投与する結果としての個体における感染の可能性を低減する、使い捨て、例えば滅菌ワイプ、使い捨て紙製品、グローブなどを含むことができる。
６．１ 頭蓋内投与する単離胎盤細胞を使用する脳卒中の治療
この実施例は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱と関係がある症状の治療において投与した、単離胎盤細胞の投与の有効性を実証する。
ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を、例えば３０分間約１〜約２ｍｇ／ｍｌでコラゲナーゼＩを使用した酵素による消化、次に３７℃において１０分間約０．２５％の濃度でトリプシンを用いた消化によって得た。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを脳卒中モデルとして使用した。ラットは、脳卒中の影響および脳卒中症状に対する様々な療法の影響を試験するための、確立したモデル動物である。例えば、Ｃｈｅｎら、「Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｆｏｃａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ：Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｓｔｒｏｋｅ１７（４）：７３８〜７４３（１９８６）を参照。１０匹の動物を実験当たりで使用した。
ＭＣＡ脳卒中外科手術：全ての外科手術手順は無菌条件下で行った。動物にはエクテシンで麻酔をかけ（３００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、反射痛に関して調べた。ＭＣＡ閉塞外科手術は深い麻酔の下で動物に実施した。ＭＣＡ縫合技法は、頸動脈を通してフィラメントを挿入しＭＣＡの接合部に到達させ、それによって総頸動脈から、およびウィリス輪からの血流を遮断することを含む。右総頸動脈を確認し、腹側正中頸部切開によって単離した。縫合糸サイズは４−０であり、滅菌済み、非吸収性の糸でできており（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）、縫合糸先端の直径はラバーセメントを使用して２４〜２６ゲージサイズまで細めた。約１５〜１７ｍｍのフィラメントを、外部頸動脈と内部頸動脈の接合部からに挿入してＭＣＡを遮断する。右ＭＣＡを１時間閉塞した。公開済みの試験に基づくと、ＭＣＡの１時間の閉塞は最大の梗塞をもたらす。Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐ．９（１６）：３６１５〜３６２１（１９９８）；Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．５２（１）：２２５〜２２９（１９９５）；Ｂｏｒｌｏｎｇａｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．５８（５）：９０９〜９１７（１９９５）を参照。加熱パッドおよび直腸温度計を使用して正常限界内に体温を維持した。首尾良い閉塞および再灌流を決定するため、レーザードロップを使用した。レーザードロッププローブをＭＣＡの遠位端に置いて、閉塞前、最中および後の脳の血流を測定した。
接着性胎盤細胞を、虚血後第２日に虚血部位への直接頭蓋内注射（５マイクロリットル中に約４００，０００個の細胞）によって投与した。ラットには、賦形剤（１０％デキストランおよび５％ヒト血清アルブミン）単独、４×１０５個の生存細胞、１０ｍｇ／ｋｇシクロスポリンＡと併用して４×１０５個の生存細胞、または４×１０５個の非生存細胞およびシクロスポリンＡを投与した。
虚血後第７および１４日に、動物を脳卒中誘導型運動非対称性に関してアッセイした。運動非対称性は高度身体変動試験（ＥＢＳＴ）またはベダーソン試験を使用して評価した。Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ ＆ Ｓａｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１５（７）：５３７２〜５３７８（１９９５）を参照。ＥＢＳＴ中、その尾に触れることによって動物を持ち上げ、変動挙動の頻度および方向を記録した。ラットはプレキシガラス箱中に置き、約２分間馴化させた。ラットの鼻が表面から約１インチであるように、ラットは尾基底部から約１インチに保った。ラットは垂直軸、または右または左への頭部の変動が１０°を超えないとして定義した中立位置に保った。ラットが垂直軸から右または左にその頭部を動かしたときは常に変動を記録し、動物の頭部が垂直軸からそれぞれ右または左に１０°以上動いたとき、右の変動または左の変動を数えた。ラットが特定の側にその試みを強めたときは、１回の変動のみを記録した。１回の変動後、動物を再度プレキシガラス箱中に置き、再試験前に３０秒間自由に運動させた。これらのステップはそれぞれの動物に２０回繰り返した（条件当たり１０匹の動物）。
右および左の変動数と同様に、変動の合計数を数えた。変動数が７０％以上であったとき、変動挙動は偏りがあると考えた。結果は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析し、Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ（純有意差）検定を使用して事後検定を実施した。
ラットにおける胎盤細胞誘導型の神経障害の修復も、感覚運動課題を測定するベダーソン神経試験を使用して評価した。Ｂｅｄｅｒｓｏｎら、Ｓｔｒｏｋｅ１７：４７２〜６（１９８６）；Ａｌｔｕｍｂａｂｉｃ、Ｓｔｒｏｋｅ２９：１９１７〜２２（１９９８）を参照。
ベダーソン試験用に、それぞれのラットの神経値を、（ａ）自発性同側旋回の観察、０（旋回なし）〜３（連続的旋回）で等級付け、（ｂ）反対側後肢後退、それを２〜３ｃｍ側方に動かした後に後肢を入れ替える動物の能力を測定、０（すぐに入れ替え）〜３（数分後に入れ替えまたは入れ替えなし）で等級付け、（ｃ）平均台歩行能力、ラットが２．４ｃｍ幅、８０ｃｍ長の平均台を容易に横断する０〜ラットが１０秒間平均台上に留まることができない３で等級付け、および（ｄ）両前肢の握力、２ｍｍ径の鋼棒をつかむ能力を測定、ラットが正常な前肢の握力挙動を有する０〜ラットが前肢で握ることができない３で等級付けを含む４試験を使用して得た。評価第７日および第１４日に約１５分の間にわたり実施した全４試験からの値を加えて、低い値が神経学的に正常なラットを示す０〜１２の神経障害値を得た。
結果
第０日、虚血誘導の直前に、全ての動物はほぼ正常な（偏りがない）変動挙動を示した（図１、ベースライン）。虚血後第２日、胎盤細胞投与の日に、全ての動物は、予想通り、ほぼ１００％の変動挙動の虚血誘導性の偏りを示した（図１）。第７日および第１４日に、生存胎盤細胞を与えた動物は有意な改善を示し、それぞれ約６５％および６０％の変動の偏りを実証した（図１、第７日および第１４日）。非生存胎盤細胞およびシクロスポリンＡ、または賦形剤のみを与えた動物は統計上有意な改善を示さなかった。
第０日、虚血誘導前に評価したラットは、いずれも神経学的に正常であり、ベダーソン試験においてゼロの障害値を与えた（図２、ベースライン）。虚血誘導後第２日、単離胎盤細胞を投与した日に、賦形剤のみを与えたラットは約２．５の全体平均障害値を示した（図２、第２日）。第７日および第１４日までに、胎盤細胞を与えたラットは神経障害値の統計上有意な改善を示し、約２．５の値からそれぞれ約１．７および１．１の値に改善した。ＥＢＳＴと同様に、賦形剤のみ、または非生存胎盤細胞およびシクロスポリンＡを与えたラットは神経障害値の統計上有意な改善を示さなかった。
結論として、神経障害の２つの試験によって、虚血の承認された動物モデルにおける虚血誘導後第２日での４×１０５個のヒト胎盤細胞の投与は、モデル動物における神経機能を有意に改善することが実証された。胎盤細胞に対する任意の宿主免疫反応を抑制するためのシクロスポリンＡの投与は、胎盤細胞による神経学的改善に必要であるようではなかった。
６．２ 静脈内投与する単離胎盤細胞を使用する脳卒中の治療
この実施例は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の混乱と関係がある症状、例えば低酸素障害もしくは酸素欠乏障害の治療において静脈内投与した、単離胎盤細胞の投与の有効性を実証する。例えば、本明細書に示す結果は、胎盤細胞の静脈内投与は、非生存ヒト胎盤細胞を与えた動物と比較して生存ヒト胎盤細胞を投与した動物において、運動試験と神経試験の両方での用量依存的挙動回復を促進することを示す。
単離ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を、本明細書で他の箇所に記載するように酵素による消化によって得た。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを脳卒中モデルとして使用し、中大脳動脈閉塞を前の実施例１に記載したのと同様に実施した。閉塞後第２日に、対象ラットに、約５μＬ賦形剤（１０％デキストランおよび５％ヒト血清アルブミン）中の４×１０５、１×１０６、４×１０６、または８×１０６個の胎盤細胞、または対照として賦形剤中の非生存細胞を投与した。ラットは外科手術前の第０日、および外科手術後第２、１４、２８、５６および８４日に、前の実施例１に記載したのと同様に高度身体変動試験（ＥＢＳＴ）によって評価した。改変型ベダーソン試験を実施し、その中で対象ラットは、（１）前肢後退、それを２〜３ｃｍ側方に動かした後に前肢を入れ替える動物の能力を測定、０（すぐに入れ替え）〜３（数分後に入れ替えまたは入れ替えなし）で等級付け、（２）平均台歩行能力、ラットが２．４ｃｍ幅、８０ｃｍ長の平均台を容易に横断する０〜ラットが１０秒間平均台上に留まることができない３で等級付け、および（３）両前肢の握力、２ｍｍ径の鋼棒をつかむ能力を測定、ラットが正常な前肢の握力挙動を有する０〜ラットが前肢で握ることができない３で等級付けに関して評価した。それぞれの評価日に約１５分の間にわたり実施した全３試験からの値を加えて、平均神経障害値を得た（最大可能値、３試験で割った９ポイント＝３）。ＥＢＳＴおよびベダーソン試験の結果は、前の実施例１に記載したのと同様に二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ検定によって評価した。
ラットは第８４日に検死用に屠殺し、胎盤細胞の生着および分化を評価した。簡単に言うと、２０μｍの低温保持切片組織を４０倍の倍率で調べ、ＰＣベースのイメージツールコンピュータプログラムを使用してデジタル化した。脳切片はブラインドコード化した。組織切片は標準的なＡＢＣ法を使用して処理した。ヒト胎盤由来幹細胞移植片生着に関する細胞の生着および分化指数を、げっ歯類細胞表面マーカーまたは他のげっ歯類タンパク質と交差反応しないヒト特異的抗体ＨｕＮｕを使用して評価した。細胞移植片における神経表現型の発現を検出するために、神経マーカーＭＡＰ２を使用する免疫組織化学分析を使用した。他の脳切片をＧＦＡＰおよびＯ４に関して処理し移植細胞のグリアおよび稀突起神経膠細胞の表現型の発現を明らかにした。
ヒト胎盤由来細胞の静脈内移植は免疫抑制を必要としなかった。
この試験中に含めた全ての動物はベースラインで正常な挙動を示し、移植前の脳卒中後第２日で首尾良い脳虚血誘導の基準に達した。移植後試験の最も初期の時間地点、脳卒中後第７日で開始し、挙動試験は、非生存ヒト胎盤由来細胞を与えた脳卒中動物と比較して、生存ヒト胎盤由来細胞を与えた脳卒中動物において運動機能と神経機能の両方の用量依存的な有意な改善を明らかにした。脳卒中後第８４日までの時間にわたり、生存ヒト胎盤由来細胞を与えた脳卒中動物において両機能のさらなる改善が増大する傾向があった。非生存細胞を与えた動物を含めていずれの移植動物においても、脳卒中誘導型挙動障害の検出可能な悪化はなかった。移植成熟期中、非生存細胞を与えた動物において一般的な自然挙動回復の傾向があったが、これは非特異的であり、移植外科手術前（すなわち、脳卒中後第２日）と比較して非移植仲介の機能改善は統計的有意に達しなかった。
高用量の８００万個の生存細胞を与えた脳卒中動物は、移植後初期と同様に運動機能と神経機能の両方の最も確かな改善を明らかに示した。しかしながら、経時的に、低用量の生存細胞を与えた脳卒中動物は、高用量の８００万個の生存細胞に概して匹敵する挙動障害の全体的な低下も示した。
第０日、虚血誘導前に評価したラットは、いずれも神経学的に正常であり、ゼロの障害値を与えた（図３、ベースライン）。虚血後第２日、胎盤幹細胞投与の日に、全ての動物は、予想通り、ほぼ１００％の変動挙動の虚血誘導性の偏りを示した（図３）。生存単離胎盤細胞を与えた動物は、対照と比較して第７、１４、２８、５６および８４日のそれぞれに関してＥＢＳＴにおいて有意な用量依存性の改善を示し、全ての日に関して４×１０６と８×１０６個の単離胎盤細胞、および第７日に関して４×１０５×１×１０６個の単離胎盤細胞以外（ｐ＝０．０４５４）、用量間で有意な改善（ｐ＜０．０１）をさらに示した。図３参照。非生存単離胎盤細胞を与えた動物は、対照と比較して統計上有意な改善を示さなかった。
ベダーソン試験に関して、第０日、虚血誘導前に評価したラットは、いずれも神経学的に正常であり、ゼロの障害値を与えた（図４、ベースライン）。虚血誘導後第２日、単離胎盤細胞を投与した日に、非生存細胞のみを与えたラットは約２．５〜３．０の全体平均障害値を示した（図２、第２日）。第７、１４、２８、５６および８４日で、単離胎盤細胞を与えたラットは、非生存細胞を与えたラットと比較して神経障害値の統計上有意な改善を示した（それぞれの場合ｐ＜０．０１）。改善は第７日（４×１０５と８×１０６および１×１０６と８×１０６）、およびそれぞれ第１４および２８日（４×１０５と４×１０６および４×１０５と８×１０６）で、さらに有意に（ｐ＜０．０１）用量依存性であった。ＥＢＳＴと同様に、賦形剤のみ、または非生存胎盤細胞およびシクロスポリンＡを与えたラットは神経障害値の統計上有意な改善を示さなかった。
したがって、単離胎盤細胞の静脈内投与は、運動試験と神経試験の両方において用量依存性の挙動回復を促進する。機能改善は投与後第７日までの初期は明らかであり、３ヶ月の投与後期間にわたりより良い回復の傾向が増大した。対象ラットのいずれにおいても、明らかな悪影響の挙動副作用は観察しなかった。
したがって、本明細書に示す結果は、脳内または脳周辺の血流の混乱と関係がある症状を治療するための、単離胎盤細胞の静脈内投与の安全性および有効性を実証する。例えば、いずれの移植動物も、脳卒中誘導型の挙動異常のいかなる悪化も示さない。非生存ヒト胎盤由来細胞を与えた動物と比較して、生存細胞を与えた動物は、虚血領域中で脳卒中誘導型の挙動障害の有意な改善および宿主細胞の有意なレスキューを示した。さらに、移植動物のいずれにおいても腫瘍または異所性組織形成は検出しなかった。
６．３ 静脈内経路により胎盤細胞を使用する脳卒中の治療−他の神経試験による評価
この実施例は、高度変動試験およびベダーソン試験以外の神経試験によって評価した、胎盤幹細胞を使用する脳卒中の治療の有効性を実証する。
６．３．１ 神経試験
中大脳動脈閉塞外科手術を、以下のようにウィスターラットにおいて実施した。オスのウィスターラット（２７０〜３００ｇ、２〜３ｍ）に、外科手術用ナイロンフィラメントを内頸動脈（ＩＣＡ）に入れてＭＣＡの起点を遮断することによって誘導した、２時間の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を施した。簡単に言うと、ジャー内において前麻酔薬２％イソフルランでラットに麻酔をかけ、改変型ＦＬＵＯＴＥＣ３吸入器（Ｆｒａｓｅｒ Ｈａｒｌａｋｅ、Ｏｒｃｈａｒｄ Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）と結びつきそれと共に調節されるフェースマスクを使用して、２：１Ｎ２Ｏ：Ｏ２混合物中の１．５％イソフルランを自然吸入させた。フィードバック制御温水システム（再循環パッドおよびＫモジュール、直腸内Ｔ型熱電対によってモニタリングした）を使用して、外科手術手順中は直腸温度を３７℃に保った。首の中心部を１ｃｍ切開し、右総頸動脈（ＣＣＡ）、外部頸動脈（ＥＣＡ）、および内部頸動脈（ＩＣＡ）は手術用顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｉｎｃ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）下に曝した。ＣＣＡとＩＣＡは顕微鏡手術用クリップ（Ｃｏｄｍａｎ ＆ Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ、Ｉｎｃ、Ｒａｎｄｏｌｆ、ＭＡ）を使用して一時的に固定した。炎付近での加熱によってその先端が丸くなっている４−０ナイロン縫合糸を、小穴を通してＥＣＡに挿入した。顕微鏡手術用クリップは除去した。動物の重量に従い決定した長さのナイロン縫合糸を、縫合糸がＭＣＡの起点を遮断するまでＥＣＡからＩＣＡの内腔へ軽く入れた。ナイロンフィラメントはＩＣＡ内に２時間（ｈ）保持し、首の切開部分を閉じた。動物はそれらのケージに移して目覚めさせた。２時間のＭＣＡｏ後、動物にイソフルランでラットに再度麻酔をかけ、先端がＥＣＡの内腔から出るまでフィラメントを離脱させることによって、血流の回復を実施した。次いで切開部分を閉じた。
接着性ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を静脈内経路（尾静脈注射）によって投与した。ＭＣＡｏを施した動物を、５群：（１）細胞対照としてヒト皮膚線維芽細胞、（２）デキストラン対照、（３）１×１０６個の胎盤細胞用量、（４）４×１０６個および（５）８×１０６個の細胞の１つに無作為化し、ＭＣＡｏ後第１日で投与した。挙動試験（接着性試験、フットフォルト試験およびｍＮＳＳ）は、試験治療前にＭＣＡｏ後第１日（ベースライン）、およびＭＣＡｏ後第７、１４、２１、２８、４２、および５６日で実施した。機能回復に対する胎盤細胞の用量応答の影響は、以下に記載した３つの挙動試験から測定した。
修正神経系重度値（ｍＮＳＳ、表１）を０〜１８（正常値０；最大障害値１８、表１）のスケールで等級付けする。試験を実施することができない、または反射試験がない１つのスコアポイントを観察する。したがって値が高いほど、障害はより重度である。
Figure 0005950577
接着性除去の体性感覚試験：全てのラットは試験環境に打ち解けていた。最初の試験では、接着剤付き紙片の２つの小さな塊（等しい大きさ、１ヶ月以内の試験用に１１３．１ｍｍ２、１ヶ月後の試験用に５６．６ｍｍ２）を、それぞれの前脚の手根関節上の末端放射状領域を占める両面触刺激として使用した。次いでラットはそれらのケージに戻した。前脚からそれぞれの刺激を除去する時間は、１日当たり５回記録した。
フットフォルト試験：２．５ｃｍ×２．５ｃｍ径の開口部を有する、固いベースフロアより２．５ｃｍ高い、グリッドフロア（４５ｃｍ×３０ｃｍ）に動物を置いた。動物はそれらの脚をワイヤーフレーム上に置きながらグリッドに移動する傾向がある。動物が不正確に脚を置いたとき、前脚はグリッド中の開口部の１つを介して落ちる。脚がワイヤー間に落ちるまたは滑るとき、フットフォルトとしてこれを記録した。合計１００のステップ（それぞれの前脚の動き）を数え、左前脚に関するフットフォルトの合計数を記録し、合計ステップに対する左脚のフットフォルトの割合を決定した。
結果：
修正神経系重度値（ｍＮＳＳ）：４．０×１０６個の細胞で治療した動物群は、第７〜５６日に賦形剤対照と比較してｍＮＳＳ値の改善を実証した（ｐ＜０．０５）（図５）。
接着性除去の体性感覚試験：４．０×１０６個の細胞で治療した動物群は、治療後第１４日に賦形剤対照または細胞対照と比較して、接着性除去の体性感覚試験において改善を示し（ｐ＜０．０５）、改善は試験期間を通じて持続した（図６）。さらに、８．０×１０６個の細胞で治療した動物は、治療後第４２日と５６日に改善を示した（ｐ＜０．０５）。
フットフォルト試験：４．０×１０６個の細胞で治療した動物群は、治療後第７日に賦形剤対照または細胞対照と比較して改善を実証し、改善は試験期間を通じて続いた（図７）。
前述の試験に基づいて、脳卒中の治療は、線維芽細胞対照およびデキストラン対照と比較して、ラットにおける脳卒中後の機能転帰を用量依存的に改善すると決定した。この試験で使用したラットにおける胎盤幹細胞治療の最適用量は４×１０６であると決定した。
６．３．２ 増殖およびシナプス可塑性試験
胎盤幹細胞の投与が新血管新生を容易にしたかどうかを評価するために、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ；５０ｍｇ／ｋｇ、０．００７Ｎ ＮａＯＨ生理食塩水中、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ ＭＯ））を、ＭＣＡｏ後２４時間から開始して、１４日間毎日実験動物に注射した。実験動物を屠殺し、閉塞領域の脳組織切片を得て、ＢｒｄＵで染色した。実験動物にはケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ、腹膜内注射）で再度麻酔をかけ、脚をつねったときの反射によって麻酔の深さをモニタリングした。麻酔後、２ｍＬの血液を心臓から回収した。血清を調製し−２０℃に保存した。次いでＳｉｍｏｎ Ｖａｒｉｓｔａｌｔｉｃポンプを使用して、動物を生理食塩水（ラット用約２００ｍｌ）灌流および４％パラホルムアルデヒド（ラット用約５０ｍｌ）灌流で心穿刺した。
脳を切断し、４８時間〜７２時間４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次に免疫染色用にパラフィン包埋した。ラット用ブレインマトリクス（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｅｎ、ＭＩ）を使用して、それぞれの前脳を２ｍｍ厚の冠状ブロック、動物当たり合計７個のブロックに切断した。最適用量（４×１０６個の細胞）の胎盤幹細胞治療、デキストランＭＣＡｏ対照およびＦＢＣ対照群から得た脳切片は、免疫染色用に使用した。標準パラフィン切片を病変の中心から得た（ブレグマ−１ｍｍ〜＋１ｍｍ）。一連の６μｍ厚切片をブロックから切断した。３個の冠状脳切片をそれぞれの免疫組織化学染色用に使用した。ＢｒｄＵ、増殖細胞マーカー（１：１００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ、１：４００；Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、ダブルコルチン（ＤＣＸ、移動する神経芽細胞のマーカー）（Ｃ−１８、ヤギポリクローナルＩｇＧ抗体、１：２００希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）およびシナプトフィジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、モノクローナル抗体、クローンＳＹ３８、１：４０）に対する抗体で免疫染色を実施した。ＢｒｄＵ免疫染色切片は、ＭＣＩＤコンピュータ画像分析システム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ、Ｃａｎａｄａ）によって４０倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０）を使用してデジタル化した。虚血病変の境界領域内に位置する合計１０の拡大および薄壁血管内のＢｒｄＵ陽性細胞を、それぞれの切片において計数した。
シナプトフィジンの免疫反応性の半定量化用に、それぞれの切片における虚血領域（皮質および線条）からの免疫染色冠状切片および８視野を２０倍対物レンズ下でデジタル化した。陽性領域を測定した。データは陽性領域の割合として表した。
結果：
４×１０６個の胎盤幹細胞の投与は、ＦＢＣ−対照およびデキストラン対照と比較し、虚血脳内の内皮細胞増殖および血管密度の増大により測定して血管新生を有意に増大することが分かった（図８）。さらに、４×１０６個の胎盤幹細胞の投与は、ＦＢＣ−対照と比較し、虚血脳内のシナプトフィジン発現の増大により測定してシナプス可塑性を有意に増大する。
６．４ 多分化能胎盤細胞を使用する脳卒中の治療
６２才の個体は、左側の片麻痺、顔面左側の筋力低下、およびしびれ、および身体左側の感覚の低下を示す。症状は提示前の２時間の行程にわたり発生した。脳卒中の診断を行う。診断１時間以内の個体に、１ミリリットル当たり約１×１０７個の細胞の濃度で１００〜２００ミリリットルの多分化能、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞を投与する。投与した多分化能胎盤細胞は９０％以上ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋であるとアッセイする。個体は、左側の筋肉強度またはしびれの認識可能な改善に関して、投与後１２時間、２４時間、４８時間、４日、および７日で評価する。第２の投与を場合によっては行う。
６．５ 脳卒中、低酸素障害または酸素欠乏障害の治療用の胎盤細胞製剤
多分化能ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋胎盤細胞を濾過して塊を除去し、５．５％（ｗ／ｖ）デキストラン−４０、１０％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、および５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む水溶液中に１ミリリットル当たり１０±３×１０６個の細胞にする。製剤中の細胞の合計数は約４〜７×１０９個の細胞である。
このように製剤化した細胞は、５０ｍＬ凍結容器中に２０ｍＬアリコートに分け、凍結する。等分した細胞は、１０００ｍＬ輸液バッグ中に１０％デキストラン−４０塩化ナトリウムで使用のため希釈する。
均等物：
本明細書で開示する組成物および方法は、本明細書で記載する具体的な実施形態によって範囲が制限されない。実際、記載したもの以外に組成物および方法の様々な変更形態が、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲の範疇にあるものとする。
様々な刊行物、特許および特許出願を本明細書で引用し、それらのそれぞれの開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (42)

  1. 脳内または脳周辺の血流の混乱を有する個体において運動機能を改善する、神経機能を改善する、又はシナプス可塑性を増大するための医薬組成物であって、前記組成物は治療上有効量の単離ヒト胎盤幹細胞を含み、前記単離ヒト胎盤幹細胞はＣＤ１０ ＋ 、ＣＤ３４ − 、ＣＤ１０５ ＋ 、ＣＤ２００ ＋ である、前記組成物。
  2. 前記ＣＤ１０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋細胞がさらにＣＤ４５−および/またはＣＤ９０＋である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は、その少なくとも８０％が単離ヒト胎盤幹細胞である細胞集団内に含有されるものである、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は、その少なくとも９０％が単離ヒト胎盤幹細胞である細胞集団内に含有されるものである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記血流の混乱が脳卒中、血腫または血管痙攣である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記脳卒中が虚血性脳卒中である、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記脳卒中が出血性脳卒中である、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記血腫が硬膜血腫、硬膜下血腫、またはくも膜下血腫である、請求項５に記載の組成物。
  9. ボーラス注射、静脈内注入または頭蓋内投与用に製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  10. 虚血領域内への投与用に製剤されたものである、請求項９に記載の組成物。
  11. 虚血周辺領域への投与用に製剤されたものである、請求項９に記載の組成物。
  12. 腹腔内、筋肉内、皮内または眼内への投与用に製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  13. 外科的移植による投与用に製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  14. マトリクスまたは骨格を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記マトリクスまたは骨格がヒドロゲルである、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記マトリクスまたは骨格が脱細胞化組織である、請求項１４に記載の組成物。
  17. 前記マトリクスまたは骨格が合成生分解性組成物である、請求項１４に記載の組成物。
  18. 前記個体に１回投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記個体に複数回投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記個体１キログラム当たり１×１０４個〜１×１０５個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記個体１キログラム当たり１×１０５個〜１×１０６個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記個体１キログラム当たり１×１０６個〜１×１０７個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記個体１キログラム当たり１×１０７個〜１×１０８個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  24. ５×１０７個〜３×１０９個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を静脈注射するために製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  25. ９×１０８個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項２４に記載の組成物。
  26. １．８×１０９個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項２４に記載の組成物。
  27. 頭蓋内投与用に５×１０７個と１×１０８個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  28. ９×１０７個の前記単離ヒト胎盤幹細胞を含むように製剤されたものである、請求項２７に記載の組成物。
  29. 第２の治療剤と共に投与するために製剤されたものである、請求項１に記載の組成物。
  30. 前記第２の治療剤が神経保護薬である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記第２の治療剤がＮＸＹ−０５９（フェニルブチルニトロンのジスルホニル誘導体）である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記第２の治療剤が血栓溶解薬である、請求項２９に記載の組成物。
  33. 前記血栓溶解薬が組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の４８時間以内に前記個体に投与するためのものである、請求項１に記載の組成物。
  35. 前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の２４時間以内に前記個体に投与するためのものである、請求項１に記載の組成物。
  36. 前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の１２時間以内に前記個体に投与するためのものである、請求項１に記載の組成物。
  37. 前記個体における１つまたは複数の脳内または脳周辺の血流の混乱症状の発生の３時間以内に前記個体に投与するためのものである、請求項１に記載の組成物。
  38. 投与前に凍結保存されたものである、請求項１に記載の組成物。
  39. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は胎盤幹細胞バンクから得られたものである、請求項１に記載の組成物。
  40. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞より検出可能に高いレベルで１つまたは複数の遺伝子を発現し、
    前記１つまたは複数の遺伝子が、ＡＣＴＧ２、ＡＤＡＲＢ１、ＡＭＩＧＯ２、ＡＲＴＳ−１、Ｂ４ＧＡＬＴ６、ＢＣＨＥ、Ｃ１１ｏｒｆ９、ＣＤ２００、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＰＡ４、ＤＭＤ、ＤＳＣ３、ＤＳＧ２、ＥＬＯＶＬ２、Ｆ２ＲＬ１、ＦＬＪ１０７８１、ＧＡＴＡ６、ＧＰＲ１２６、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＩＣＡＭ１、ＩＥＲ３、ＩＧＦＢＰ７、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１８、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＬＩＰＧ、ＬＲＡＰ、ＭＡＴＮ２、ＭＥＳＴ、ＮＦＥ２Ｌ３、ＮＵＡＫ１、ＰＣＤＨ７、ＰＤＬＩＭ３、ＰＫＰ２、ＲＴＮ１、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＳＬＣ１２Ａ８、ＴＣＦ２１、ＴＧＦＢ２、ＶＴＮ、およびＺＣ３Ｈ１２Ａの１つまたは複数であり、
    かつ前記骨髄由来間葉系幹細胞が、前記単離ヒト胎盤幹細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている、請求項１に記載の組成物。
  41. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでＥＬＯＶＬ２、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５またはＳＬＣ１２Ａ８の１つまたは複数を発現し、
    かつ前記骨髄由来間葉系幹細胞が、前記単離ヒト胎盤幹細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記単離ヒト胎盤幹細胞は骨髄由来間葉系幹細胞より高いレベルでＫＲＴ１８を発現し、
    かつ前記骨髄由来間葉系幹細胞が、前記単離ヒト胎盤幹細胞が経ている継代数と等しい培養の継代数を経ている、請求項４０に記載の組成物。
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