KR20230035451A - 조산 합병증의 치료에 있어서의 제대혈의 용도 - Google Patents

조산 합병증의 치료에 있어서의 제대혈의 용도 Download PDF

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KR20230035451A
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모하마드 에이. 헤이다란
크리스틴 에릭슨 존슨
로버트 제이. 하리리
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셀룰래리티 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 조산아에게 제대혈 줄기 세포 및 임의로 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 조산아가 앓는 하나 이상의 조산 합병증의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 조산아의 치료를 위한 제대혈 줄기 세포, 특히 자가유래 제대혈 세포 및 태반 줄기 세포를 조합하고 투여하는 방법, 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

조산 합병증의 치료에 있어서의 제대혈의 용도{USE OF UMBILICAL CORD BLOOD IN THE TREATMENT OF PREMATURE BIRTH COMPLICATIONS}
본원은 2007년 11월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/002,375호를 우선권 주장하고, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
1. 기술분야
본 발명은 조산아를 포함하는 유아에게 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포 및/또는 혈액 첨가제를 투여함으로써, 상기 유아에서 하나 이상의 질환 또는 상태를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
2. 배경기술
만기아는 자궁에서 37주 내지 42주를 보낸다. 37주보다 더 일찍 출생한 유아는 조산 또는 조기분만으로 고려된다. 조산은 생후 첫번째 달에 사망의 주요 원인이고, 주요 대중 관심사이다. 선천적 기형을 위한 동전보내기운동재단(March of Dimes Birth Defects Foundation)에 따르면, 2002년에 미국에서 480,812명의 조산아 (모든 살아있는 출생의 12.1％를 나타냄)가 있었으며, 조산아의 의료 비용은 155억 달러였다.
조기출산 및 조기분만에 대한 위험 인자에는 모체의 연령 (18세 미만 또는 35세 초과), 감염, 당뇨병, 고혈압, 흡연, 다태임신 및 약물 남용이 포함된다.
현재, 약 23주 내지 약 25주의 제태기간에 출생한 유아의 생존율은 23주의 제태기간의 유아의 경우 약 20％로부터 25주의 제태기간의 유아의 경우 약 65％까지 다양하다. 이 연령군의 생존한 유아의 약 1/3은 정상적으로 발달하고; 약 1/3은 경증 또는 중등도 장애를 발병하고; 약 1/3은 중증 장애를 발병한다.
약 26주 내지 약 29주의 제태기간에 출생한 조산아의 생존율은 26주의 제태기간에 출생한 유아의 경우 약 75％, 및 29주의 제태기간에 출생한 유아의 경우 약 85％이다. 생존한 이러한 조산아의 약 40％는 정상적으로 발달하나, 약 40％는 경증 또는 중등도 장애를 발병하고, 약 20％는 하나 이상의 중증 장애를 발병한다.
약 30주 내지 약 33주의 제태기간에 출생한 조산아의 90 내지 95％는 생존한다. 이들 조산아의 약 65％는 정상적으로 발달하나, 이들 조산아의 약 20％는 경증 또는 중등도 장애를 발병하고, 약 15％는 하나 이상의 중증 장애를 발병한다.
약 34주 내지 약 37주의 제태기간에 출생한 조산아는 만기아보다 덜 성숙하나, 이들의 생존율 (대략 95％)은 만기아의 생존율과 거의 동일하고, 이들의 장기간 전망은 임의의 만기아의 전망만큼 좋다.
조산아의 신체 특징에는 예를 들어, 작은 크기; 낮은 출생 체중; 불규칙적인 호흡; 및 발육부전 장기 또는 계, 예컨대 폐, 면역계 및 뇌가 포함된다. 조산아와 관련된 일반적인 문제점에는 빈혈, 저혈압, 고빌리루빈혈증, 감염, 망막병증, 호흡 곤란, 및 폐, 눈, 면역계, 뇌, 심장, 간 및 신장과 같은 특정 장기의 불완전 발달이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
조산아와 관련된 질환 및 상태를 치료하기 위한, 다양한 성공 정도를 갖는 다양한 치료 옵션이 이용가능하다. 예를 들어, 빈혈을 갖는 조산아는 수혈 및/또는 철 보충으로 치료될 수 있고, 조기분만과 관련된 호흡 곤란 증후군을 치료하기 위해 계면활성제 투여가 사용된다. 그러나, 불완전 장기 발달을 위한 치료 옵션은 존재하지 않는다. 발전에도 불구하고, 조산아와 관련된 질환 및 상태를 위한 치료제의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
3. 발명의 요약
본 발명은 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 조산아의 질환 및 상태의 치료 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 조산아에게 제대혈, 예를 들어 동종이계 제대혈을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 조산아의 질환 및 상태의 치료 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 방법은 조산아에게 태반 줄기 세포 및/또는 혈액 첨가제를 투여하는 것을 더 포함한다. 태반 줄기 세포 및/또는 혈액 첨가제를 투여하는 실시양태에서, 제대혈은 자가유래 또는 동종이계일 수 있다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 혈액 첨가제는 에리트로포이에틴, 철 보충제, 비타민, 또는 제대혈로부터 얻지 않은 동종이계 적혈구이다. 상기 첨가제가 동종이계 적혈구인 더 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 이식편대숙주 질환을 감소시키거나 예방하기에 충분한 정도로 조사된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 조사는 2,500 cGy 이상의 방사선에 의한 것이다. 상기 첨가제가 동종이계 적혈구인 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 백혈구고갈된다.
조산아는 37주 미만의 제태기간에 출생한 유아이다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 23주 내지 약 25주의 제태기간을 지낸다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 26주 내지 약 29주의 제태기간을 지낸다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 30주 내지 약 33주의 제태기간을 지낸다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 34주 내지 약 37주의 제태기간을 지낸다.
특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 800 그램 이상의 체중을 갖는다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 500 그램 내지 약 800 그램의 체중을 갖는다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 500 그램 미만의 체중을 갖는다.
본 발명에 따라 치료되는 질환 또는 상태는 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 당분야에 공지된 임의의 질환 또는 상태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 호흡 곤란 증후군 (RDS) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 빈혈이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 뇌실내 출혈, 괴사성 소장결장염, 미성숙 망막병증, 만성 폐 질환 (기관지폐 이형증), 감염, 동맥관 개존증, 무호흡, 저혈압 또는 고빌리루빈혈증이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 폐, 눈, 면역계, 뇌, 심장, 간 또는 신장과 같은 장기의 불완전 발달에 의해 유발된다.
본 발명에서 사용되는 제대혈은 당분야에 공지된 임의의 기술에 의해 수집될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제대혈은 제대혈 은행으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 제대혈은 산후 포유동물 태반으로부터 수집된다. 몇몇 실시양태에서, 제대혈은 만기 출산의 산후 포유동물 태반으로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 제대혈은 조산의 산후 포유동물 태반으로부터 얻는다. 제대혈은 단독으로 투여시 치료되는 조산아에 대해 동종이계일 수 있거나, 태반 줄기 세포 또는 혈액 첨가제와 함께 투여시 동종이계 또는 자가유래 또는 양자 모두의 조합일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 태반 줄기 세포는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 단리되고 처리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 만기 출산의 태반으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 조산의 태반으로부터 얻는다. 본 발명의 방법에서 유용한 태반 줄기 세포는 치료되는 조산아에 대해 동종이계 또는 자가유래 또는 양자 모두의 조합일 수 있다.
특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 잔여 혈액 세포를 제거하기 위해 방혈되고 관류된 태반으로부터 얻는다. 그 후, 방혈된 태반은 태반으로부터 유래된 내생성 줄기 세포의 생성을 허용하기에 적절한 조건하에 약 2 내지 약 24시간 동안, 또는 그 이상 동안 배양될 수 있다.
배양된 태반으로 얻은 후, 태반 줄기 세포는 특정 세포 표면 마커를 확인하기 위해 면역화학을 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 방법에 의해 특징화될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 줄기 세포는 다음 세포 표면 마커의 존재에 의해 확인될 수 있다: CD34-, OCT-4+, CD73+, CD105+, CD200+ 및/또는 HLA-G+. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD34+ 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD34- 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+ 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 CD200+인 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200+ 또는 OCT-4+인 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200+ 및 OCT-4+인 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이며 상기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우에 상기 집단 내 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진하는 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 CD200+인 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+이며 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우에 상기 집단 내 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진하는 세포를 포함한다.
조산아에게 제대혈 또는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물을 투여하는 단계는 당업자의 판단에 따라 수행될 수 있고, 예를 들어 정맥내로 수행될 수 있다. 투여는 조산아의 출생후 다양한 시간에 수행될 수 있으나, 일반적으로 출생후 약 2주 이하가 바람직하다. 다양한 실시양태에서, 투여는 조산아의 출생후 1, 2, 5, 10, 12 또는 24시간 또는 1주 내에 수행된다. 투여는 조산아의 출생후 1회 또는 수회 수행될 수 있다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1은 태반을 관류한 후 관류액을 수집하기 위한 태반의 정맥 및 동맥의 캐뉼라삽입의 단면도이다.
도 2a 내지 도 2e는 배수되고 관류된 태반의 수집, 클램핑, 관류, 수집 및 저장을 나타내는 개략도이다.
도 3은 생물반응기로서 사용하기 위한 장치 내의 관류된 태반의 개략 단면도이다.
5. 발명의 상세한 설명
5.1 조산아의 치료
본 발명은 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 조산아의 질환 및 상태의 치료 방법을 제공한다. 방법은 조산아에게 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 제대혈이 단독으로 또는 혈액 첨가제와 함께 투여되는 실시양태에서, 제대혈은 치료되는 조산아에 대해 동종이계이다. 제대혈이 태반 줄기 세포 및/또는 혈액 첨가제와 함께 투여되는 실시양태에서, 제대혈은 수용자 조산아에 대해 자가유래 또는 동종이계일 수 있다.
유아가 1 kg (대략 2.3 lbs) 미만의 체중으로 출생한 경우 극히 낮은 출생 체중 (ELBW) 유아인 것으로 고려된다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 800 그램 이상의 체중을 갖는다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 500 그램 내지 약 800 그램의 체중을 갖는다. 특정 실시양태에서, 조산아는 출생시 약 500 그램 미만의 체중을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 질환 또는 상태 (이 경우에 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 것)의 진행, 중증도 및/또는 지속시간, 또는 이러한 질환 또는 상태의 임의의 파라미터 또는 증상의 치유, 개선 또는 감소 또는 경감을 지칭한다.
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포에 의한 조산아의 치료는 조산아가 생존한 경우, 또는 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 질환 또는 상태가 치료의 결과로서 임의의 방법으로 측정가능하게 개선된 경우 효능있는 것으로 고려될 수 있다. 이러한 개선은 예를 들어, 하나 이상의 측정가능한 지표, 예를 들어 특정 질병, 질환 또는 상태와 관련된 생리학적 상태 또는 생리학적 상태의 일군의 검출가능한 변화 (혈압, 심박수, 호흡률, 다양한 혈액 세포 유형의 개수, 특정 단백질, 탄수화물, 지질 또는 사이토카인의 혈액 중 수준, 또는 질병, 질환 또는 상태와 관련된 유전자 마커의 발현의 조정을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 의해 나타낼 수 있다.
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포에 의한 조산아의 치료는 이러한 지표 중 임의의 하나가 제대혈 및/또는 태반 줄기 세포의 투여의 부재하에서 기대되는 이러한 지표(들)보다 정상값 (예를 들어, 만기아에 대한 정상값) 내에 있거나 이에 가까운 값으로 변화함으로써 이러한 치료에 반응하는 것으로 보이는 경우 효과적인 것으로 고려된다. 정상값은 지표에 대해 당분야에 공지된 정상값 또는 정상값들의 범위일 수 있다. 예를 들어, 조산아에 의해 나타나는 하나 이상의 대사 또는 생화학 지표는 지표(들)에 대한 정상적인 범위와 비교될 수 있으며, 여기서 치료가 하나 이상의 대사 또는 생화학 지표가 정상적인 만기아에 대한 기준 범위에 더 가까이 근접하게 하거나 이에 포함되게 하는 경우, 치료는 효과적인 것으로 고려된다. 이러한 지표에는 17-히드록시프로게스테론, 25-히드록시비타민 D (25(OH)D), 아세토아세테이트, 산도 (pH), 알부민, 암모니아, 아밀라제, 아스코르브산, 바이카르보네이트, 빌리루빈, 혈액 부피, 칼슘, 이산화탄소 부분압, 일산화탄소, CD4 세포수, 세룰로플라스민, 클로라이드, 구리, 크레아틴 키나제 (CK 또는 CPK), 크레아틴 키나제 동위효소, 크레아티닌, 적혈구 침강 속도 (ESR 또는 Sed-Rate), 글로불린, 글루코스, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 철, 철-결합능, 락테이트 (락트산) (동맥), 락트산 데히드로게나제, 리파제, 마그네슘, 평균 적혈구 혈색소량 (MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도 (MCHC), 평균 적혈구 부피 (MCV), 몰랄삼투압농도, 산소 부분압, 산소 포화도 (동맥), 포스파타제, 인, 혈소판수, 칼륨, 단백질 (총), 프로트롬빈 (PTT), 피루브산, 적혈구수 (RBC), 나트륨, 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 트랜스아미나제 (알라닌 또는 아스파르테이트), 우레아 질소 (BUN) 및 BUN/크레아티닌 비율, 요산, 비타민 A, WBC (백혈구 개수 및 백혈구수), 아연 등의 수준 또는 값이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
제대혈, 또는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 투여의 유효성은 행동 시험에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 조산아의 신경발달의 개선은 예를 들어 신생아 신경행동 검사(Neonatal Neurobehavioral Examination), 알버타 유아 운동 척도(Alberta Infant Motor Scale) 또는 베일리 유아 발달 척도(Bayley Scale of infant Development) (제3판)와 같은 하나 이상의 시험에 의해 생후 첫 2년 내지 3년 내에, 이러한 시험에 대한 조산아에 의한 스코어를 정상아 및 상이한 제태 연령의 조산아에 대한 스코어 또는 스코어들의 범위와 비교하고, 스코어가 조산아의 제태 연령에서 기대되는 스코어보다 높은 경우 개선된 것으로 결정함으로써, 평가될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제대혈, 또는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물을 투여받은 조산아는 스코어가 통상적인 치료제에 의해서만 치료된 동일한 제태 연령의 조산아의 스코어 또는 스코어들의 평균보다 높은 경우 개선된 것으로 간주된다.
한 실시양태에서, 조기분만아는 출생 직후 (예를 들어, 첫주 내에) 신생아 신경행동 검사 (NNE)에 의해 평가되고, 행동 성향, 원시 반사, 및 음조 및 운동 패턴의 발달을 나타내는 스코어를 제공하며, 여기서 최대 스코어는 81이다. 유아는 생후 2년 내에, 바람직하게는 약 18개월 내지 약 22개월에 1회 이상 재평가된다. 상기 시간 동안 NNE 스코어의 유의한 개선은 효능을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포의 투여는 스코어가 제대혈, 또는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물에 의해 치료되지 않은 조산아와 비교하여 평균 스코어로부터 개선된 경우 (예를 들어, 조산아가 37주 내지 42주의 제태 연령으로 출생한 경우 37주 내지 42주의 제태 연령 조기분만아 (66.5), 조산아가 34주 내지 36주의 제태 연령으로 출생한 경우 34주 내지 36주의 조기분만아 (60.7), 또는 조산아가 34주 이하의 제태 연령으로 출생한 경우 34주 이하의 제태 연령으로 출생한 유아 (51.1)) 효과적이다. 문헌 [Morgan, "Neonatal Neurobehavioral Examination. A New Instrument For Quantitative Analysis of Neonatal Neurological Status," Phys. Ther. 68(9):1352-1358 (1988)]을 참조한다.
5.1.1 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 질환 또는 상태
본 발명에 의해 치료되는 질환 또는 상태는 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 임의의 질환 또는 상태일 수 있으며, 이는 당분야에 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 호흡 곤란 증후군 (RDS) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 빈혈이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 뇌실내 출혈, 괴사성 소장결장염, 미성숙 망막병증, 만성 폐 질환 (기관지폐 이형증), 감염, 동맥관 개존증, 무호흡, 저혈압 또는 고빌리루빈혈증이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 폐, 눈, 면역계, 뇌, 심장, 간 또는 신장을 포함하나 이에 제한되지 않는 장기의 불완전 발달에 의해 유발된다.
(급성) 호흡 곤란 증후군 (ARDS/RDS) 또는 유아 호흡 곤란 증후군 (IRDS) (이전에 유리질막병이라고 함)은 유아의 폐 내의 기낭 (폐포)가 계면활성제의 불충분한 생성으로부터 기인한 높은 표면 장력 때문에 열린 상태를 유지할 수 없는 호흡 질환이다. 호흡 곤란 증후군은 모든 조산아의 10％에 영향을 미치고, 만기에 출생한 유아에 거의 영향을 미치지 않는다. 상기 질병은 성숙 폐에서 정상적으로 나타나는 화학물질인 폐 계면활성제의 결핍에 의해 유발된다. 계면활성제는 기낭이 협착하지 않게 하고, 공기에 의해 더 쉽게 팽창하게 한다. 호흡 곤란 증후군에서, 기낭은 협착하고 어린이가 적절하게 호흡하지 못하게 한다. 증상은 통상적으로 출생 직후 나타나고, 점점 더 중증으로 된다. RDS/ARDS를 갖는 유아는 통상적으로 산소 및 인공호흡기에 의한 지지를 필요로 하거나, 계면활성제 약물에 의해 치료된다.
빈혈은 신체에 적절한 산소를 운반하기에 혈액 중 적혈구 또는 헤모글로빈의 수가 불충분한 것을 특징으로 하는 질환이다. 조산아는 분만 도중 혈액 손실, 철 함량의 부족 및 성인과 비교하여 적혈구의 더 짧은 반감기를 포함하는 수많은 원인으로 빈혈을 발병할 수 있다. 현재 치료 옵션에는 수혈 (혈액 은행 또는 가족 구성원으로부터 얻은 지정 공여자 혈액으로부터), 철 보충 및 혈액 손실의 방지가 포함된다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이는 것을 의도하지 않지만, 제대혈이 수혈에 대한 양호한 혈액 공급원일 수 있다고 여겨진다. 제대혈의 자가유래 주입은 혈액 은행 또는 관련 공여자로부터의 혈액보다 여러 장점을 갖는다: 1) 제대혈은 산소를 운반하는 적당한 능력을 갖는 양호한 적혈구 공급원이고; 2) 제대혈은 쉽게 이용가능하고 최소 시험을 필요로 하고; 3) 제대혈은 미숙 장기 또는 조산으로 인해 손상된 장기의 추가 발달을 지지할 수 있는 줄기 및 선조 세포의 풍부한 공급원이다.
무호흡은 조산아가 호흡을 일시적으로 멈추는 질환이고, 통상적으로 15초 내지 20초 동안의 호흡 정지로서 정의된다. 무호흡은 임신 34주 전에 출생한 유아에서 발생할 수 있으며, 대부분의 조기 출생한 유아 중에서 빈도수가 증가한다. 이는 호흡을 제어하는 뇌의 부분의 미숙에 의해 유발되는 것을 생각된다. 무호흡을 갖는 유아는 약물 (예를 들어, 아미노필린, 카페인 또는 독사프람)에 의해 치료되고/거나, 연속적인 양성 기도 압력 또는 인공호흡기에 의해 지지된다.
만성 폐 질환 (기관지폐 이형증)은 연장된 기간 동안 기계적 환기 및/또는 높은 산소 수준에 있는 조산아에서 발병하는 상태이다. 만성 폐 질환은 산소, 약물 및 유아의 인공호흡기로부터의 점차적인 이유에 의해 치료된다.
신생아에서 접하게 되는 가장 일반적인 문제점 중 하나인 고빌리루빈혈증은 혈액 중 빌리루빈의 비정상적으로 높은 수준이다. 이는 5 mg/dL 초과의 총 혈청 빌리루빈 수준으로 정의된다. 상기 수준 초과의 빌리루빈은 신경독성/세포독성이 있다. 이는 피부 및 점액 막에서 비접합 빌리루빈 안료의 침착으로부터 기인한다. 경증 고빌리루빈혈증은 치료를 필요로 하지 않는다. 더 높은 빌리루빈 수준은 유아를 빌리루빈 광 아래에 위치시키는 광선요법에 의해 치료될 수 있다.
조산아는 면역계가 미숙하기 때문에 만기아보다 감염에 걸릴 위험이 더 높다. 조산아에서 나타나는 심각한 감염에는 패혈증, 폐렴 및 수막염 (뇌 주변 막의 감염)이 포함된다. 현재, 감염은 항생제 또는 항바이러스 약물에 의해 치료된다.
뇌실내 출혈은 뇌 내의 출혈이다. 이는 뇌실 옆에 있는 작은 혈관이 붕괴하는 경우에 발생한다. 뇌실내 출혈은 조산 신생아에 가장 빈번히 영향을 미친다. 중증 출혈은 뇌 손상을 유발할 수 있고, 예를 들어 학습 장애 및/또는 행동 문제를 야기할 수 있다.
괴사성 소장결장염은 장의 내부 표면이 손상되고 염증이 생긴 상태이고; 중증인 경우, 장의 일부가 괴사할 수 있으며, 이는 장 천공 및 복막염을 야기한다. 괴사성 소장결장염은 주로 조산아에서 발생한다. 이 질환의 원인은 공지되어 있지 않으나, 창자로의 혈류 감소가 창자가 정상적인 보호성 점액을 생성하지 못하게 하는 것으로 생각된다. 장 내의 박테리아가 또한 원인일 수 있다. 괴사성 소장결장염은 수유 문제, 유아의 힘살의 팽윤 및 다른 합병증을 야기할 수 있다. 괴사성 소장결장염은 약물 및 종종 수술에 의해 치료된다.
동맥관 개존증 (PDA)은 혈액이 출생전 유아의 폐를 우회하게 하는 혈관인 동맥관이 출생후 닫히지 않은 상태이다. 동맥관 개존증은 현재 약물 및 필요하다면 수술에 의해 치료된다.
미성숙 망막병증은 눈의 뒤쪽 (망막)의 혈관이 조산아에서 비정상적으로 발달하는 질환이며; 이들 혈관은 출혈할 수 있고, 가장 중증의 경우 망막이 박리할 수 있으며, 이는 시력 손실을 야기한다. 이는 주로 임신 32주 전에 출생한 유아에서 발생한다. 미성숙 망막병증의 발병에 대한 주요 위험 인자는 극한 조숙이고; 호흡 문제의 치료로부터의 혈액 중 높은 산소 수준이 위험을 증가시킬 수 있다. 높은 산소 농도에 의해 치료된 조산아에서 전형적으로 발생하는 양측 망막병증은 혈관 확장, 증식 및 비틀림, 부종, 및 망막 박리를 특징으로 하며, 망막이 치밀 수정체후 막으로 보일 수 있는 섬유성 덩어리로 궁극적으로 전환한다. 전형적으로, 눈의 성장이 정지하고, 소안구증을 야기할 수 있고, 실명이 발생할 수 있다. 조숙의 경증 망막병증은 종종 자발적으로 치유되고; 중증 망막병증을 갖는 유아는 현재 레이저 또는 망막의 주변 부분을 동결시키는 냉동요법에 의해 치료된다.
또한, 본 발명은 폐, 눈, 면역계, 뇌, 심장, 간 및 신장을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 장기의 불완전 발달에 의해 유발된 질환 및 상태의 치료를 또한 포함한다. 현재, 불완전 장기 발달을 위한 치료 옵션이 존재하지 않는다.
5.1.2 조산아에게 제대혈 및 태반 줄기 세포의 투여
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포는 조산아, 특히 조숙과 관련되거나 조숙에 의해 유발된 임의의 질환 또는 상태를 갖거나 이를 나타내는 조산아에게 주사 또는 수혈을 포함하는 임의의 제약상 또는 의료상 허용되는 방법으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제대혈 및 태반 줄기 세포는 조산아에게 비경구로 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"에는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 동맥내 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포는 조산아에게 정맥내로 투여된다.
제대혈 또는 태반 줄기 세포는 임의의 제약상 허용되는 담체 내에 함유될 수 있다. 제대혈 또는 태반 줄기 세포는 임의의 제약상 또는 의료상 허용되는 컨테이너, 예를 들어 혈액 백, 이동 백, 플라스틱 튜브, 주사기, 바이알 등에 담지되거나 저장되거나 운송될 수 있다.
조산아에게 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포를 투여하는 단계는 임의의 의료상 허용되는 방법으로 수행될 수 있다. 투여는 조산아의 출생후 수회 수행될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 예를 들어 투여는 출생후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21 또는 24시간 내에, 또는 출생후 2, 3, 4, 5 또는 6일 내에, 또는 출생후 1 또는 2주 내에 수행된다.
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포의 투여는 조산아의 출생후 1회 또는 수회 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여는 조산아의 출생후 1회 수행된다. 특정 실시양태에서, 투여는 조산아의 출생후 수회 수행된다.
조산아에게 투여되는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 양 또는 수는 사용되는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 공급원, 치료되는 질환 또는 상태의 중증도 또는 성질, 뿐만 아니라 조산아의 연령, 체중 및 신체 상태 등에 의존한다. 특정 실시양태에서, 조산아의 체중 1 킬로그램 당 약 0.01 내지 약 0.1, 약 0.1 내지 약 1, 약 1 내지 약 10, 약 10 내지 약 102, 약 102 내지 약 103, 약 103 내지 약 104, 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 또는 약 108 내지 약 109개의 제대혈 세포, 태반 줄기 세포, 또는 제대혈 세포 및 태반 줄기 세포가 투여된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 제대혈 세포는 CD34+ 세포이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD34+ 세포이다. 바람직하게는, 체중 1 킬로그램 당 적어도 약 105 내지 약 107개의 CD34+ 세포가 투여된다. 이러한 CD34+ 세포는 제대혈 단독으로부터 유래될 수 있거나, 제대혈 및 태반으로부터 유래될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조산아의 체중 1 킬로그램 당 적어도 약 0.1, 1, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 제대혈 세포, 태반 줄기 세포, 또는 제대혈 세포 및 태반 줄기 세포가 투여된다. 다양한 실시양태에서, 조산아의 체중 1 킬로그램 당 최대 약 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개의 제대혈 세포, 태반 줄기 세포, 또는 제대혈 세포 및 태반 줄기 세포가 투여된다. 상기 실시양태의 구체적인 실시양태에서, 제대혈 및/또는 태반 줄기 세포는 CD34+ 세포이다.
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포는 바람직하게는 조산아의 크기에 적절한 부피로 전달된다. 조산아의 전형적인 혈액 부피는 약 85 내지 100 mL/체중 kg이다. 그러므로, 조산아에 대한 혈액 부피는 대략 40 mL 내지 대략 300 mL의 범위이다. 다양한 실시양태에서, 그러므로, 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포는 약 0.5 mL, 1.0 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 11 mL, 12 mL, 13 mL, 14 mL, 15 mL, 16 mL, 17 mL, 18 mL, 19 mL 또는 약 20 mL, 또는 그 이상의 총 부피로 투여된다. 이러한 부피의 투여는 단일 투여 또는 다중 투여일 수 있다. 유아가 특히 낮은 출생 체중 (예를 들어, 1 kg 미만)인 경우, 원하는 부피의 제대혈, 또는 수의 제대혈 세포 및 임의로 태반 줄기 세포는 유아에게 다수의 투여로 제공될 수 있다. 제대혈, 또는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물의 이러한 부피가 투여될 수 있는 시간은 예를 들어, 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간 또는 그 이상으로 다양할 수 있다.
일반적으로, 20 mL 이하의 소량 수혈은 펌프를 필요로 하지 않고, 주사기를 통해 예를 들어 간헐적 소량 볼루스에 의해 유아의 부피-관용성을 고려하여 주입될 수 있다. 더 다량의 부피 수혈은 바람직하게는 주입 장치에 의해 2 내지 4시간의 기간 내에 투여된다. 수혈 간격이 4시간을 초과하는 경우, 혈액 구성성분은 세분되어야 하고, 그의 제2 부분은 필요시까지 예를 들어 혈액 은행에 저장되어야 한다.
5.1.3 혈액 첨가제
특정 실시양태에서, 조산아에게 투여되는 제대혈은 1종 이상의 첨가제를 포함한다. 예를 들어, 이러한 첨가제로는 예를 들어, 에리트로포이에틴, 철 보충제, 비타민 또는 동종이계 적혈구를 들 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 혈액 첨가제는 에리트로포이에틴이다. 에리트로포이에틴은 임의의 의료상 허용되는 형태로 투여될 수 있다. 에리트로포이에틴은 생물학적 공급원으로부터 정제된 천연 에리트로포이에틴 또는 조작된 에리트로포이에틴, 예컨대 에포겐(EPOGEN)®, 아라네스프(ARANESP)® 또는 프로크리트(PROCRIT)®일 수 있다. 에리트로포이에틴은 천연 인간 에리트로포이에틴의 서열을 가질 수 있거나, 혈청 반감기를 증가시키도록 조작된 에리트로포이에틴일 수 있다. 에리트로포이에틴에 대한 전형적인 투여량은 500 내지 1500 U/kg/주의 범위이다.
다른 구체적인 실시양태에서, 혈액 첨가제는 철 또는 철 보충제이다. 철 또는 철 보충제는 임의의 대사상 이용가능하고 의료상 허용되는 형태일 수 있으나, 바람직하게는 원소 철이다. 조기분만아에 대한 전형적인 투여량은 조기분만아가 약 1500 그램 이하의 체중을 갖는 경우 약 4.0 mg/kg/일 내지 약 4.5 mg/kg/일이고, 조기분만아가 약 1500 그램 내지 약 2500 그램의 체중을 갖는 경우 약 2 mg/kg/일이다.
다른 구체적인 실시양태에서, 혈액 첨가제는 1종 이상의 비타민이거나 이를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 비타민은 리보플라빈 (비타민 B2), 피리독신 (비타민 B6), 엽산, 비타민 B12 및/또는 비타민 E를 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액 발달에 필수적인 비타민이다. 한 실시양태에서, 약 25 IU의 비타민 E가 조산아에게 투여된다. 이러한 비타민은 성인에 대해 확립된 바와 대략 동일한 투여량 (킬로그램 당)으로 조산아에게 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포의 단일 투여는 리보플라빈 약 150 ㎍; 피리독신 약 100 ㎍; 엽산 약 25 ㎍; 비타민 B12 약 0.4 ㎍ 및/또는 비타민 E 약 3.6 IU를 포함한다. 혈액 첨가제는 또한 1종 이상의 다른 비타민, 예를 들어 비타민 A (예를 들어, 투여 당 약 460 IU); 비타민 D (예를 들어, 투여 당 약 70 IU); 비타민 K (예를 들어, 투여 당 약 11 ㎍); 티아민 (비타민 B1, 예를 들어 투여 당 약 220 ㎍); 니아신 (예를 들어, 투여 당 약 1950 ㎍); 판토텐산 (예를 들어, 투여 당 약 800 ㎍); 비오틴 (예를 들어, 투여 당 약 9 ㎍); 비타민 C (아스코르브산, 예를 들어 투여 당 약 15 mg); 이노시톨 (예를 들어, 투여 당 약 6 mg) 및/또는 리놀레산 (예를 들어, 투여 당 약 750 mg)일 수 있다. 혈액 첨가제는 상기 비타민들의 임의의 조합일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
다른 구체적인 실시양태에서, 혈액 첨가제는 제대혈 이외의 공급원으로부터의 동종이계 적혈구, 예를 들어 말초 혈액으로부터의 적혈구이다. 바람직한 실시양태에서, 공여자가 일차 또는 이차 친족인 경우, 적혈구는 이식편대숙주 질환을 감소시키거나 예방하기에 충분한 정도로 조사된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 적혈구는 투여전 2,500 cGy 이상으로 조사된다. 이러한 조사된 적혈구는 바람직하게는 조사 24 시간 내에 투여된다. 다른 실시양태에서, 제대혈과 함께 조산아에게 투여되는 적혈구는 친족이 아닌 공여자로부터 유래된다. 바람직하게는, 이러한 적혈구는 친족이 아닌 단일 공여자로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 적혈구는 동일한 공여자로부터 조산아에게 다중 투여를 가능하게 하는 멀티팩 혈액 수집 시스템을 사용하여 친족이 아닌 공여자로부터 수집되며, 이는 면역학적 합병증을 감소시킨다. 상기 첨가제가 동종이계 적혈구인 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 예를 들어 백혈구고갈 필터를 사용하여 백혈구고갈된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,728,306호를 참조한다. 적혈구가 혈액 첨가제로서 사용되는 모든 실시양태에서, 적혈구는 투여전 5일 이하 동안 저장되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 적혈구는 아데닌-염수 (AS-3) 항응고제를 포함한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 적혈구는 적어도 다음 병원체의 부재 또는 다음 병원체에 대한 항체의 부재에 대해 시험된 공여된 혈액 유닛로부터 유래된다: 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-I, HIV-II, C형 간염 바이러스, 인간 T-림프영양성 바이러스 (HTLV)-I 및 HTLV-II, B형 간염 바이러스 (HBV, 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)의 부재에 의해 증명됨), 사이토메갈로바이러스 및 매독.
5.1.4 조합 치료요법
본원에서 제공된 방법의 특정 실시양태에서, 제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포는 조산아의 질환 및 상태의 치료에서 하나 이상의 이차 치료요법과 조합하여 일차 치료요법으로서 사용된다. 이러한 이차 치료요법에는 수술, 호르몬 치료요법, 면역요법, 광선요법 또는 특정 약물에 의한 치료가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
용어 "조합 치료요법"의 사용은 제공된 방법에서 치료제를 조산아에게 투여하는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 조합 치료요법의 약제는 조산아에게 동시에, 순차적으로 임의의 순서로 또는 주기적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 조합 치료요법의 2종의 구성성분은 조산아에게 동시에 투여된다.
조합 치료요법의 구성성분은 조산아에게 동일한 제약 조성물로 투여될 수 있다. 별법으로, 조합 치료요법의 구성성분은 조산아에게 별개의 제약 조성물로 투여될 수 있고, 이들 별개의 조성물은 예를 들어, 경구, 비경구 (예를 들어, 눈, 코, 피부, 근육 또는 복강 경로(들) 등) 또는 국소 등을 포함하는 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
특정 이차 치료요법은 치료요법의 각 표준 또는 당분야-인지 용량 및 투여 스케쥴에 따라 수행된다.
특정 실시양태에서, 이차 치료제 및/또는 임의의 삼차 치료제는 조산아의 질환 및 상태의 치료에서 제대혈 및 태반 줄기 세포와의 그의 부가 효과를 위해 선택된다.
특정 실시양태에서, 이차 치료제 및/또는 임의의 삼차 치료제는 조산아의 질환 및 상태의 치료에서 제대혈 및 태반 줄기 세포와의 그의 상승작용 효과를 위해 선택된다.
제대혈 및 임의로 태반 줄기 세포의 투여와 조합하여 사용될 수 있는 치료요법의 예로는 환경 온도의 제어; 산소에 의한 지지; 호흡기 또는 인공호흡기; 말초 혈액 수혈; 철 보충; 정맥내 영양공급; 광선요법; 수술; 무호흡 치료를 위한 약제 (예를 들어, 아미노필린, 카페인 또는 독사프람 등); ARDS 또는 RDS 치료를 위한 약제 (예를 들어, 계면활성제 약물, 예를 들어 큐로서프(CUROSURF)® (포락탄트 알파(Poractant Alfa); 더글라스 파마슈티칼스(Douglas Pharmaceuticals))); 항생제 또는 항바이러스 약물, 항염증제 (예를 들어, 스테로이드성 항염증 화합물, 비스테로이드성 항염증 (NSAID) 화합물), 산화질소; 항히스타민제, 면역억제제, 면역조정 화합물 (예를 들어, TNF-α 억제제); 레이저 치료 (예를 들어, 미성숙 망막병증 치료를 위함) 등이 포함된다. 조산아의 치료는 당분야에 익히 공지되어 있고, 당업자는 사례마다 제대혈의 투여와 조합하여 사용하기에 적합한 특정 치료요법을 선택할 수 있다.
5.2 제대혈
제대혈은 임의의 의료상 또는 제약상 허용되는 방법으로 수집될 수 있다. 제대혈을 수집하기 위한 다양한 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,102,871호; 미국 특허 제6,179,819 B1호 및 미국 특허 제7,147,626호를 참조하며, 상기 특허들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 제대혈을 수집하기 위한 통상적인 기술은 바늘 또는 캐뉼라의 사용을 기초로 하며, 이는 중력의 도움으로 태반으로부터 제대혈을 배수하기 위해 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,192,553호, 제5,004,681호, 제5,372,581호 및 제5,415,665호를 참조한다. 통상적으로, 바늘 또는 캐뉼라를 제정맥에 위치시키고, 태반으로부터 제대혈을 배수하는 것을 보조하기 위해 태반을 부드럽게 마사지한다. 제대혈은 예를 들어, 혈액 백, 이동 백 또는 멸균 플라스틱 튜브에 수집될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 제대혈은 상업 제대혈 은행 (예를 들어, 라이프뱅크유에스에이(LifeBankUSA) 등)으로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 제대혈을 산후 포유동물 태반으로부터 수집하고, 즉시 (예를 들어, 수집 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 시간 내에) 사용한다. 다른 실시양태에서, 조산아를 치료하기 위해 사용되는 제대혈은 동결보존된 제대혈이다. 제대혈은 단일 태반 또는 다수의 태반으로부터 수집될 수 있다.
조산아에게 투여되는 제대혈은 자가유래 또는 이종일 수 있다. 특정 실시양태에서, 제대혈은 치료되는 조산아의 태반으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 제대혈은 만기 출산의 산후 포유동물 태반으로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 제대혈은 조산의 산후 포유동물 태반, 예를 들어 조산아의 태반으로부터 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 23주 내지 약 25주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 26주 내지 약 29주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 30주 내지 약 33주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 34주 내지 약 37주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다.
제대혈 또는 이로부터 유래된 줄기 세포는 투여를 위해 단일 개인으로부터 수집된 채로 (즉, 단일 유닛으로서) 저장될 수 있거나, 다른 유닛과 함께 풀링될 수 있다. 제대혈이 다수의 태반으로부터 풀링된 경우, 풀링된 제대혈은 오직 만기 출산으로부터의 제대혈, 만기 출산들의 조합으로부터의 제대혈 또는 오직 조산으로부터의 제대혈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조산아의 태반으로부터의 제대혈은 예를 들어 다른 조산아로부터의 제대혈, 오직 만기 출산으로부터의 제대혈, 또는 조산 및 만기출산 태반 양자 모두로부터의 제대혈의 조합과 조합될 수 있다. 자가유래 또는 동종이계 제대혈을 포함하는 제대혈은 또한 말초 혈액과 조합될 수 있다. 조산으로부터의 제대혈이 바람직하며, 이는 이러한 제대혈이 만기 출산으로부터의 제대혈과 비교하여 유닛 부피 당 상대적으로 많은 수의 CD34+ 줄기 세포를 포함하기 때문이다.
몇몇 실시양태에서, 제대혈에 존재하는 총 유핵 세포는 적어도 5％, 10％, 15％, 20％ 또는 그 이상의 CD38+CD45+ 세포를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제대혈에 존재하는 총 유핵 세포는 적어도 25％, 30％, 40％, 50％ 또는 그 이상의 CD38-CD45- 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제대혈은 조기분만 태반으로부터 제조된다. 다른 실시양태에서, 제대혈은 만기분만 태반으로부터 제조된다.
5.3 태반 줄기 세포
본원에서 사용되는 용어 "태반 줄기 세포"는 형태학, 세포 표면 마커 등과 상관없이 포유동물 태반 또는 그의 부분 (예를 들어, 양막, 융모막 등)으로부터 얻거나 이로부터 유래된 조직 배양 플라스틱-접착성 줄기 세포 (예를 들어, 다능(multipotent) 세포)를 지칭한다. 상기 어구는 태반으로부터 직접 얻은 줄기 세포 (예를 들어, 태반 관류액 또는 소화된 태반 조직 (소화물) 중 태반 세포의 집단의 부분으로서) 또는 1회 이상 팽창되고/거나 통과된 태반 세포의 집단의 부분인 줄기 세포를 포함한다. 그러나, 상기 용어는 오로지 다른 조직, 예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈로부터 유래된 줄기 세포를 포함하지 않는다. 태반은 예를 들어, 독특한 마커 세트를 갖고 이에 의해 서로 구별가능한 줄기 세포 집단을 포함한다. 태반 줄기 세포 및 이를 얻는 방법은 미국 특허 제7,045,148호, 제7,255,879호 및 2006년 12월 26일에 출원된 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
태반 줄기 세포는 성공적인 출산 및 태반 만출 후 회수될 수 있으며, 이는 십억개 만큼 많은 수의 유핵 세포를 회수하고, 오천만 내지 일억개의 다능 및 만능(pluripotent) 줄기 세포를 제공한다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 태반 줄기 세포에는 예를 들어, 태반으로부터의 만능 세포, 다능 세포, 수임 선조 세포, 조혈 선조 세포 및 중간엽-유사 줄기 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 태반 관류액 내에 함유되거나 이로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 하나 이상의 조직-소화 효소 (예를 들어, 콜라게나제, 히알루로니다제 등)에 의해 소화된 태반 조직 내에 함유되거나 이로부터 유래된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 태반-유래 줄기 세포는 단일 태반 또는 다수의 태반으로부터 유래될 수 있다.
특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 만기 출산의 태반으로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 조산의 태반으로부터 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 23주 내지 약 25주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 26주 내지 약 29주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 30주 내지 약 33주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다. 몇몇 실시양태에서, 태반은 약 34주 내지 약 37주의 제태기간에 출생한 유아의 태반이다.
태반 줄기 세포는 치료되는 특정 조산아에 대해 자가유래 또는 동종이계일 수 있다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 치료되는 조산아로부터 얻는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 태반 줄기 세포는 임의의 방법에 의해 얻을 수 있다. 태반 줄기 세포는 예를 들어 미국 특허 제7,045,148호에 개시된 바와 같이 관류에 의해 얻을 수 있으며, 상기 특허는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 이러한 관류는 관류 액체를 태반 혈관구조를 통해 밀어내고, 태반, 전형적으로 모체 측으로부터 삼출하는 관류액을 태반을 함유하는 팬에서 수집하는 팬 방법에 의한 관류일 수 있다. 관류는 또한 관류액을 오직 태반의 태아 혈관구조를 통해 통과시키고 이로부터 수집하는 폐쇄-회로 관류일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 이러한 관류는 연속적일 수 있으며, 즉 태반을 통해 통과되고 다수의 태반 세포를 포함하는 관류액을 태반 세포의 단리전 2회 또는 수회 통과시킨다.
태반-유래 줄기 세포는 또한 태반의 물리적 또는 효소적 붕괴에 의해, 예를 들어 태반의 다세포 구조를 붕괴시키는 프로테아제 및/또는 다른 조직-붕괴 효소를 사용하여 얻을 수 있다. 이러한 프로테아제에는 중성 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예를 들어 콜라게나제, 디스파제, 트립신, 엘라스타제 등이 포함될 수 있다. 태반 줄기 세포는 또한 태반의 물리적 붕괴에 의해 예를 들어 점액용해 효소, 예를 들어 히알루로니다제를 사용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 단리된 관류된 태반은 CD34+ 줄기 세포, 예를 들어 CD34+CD38- 줄기 세포, 및 CD34- 줄기 세포, 예를 들어 CD34-CD38+ 줄기 세포가 풍부한 다량의 줄기 세포의 공급원을 제공한다. 태반으로부터의 혈액의 제1 수집은 제대혈이라고 지칭되며, 이는 주로 CD34+CD38+ 조혈 선조 세포를 함유한다. 산후 관류의 처음 24시간 내에, CD34+CD38- 조혈 선조 세포는 CD34-CD38+ 세포와 함께 태반으로부터 단리될 수 있다. 관류의 약 24시간 후, CD34-CD38- 세포가 상기 언급된 세포와 함께 태반으로부터 단리될 수 있다. 24시간 이상 동안 관류된 단리된 태반은 CD34-CD38- 줄기 세포가 풍부한 다량의 줄기 세포의 공급원을 제공한다.
하나 이상의 부류의 인간 태반 줄기 세포는 배아 줄기 또는 생식 세포의 특징을 갖는다. 예를 들어, 이 부류의 줄기 세포는 SSEA3- (단계-특이적 배아 항원 3), SSEA4-, OCT-4+ (줄기 세포 전사 인자) 및/또는 ABC-p+ (ATP-결합 카세트 (ABC) 수송 단백질), 아직 분화를 거치지 않은 만능 줄기 세포에 의해 나타난 마커 프로파일이다. 그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 유용한 태반 줄기 세포는 SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및/또는 ABC-p+이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 배아-유사 줄기 세포는 OCT-4+ 및 ABC-p+이다. 다른 실시양태에서, 인간 태반 줄기 세포는 MHC 클래스 2 항원을 발현하지 않는다.
본 발명의 방법에서 사용가능한 바람직한 태반 줄기 세포는 CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및/또는 ABC-p이다.
본 발명에 따라 사용되는 바람직한 줄기 세포는 CD34-, OCT-4+, CD73+, CD105+, CD200+ 및 HLA-G+이다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD34- 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+ 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 CD200+인 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200+ 또는 HLA-G+인 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200+ 및 OCT-4+인 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+ 및 CD105+이며 상기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우에 상기 집단 내 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진하는 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 HLA-G+인 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+이며 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우에 상기 집단 내 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진하는 세포를 포함한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 조산아에게 제대혈 및 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 조산아의 치료 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD200+ 또는 HLA-G+이다. 구체적인 실시양태에서, 줄기 세포는 또한 CD200+ 및 HLA-G+이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD73+ 및 CD105+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 CD200+ 또는 HLA-G+ 줄기 세포는 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 줄기 세포를 포함하는 태반-유래 세포의 집단에서 배아상-유사체의 형성을 촉진한다.
다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 CD200+이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 HLA-G+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 또한 CD34-, CD38-, CD45- 및 HLA-G+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, CD73+, CD105+ 및 CD200+ 줄기 세포는 줄기 세포를 포함하는 태반-유래 세포의 집단에서 상기 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진한다.
다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200+ 및 OCT-4+이다. 더 구체적인 실시양태에서, 줄기 세포는 또한 CD73+ 및 CD105+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 또한 HLA-G+이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G+이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 줄기 세포를 포함하는 태반-유래 세포의 집단에서 상기 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우 하나 이상의 배아상-유사체의 형성을 촉진한다.
다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD73+, CD105+ 및 HLA-G+이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 CD73+, CD105+ 및 HLA-G+ 줄기 세포는 OCT-4+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD200+이다. 더 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+이다. 다른 더 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단에서 상기 집단이 배아상-유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우 배아상-유사체의 형성을 촉진한다.
다른 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및 ABC-p+ 중 하나 이상일 수 있다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 OCT-4+ 및 ABC-p+이다. 한 실시양태에서, 인간 태반 줄기 세포는 MHC 클래스 II 항원을 발현하지 않는다. 다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD10+, CD38-, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및/또는 ABC-p+ 중 하나 이상이다.
다른 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 균질하고 멸균이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 인간에게 투여하기에 적합한 제약 등급 용액으로 존재한다.
마커, 예컨대 세포 표면 마커는 통상적으로 당분야에 익히 공지된 방법에 따라, 예를 들어 유동 세포계측법 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 세척하고 적절한 형광단으로 표지된 항-세포 표면 마커 항체로 염색함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위해, 세포를 PBS에서 세척한 후, 항-CD34 피코에리트린 및 항-CD38 플루오레세인 이소티오시아네이트 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)로 이중-염색할 수 있다. 그 후, 표준 유동 세포계측기를 사용하여 세포를 분석한다. 별법으로, 세포내 마커를 또한 표준 방법을 통해 검사할 수 있다.
5.4 태반 줄기 세포의 수집 및 특징화
태반 줄기 세포는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수집되고 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 미국 특허 제7,045,148호 또는 2006년 12월 26일에 출원된 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 기재된 바와 같이 단리되고 수집되며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 태반 줄기 세포를 수집하는 방법은 하기 기재되어 있다.
5.4.1 관류에 의한 태반 줄기 세포의 단리
5.4.1.1 태반의 전처리
태반 줄기 세포의 수집은 태반, 예를 들어 인간 태반의 수집으로 시작한다. 특정 실시양태에서, 인간 태반을 출산후 그의 만출 직후 회수하고, 특정 실시양태에서, 태반 내의 제대혈을 회수한다. 구체적인 실시양태에서, 태반을 조산아의 치료에 대한 부가물로서 통상적인 제대혈 회수 공정 (예를 들어, 특정 조산아의 필요에 응한 제대혈의 회수)으로 처리한다. 제대혈을 또한 상업 제대혈 은행 서비스, 예를 들어 라이프뱅크유에스에이(LifeBankUSA) (미국 뉴저지주 시더 놀스 소재)로부터 얻을 수 있다.
전형적으로, 제대혈 수집은 다음과 같이 진행한다. 산후 (제왕 절개 또는 자연 분만 후), 태반을 방혈하며, 예를 들어 제대혈을 배수한다. 제대혈 수집 전에, 태반을 멸균 조건하에 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 25℃의 온도에서 또는 약 실온에서 저장할 수 있다. 특정 실시양태에서, 근위 제대를 바람직하게는 제대혈 회수 전에 태반 디스크로의 삽입의 4 내지 5 cm (센티미터) 내에 클램핑한다. 다른 실시양태에서, 근위 제대를 제대혈 회수 후, 태반의 추가 처리 전에 클램핑한다. 제대혈의 수집을 위한 통상적인 기술을 사용할 수 있다. 전형적으로, 중력의 도움으로 태반으로부터 제대혈을 배수하기 위해 (즉, 방혈) 바늘 또는 캐뉼라를 사용한다 (예를 들어, 보이세(Boyse) 등의 미국 특허 제5,192,553호; 보이세 등의 미국 특허 제5,004,681호; 앤더슨(Anderson)의 미국 특허 제5,372,581호; 헤셀(Hessel) 등의 미국 특허 제5,415,665호 참조). 바늘 또는 캐뉼라를 통상적으로 제정맥에 위치시키고, 태반으로부터 제대혈을 배수하는 것을 돕기 위해 태반을 부드럽게 마사지한다.
그 후, 임의의 잔여 제대혈을 제거하기 위해 태반을 관류하기 전 약 1 시간 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 4 내지 약 24 시간의 기간 동안 태반을 저장할 수 있다.
제대혈 수집 후, 태반을 바람직하게는 약 5℃ 내지 약 25℃의 온도에서, 예를 들어 약 실온에서 항응고제 용액에서 저장한다. 적합한 항응고제 용액은 당분야에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 와파린 나트륨의 용액을 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항응고제 용액은 헤파린 용액 (1:1000 용액 중 1％ w/w)을 포함한다. 배수된 태반은 바람직하게는 하기 기재된 바와 같이 태반 줄기 세포를 수집하기 전에 36 시간 이하 동안 저장된다.
전형적으로, 예를 들어 태반 조직의 관류 또는 효소 소화에 의한 제대혈 및/또는 배수액의 회수 및 줄기 세포 수집을 위해, 태반을 분만실 또는 출산실로부터 다른 위치, 예를 들어 실험실로 이동시킨다. 태반은 바람직하게는 예를 들어 도 2a 내지 2e에 나타낸 바와 같이 근위 제대를 클램핑한 상태에서 태반을 멸균 집-락(zip-lock) 플라스틱 백에 위치시킨 후 단열된 컨테이너에 위치시킴으로써 멸균의 단열된 이송 장치 (예를 들어, 태반 온도를 약 20℃ 내지 약 28℃로 유지시키는 장치)에서 이송시킨다.
바람직한 실시양태에서, 태반을 통지된 동의서에 의해 환자로부터 회수하고, 임신전, 임신 기간 동안 및 임신후 환자의 완전한 의료 병력을 또한 취하고, 태반과 연관시킨다. 태반 또는 이로부터 수확된 줄기 세포의 후속적인 사용을 조정하기 위해 이들 의료 기록을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 인간 태반 줄기 세포를 그 후 치료되는 조산아를 위한 개인화된 의료를 위해 쉽게 사용할 수 있다.
5.4.1.2 태반의 방혈 및 잔여 세포의 제거
제대혈 회수 후, 태반으로부터 태반 줄기 세포를 예를 들어 관류에 의해 회수한다. 한 측면에서, 잔여 제대혈을 제거하기 위해 적합한 수성 관류 유체로 방혈된 태반을 관류한다. 관류 용액은 항응고제 (예를 들어, 헤파린, 와파린 나트륨)를 바람직하게는 용해시키는 임의의 수성 등장성 유체일 수 있다. 관류를 위한 이러한 수성 등장성 유체는 당분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들어 영양소 배지, 염수 용액, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수 또는 바람직하게는, 0.9 N 염화나트륨 용액을 포함한다. 관류 유체는 바람직하게는 임의의 잔여 제대혈의 혈병 형성을 방지하기에 충분한 농도로 항응고제를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 헤파린 1 내지 100 유닛의 농도가 사용되며, 바람직하게는 ml 당 헤파린 1 내지 10 유닛의 농도가 사용된다. 한 실시양태에서, 세포자멸(apoptosis) 억제제, 예컨대 자유 라디칼 스캐빈저, 특히 산소 자유 라디칼 스캐빈저를 방혈 동안 및 방혈 직후 사용할 수 있으며, 그 후 이들 약제를 태반으로부터 세척할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에 따라, 단리된 태반을 세포자멸을 방지하거나 억제하기 위해 체온저하 조건 하에 저장할 수 있다.
바람직하게는, 태반 줄기 세포의 수집 전에, 실질적으로 모든 나머지 제대혈을 제거하기 위해 태반을 예를 들어 관류 유체 10 내지 100 mL로 플러싱한다. 전형적으로, 태반으로 중력 유동을 사용하여 제동맥 및 제정맥 중 하나 또는 양자 모두를 통해 관류 유체를 통과시킴으로써 이러한 플러싱을 수행한다. 태반을 바람직하게는 제동맥 및 제정맥을 태반의 최고점에 위치시키는 방법으로 배향시킨다 (예를 들어, 매단다). 바람직한 실시양태에서, 제동맥 및 제정맥을 도 1에 나타낸 바와 같이 가요성 커넥터를 통해 관류 유체의 저장부에 연결된 피펫에 동시에 연결시킨다. 관류 유체를 제정맥 및 제동맥으로 통과시키고, 제태기간 동안 모체의 자궁에 부착된 태반의 표면으로부터 적합한 개방 혈관에서 수집한다. 관류 유체를 또한 제대 개구부를 통해 도입하고, 모체 자궁벽과 접한 태반벽 내의 개구부 밖으로 유동시키거나 거른다.
바람직한 실시양태에서, 근위 제대를 관류 동안 클램핑하며, 보다 바람직하게는 태반 디스크로의 제대의 삽입의 4 내지 5 cm (센티미터) 내에 클램핑한다.
한 실시양태에서, 모든 잔여 제대혈의 제거, 및 제대혈의 제거 후 태반 내에 잔류하는 배아-유사 줄기 세포 및 선조 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 태반 세포의 후속적인 수집 또는 회수에 이르게 하기에 충분한 양의 관류액을 사용한다.
관류 유체를 플러싱 동안 태반으로부터 먼저 수집하는 경우 유체는 제대혈의 잔여 적혈구로 색을 띠는 것이 관찰되었다. 관류 유체는 관류가 진행됨에 따라 더 투명해지는 경향이 있고, 잔여 제대혈 세포를 태반 밖으로 세척한다. 일반적으로, 관류 유체 30 내지 100 ml (밀리리터)가 태반을 방혈하고 배아-유사 세포의 초기 집단을 태반으로부터 회수하기에 적절하나, 관찰된 결과에 의존하여 더 많거나 더 적은 관류액을 사용할 수 있다.
5.4.1.3 태반의 배양
바람직한 실시양태에서, 태반을 무균 조건 하에 컨테이너 또는 다른 적합한 용기에서 배양하거나 재배하고, 항응고제 (예를 들어, 헤파린, 와파린 나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)를 함유하거나 함유하지 않고/거나 항미생물제 (예를 들어, β-머캅토에탄올 (0.1 mM); 항생제, 예컨대 스트렙토마이신 (예를 들어, 40 내지 100 ㎍/ml), 페니실린 (예를 들어, 40 U/ml), 암포테리신 B (예를 들어, 0.5 ㎍/ml) 등을 함유하거나 함유하지 않는 관류액 용액 (예를 들어, 식염수 용액, 예컨대 포스페이트 완충된 염수 ("PBS"), 또는 바람직하게는, 0.9 N 염수 용액)으로 관류한다. 태반 배양 또는 재배를 위한 관류 유체로서, 소 태아 혈청 (FBS), 전체 인간 혈청 (WHS) 또는 태반의 분만시 수집된 인간 제대 혈청으로 보충된 다양한 배지, 예컨대 DMEM, 햄(Ham)의 F-12, M199, RPMI, 피셔(Fisher), 이스코브(Iscove), 맥코이(McCoy) 및 이들의 조합물을 사용할 수 있다. 잔여 제대혈의 태반을 방혈하기 위해 사용된 동일한 관류 유체를 항응고제의 첨가 없이 태반을 배양하거나 재배하는데 사용할 수 있다.
유출 관류액은 태반 순환을 통해 유동한 순환 관류액, 및 혈관벽으로부터 또는 이를 통해 태반의 주변 조직으로부터 삼출하거나 통과한 혈관외유출 관류액 양자 모두를 포함한다. 유출 관류액 또는 순환 관류액, 또는 바람직하게는 순환 관류액 및 혈관외유출 관류액 양자 모두를 바람직하게는 멸균 리셉터클에서 수집한다. 태반을 유지시키는 조건 및 관류액의 성질을 변화시켜, 유출 관류액의 부피 및 조성을 조정할 수 있다.
그 후, 당업자에 의해 공지된 기술, 예를 들어 밀도 기울기 원심분리, 자성 세포 분리, FACS에 의한 세포 분류, 친화도 세포 분리 또는 차별 접착 기술 (이에 제한되지 않음)을 이용함으로써 수집된 관류액으로부터 세포 유형을 단리한다.
한 실시양태에서, 태반을 멸균 그릇에 위치시키고, 포스페이트-완충 식염수 500 ml로 세척한다. 그 후, 세척액을 버린다. 이어서, 멸균 연결 기구, 예컨대 멸균 관에 연결된 캐뉼라, 예를 들어 테플론(TEFLON)® 또는 플라스틱 캐뉼라로 제정맥을 캐뉼라삽입한다. 멸균 연결 기구를 도 3에 나타낸 바와 같이 관류 매니폴드에 연결한다. 그 후, 태반을 함유하는 컨테이너를 덮고, 태반을 실온 (20 내지 25℃)에서 원하는 기간 동안, 바람직하게는 2 내지 24 시간, 및 바람직하게는 48 시간 이하 동안 유지시킨다. 동일한 부피의 관류액을 도입하고, 유출 관류액을 제거하거나 수집하여, 태반을 연속적으로 관류시킬 수 있다. 별법으로, 일정 부피의 관류액, 예를 들어 100 ml의 관류액 (1000 u/l 헤파린 및/또는 EDTA 및/또는 CPDA (크레아틴 포스페이트 덱스트로스)로 보충되거나 보충되지 않은 멸균 식염수)으로 태반을 주기적으로, 예를 들어 2시간 마다; 4, 8, 12 및 24시간 마다; 또는 다른 간격으로 배양 도중 관류할 수 있다. 주기적 관류의 경우, 바람직하게는 안정한 부피의 관류액이 항상 태반을 적시도록, 동일한 부피의 관류액을 도입하고 태반의 배양 환경으로부터 제거한다.
예를 들어 태반의 반대 표면에서 태반을 빠져나오는 유출 관류액을 수집하고 처리하여, 배아-유사 줄기 세포, 선조 세포 또는 관심있는 다른 세포를 단리한다.
번식된 세포의 수 및 유형은 표준 세포 검출 기술, 예컨대 유동 세포계측법, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어, 조직 특이적 또는 세포-마커 특이적 항체에 의한 염색), 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자성 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 형태학 및 세포 표면 마커의 변화를 측정함으로써, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태학을 검사함으로써, 또는 당분야에 익히 공지된 기술, 예컨대 PCR 및 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 유전자 발현의 변화를 측정함으로써 쉽게 모니터링될 수 있다.
한 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 분류될 수 있다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 특성을 기준으로 세포를 포함하는 입자를 분리하기 위한 익히 공지된 방법이다 (문헌 [Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165]). 개별 입자의 형광 부분의 레이저 여기는 작은 전하를 야기하며, 이는 혼합물로부터 양성 및 음성 입자의 전자기 분리를 허용한다. 한 실시양태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드는 독특한 형광 표지로 표지된다. 세포는 사용되는 항체에 결합하는 능력을 기준으로 세포를 분리하는 세포 분류기를 통해 처리된다. FACS 분류된 입자는 분리 및 클로닝을 촉진하기 위해 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰에 직접 침착될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포를 분리하기 위해 자성 비드를 사용할 수 있다. 세포는 자성 비드 (0.5 내지 100 ㎛ 직경)에 결합하는 능력을 기초로 하여 입자를 분리하는 방법인 자성 활성화 세포 분류 (MACS) 기술을 사용하여 분류될 수 있다. 세포-고체 상 표면 분자 또는 합텐을 특이적으로 인식하는 항체의 공유결합 첨가를 포함하는 자성 미소구 상의 다양한 유용한 변형을 수행할 수 있다. 그 후, 선택된 비드를 물리적으로 조작하기 위해 자기장을 적용한다. 그 후, 비드를 세포와 혼합하여 결합시킨다. 이어서, 자기장을 통해 세포를 통과시켜, 세포 표면 마커를 갖는 세포를 분리한다. 그 후, 이들 세포를 단리하고, 추가 세포 표면 마커에 대한 항체에 커플링된 자성 비드와 재혼합할 수 있다. 세포를 다시 자기장을 통해 통과시켜, 항체 양자 모두에 결합한 세포를 단리한다. 그 후, 이러한 세포를 클론 단리를 위한 별도의 접시, 예컨대 마이크로타이터 접시로 희석할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 배수되고 방혈된 태반을, 태반 줄기 세포의 번식을 위한 생물반응기, 즉 생체외 시스템으로 배양한다. 태반 생물반응기 중 번식된 세포의 수는 번식된 세포를 회수할 수 있는 태반 생물반응기에 도입된 배양 배지 또는 관류 유체의 일부를 주기적으로 또는 연속적으로 제거함으로써 균형잡힌 성장의 연속적인 상태로 유지될 수 있다. 신선한 배지 또는 관류 유체를 동일한 속도 또는 동일한 양으로 도입한다. 태반을 생물반응기로서 사용하기 위해, 다양한 시간 동안 멸균 조건 하에 본원에 개시된 바와 같이 관류액 용액으로 관류함으로써 배양할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 태반을 적어도 약 12, 24, 36 또는 48 시간 동안, 또는 3 내지 5일 동안, 6 내지 10일 동안, 또는 1 내지 2주 동안 배양한다. 바람직한 실시양태에서, 태반을 약 48 시간 동안 배양한다. 배양된 태반을 바람직하게는, 소비된 배지 및 배지에 현탁된 세포의 제거 및 신선한 배지의 첨가에 의해 주기적으로 "영양공급"한다. 배양된 태반을 바람직하게는 오염 가능성을 감소시키기 위해 멸균 조건 하에 저장하고, 태반의 세포에 영양소의 적절한 공급을 유지하는 조건을 만들기 위해 간헐적 및 주기적 여압 하에 유지한다. 효율 및 용량 증가를 위해 태반의 관류 및 배양을 자동화화하고 컴퓨터화할 수 있다.
특정 실시양태에서, 영양소, 호르몬, 비타민, 성장 인자 또는 이들의 임의의 조합을 관류 용액에 도입함으로써 태반 생물반응기에서 태반 줄기 세포를 번식하도록 유도시킨다. 혈청 및 다른 성장 인자를 번식 관류 용액 또는 배지에 첨가할 수 있다. 성장 인자는 통상적으로 단백질이고, 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 집락 자극 인자 (CSF), 인터페론, 케모카인 및 인터류킨이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 성장 인자에는 재조합 인간 조혈 성장 인자, 예를 들어 리간드, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴 (Tpo), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 백혈병 억제 인자, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 태반 유래 성장 인자 및 표피 성장 인자가 포함된다.
5.4.1.4 태반으로부터 세포의 수집
상기 개시된 바와 같이, 태반의 방혈 및 관류 후, 배아-유사 줄기 세포는 배수된 빈 미세순환으로 이동하며, 여기서 이는 본 발명의 방법에 따라 바람직하게는 수집 혈관에서 유출 관류액을 수집함으로써 수집된다.
바람직한 실시양태에서, 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 밀도 기울기 원심분리, 자성 세포 분리, FACS 분류, 또는 당분야에 익히 공지된 다른 세포 분리 또는 분류 방법을 이용하여 태반에서 배양된 세포를 유출 관류액으로부터 단리하고, 예를 들어 도 4에 나타낸 식에 따라 분류한다.
구체적인 실시양태에서, 태반으로부터 수집된 세포를 예를 들어 약 5000 X g에서 약 15분 동안 실온에서 원심분리에 의해 유출 관류액으로부터 회수할 수 있으며, 이는 오염 잔해 및 혈소판으로부터 세포를 분리한다. 세포 펠렛을 예를 들어, 2 U/ml 헤파린 및 2 mM EDTA를 함유하는 IMDM 혈청-비함유 배지 (깁코비알엘(GibcoBRL), 미국 뉴욕주 소재)에서 재현탁한다. 성분채집술을 이용하여, 바람직하게는 상업 수집 키트, 예컨대 LYMPHOPREP™ (니코메드 파마(Nycomed Pharma), 노르웨이 오슬로 소재)을 사용하여 총 단핵 세포 분획물을 단리할 수 있다. 그 후, 예를 들어 혈구계측기를 사용하여 세포를 개수한다. 생존력을 전형적으로 트립판 블루 배제에 의해 평가한다. 세포의 단리를 바람직하게는 예를 들어, 0.2％ EDTA와의 0.05％ 트립신의 용액 (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)을 사용하는 "차별 트립신화"에 의해 달성한다. 이 방법으로 트립신화된 섬유모세포양 세포는 플라스틱 세포 배양 표면으로부터 약 5분 내에 박리하는 반면, 다른 접착성 집단은 트립신과의 약 20 내지 30분 초과의 인큐베이션을 필요로 하기 때문에 차별 트립신화가 가능하다. 트립신화 및 트립신 중화 용액 (TNS, 바이오휘테이커(BioWhittaker))을 사용하는 트립신 중화 후 박리된 섬유모세포양 세포를 수확한다. 그 후, 세포를 영양소 배지, 예컨대 H.DMEM에서 세척하고, 예를 들어 MSCGM에서 재현탁할 수 있다.
다른 실시양태에서, 관류액을 수집하기 전 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20 또는 24 시간 또는 심지어 수일 동안 태반을 관류할 수 있도록, 관류액을 수집하기 않고 일정 기간 동안 단리된 태반을 관류한다. 이러한 실시양태에서, 예를 들어 관류 유체를 태반에 도입하고, 수집 전에 일정 시간 동안 태반 혈관구조를 차지하게 할 수 있거나, 순환 관류액의 경우 관류 유체를 이러한 시간 동안 재순환시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포를 태반으로부터 물리적으로 절개함으로써 태반 생물반응기에서 배양된 세포를 태반으로부터 단리한다.
다른 실시양태에서, 태반의 조직 또는 그의 일부를 해리시키고, 배양된 세포를 당분야에 공지된 세포 분리 또는 분류 방법, 예컨대 밀도 기울기 원심분리, 자성 세포 분리, FACS 분류 등에 의해 회수함으로써, 태반 생물반응기에서 배양된 세포를 태반으로부터 단리한다.
바람직한 실시양태에서, 회수된 유핵 세포의 수가 100개 세포/ml 미만으로 떨어질 때까지 태반의 관류 및 유출 관류액의 수집을 태반의 배양 도중 1회 또는 2회 반복한다. 관류액을 풀링하고, 광 원심분리로 처리하여, 혈소판, 잔해 및 탈핵 세포막을 제거한다. 그 후, 유핵 세포를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 기울기 원심분리에 의해 단리하고, 세척 후 HDMEM에서 재현탁한다. 접착성 세포의 단리를 위해, 5 내지 10 x 106개 세포의 분취액을 여러 T-75 플라스크 각각에 위치시키고, 바이오휘테이커로부터 얻은 상업적으로 이용가능한 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM)로 배양하고, 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5％ CO2)에 위치시킨다. 10 내지 15일 후, 비접착성 세포를 PBS로 세척함으로써 플라스크로부터 제거한다. 그 후, PBS를 MSCGM으로 대체한다. 플라스크를 바람직하게는 다양한 접착성 세포 유형의 존재 및 특히 섬유모세포양 세포의 클러스터의 확인 및 팽창에 대해 매일 검사한다.
다른 실시양태에서, 태반으로부터 수집된 세포를 이후 사용을 위해 동결보존한다. 줄기 세포와 같은 세포의 동결보존 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다 (예를 들어, 보이세 등 (1993년 3월 9일에 허여된 미국 특허 제5,192,553호) 또는 휴(Hu) 등 (2000년 12월 7일에 공개된 제WO 00/73421호)의 방법을 이용한 동결보존).
5.4.2 물리적 붕괴에 의한 태반 줄기 세포의 단리
태반 줄기 세포를 장기의 물리적 붕괴, 예를 들어 효소 소화에 의해 포유동물 태반으로부터 수집할 수 있다. 예를 들어, 태반 또는 그의 부분을 본 발명의 줄기 세포 수집 조성물과 접촉시키면서 예를 들어 파쇄하거나, 전단하거나, 저미거나, 깍둑썰기하거나, 잘게 썰거나, 연하게 하는 등으로 처리할 수 있고, 조직을 1종 이상의 효소에 의해 후속적으로 소화시킬 수 있다. 태반 또는 그의 부분을 또한 물리적으로 붕괴시키고, 1종 이상의 효소에 의해 소화시킨 후, 얻어진 물질을 본 발명의 줄기 세포 수집 조성물에 침지시키거나 혼합할 수 있다. 물리적 붕괴 방법이 상기 장기 중 다수, 보다 바람직하게는 대다수, 및 보다 바람직하게는 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 세포를 생존가능하게 유지시키는 한 (예를 들어, 트립판 블루 배제에 의해 결정됨), 임의의 물리적 붕괴 방법이 사용될 수 있다.
태반을 물리적 붕괴 및/또는 효소 소화 및 줄기 세포 회수 전에 구성성분으로 절개할 수 있다. 예를 들어, 태반-유래 줄기 세포를 양막, 융모막, 제대, 태반엽 또는 이들의 임의의 조합으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 태반-유래 줄기 세포를 양막 및 융모막을 포함하는 태반 조직으로부터 얻는다. 전형적으로, 태반-유래 줄기 세포를 태반 조직의 작은 블록, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 세제곱 밀리미터인 태반 조직의 블록의 붕괴에 의해 얻을 수 있다.
바람직한 줄기 세포 수집 조성물은 1종 이상의 조직-붕괴 효소(들)를 포함한다. 효소 소화는 바람직하게는 효소들의 조합, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테아제 및 중성 프로테아제의 조합, 예를 들어 콜라게나제 및 디스파제의 조합을 사용한다. 한 실시양태에서, 태반 조직의 효소 소화는 히알루론산의 소화를 위해 매트릭스 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 점액용해 효소의 조합, 예컨대 콜라게나제, 디스파제 및 히알루로니다제의 조합 또는 리베라제(LIBERASE)® (베링거 만하임 코포레이션(Boehringer Mannheim Corp.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 히알루로니다제의 조합을 사용한다. 태반 조직을 붕괴하기 위해 사용될 수 있는 다른 효소에는 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예컨대 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제가 포함된다. 세린 프로테아제는 혈청 중 알파 2 마이크로글로불린에 의해 억제될 수 있으며, 그러므로 소화를 위해 사용되는 배지는 통상적으로 혈청-비함유이다. EDTA 및 DNase가 세포 회수 효율을 증가시키기 위해 효소 소화 절차에서 일반적으로 사용된다. 소화물은 점성 소화물 내의 줄기 세포를 포획하는 것을 회피하기 위해 바람직하게는 희석된다.
조직 소화 효소의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 조직 소화 효소에 대한 전형적인 농도는 예를 들어, 콜라게나제 I 및 콜라게나제 IV에 대해 50 내지 200 U/mL, 디스파제에 대해 1 내지 10 U/mL, 및 엘라스타제에 대해 10 내지 100 U/mL를 포함한다. 프로테아제는 조합으로, 즉 동일한 소화 반응에서 둘 이상의 프로테아제로 사용될 수 있거나, 태반 줄기 세포를 유리시키기 위해 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 태반 또는 그의 부분은 먼저 적절한 양의 콜라게나제 I (2 mg/ml)에 의해 30분 동안 소화된 후, 트립신 0.25％에 의해 10분 동안 37℃에서 소화된다. 세린 프로테아제는 바람직하게는 다른 효소의 사용 후 연속하여 사용된다.
다른 실시양태에서, 조직은 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 수집 조성물에, 또는 줄기 세포 수집 조성물에 의한 줄기 세포의 단리 전에 조직이 붕괴되고/거나 소화된 용액에 킬레이터, 예를 들어 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N'N'-테트라아세트산 (EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 첨가함으로써 추가로 붕괴될 수 있다.
전체 태반 또는 태반의 부분이 태아 및 모체 세포 양자 모두를 포함하는 경우 (예를 들어, 태반의 부분이 융모막 또는 태반엽을 포함하는 경우), 수집된 태반-유래 줄기 세포가 태아 및 모체 공급원 양자 모두로부터 유래된 태반-유래 줄기 세포의 혼합물을 포함할 것이라는 것이 이해될 것이다. 태반의 부분이 모체 세포 (예를 들어, 양막)를 매우 소량 포함하거나 전혀 포함하지 않는 경우, 수집된 태반-유래 줄기 세포는 거의 배타적으로 태아 태반-유래 줄기 세포를 포함할 것이다.
소화된 태반 조직 중 태반 줄기 세포는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 이러한 세포를 소화된 조직 중 다른 세포와 배양하고 차별 트립신화에 의해 단리함으로써 단리될 수 있다. 별법으로, 이러한 세포는 태반 줄기 세포 마커에 대한 하나 이상의 항체를 사용한 후, 예를 들어 자성 비드 분리에 의해 정제될 수 있다. 섹션 5.4.1.4를 참조한다.
5.5 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물
본 발명은 제대혈 및 태반 줄기 세포의 조합물을 사용함으로써 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 태반 줄기 세포는 태반 관류액 내에 함유된 줄기 세포; 태반 관류액으로부터 초기에 수집된 태반 줄기 세포; 태반 조직의 소화로부터 수집된 태반 줄기 세포; 태반 관류액 또는 태반 조직의 소화로부터의 태반 줄기 세포일 수 있으며, 여기서 태반 줄기 세포는 태반 줄기 세포가 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40 집단 배가; 또는 상기들의 임의의 조합으로 번식하기에 충분한 시간 동안 세포 배양물에서 배양된다. 조산아의 치료에서 제대혈과 조합되는 태반 줄기 세포는 단일 태반 또는 다수의 태반으로부터 유래될 수 있다.
제대혈 대 태반 줄기 세포의 비율은 당업자의 판단에 따라 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각 집단 중 총 유핵 세포의 개수를 포함하거나 또는 각 집단 중 줄기 세포의 총 수를 포함하는, 제대혈 대 태반 줄기 세포의 비율은 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; 또는 약 1:100,000,000이다. 바람직한 실시양태에서, 제대혈 대 태반 줄기 세포의 비율은 약 20:1 내지 약 1:20이거나, 약 1:10, 약 1:5, 약 1:1, 약 5:1 또는 약 10:1이다.
태반 줄기 세포 및 제대혈은 조산아에게 투여 전에 조합될 수 있거나, 별도로 투여될 수 있다.
5.5.1 제약 조성물
본 발명은 또한 제대혈 및 태반 줄기 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
이 실시양태에 따라, 본 발명의 조합된 제대혈 및 태반 줄기 세포는 주사가능한 조성물로서 제제화될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 도입된 제WO 96/39101호). 다른 실시양태에서, 본 발명의 조합된 제대혈 및 태반 줄기 세포는 예를 들어 미국 특허 제5,709,854호, 제5,516,532호, 제5,654,381호에 기재된 바와 같이 중합가능한 또는 가교 히드로겔을 사용하여 제제화될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 조합된 줄기 세포 집단을 생체내에서 제조하기 위해 순차적으로 또는 공동으로 투여되는 별도의 제약 조성물로서, 개인에게 투여 전에 조합된 제대혈 및 태반 줄기 세포의 각 줄기 세포 집단의 유지를 제공한다. 각 구성성분은 단일 유형의 세포 또는 세포 집단을 함유하는 별도의 컨테이너, 예를 들어 단일 백 (예를 들어, 백스터(Baxter), 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), 메드셉(Medcep), 내셔널 호스피탈 프로덕츠(National Hospital Products), 테루모(Terumo) 등으로부터의 혈액 저장 백) 또는 별도의 주사기에 저장되고/거나 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제대혈 또는 제대혈-유래 유핵 또는 줄기 세포는 제1 백에 함유되고, 태반 관류액 또는 태반 관류액으로부터의 태반 줄기 세포는 제2 백에 함유된다.
태반 줄기 세포의 집단을 풍부하게 할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단은 태반 관류액 중 다른 세포 유형에 비해 태반 줄기 세포에서 유핵 세포의 나머지 집단이 풍부하게 되도록 표준 방법에 따라 적혈구 및/또는 과립구의 제거에 의해 풍부하게 된다. 태반 줄기 세포의 이러한 풍부해진 집단은 동결되지 않은 채로 사용될 수 있거나, 이후 사용을 위해 동결될 수 있다. 세포의 집단을 동결하는 경우, 표준 동결보존제 (예를 들어, DMSO, 글리세롤, 에필라이프(Epilife)™ 세포 동결 배지 (캐스케이드 바이올로직스(Cascade Biologics))를 동결 전에 세포의 풍부해진 집단에 첨가한다.
본 발명의 제약 조성물은 세포 분화를 유도하는 1종 이상의 약제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분화를 유도하는 약제에는 Ca2+, EGF, α-FGF, β-FGF, PDGF, 각질세포 성장 인자 (KGF), TGF-β, 사이토카인 (예를 들어, IL-1α, IL-1β, IFN-γ, TFN), 레티노산, 트랜스페린, 호르몬 (예를 들어, 안드로겐, 에스트로겐, 인슐린, 프롤락틴, 트리요오도티록신, 히드로코르티손, 덱사메타손), 나트륨 부티레이트, TPA, DMSO, NMF, DMF, 매트릭스 요소 (예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트, 마트리겔(Matrigel)™), 또는 이들의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 세포 분화를 억제하는 1종 이상의 약제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 분화를 억제하는 약제에는 인간 델타-1 및 인간 세레이트(Serrate)-1 폴리펩티드 (사카노(Sakano) 등의 미국 특허 제6,337,387호 참조), 백혈병 억제 인자 (LIF), 줄기 세포 인자 또는 이들의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제약 조성물은 개인에게 투여 전에 TNF-α의 활성을 조정하는 화합물에 의해 처리될 수 있다. 바람직한 이러한 화합물은 예를 들어, 미국 출원 공개 제2003/0235909호에 상세히 개시되어 있으며, 상기 개시물은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 바람직한 화합물은 IMiD (면역조정 화합물) 및 SELCIDS® (선택적 사이토카인 억제 약물)라고 지칭되고, 특히 바람직한 화합물은 상표명 액티미드(ACTIMID)™, 레비미드(REVIMID)™ 및 레블리미드(REVLIMID)™ 하에 이용가능하다.
6. 실시예
6.1 실시예 1: 제대혈 및 태반 줄기 세포의 수집
이 실시예는 제대혈 및 태반 줄기 세포의 수집을 예시한다.
6.1.1 제대혈의 수집
발명의 명칭이 "제대혈 수집 키트 및 그의 사용 방법"인 미국 특허 출원 공개 제2006/0060494호에 기재된 바와 같은 제대혈 수집 키트를 사용하여 제대혈을 수집하였으며, 상기 공개는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
표준 물림쇠, 멸균 거즈 패드, 포비딘 요오드 면봉, 멸균 알콜 패드, 플라스틱 제대혈 클램프, 슬라이드 클립 또는 지혈 클램프 및 샘방지 재밀봉가능한 백 또는 캐니스터를 함유하는 수집 키트를 사용하였다.
수집은 태반을 분만하기 전에 (자궁내 수집), 태반을 분만한 후에 (자궁외 수집) 또는 태반의 분만 전 제왕절개 도중 수행할 수 있었다.
간단히, 제대 상의 원위 상의 정맥천자 부위를 멸균하였다. 큰 수집 백으로부터 통하는 수집 관을 클램핑하고, 바늘로부터 캡을 제거하고, 바늘의 빗면이 제정맥을 향해 아래를 향하게 하여 제정맥을 캐뉼라삽입하였다. 혈액을 유동시키기 위해 클램프를 제거하고, 수집 백을 캐뉼라삽입 부위 아래로 낮추어, 혈액이 중력에 의해 수집 백에 채워지도록 하였다.
혈액 유동이 정지하였을 때, 정맥천자 부위를 클램핑하고, 바늘을 제정맥으로부터 회수하였다. 수집 백을 표지하고, 단열된 운송 컨테이너에 넣었다.
클램핑된 제대혈을 갖는 태반을 샘방지 재밀봉가능한 백에 위치시킨 후, 백을 적절하게 밀봉하고 표지하였다.
수집 후, 트립판 블루 염색 후 제대혈 세포의 생존력을 혈구계측기에 의해 결정하였다.
6.1.2 태반 줄기 세포의 단리
제대 및 태반의 방혈 후, 태반을 실온에서 멸균 단열 컨테이너에 위치시키고, 출산 4시간 내에 실험실로 전달하였다. 점검시 장기의 단편형성 또는 제혈관의 적출과 같은 물리적 손상의 증거를 갖는 경우 태반을 버렸다. 태반을 실온 (23±2℃)에서 유지하거나, 멸균 컨테이너에서 2 내지 20시간 동안 냉장하였다 (4℃). 주기적으로, 태반을 멸균 염수에서 25±3℃에서 침지시키고 세척하여, 임의의 가시적 표면 혈액 또는 잔해를 제거하였다. 제대를 태반으로의 삽입으로부터 대략 5 cm에서 횡절단하고, 태반의 양방향 관류 및 유출 유체의 회수를 허용하는 멸균 유체 경로에 연결된 테플론® 중합체 또는 폴리프로필렌 카테터로 제혈관을 캐뉼라삽입하였다. 본 발명에서 사용된 시스템은 컨디셔닝, 관류 및 유출 수집의 모든 측면이 제어된 주변 대기 조건 하에 수행될 수 있게 할 뿐만 아니라 혈관내 압력 및 유속, 코어 및 관류액 온도 및 회수된 유출 부피의 실시간 모니터링을 가능하게 하였다. 컨디셔닝 프로토콜의 범위를 24시간 산후 기간에 걸쳐 평가하고, 유출 유체의 세포 조성을 유동 세포계측법, 광학 현미경 및 집락 형성 단위 검정법에 의해 분석하였다.
태반 컨디셔닝: 잔여 세포의 증식 및 동원을 위한 생리학상 상용성 환경을 모의하고 유지하기 위한 시도로 다양한 조건하에 태반을 유지하였다. 캐뉼라를 2 U/ml 헤파린 (이제이킨스-신(EJkins-Sinn), 미국 뉴저지주 소재)을 함유하는 IMDM 혈청-비함유 배지 (깁코비알엘, 미국 뉴욕주 소재)로 플러싱하였다. 대략 150 mL의 관류액을 수집할 때까지 분당 50 mL의 속도로 태반을 계속 관류하였다. 이 부피의 관류액을 "초기 분획물"이라고 표지하였다. 동일한 유속의 태반 관류의 계속은 대략 150 mL의 제2 분획물의 수집에 이르게 하였고, 이를 "후기 분획물"이라고 표지하였다. 절차 과정 도중, 관류 과정을 보조하고 세포 물질의 회수를 돕기 위해 태반을 부드럽게 마사지하였다. 중력 배수 및 동맥 캐뉼라를 통한 흡입 양자 모두에 의해 유출 유체를 관류 회로로부터 수집하였다.
서면 부모 동의서를 받은 후 태반을 제대혈과 함께 분만실로부터 얻고, 분만 후 12 내지 24시간 내에 실온에서 처리하였다. 처리 전에, 막을 제거하고, 모체 부위를 세척하여 잔여 혈액을 깨끗하게 하였다. 혈액 샘플 수집을 위해 사용되는 20 게이지 버터플라이 니들로 제조된 카테터로 제혈관을 캐뉼라삽입하였다. 그 후, 헤파린화된 (2 U/mL) 둘베코 개질 이글 배지 (H.DMEM)로 15 mL/분의 속도로 10분 동안 태반을 관류하고, 관류액을 1시간 내에 모체 부위로부터 수집하고, 유핵 세포를 개수하였다. 회수된 유핵 세포의 수가 100/mL 미만으로 떨어질 때까지 관류 및 수집 절차를 1회 또는 2회 반복하였다. 관류액을 풀링하고, 혈소판, 잔해 및 탈핵 세포막을 제거하기 위해 광 원심분리로 처리하였다. 그 후, 유핵 세포를 피콜-하이파크 밀도 기울기 원심분리에 의해 단리하고, 세척 후 H.DMEM에서 재현탁하였다. 접착성 세포의 단리를 위해, 5 내지 10 x 106개 세포의 분취액을 여러 T-75 플라스크 각각에 위치시키고, 바이오휘테이커로부터 얻은 상업적으로 이용가능한 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM)로 배양하고, 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5％ CO2)에 위치시켰다. 10 내지 15일 후, 비접착성 세포를 PBS로 세척함으로써 제거한 후, 이를 MSCGM으로 대체하였다. 플라스크를 다양한 접착성 세포 유형의 존재 및 특히 섬유모세포양 세포의 클러스터의 확인 및 팽창에 대해 매일 검사하였다.
세포 회수 및 단리: 세포를 100 x g에서 15분 동안 실온에서 원심분리에 의해 관류액으로부터 회수하였다. 이 절차는 오염 잔해 및 혈소판으로부터 세포를 분리하는 작용을 하였다. 세포 펠렛을 2 U/ml 헤파린 및 2 mM EDTA를 함유하는 IMDM 혈청-비함유 배지 (깁코비알엘, 미국 뉴욕주 소재)에서 재현탁하였다. 제조자의 추천 절차에 따라 LYMPHOPREP™ (니코메드 파마, 노르웨이 오슬로 소재)을 사용하여 총 단핵 세포 분획물을 단리하고, 단핵 세포 분획물을 재현탁하였다. 혈구계측기를 사용하여 세포를 개수하였다. 생존력을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다. 0.2％ EDTA와의 0.05％ 트립신의 용액 (시그마)을 사용하여 "차별 트립신화"에 의해 중간엽 세포의 단리를 달성하였다. 태반 줄기 세포를 포함하는 섬유모세포양 세포는 플라스틱 표면으로부터 약 5분 내에 박리한 반면, 다른 접착성 집단은 20 내지 30분 초과의 인큐베이션을 필요로 하였기 때문에 차별 트립신화가 가능하였다. 트립신화 및 트립신 중화 용액 (TNS, 바이오휘테이커)을 사용하는 트립신 중화 후 박리된 섬유모세포양 세포를 수확하였다. 그 후, 세포를 H.DMEM에서 세척하고, MSCGM에서 재현탁하였다. 유동 세포계측법을 벡톤-디킨슨 팩스칼리버(FACSCalibur) 기기를 사용하여 수행하였다. CD10, CD34, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3 및 SSEA4에 대한 항체를 포함하는 FITC 및 PE 표지된 모노클로날 항체를 벡톤-디킨슨 및 칼태그 래보러토리즈(Caltag laboratories) (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재) 또는 다른 공급자로부터 구매하고, SH2, SH3 및 SH4 항체 생성 하이브리도마를 아케리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 얻고, 배양된 상등액 중 모노클로날 항체의 반응성을 FITC 또는 PE 표지된 F(ab)'2 염소 항-마우스 항체에 의해 검출하였다. 상업적으로 이용가능한 유도 및 유지 배양 배지 (바이오휘테이커)를 사용하여 혈통 분화를 수행하였으며, 상기 배지는 제조자의 지시사항에 따라 사용하였다.
태반 줄기 세포의 단리: 배양 플라스크 중 접착성 세포의 현미경 검사는 방추형 세포, 큰 핵 및 많은 핵주위 소공포를 갖는 원형 세포, 및 여러 돌기 (이중 하나를 통해 세포가 플라스크에 부착함)를 갖는 별형 세포를 포함하는 형태학상 상이한 세포 유형을 나타내었다. 골수, 제대 및 말초 혈액의 배양에서 유사한 비-줄기 세포가 관찰되었으며; 그러므로, 이들 세포는 성질이 비-줄기 세포인 것으로 고려되었다. 마지막으로 클러스터로서 나타난 섬유모세포양 세포는 중간엽-유사 줄기 세포에 대한 후보자였으며, 이를 차별 트립신화에 의해 단리하고, 이차 플라스크에서 계대배양하였다. 원형 세포의 트립신화후 상 현미경검사는 세포가 고도로 과립화되고 실험실에서 제조되거나 상업 공급원으로부터 구매된 골수-유래 MSC와 유사하다는 것을 나타내었다. 계대배양된 경우, 태반 줄기 세포는 수시간 내에 접착된 그의 초기 상과 대조적으로 특징적인 섬유모세포양 형상을 취하였고, 기준 골수-유래 MSC와 동일한 성장 패턴을 형성하였다. 또한, 계대배양 및 재영양공급 동안, 느슨하게 결합된 단핵 세포를 세척하고, 배양물을 균질하게 유지하였으며, 임의의 가시적 비-섬유모세포양 세포 오염물은 없었다.
유동 세포계측법: CD10, CD29, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD90, SSEA3 및 SSEA4를 포함하는 태반 줄기 세포 표면 마커의 발현을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. OCT-4 및 ABC-p의 발현을 RT-PCR에 의해 이들 마커에 대한 공지된 프라이머를 사용하여 평가하였다.
6.2 실시예 2: 제대혈 및 태반 줄기 세포에 의한 조산아의 치료
호흡 곤란 증후군 (RDS) 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 빈혈, 뇌실내 출혈, 괴사성 소장결장염, 미성숙 망막병증, 만성 폐 질환 (기관지폐 이형증), 감염, 동맥관 개존증, 무호흡, 저혈압, 고빌리루빈혈증, 폐, 눈, 면역계, 뇌, 심장, 간 또는 신장의 불완전 발달을 나타내는 23주 내지 36주의 제태 연령으로 출생한 조산아 6명을 제대혈 및 태반 줄기 세포에 의해 치료하였다.
제대혈을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수집하고, 태반 줄기 세포를 2006년 12월 26일에 출원된 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 기재된 바와 같이 관류 또는 효소 소화에 의해 얻었으며, 상기 출원의 개시내용은 본원에 참고로 도입된다. 제대혈 및 태반 줄기 세포를 1:1의 비율로 합하였다. 제대혈 및 태반 줄기 세포를 FACS 분석에 의해 특징화하였다. 제대 세포 및 태반 줄기 세포를 정맥내로 조산아에게 조산아의 체중 1 킬로그램 당 약 1 x 105 내지 1 x 106개 CD34+ 세포의 투여량으로 분만후 1주 및 분만후 2주에 주사하였다.
제대혈 및 태반 줄기 세포의 투여전 및 투여후, 조산아의 혈압, 심박수, 호흡률 및 다양한 혈액 세포 유형의 개수를 측정하였다.
6.3 실시예 3: 제대혈 및 태반 관류액으로부터의 세포의 특징화
조기분만 태반으로부터의 조합된 HPP 및 UCB를 생성하는 가능성을 나타내고, 만기분만 태반으로부터 단리된 세포와 비교하여 조합된 생성물의 세포 조성을 결정하기 위해 다음 실험을 수행하였다.
전반적인 결과는 (1) 조기분만 태반으로부터 HPP 및 UCB를 수집할 가능성이 있고; (2) 조기분만 태반으로부터 단리된 총 유핵 세포가 만기분만 태반으로부터 단리된 세포에 필적할만하고; (3) 조기분만 태반으로부터 단리된 HPP/UCB의 TNC 함량이 유사한 중량으로 표준화시 만기분만 태반에서 나타난 것보다 유의하게 더 높고; (4) 조기분만 태반으로부터 단리된 제대혈 세포의 세포 조성이 만기분만 태반의 세포 조성과 상이하고; CD38+CD45+ 세포가 조기분만 태반과 비교하여 만기분만 태반에서 통계적으로 유의하게 더 높으나 (0.0146의 p-값), CD38-CD45- 세포가 조기분만 태반에서 통계적으로 유의하게 더 높고 (0.0335의 p-값); (5) 조기분만 태반으로부터 단리된 HPP의 세포 조성이 만기분만 태반과 유의하게 상이하지 않는다는 것을 나타내었다.
UCB 줄기 세포를 단리하기 위한 통상적인 방법을 실질적으로 초과하는 양으로 조기분만 태반으로부터 HPP 및 UCB 줄기 세포를 생성하는 가능성이 있다. 조합된 세포 생성물은 조산과 관련된 합병증의 치료에 유용함이 확실하며, 이는 저산소증으로부터 내생성 세포 사멸을 보호하기 위한 영양 능력, 및 혈액, 혈관형성 및 뉴런 세포를 생체내에서 형성하기 위한 분화 능력을 갖는 여러 선조 세포의 풍부한 공급원일 수 있기 때문이다.
6.3.1 방법:
대상체: 예정 제왕절개술을 기다리는 여성들을 출산전 병원에서 모집하고, 자연분만을 한 여성들을 분만실에서 모집하였다.
제대혈 및 태반 수집: 태반을 수집하고, 제대를 절단하고 클램핑하였다. 가능한 한 많은 제대혈을 제대로부터 배수하였다. 그 후, 추가 혈액 손실을 방지하기 위해 제대를 다시 클램핑하고, 태반 및 제대혈을 즉시 실험실로 전달하였다.
실험실 처리: 실험실에 도착시, 분만으로부터 10 내지 15분 내에 태반을 중량측정하고, 태반 막을 제거하였다. 관류에 적합한가, 예를 들어 제대가 태반에 완전히 부착되어 있는가, 및 붕괴 징후가 없는가, 및 또한 태반에 깊은 붕괴이 없는가를 확인하여, 태반 및 제대를 평가하였다. 그 후, 태반을 보존 용액으로 덮었다. 그 후, 태반을 냉장실에서 48시간 동안 위치시켰다. 제대혈 샘플을 Cell-Dyn 및 FACS 분석에 대해 즉시 실행시켰다.
태반 관류: 태반을 관류하고, 관류액을 동결보존하였다. 마스터플렉스(Masterflex) L/S 7523 프로그래밍가능한 연동운동 펌프를 사용하여 압력 제어된 관류를 달성하였다. 제대 카테터를 각 태반 제정맥에 삽입하고, 3방향 잠금꼭지에 연결시켰다. 그 후, 이 어셈블리를 유타 메디칼(Utah medical)로부터의 DPT100 일회용 압력 변환기에 연결시킨 후, 마스터플렉스 L/S 16 연동운동 펌프 관에 연결시켰으며, 이를 다시 주사가능한 등급 염수의 백에 연결시켰다. 태반 혈액을 수집하기 위해 혈액 수집 백으로부터의 관을 제정맥에 삽입하였다. 랩뷰(Labview) 소프트웨어는 관류 압력을 모니터링하였고, 마스터플렉스 펌프를 수동으로 원하는 압력으로 조절하였다. 관류를 부피로 3시간으로 제한하였고, NOC 시험을 관류의 각 시간 후 완료하였다.
태반 관류액 세포의 생존력 시험: 인간 태반 관류액 (HPP)을 함유하는 백을 완전히 혼합하고, HPP의 소량 분취액을 백으로부터 제거하였다. 그 후, 샘플을 아세트산에 의해 처리함으로써 오염 적혈구를 용해시켰다. 적혈구 세포 용해가 완료된 후, 각 샘플을 트립판 블루 염색 또는 셀 다인(Cell Dyne) 3200에 의한 개수로 처리하였다. 생존가능한 세포의 백분율을 결정하기 위해, 트립판 블루의 흡수를 배제하는 현미경 영역 중 무손상 세포의 수를 3회로 결정하였다. 생존가능한 세포의 수를 총 세포수로 나누고 100을 곱하였다.
유동 세포계측법: 다음 항체를 사용하여 HPP 또는 UCB 또는 조합된 세포를 사용하여 유동 세포계측법 연구를 수행하였다:
Figure pat00001
세포를 완충액으로 세척한 후, 완충액 중 설정 농도 범위 (즉, 100 ㎕ 당 1 x 106개 간 세포)로 재현탁하였다. 그 후, 세포를 형광-접합 항체로 염색하고, 인큐베이션한 후, 과량의 항체를 제거하기 위해 완충액으로 세척하였다. 관심있는 마커의 양성 또는 음성 발현을 결정하기 위해 염색된 세포를 유동 세포계측기 상에서 시험하였다.
6.3.2 결과
조기분만 및 만기분만 태반은 유의하게 상이한 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다 (각각 345 g 및 731 g의 평균; p = 0.0001). 조기분만 및 만기분만 태반으로부터의 세포의 생존력은 유의하게 상이하지 않은 것으로 밝혀졌다 (각각 93.13％ 및 90.84％의 생존력; p = 0.0724). 그러나, 조기분만으로부터 얻을 수 있는 총 유핵 제대혈 세포는 유의하게 상이하였다 (p = 0.0001). 조기분만 태반으로부터 5.277 x 107개 세포의 평균을 얻었고, 만기분만 태반으로부터 1.9498 x 108개 세포의 평균을 얻었다. 유사하게, 조기분만으로부터 얻을 수 있는 총 유핵 관류액 세포는 유의하게 상이하였다 (p = 0.0016). 조기분만 태반으로부터 1.28 x 107개 세포의 평균을 얻었고, 만기분만 태반으로부터 3.76 x 107개 세포의 평균을 얻었다. 그러므로, 태반 조직 g 당 얻을 수 있는 유핵 세포의 수는 만기분만 태반에서보다 조기분만 태반에서 유의하게 더 많았다 (p = 0.0001). 조기분만 태반으로부터 얻을 수 있는 총 관류액 + 제대혈 유핵 세포는 비교하여 1.79 x 108개였다. 이는 만기분만 태반과 비교하여 (만기분만 태반의 경우 5.71 x 108개) 극히 유의하게 상이하였다 (p = 0.0001). 태반 조직 g 당 조합된 총 유핵 세포수의 유의한 차이는 발견되지 않았다.
6.3.3 유동 세포계측법
조기분만 및 만기분만 태반으로부터의 제대혈 중 CD34+ 세포, CD38-CD45+ 세포, 또는 CD38+CD45- 세포의 백분율에서 통계적으로 유의한 차이는 발견되지 않았다. 유의하게 더 많은 수의 CD38+CD45+ 세포가 만기분만 태반에서 발견되었고 (16.68％ TNC 대 조기분만에서 2.0％ TNC), 유의하게 더 많은 수의 CD38-CD45- 세포가 조기분만 태반에서 발견되었다 (56.52％ 대 만기분만 태반에 대해 24.58％). 조기분만 및 만기분만 태반 간에 관류액-유래 CD38-CD45+ 세포, CD38+CD45- 세포, CD38+CD45+ 세포 또는 CD38-CD45- 세포의 백분율의 통계적으로 유의한 차이는 발견되지 않았다.
균등물:
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의한 범위로 제한되지 않는다. 사실, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 도입된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
임의의 공개물의 인용은 출원일 이전의 개시에 대한 것이고, 본 발명에게 종래 발명에 의한 이러한 공개를 선행하는 권리가 부여되지 않는다는 승인으로서 해석되어서는 안된다.

Claims (1)

  1. 조산아에게 제대혈을 투여하는 것을 포함하는, 조산에 의해 유발되거나 조산과 관련된 조산아의 질환 또는 상태의 치료 방법.
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