KR20190090882A - 태반 줄기 세포를 이용하는 척수 손상 및 외상성 뇌 손상의 치료 - Google Patents

태반 줄기 세포를 이용하는 척수 손상 및 외상성 뇌 손상의 치료 Download PDF

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제임스 더블유. 에딩거
알렉잔다르 프란키
블라디미르 얀코비치
알렉산드르 카플루노브스키
크리스텐 라바쪼
에릭 로우
비타오 리앙
로버트 제이. 하리리
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Abstract

본원은 본원에 기재된 태반 줄기 세포 및 태반 다능성 줄기 세포, 및 이러한 태반 세포의 집단을 사용하여 중추신경계에 대한 손상, 예컨대 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

태반 줄기 세포를 이용하는 척수 손상 및 외상성 뇌 손상의 치료{TREATMENT OF SPINAL CORD INJURY AND TRAUMATIC BRAIN INJURY USING PLACENTAL STEM CELLS}
본 출원은 2010년 12월 17일자로 출원된 미국 가출원 제61/424,559호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
1. 기술분야
본원은 외상성 척수 손상 (SCI) 또는 외상성 뇌 손상 (TBI)을 가진 개체를 치료하기 위해 인간 태반 줄기 세포를 사용하는 방법을 제공한다.
2. 배경기술
중추신경계 (CNS) 손상은 의학적으로 중요한 문제를 대표한다. 미국에 살고 있는 대략 300,000명의 사람들이 척수 손상 (SCI)으로 고통받고, 해마다 대략 10,000 내지 14,000건의 새로운 SCI 사례가 진단된다. SCI는 통상적으로 척주에 대한 외상으로 인한 것이며, 예를 들어 척수를 압박하는 이동된 뼈 또는 디스크로 인한 것이다. SCI는 명확한 척추 골절 없이도, 예를 들어 척수로의 혈류 손실로 인해 발생할 수도 있고, 척추 골절이 SCI 없이 발생할 수도 있다.
외상성 뇌 손상 (TBI)은 세계적으로 젊은이들의 활동제한 및 사망의 주요 원인 중 하나이다. 군사 상황에서, 예를 들어 뇌 손상은 예를 들어 직접적인 충격, 관통하는 물체, 예컨대 총알 및 파편으로부터, 및 폭발에 의해 초래되는 폭발파로부터 기인한다.
3. 개요
본원은 CNS 손상과 관련된 장애 및/또는 상태를 치료, 관리 및/또는 호전시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본원은 외상성 CNS 손상, 또는 CNS 손상과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 가진 개체에게 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지를 투여하는 것을 포함하며, 상기 치료 유효량은 상기 외상성 CNS 손상, 또는 상기 CNS 손상과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상에서의 검출가능한 개선, 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 양인 것인, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI 중 하나 이상의 증상을 치료, 관리 및/또는 호전시키는 의약의 제조에서의 태반 줄기 세포의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 배지를 손상 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50일 이상 이내에, 또는 CNS 손상 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 이내에 개체에게 투여한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 배지를 CNS 손상 21일, 14일 또는 7일 이내에, 또는 CNS 손상 48시간, 24시간, 12시간 또는 3시간 이내에 개체에게 투여한다.
구체적인 실시양태에서, CNS 손상은 SCI이다. 일부 실시양태에서, SCI는 직접적인 외상에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, SCI는 뼈 분절, 혈종, 또는 디스크 물질의 압박에 의해 야기된다. 일부 실시양태에서, SCI는 경추, 흉추, 요추 또는 천추 중 하나 이상에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, SCI는 경추 인대, 흉수, 요천추, 원추, 후두, 또는 마미의 하나 이상의 신경 중 하나 이상에 있다.
일부 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 SCI로 인한 척수 쇼크이다. 일부 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 SCI로 인한 신경발생성 쇼크이다. 일부 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 SCI로 인한 자율신경 반사부전이다. 일부 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 SCI로 인한 부종이다. 일부 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 중심 척수 증후군, 브라운-세카르(Brown-Sequard) 증후군, 척수 전삭 증후군, 척수 원추 증후군, 및 마미(cauda equina) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 투여되는 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지의 치료 유효량은 SCI의 하기 증상: 척수의 경추, 흉추, 요추 또는 천추 분절에서 운동 기능, 감각 기능, 또는 운동 및 감각 기능의 상실 또는 손상 중 하나 이상에서의 검출가능한 개선, 또는 그의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, SCI 중 하나 이상의 증상은 팔, 몸통, 다리 또는 골반 장기에서 운동 기능, 감각 기능, 또는 운동 및 감각 기능의 상실 또는 손상을 포함한다. 일부 실시양태에서, SCI의 하나 이상의 증상은 피부분절 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9, T10, T11, T12, L1, L2, L3, L4 또는 L5 중 하나 이상에서의 무감각을 포함한다.
본원에 제공된 SCI 치료의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 코르티코스테로이드, 신경보호제, 면역조절제 또는 면역억제제, 또는 항응고제이다.
본원에서 제공되는 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, CNS 손상과 관련이 있는 질환, 장애 또는 상태는 TBI이다. 일부 실시양태에서, TBI는 전두엽, 두정엽, 후두엽, 측두엽, 뇌간 또는 소뇌에 대한 손상이다. 일부 실시양태에서, TBI는 경증 TBI이다. 일부 실시양태에서, TBI는 중등도 내지 중증 TBI이다.
일부 실시양태에서, 투여되는 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지의 치료 유효량은 경증 TBI의 하기 증상: 두통, 기억력 문제, 주의력 결핍, 감정 기복 및 좌절감, 피로, 시각 장애, 기억 상실, 주의력/집중력 부족, 수면 장애, 현기증/균형 상실, 과민성, 감정 장애, 우울감, 발작, 오심, 후각 상실, 빛과 소리에 대한 감수성, 기분 변화, 상실감 또는 착란, 또는 사고의 저속화 중 하나 이상에서의 검출가능한 개선, 또는 그의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 투여되는 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지의 치료 유효량은 중등도 내지 중증 TBI의 하기 증상: 주의 곤란, 집중 곤란, 주의산만, 기억 곤란, 처리 속도의 저속화, 착란, 고집증, 충동성, 언어 처리 곤란, 언어 구사 곤란, 말의 이해 불가 (수용 실어증), 이해한 것의 말하기 곤란 (표현 실어증), 불명료 언어, 매우 빠르게 또는 매우 느리게 말하는 것, 읽기 문제, 쓰기 문제, 접촉, 온도, 움직임, 사지 위치 및 미세 식별의 이해 곤란, 감각 인상을 심리적으로 의미있는 데이터로 통합하거나 패턴화하는 것의 곤란, 부분적 또는 완전한 시력 상실, 눈의 근육 쇠약 및 이중시 (복시), 흐린 시력, 거리 판단 문제, 불수의 안구 운동 (안구진탕증), 광 불내성 (광선공포증), 청력 감소 또는 상실, 귀울림 (이명), 소리에 대한 감수성 증가, 후각 상실 또는 약화 (후각상실증), 미각 상실 또는 약화, 발작, 간질과 관련이 있는 경련, 신체 마비/경직, 만성 통증, 장 및/또는 방광의 통제력 상실, 수면 장애, 스태미나 상실, 식욕 변화, 체온 조절곤란, 월경 곤란, 사회-정서 곤란, 의존적 거동, 정서 능력의 결핍, 동기 결여, 과민성, 공격성, 우울증, 탈억제, 또는 자각 결여 중 하나 이상에서의 검출가능한 개선, 또는 그의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI 치료의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 항발작 약물, 항우울제, 아만타딘, 메틸페니데이트, 브로모크립틴, 카르밤아마자핀 또는 아미트립틸린이다.
본원에 제공된 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI 치료의 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 배지는 정맥내, 동맥내, 복강내, 심실내, 흉골내, 두개내, 근육내, 활액낭내, 안내, 유리체내, 뇌내, 뇌실내, 경막내, 골내 주입, 방광내, 경피, 뇌조내, 경막외, 요추 천자, 대조 또는 피하 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 개체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 배지는 손상 부위로 직접 개체에게 투여된다.
구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포는 CD200은 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; 또는 CD73, CD105 및 CD200을 발현하거나; 또는 CD200 및 OCT-4를 발현하거나; 또는 CD73 및 CD105는 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; 또는 CD73 및 CD105를 발현하고, 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 OCT-4를 발현하고, 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 면역 세포의 활성을 저해하고, 예를 들어 T 세포의 증식을 저해한다.
특정 실시양태에서, 본원은 CNS 손상 또는 부분적으로 그와 관련된 T 세포 (예를 들어, CD4+ T 림프구 또는 백혈구)를 태반 줄기 세포, 예를 들어 본원에 기재된 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 개체에서 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI에 대한 염증전 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 염증 반응은 Th1 반응 또는 Th17 반응이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 Th1 세포 성숙을 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 T 세포에 의한 인터류킨-1β (IL-1β), IL-12, IL-17, IL-21, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 및/또는 인터페론 감마 (IFNγ) 중 하나 이상의 생성을 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 조절성 T 세포 (Treg) 표현형을 강화시키거나 상향조절한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 Th1 및/또는 Th17 면역 반응을 촉진시키는 마커 (예를 들어, CD80, CD83, CD86, ICAM-1, HLA-II)의 수지상 세포 (DC) 및/또는 대식세포 발현을 하향조절한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 T 세포를 또한 IL-10, 예를 들어 외인성 IL-10 또는 상기 T 세포에 의해 생성되지 않는 IL-10, 예를 들어 재조합 IL-10과 접촉시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 대식세포와 유효량의 태반 줄기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포로부터의 염증전 시토카인의 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역계 세포와 유효량의 태반 줄기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 예를 들어 대식세포로부터의 면역관용성 세포 및/또는 시토카인을 상향조절하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 태반 줄기 세포와 접촉하지 않은 활성화된 대식세포에 비해 활성화된 대식세포가 더 많은 IL-10을 검출가능하게 생성하게 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역계 세포를 유효량의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 항염증성 T 세포를 상향조절하거나 그의 개수를 증가시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원은 개체에게 유효량의 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 유효량은 개체에서 CNS 손상-관련된 Th1 반응에서의 검출가능한 감소를 일으키는 양인 것인, 상기 개체에서 상기 CNS 손상-관련된 Th1 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 개체에게 유효량의 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 유효량은 개체에서 Th17 반응에서의 검출가능한 감소를 일으키는 양인 것인, 상기 개체에서 CNS 손상-관련된 Th17 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에서 림포톡신-1α (LT-1α), IL-1β, IL-12, IL-17, IL-21, IL-23, TNFα 및/또는 IFNγ 중 하나 이상의 T 세포에 의한 생성 또는 그의 항원 제시 세포 (예를 들어, DC, 대식세포 또는 단핵구)를 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 조절성 T 세포 (Treg)를 강화시키거나 상향조절한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 개체에서 Th1 또는 Th17 반응을 촉진시키는 마커 (예를 들어, CD80, CD83, CD86, ICAM-1, HLA-II)의 수지상 세포 (DC) 및/또는 대식세포에 의한 생성을 조정한다 (예를 들어 감소시킨다). 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 IL-10을 추가로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원은 1종 이상의 항염증성 시토카인을 발현하도록 유전자 조작된, 본원에 기재된 바와 같은 태반 줄기 세포를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항염증성 시토카인은 IL-10을 포함한다.
3.1 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 수치 값과 관련하여 지칭될 때, 명시된 수치 값의 + 또는 - 10％ 이내의 값을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "양"은 본원에 기재된 태반 줄기 세포와 관련하여 지칭될 때, 예를 들어 CNS 손상의 하나 이상의 증상을 검출가능하게 개선시키거나, 그의 중증도를 감소시키거나 또는 그의 진행을 감소시키는데 충분한 하나 이상의 용량으로 투여되는 태반 세포의 특정한 개수, 예를 들어 태반 줄기 세포의 개수를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유래된"은 단리되거나 또는 달리 정제된 것을 의미한다. 예를 들어, 태반 유래 부착성 세포는 태반으로부터 단리된다. 용어 "유래된"은 조직, 예를 들어 태반으로부터 직접 단리된 세포로부터 배양된 세포, 및 1차 단리물로부터 배양되거나 증식된 세포로부터 배양된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역국소화"는 예를 들어 유동 세포계측, 형광 활성화 세포 분류, 자석 세포 분류, 계내 혼성화, 면역조직화학 등에서 면역 단백질, 예를 들어 항체 또는 그의 단편을 이용하여 화합물, 예를 들어 세포 마커를 검출하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "SH2"는 마커 CD105 상에서 에피토프와 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, SH2+로 지칭되는 세포는 CD105+이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "SH3" 및 SH4"는 마커 CD73 상에 존재하는 에피토프와 결합하는 항체를 지칭한다. 따라서, SH3+ 및/또는 SH4+로 지칭되는 세포는 CD73+이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 줄기 세포를 수집 및/또는 배양하는 동안, 줄기 세포와 천연적으로 회합되어 있는 다른 세포의 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 적어도 99％가 상기 줄기 세포로부터 제거된 경우, 상기 줄기 세포는 "단리된" 것이다. "단리된" 세포의 집단은, 세포의 집단이 유래된 조직, 예를 들어 태반의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포의 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 줄기 세포의 집단을 수집 및/또는 배양하는 동안, 줄기 세포의 집단과 천연적으로 회합되어 있는 세포의 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 적어도 99％가 줄기 세포의 집단으로부터 제거된 경우, 예를 들어 줄기 세포의 집단은 "단리된" 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "태반 줄기 세포"는 형태, 세포 표면 마커, 또는 초대 배양 이후 계대의 횟수와 무관하게, 조직 배양 기재 (예를 들어, 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴-코팅된 조직 배양 플레이트)에 부착하는, 포유동물 태반으로부터 유래된, 예를 들어 단리된 줄기 세포 또는 전구 세포를 지칭한다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "태반 줄기 세포"는 이들 세포가 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 영양막, 세포영양막, 배아 생식 세포, 또는 배아 줄기 세포를 지칭하지는 않는다. 세포가 줄기 세포의 하나 이상의 속성, 예를 들어 하나 이상의 유형의 줄기 세포와 관련된 마커 또는 유전자 발현 프로파일; 배양물에서 적어도 10-40배 복제하는 능력; 다중효력, 예를 들어 시험관내, 생체내 또는 이들 둘 다에서 3 배아 층 중 하나 이상의 세포로 분화되는 능력; 성체 (즉, 분화된) 세포 특징의 결여 등을 보유하는 경우에는, 상기 세포는 "줄기 세포"로 간주된다. 용어 "태반 줄기 세포" 및 "태반-유래 줄기 세포"는 구별없이 사용될 수 있다. 본원에서 달리 언급하지 않는다면, 용어 "태반"은 제대를 포함한다. 본원에 개시된 태반 줄기 세포는 특정 실시양태에서 시험관내 다능성 (즉, 세포가 시험관내에서 분화 조건하에 분화함), 생체내 다능성 (즉, 세포가 생체내에서 분화함), 또는 이들 둘 다이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 줄기 세포는 특정 마커가 검출가능한 경우 상기 마커에 대해 "양성"이다. 예를 들어, CD73이 태반 줄기 세포 상에서 백그라운드에 비해 (예를 들어, 임의의 주어진 검정에 대한 이소형 대조군 또는 실험적 음성 대조군에 비해) 더 많은 검출가능한 양으로 검출가능한 경우, 태반 줄기 세포는 예를 들어 CD73에 대해 양성이다. 소정의 마커가 적어도 하나의 다른 세포 유형과 구분하기 위해 사용될 수 있거나 또는 세포에 존재하거나 세포에 의해 발현될 때 세포를 선별 또는 단리하기 위해 사용될 수 있는 경우, 세포는 또한 상기 마커에 대해 양성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역조정" 및 "면역조절"은 면역 반응에서 검출가능한 변화를 일으키는 용량 및 면역반응에서 검출가능한 변화를 일으키는 능력을 야기하거나 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역억제" 및 "면역억제성"은 면역 반응에서 검출가능한 감소를 일으키는 용량 및 면역 반응에서 검출가능한 저해를 일으키는 능력을 야기하거나 갖는 것을 의미한다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1은 선택된 혈관신생 단백질이 태반 유래 부착성 세포에 의해 분비되는 것을 도시한다.
도 2는 인간 내피 세포 (HUVEC) 관 형성에 대한 태반 유래 부착성 세포-조건화된 배지의 혈관신생 효과를 도시한다.
도 3은 인간 내피 세포 이동에 대한 태반 유래 부착성 세포-조건화된 배지의 혈관신생 효과를 도시한다.
도 4는 인간 내피 세포 증식에 대한 태반 유래 부착성 세포-조건화된 배지의 효과를 도시한다.
도 5는 HUVEC 및 태반 유래 부착성 세포의 관 형성을 도시한다.
도 6은 저산소 및 정상산소 조건하에 태반 유래 부착성 세포에 의한 VEGF 및 IL-8의 분비를 도시한다.
도 7은 병아리 장요막 혈관신생 모델에서 혈관신생에 대한 PDAC의 양성 효과를 도시한다. bFGF: 염기성 섬유모세포 성장 인자 (양성 대조군). MDAMB231: 혈관신생 유방암 세포주 (양성 대조군). Y 축: 혈관 형성의 정도.
도 8은 병아리 장요막 혈관신생 모델에서 혈관신생에 대한 PDAC-조건화된 배지 (상등액)의 양성 효과를 도시한다. bFGF: 염기성 섬유모세포 성장 인자 (양성 대조군). MDAMB231: 혈관신생 유방암 세포주 (양성 대조군). Y 축: 혈관 형성의 정도.
도 9: 성상세포의 배양물 또는 성상세포와 PDAC의 공배양물에 존재하는 과산화수소-발생된 반응성 산소 종. RFU ROS 활성: 반응성 산소 종에 대한 상대적인 형광 단위.
5. 상세한 설명
5.1 CNS 손상의 치료 방법
본원은 CNS 손상을 가진 개체에게 하나 이상의 용량의 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, CNS에 대한 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI, 또는 CNS 손상과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 개체를 치료하는 방법 및 이러한 줄기 세포를 투여하는 방법은 단독으로 또는 다른 요법과 조합되어 하기에 상세하게 논의된다.
5.1.1 척수 손상 (SCI)의 치료
본원은 개체에게 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 치료 유효량은 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 검출가능한 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 양인 것인, SCI의 증상, 또는 SCI와 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖거나 또는 경험하고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "하나 이상의 증상"은 객관적으로 측정가능한 파라미터, 예컨대 염증 정도, 면역 반응, 치유 과정과 상관관계가 있는 손상 부위 내의 유전자 발현, 손상 부위에서 반흔의 특징 및 정도, 환자의 운동 및 감각 기능에서의 개선 등, 및 주관적으로 측정가능한 파라미터, 예컨대 환자 복지, 운동 및 감각 기능에서의 개선에 대한 환자의 지각, SCI와 관련된 통증 또는 불편함의 감소에 대한 지각 등을 포함한다.
SCI는 척수의 정상적인 운동, 감각 또는 자율신경 기능에서의 일시적인 또는 영구적인 변화를 유발하는 척수에 대한 손상이다. SCI는 사지마비(tetraplegia) (이전에는 사지마비(quadriplegia)로 공지됨) 및 대마비로 공지된 상태를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, SCI의 증상, 또는 SCI와 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖거나 또는 경험하고 있는 개체는 사지마비 또는 대마비이다.
사지마비는 척추관 내의 신경 요소의 손상으로 인해 척수의 경추 분절에서 운동 및/또는 감각 기능이 손상 또는 상실되는 것을 특징으로 하는, 경추 영역에서의 척수에 대한 손상을 지칭한다. 사지마비는 팔에서, 뿐만 아니라 몸통, 다리 및 골반 장기에서 기능의 손상을 일으킨다. 이는 상완 신경총 병변, 또는 신경관 외부의 말초 신경에 대한 손상을 포함하지 않는다.
대마비는 척추관 내의 신경 요소의 손상 이후에, 척수의 흉추, 요추 또는 천추 (경추 아님) 분절에서 운동 및/또는 감각 기능의 손상 또는 상실을 지칭한다. 대마비와 관련하여, 팔 기능수행은 보존되지만, 손상 높이에 따라 몸통, 다리 및 골반 장기가 관여될 수 있다. 상기 용어는 마미 및 척수 원추 손상과 관련하여 사용되지만, 요천추 병변, 또는 신경관 외부의 말초 신경에 대한 손상에 대해서는 사용되지 않는다.
SCI의 흔한 원인에는 자동차 사고, 넘어짐, 폭행, 스포츠 손상, 혈관 장애, 종양, 감염성 상태, 척추증, 의인성 손상 (특히, 척추 주사 및 경막외 카테터 설치 이후), 골다공증 이후의 척추 골절, 및 발달 장애가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, SCI는 예를 들어 무딘 힘 외상, 압박, 이동 등으로 인해 일어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 척수는 완전히 절단된다. 다른 특정 실시양태에서, 척수는 손상되고, 예를 들어 부분적으로 절단되지만, 완전히 절단되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 척수는 예를 들어 척주의 뼈 구조에 대한 손상, 다른 척추뼈에 대한 하나 이상의 척추뼈의 이동, 인접한 조직의 염증 또는 부종 등을 통해 압박된다.
한 실시양태에서, SCI는 경추의 하나 이상에 있다. 또 다른 실시양태에서, SCI는 흉추의 하나 이상에 있다. 또 다른 실시양태에서, SCI는 요추의 하나 이상에 있다. 또 다른 실시양태에서, SCI는 천추의 하나 이상에 있다. 특정 실시양태에서, SCI는 척추뼈 C1, C2, C3, C4, C5, C6 또는 C7; 또는 척추뼈 T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9, T10, T11 또는 T12; 또는 척추뼈 L1, L2, L3, L4 또는 L5에 있다. 다른 특정 실시양태에서, SCI는 척주 C1과 C2 사이; C2와 C3 사이; C3과 C4 사이; C4와 C5 사이; C5와 C6 사이; C6과 C7 사이; C7과 T1 사이; T1과 T2 사이; T2와 T3 사이; T3과 T4 사이; T4와 T5 사이; T5와 T6 사이; T6과 T7 사이; T7과 T8 사이; T8과 T9 사이; T9와 T10 사이; T10과 T11 사이; T11과 T12 사이; T12와 L1 사이; L1과 L2 사이; L2와 L3 사이; L3과 L4 사이; 또는 L4와 L5 사이에 존재하는 척수근에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 손상은 경추 인대에 대한 것이다. 다른 실시양태에서, 손상은 흉수에 대한 것이다. 다른 실시양태에서, SCI는 요천추 척수에 대한 것이다. 다른 특정 실시양태에서, SCI는 원추에 대한 것이다. 다른 특정 실시양태에서, CNS 손상은 마미의 하나 이상의 신경에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, SCI는 후두에 있다.
특정 실시양태에서, SCI의 증상은 하나 이상의 피부분절 (즉, 해당 척수 높이만큼 신경이 통하는 피부의 부분)에서의 무감각이다. 구체적인 실시양태에서, SCI의 증상은 피부분절 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9, T10, T11, T12, L1, L2, L3, L4 또는 L5 중 하나 이상에서의 무감각이다.
척수 쇼크는 모든 감각운동 기능의 상실과 관련이 있는, 손상 높이 아래쪽에 있는 척수 기능의 일시적인 생리적 (해부학적으로가 아니라) 반사적 억압 상태이다. 카테콜아민의 방출로 인한 초기 혈압 상승 이후 저혈압이 주목된다. 장 및/또는 방광을 비롯해서 이완 마비가 관찰되며, 때때로 지속적인 발기증이 발생한다. 이들 증상은 손상 높이 아래쪽에 있는 반사궁이 다시 기능실행할 때까지 (예를 들어, 구해면체 반사, 근육 신전 반사 [MSR]) 수시간 내지 수일 지속되는 경향이 있다. 따라서, 상기 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 SCI로 인한 척수 쇼크의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 일부 또는 모든 감각운동 기능의 상실, 고혈압, 저혈압, 이완 마비 (예를 들어, 장 및/또는 방광에서), 및 지속 발기증에서의 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
신경발생성 쇼크는 저혈압, 서맥 및 저체온증의 3가지 징후에 의해 나타난다. 쇼크는 T6 위쪽의 손상에서 더욱 흔히 발생하는 경향이 있으며, T1-L2로부터 교감신경계 유출부의 파괴 및 무저항 미주신경 톤에 이어서, 혈관 확장과 관련이 있는 혈관 내성의 감소를 초래한다. 신경발생성 쇼크는 빈맥과 관련되는 경향이 있는 척수 및 저혈량성 쇼크와는 구별된다. 따라서, SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 SCI로 인한 신경발생성 쇼크의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 저혈압, 서맥, 저체온증, 혈관 내성의 감소, 및 혈관 확장에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
자율신경 반사부전 (AD)은 내장 교감신경계 유출부 (T5-T6) 위쪽에 SCI를 갖는 환자에서 발생하는 과도한 불균형 반사 교감신경 방전의 증후군이다. AD는 반사가 되돌아오는 척수 쇼크 시기 이후에 일어난다. 주요 내장 유출부 위쪽에 손상을 가진 개체에서는 AD가 발병할 수 있다. 손상 아래쪽에서, 무손상 말초 감각 신경은 척수시상 및 후주에서 올라가는 충격을 전송하여, 척수의 중간외측 회백질에 위치한 교감신경계 뉴런을 자극한다. 뇌 혈관운동 중추로부터 SCI 위쪽에서 억제성 유출이 증가하지만, SCI의 블록 아래쪽을 통과할 수 없다. 이러한 큰 교감신경계 유출은 다양한 신경전달물질 (노르에피네프린, 도파민-b-히드록실라제, 도파민)의 방출을 초래하여, 입모, 피부 창백함, 및 동맥 혈관계의 심각한 혈관수축을 야기한다. 그 결과는 혈압의 갑작스런 상승 및 손상 높이 위쪽에서 혈관확장이다. 환자는 흔히 통증 감수성 두개내 혈관의 혈관확장에 의해 초래되는 두통을 갖는다. 따라서, SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 SCI로 인한 자율신경 반사부전의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 입모, 피부 창백함, 동맥 혈관계에서의 심각한 혈관수축, 혈압 상승, 및 손상 높이 위쪽에서 혈관확장에서의 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 SCI로 인한 부종의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 직접적인 외상으로 인한 SCI의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 척추 뼈 분절에 의한 압박으로 인한 SCI의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 척추 디스크 물질의 압박으로 의한 SCI의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 SCI의 치료 방법은 또한 다른 분류의 SCI의 증상 또는 SCI와 관련된 질환, 장애 또는 상태, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 중심 척수 증후군, 브라운-세카르 증후군, 척수 전삭 증후군, 척수 원추 증후군, 및 마미 증후군을 갖거나 이를 경험하고 있는 개체를 치료하는 것을 제공한다.
중심 척수 증후군은 종종 경추 영역 손상과 관련이 있으며, 천추 감각은 보존되면서 하지보다 상지에서 더 큰 쇠약으로 이어진다. 따라서, SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 중심 척수 증후군의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 천추 감각은 보존되면서 하지보다 상지에서 더 큰 쇠약에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
종종 척수의 편측절단 병변과 관련이 있는 브라운-세카르 증후군은 통증 및 온도에 대한 감수성의 대측성 상실과 함께 비교적 큰 동측 자가수용성 및 운동성 상실을 초래한다. 따라서, SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 브라운-세카르 증후군의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 통증 및 온도에 대한 감수성의 대측성 상실과 함께 동측 자가수용성 및 운동성 상실에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
척수 전삭 증후군 종종 운동 기능의 가변적인 상실 및 통증 및 온도에 대한 감수성을 초래하는 병변과 관련이 있으며; 자가수용성은 보존된다. 따라서, SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 척수 전삭 증후군의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 운동 기능의 가변적인 상실 및 통증 및 온도에 대한 감수성에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
척수 원추 증후군은 비반사성 방광, 장 및 하지를 초래하는, 천수 및 요추 신경근에 대한 손상과 관련 있지만, 천추 분절은 때때로 보존된 반사 (예를 들어, 구해면체 및 배뇨 반사)를 나타낼 수 있다. 따라서, SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 척수 원추 증후군의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 비반사성 방광, 장 및 하지에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
마미 증후군은 비반사성 방광, 장 및 하지를 초래하는, 척추관에서의 요천추 신경근에 대한 손상으로 인한 것이다. 따라서, SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 마미 증후군의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 비반사성 방광, 장 및 하지에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
특정 실시양태에서, SCI의 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군에서의 개선, 그의 중증도에서의 감소 또는 그의 진행에서의 감소를 검출하는 특정 기술(들)은 본원에 제공된 SCI의 치료 방법에서 중요하지 않다. 특정 실시양태에서, SCI의 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군에서의 상기 개선 또는 그의 진행에서의 감소의 평가는 당업계의 전문인의 판단에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, SCI의 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군에서의 상기 개선 또는 그의 진행에서의 감소의 평가는 대상체의 주관적인 경험과 조합되어 당업계의 전문인의 판단에 따라 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 척수 손상의 신경학적 및 기능적 분류의 국제 표준에 따라 검출된다. 미국 척추 손상 협회 (American Spinal Injury Association; ASIA)에서 간행된 척수 손상의 신경학적 및 기능적 분류의 국제 표준은 신경학적 기능의 전신 운동 및 감각 조사에 기초하여 SCI의 높이 및 정도를 기재하는 널리 허용되는 시스템이다. 문헌 [International Standards For Neurological Classification Of Spinal Cord Injury, J Spinal Cord Med. 26 Suppl 1:S50-6 (2003)]을 참조하며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특별한 실시양태에서, 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 하기 카테고리를 이용하는 ASIA 손상 규모 (프란켈(Frankel) 분류의 변형)에 따라 검출된다:
A - 완전: 천추 분절 S4-S5.4에서 감각 및 운동 기능이 보존되지 않는다. "완전"은 가장 낮은 천추 분절에서의 감각 및 운동 기능의 부재를 지칭한다.
B - 불완전: 신경학적 손상 높이 아래쪽에서 감각 기능이 보존되고 (운동 기능은 아님), 천추 분절 S4-S5까지 연장된다. "불완전"은 가장 낮은 천추 분절을 비롯하여 손상 높이 아래쪽에서 감각 또는 운동 기능의 보존을 지칭한다.
C - 불완전: 신경학적 손상 높이 아래쪽에서 운동 기능이 보존되고, 신경학적 손상 높이 아래쪽의 가장 핵심 근육은 3 미만의 근육 등급을 갖는다.
D - 불완전: 신경학적 손상 높이 아래쪽에서 운동 기능이 보존되고, 신경학적 손상 높이 아래쪽의 가장 핵심 근육은 3 이상의 근육 등급을 갖는다.
E - 정상: 감각 및 운동 기능이 정상이다.
따라서, 본원에 제공된 SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 ASIA 손상 규모 (AIS)에 따른 손상에서의 감소를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 감소는 손상에서의 1, 2, 3, 4 또는 5 등급 감소이며, 여기서 1 등급은 단일 카테고리 개선, 예를 들어 카테고리 D에서 카테고리 E로의 손상의 감소에 상응한다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 AIS에 따라 ASIA A로 분류된 개체를 ASIA B, ASIA C, ASIA D 또는 ASIA E로 전환시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 AIS에 따라 ASIA B로 분류된 개체를 ASIA C, ASIA D 또는 ASIA E로 전환시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 AIS에 따라 ASIA C로 분류된 개체를 ASIA D 또는 ASIA E로 전환시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 AIS에 따라 ASIA D로 분류된 개체를 ASIA E로 전환시키는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 환자의 근육 강도를 측정함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 근육 강도는 하기 의학 연구 위원회 (Medical Research Council; MRC) 규모 0-5를 이용하여 등급화될 수 있다:
5 - 정상적인 힘
4+ - 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임
4 - 저항에 대해 중등도의 움직임
4- - 저항에 대해 약간의 움직임
3 - 저항에 대해서가 아니라 중력에 대해 움직임
2 - 중력에 대한 움직임이 감소됨
1 - 움직임이 간혹 있음
0 - 움직임 없음
하기 핵심 근육을 SCI를 가진 환자에서 시험하여, 손상의 상응하는 높이를 나타낸다:
C5 - 팔꿈치 굴근 (이두근, 상완신근)
C6 - 손목 신근 (장요측 및 단요측 수근신근)
C7 - 팔꿈치 신근 (삼두근)
C8 - 중지에 대한 손가락 굴근 (심지 굴근)
T1 - 작은 손가락 외전근 (소지 외전근)
L2 - 둔부 굴근 (장요근)
L3 - 무릎 신근 (사두근)
L4 - 발목 배굴근 (전경골근)
L5 - 긴 발가락 신근 (장모지신근)
S1 - 발바닥 굴근 (비복근, 가자미근)
따라서, 본원에 제공된 SCI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 MRC 규모에 따른 근육 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 움직임 없음을 가진 근육이 움직임이 간혹 있음, 중력에 대한 움직임이 감소됨, 저항에 대해서가 아니라 중력에 대해 움직임, 저항에 대해 약간의 움직임, 저항에 대해 중등도의 움직임, 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임, 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 움직임이 간혹 있음만을 가진 근육이 중력에 대한 움직임이 감소됨, 저항에 대해서가 아니라 중력에 대해 움직임, 저항에 대해 약간의 움직임, 저항에 대해 중등도의 움직임, 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임, 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 중력에 대한 움직임이 감소됨만을 갖는 근육이 저항에 대해서가 아니라 중력에 대해 움직임, 저항에 대해 약간의 움직임, 저항에 대해 중등도의 움직임, 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임, 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 저항에 대해서가 아니라 중력에 대해 움직임만을 갖는 근육이 저항에 대해 약간의 움직임, 저항에 대해 중등도의 움직임, 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임, 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 저항에 대해 약간의 움직임만을 가진 근육이 저항에 대해 중등도의 움직임, 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임, 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 저항에 대해 중등도의 움직임만을 가진 근육이 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임 또는 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 저항에 대해 최대보다 낮은 정도의 움직임만을 가진 근육이 정상적인 힘을 갖도록 하는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 이두근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 상완신근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 장요측 및 단요측 수근신근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 삼두근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 심지 굴근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 소지 외전근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 장요근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 사두근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 전경골근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 장모지신근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 비복근 또는 가자미근 근육의 강도에서 1, 2, 3, 4 또는 5점 증가를 일으키는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 감각 시험에 의해 검출된다. 감각 시험은 하기 높이에서 수행될 수 있다:
C2 - 후두부 융기
C3 - 쇄골 상와
C4 - 견쇄 관절의 상부
C5 - 전주와의 측면
C6 - 엄지
C7 - 중지
C8 - 소지
T1 - 전주와의 내측
T2 - 겨드랑이의 정점
T3 - 3번째 늑간극 (IS)
T4 - 유두선에서 4번째 IS
T5 - 5번째 IS (T4와 T6 사이의 중간)
T6 - 검상 돌기 높이에서 6번째 IS
T7 - 7번째 IS (T6과 T8 사이의 중간)
T8 - 8번째 IS (T6과 T10 사이의 중간)
T9 - 9번째 IS (T8과 T10 사이의 중간)
T10 - 10번째 IS 또는 배꼽
T11 - 11번째 IS (T10과 T12 사이의 중간)
T12 - 서혜 인대의 중앙
L1 - T12와 L2 사이의 거리의 절반
L2 - 허벅지의 중간앞
L3 - 내측 대퇴 관절구
L4 - 내측 복사뼈
L5 - 3번째 중족 관절의 발등
S1 - 측면 발뒤꿈치
S2 - 정중선에서 슬와
S3 - 좌골 조면
S4-5 - 항문주위 구역 (1 높이로 함)
감각 스코어링은 하기와 같이 가벼운 자극 및 침 찌르기에 대한 것이다:
0 - 부재
1 - 손상되거나 또는 감각과민
2 - 무손상
환자가 뾰족한 침 지점과 무딘 칼날 사이를 구별할 수 없을 때, 0의 점수를 준다. 따라서, 본원에서 제공되는 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9, T10, T11, T12, L1, L2, L3, L4, L5, S1, S2, S3, S4 및 S5 중 하나 이상에 상응하는 감각 스코어링에서 1 또는 2점 증가를 일으키는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 상기 SCI의 하나 이상의 증상에서의 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 환자의 일상 생활 기능을 모니터링함으로써 검출된다. 본원에 제공된 SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 환자의 일상 생활 활동에서의 기능적 개선을 유효화하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 기능적 독립성 측정 (FIM)을 이용하여, 환자의 기능적 개선을 평가한다. FIM은 기능수행의 6가지 분야에 초점을 둔다: 자기 관리, 괄약근 조절, 이동성, 보행 능력, 의사소통 및 사회적 인지. 총 18개의 항목으로 각각의 분야 내에서 2개 이상의 구체적인 활동/항목을 평가한다. 예를 들어, 6개의 활동 항목 (식사하기, 몸단장하기, 목욕하기, 상의 입기, 하기 입기, 및 화장실 사용하기)은 자기 관리 분야를 포함한다. 각각의 18개의 항목을 7점 규모를 이용하여 기능수행의 독립성의 측면에서 평가한다:
독립성 (사람의 보조가 불필요함):
7=완전 독립: 전형적으로, 행동수정, 보조 장치 또는 도움이 없이 합리적인 시간 이내에 안전하게 활동을 수행한다.
6=부분 독립: 활동하는데 보조 장치가 필요하고/거나 합리적인 시간보다 오래 걸리고/거나 안전하게 수행하지 못한다.
의존성 (사람의 지도감독 또는 물리적 보조가 필요함):
5=지도감독 또는 기구 제공: 물리적인 보조가 필요없지만, 단서주기, 구슬리기 또는 기구 제공이 필요하다.
4=최소 접촉 보조: 대상체가 접촉 이상의 보조는 필요로 하지 않으며, 활동에 필요한 노력의 75％ 이상을 소모한다.
3=중간 보조: 대상체가 접촉보다 많은 보조를 필요로 하며, 활동에 필요한 노력의 50 ± 75％를 소모한다.
2=최대 보조: 대상체가 활동에 필요한 노력의 25 ± 50％를 소모한다.
1=완전 보조: 대상체가 활동에 필요한 노력의 0 ± 25％를 소모한다.
따라서, FIM 총점 (모든 항목에 대해 합함)은 안전성 문제, 및 타인 및 기술적인 장치에 대한 의존성의 측면에서 활동제한의 손실을 추정한다. 분야 점수 및 항목 점수의 프로파일은 SCI에 의해 가장 영향을 받은 일상 생활의 구체적인 측면을 정확히 찾아낸다. 본원에 제공된 SCI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 FIM 규모에 따라 환자의 기능수행에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6점 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 완전 보조를 필요로 하는 대상체가 중간 보조만을, 최소 접촉 보조만을, 지도감독 또는 기구 제공만을 필요로 하거나 또는 부분 독립 또는 완전 독립을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 중간 보조를 필요로 하는 대상체가 최소 접촉 보조만을, 지도감독 또는 기구 제공만을 필요로 하거나 또는 부분 독립 또는 완전 독립을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 최소 접촉 보조를 필요로 하는 대상체가 지도감독 또는 기구 제공만을 필요로 하거나 또는 부분 독립 또는 완전 독립을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 지도감독 또는 기구 제공을 필요로 하는 대상체가 부분 독립 또는 완전 독립을 갖도록 하는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 SCI의 결과로서 부분 독립을 갖는 대상체가 완전 독립을 갖도록 하는데 충분한 양이다.
SCI를 갖거나 또는 그의 증상을 경험하고 있는 개체를 손상이 진행되는 동안 임의의 시점에서 복수개의 태반 줄기 세포 및 임의로 1종 이상의 치료제에 의해 치료할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체를 손상 직후에, 또는 손상 1, 2, 3, 4, 5, 6일 이내에, 또는 손상 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50일 이상 이내에, 또는 손상 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 이내에 치료할 수 있다. 상기 개체를 손상의 임상적 과정 동안 1회 또는 다수회 치료할 수 있다. 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 21일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 14일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 7일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 48시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 24시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 12시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 SCI의 하나 이상의 증상의 발생의 3시간 이내에 상기 개체에게 투여한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 비-인간 영장류이다. 특정 실시양태에서, 개체는 인간 환자이다. 개체는 남성 또는 여성 대상체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물, 예컨대 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트 또는 마우스이다.
SCI의 치료에 유용한 태반 줄기 세포는 본원에 개시된 임의의 태반 줄기 세포일 수 있다 (섹션 5.5 참조). 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200은 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; CD73, CD105 및 CD200을 발현하거나; CD200 및 OCT-4를 발현하거나; CD73 및 CD105는 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; CD73 및 CD105를 발현하고, 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 OCT-4를 발현하고, (c) 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 이들의 임의의 조합이다. 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD10+, CD105+, CD200+, CD34- 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD117-이다.
한 실시양태에서, 개체에게 약 300×106 개의 태반 줄기 세포의 용량을 투여한다. 그러나, 투여량은 개체의 신체적 특징, 예를 들어 체중에 따라 달라질 수 있으며, 1×106 내지 10×109개의 태반 줄기 세포/용량, 바람직하게는 10×106 내지 1×109 개/용량, 또는 100×106 내지 500×106 개의 태반 줄기 세포/용량일 수 있다. 일부 실시양태에서, 살아있는 세포의 투여에 대해 임의의 의학적으로-허용되는 경로에 의한 투여, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 심실내, 흉골내, 두개내, 근육내, 활액낭내, 안내, 유리체내 (예를 들어, 안구가 관여된 경우), 뇌내, 뇌실내 (예를 들어, 신경 또는 뇌가 관여된 경우), 경막내, 골내 주입, 방광내, 경피, 뇌조내, 경막외 또는 피하 투여일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, SCI 부위로 직접적으로 볼루스 주사 또는 주입에 의해, 예를 들어 요추 천자를 통해 투여된다.
한 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 세포 은행, 예를 들어 태반 줄기 세포 은행으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 용량은 볼루스 주사 또는 카테터에 의한 투여에 적합한 혈액 백 또는 유사한 백 내에 함유된다.
태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 태반 줄기 세포가 다중 용량으로 투여되는 경우, 상기 용량은 SCI의 하나 이상의 급성 증상을 경감시키도록 디자인된 치료적 처치의 일부일 수 있거나, 또는 SCI의 중증도를 줄이도록 디자인된 장기간 치료적 처치의 일부일 수 있다.
본원에 제공된 SCI의 치료 방법은 추가로 치료 유효량의 태반 줄기 세포를 SCI의 치료 과정에서 사용되는 하나 이상의 요법 또는 치료법과 병행하여 투여함으로써 SCI를 치료하는 것을 포함한다. 하나 이상의 추가의 요법은 태반 줄기 세포의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 치료적 척추 견인의 적용을 포함한다. 치료적 척추 견인은 수동적으로 또는 기계적으로 생성된 힘을 이용하여, 척주의 세로축을 따른 힘 (통상적으로 체중)의 적용에 기초하여 척추를 신장 및 이동시킨다. 목 또는 경추 분절이 골절된 경우, 견인에 의해 척주를 똑바르게 하여 압박을 줄인다.
다른 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 예를 들어 척주를 적당히 정렬하기 위해 또는 인접한 척추뼈를 융합하여 척추뼈를 강화시키고, 골 재성장을 촉진시키고, 향후 추가의 SCI의 가능성을 감소시키기 위해 막대 또는 스크류를 삽입하는 것을 통한 척추의 수술적 안정화를 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 재활 (예를 들어, 반복적이고 자발적인 움직임 훈련, 근력 운동 등)을 포함하며, 이는 새로운 국부 CNS 연결의 형성을 촉진시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 특정 신경 또는 근육의 기능적 전기 자극 (FES), 예를 들어 호흡을 보조하기 위한 격막 신경의 FES; 방광 및 장 기능을 촉진시키기 위한 천골근의 FES; 팔 또는 손 기능뿐 아니라 서기 또는 걷기를 개선시키기 위한 사지 근육의 FES를 포함한다.
또한, 본원은 SCI를 갖거나 또는 그의 증상을 경험하고 있는 개체에게 SCI의 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군에서의 검출가능한 개선, 또는 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 복수개의 태반 줄기 세포, 및 1종 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료제는 코르티코스테로이드이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 항응고제, 예컨대 헤파린이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 신경보호제이다. 일부 실시양태에서, 신경보호제는 메틸프레드니솔론 나트륨 숙시네이트 (MPSS), GM-1 (시젠(Sygen)), 가실리딘 (GK-11), 티로트로핀 방출 호르몬, 모노시클린 (미노시클린), 리튬 또는 에리트로포이에틴 (EPO)이다.
다른 실시양태에서, 치료제는 이노신, 롤리프람, ATI-355 (NOGO), 콘드로이티나제, 팜프리딘 (4-아미노피리데인), 가바펜틴 또는 Rho 길항제 (예를 들어, 세트린(Cethrin®))이다. 또 다른 실시양태에서, 치료제는 면역조절제 또는 면역억제제, 예를 들어 시클로스포린 A, FTY506 (타크롤리무스) 또는 FTY720이다. 다른 실시양태에서, 치료제는 태반 줄기 세포와 공동 투여되는 세포의 제2 집단이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제2 집단은 자가 대식세포, 골수 간질 세포, 코의 후각 초성 세포, 배아 후각 피질 세포 또는 슈반 세포의 집단이다.
5.1.2 외상성 뇌 손상 (TBI)의 치료
또한, 본원은 TBI를 갖거나 그의 증상을 경험하고 있는 개체에게 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지를 투여하는 것을 포함하며, 상기 치료 유효량은 상기 TBI의 하나 이상의 증상에서의 검출가능한 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 것인, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "하나 이상의 증상"은 객관적으로 측정가능한 파라미터, 예컨대 염증 정도, 면역 반응, 치유 과정과 상관관계가 있는 손상 부위 내의 유전자 발현, 손상 부위에서 반흔의 특징 및 정도, 환자의 운동, 감각 및 인지 기능에서의 개선 등, 및 주관적으로 측정가능한 파라미터, 예컨대 환자 복지, 운동, 감각 및 인지 기능에서의 개선에 대한 환자의 지각, TBI와 관련된 통증 또는 불편함의 감소에 대한 지각 등을 포함한다.
TBI는 두개골 및 두개내 내용물에 인가된 외부 기계적 힘에 의한 뇌의 비퇴행성 비선천적 손상이며, 가능하게는 인지의 감소된 또는 변경된 상태와 관련이 있는, 인지적, 신체적 및 심리사회적 기능의 영구적 또는 일시적 손상을 초래한다. TBI는 임상적으로 뇌진탕에서부터 혼수 및 사망까지 나타낸다.
TBI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은 원발성 TBI, 즉, 외상 순간에 발생한 TBI의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 원발성 TBI는 국소 손상, 예를 들어 두개 골절, 파열, 타박상, 또는 관통창이다. 일부 실시양태에서, 원발성 TBI는 미만성, 예를 들어 미만성 축삭 손상이다.
TBI의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포의 치료 유효량은, 외상 직후에 발생하고 그 효과가 일부 시간 동안 지속되는, 원발성 TBI로 인한 2차 손상의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양이다. TBI의 2차 유형은 1차 손상의 효과로부터 추가의 세포 손상에 기인할 수 있다. 2차 손상은 뇌의 초기 외상 이후 소정 시간 또는 날에 걸쳐 진행될 수 있다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법은 또한 뇌의 특정 영역에 대해 가해진 TBI 손상을 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 TBI의 치료 방법은 전두엽 (이마에 위치함), 두정엽 (머리의 위쪽 후방 근처에 위치함), 후두엽 (머리의 후방에서 가장 뒤쪽에 위치함), 측두엽 (귀 위쪽 머리의 측면에 위치함), 뇌간 (뇌 내의 심부에 위치함) 및 소뇌 (두개의 맨 아래 부분에 위치함)에 대한 손상을 치료하는데 유용하다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 전두엽에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 다양한 신체 부분의 단순한 움직임의 상실 (마비), 여러 단계의 과제, 예컨대 커피 제조를 완료하는데 필요한 복잡한 움직임의 순서를 계획하는 것 (순서화)의 불능, 타인과의 상호작용에서 자발성의 상실, 사고 유연성의 상실, 한 가지 생각의 고집 (고집증), 업무 집중 (주의력) 불능, 기분 변화 (감정적으로 불안정함), 사회적 거동의 변화, 인격의 변화, 문제 해결 곤란, 또는 언어 표현 불능 (브로카(Broca) 실어증)에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 두정엽에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 한번에 1개 초과의 사물에 주의를 기울이는 것의 불능, 사물의 명칭 기억 불능 (명칭실어증), 필기 불능 (실서증), 읽기 문제 (실독증), 사물 그리기의 곤란, 좌우 구별의 곤란, 수학 풀기의 곤란 (난산증), 자기 관리의 곤란을 초래하는 특정 신체 부분 및/또는 주위 공간의 자각 결여 (운동불능증), 시각적 주의 집중의 불능, 또는 눈과 손의 협응 곤란에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 후두엽에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 시력 결함 (시야 차단), 환경에서 사물 위치화의 곤란, 색체 인식 곤란 (색체 실인증), 환각 생성, 착시 (사물을 부정확하게 보기), 실독증 (단어 인식의 불능), 그려진 사물 인식의 곤란, 사물의 움직임 인식 불능 (움직임 실인증), 또는 읽기 및 쓰기의 곤란에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 측두엽에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 얼굴 인식의 곤란 (안면실인증), 말한 단어 이해의 곤란 (베르니케(Wernicke) 실어증), 대상체가 보고 듣는 것에 선택적으로 주의하는 것의 혼란, 사물을 확인하고 그에 대해 말로 표현하는 것의 곤란, 단기 기억 상실, 장기 기억에 대한 혼선, 성적 거동에 대한 증가된 및 감소된 관심, 사물 분류의 불능, 지속적으로 이야기하기 (우엽 손상의 지표), 또는 증가된 공격적 거동에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 뇌간에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 호흡시 감소된 폐활량 (말하는데 있어서 중요함), 음식과 물 삼키기의 곤란 (연하곤란), 환경의 조직화/지각의 곤란, 균형 및 움직임 문제, 현기증 및 오심 (어지럼증), 또는 수면 곤란 (불면증, 수면 무호흡증)에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 두개의 맨 아래 부분에 대한 손상의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 미세한 움직임들의 협응 능력의 상실, 걷는 능력의 상실, 사물에 도달하여 잡는 것의 불능, 진전, 현기증 (어지럼증), 불명료 언어 (단속성 언어), 또는 신속히 움직이기의 불능에서의 개선을 일으키는데 충분한 양이다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법은 또한 경증에서 중증의 범위에 이르는 TBI 손상의 치료 방법을 포함한다. TBI는 의식 상실 및/또는 착란 및 방향감각 상실이 30분보다 짧은 경우에는 경증으로 분류될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 TBI를 가진 개체에게 유효 용량의 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDACS)를 투여하는 것을 제공하며, 여기서 상기 유효 용량은 예를 들어 경증 TBI의 경증의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 인지 문제, 예컨대 두통, 기억력 문제, 주의력 결핍, 감정 기복 및 좌절감, 피로, 시각 장애, 기억 상실, 주의력/집중력 부족, 수면 장애, 현기증/균형 상실, 과민성, 감정 장애, 우울감, 발작, 오심, 후각 상실, 빛과 소리에 대한 감수성, 기분 변화, 상실감 또는 착란, 또는 사고의 저속화에서의 검출가능한 개선을 일으키거나, 그의 중증도를 감소시키거나, 또는 그의 진행을 감소시키는데 충분한 태반 세포의 양이다.
구체적인 실시양태에서, 유효 용량은 예를 들어 뇌진탕의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 착란 또는 멍한 감정, 서투름, 불명료 언어, 오심 또는 구토, 두통, 균형 문제 또는 현기증, 흐린 시력, 빛에 대한 감수성, 소음에 대한 감수성, 나태, 귀울림, 거동 또는 인격 변화, 집중 곤란, 또는 기억 상실에서의 검출가능한 개선을 일으키거나, 그의 중증도를 감소시키거나, 또는 그의 진행을 감소시키는데 충분한 태반 세포의 양이다. 일부 실시양태에서, 뇌진탕은 등급 1 (경증의) 뇌진탕이며, 이는 의식 상실이 없으며, 수분보다 짧게 지속되는 뇌진탕 증상을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 뇌진탕은 등급 2 (중등도의) 뇌진탕이며, 이는 의식 상실이 없으며, 15분보다 길게 지속되는 뇌진탕 증상을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 뇌진탕은 등급 3 (중증의) 뇌진탕이며, 이는 적어도 수초 동안의 의식 상실을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 TBI를 가진 개체에게 유효 용량의 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)를 투여하는 것을 제공하며, 여기서 상기 유효 용량은 예를 들어 중등도 내지 중증 TBI의 하나 이상의 증상, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 인지 결함, 예컨대 주의, 집중, 주의산만, 기억, 처리 속도, 착란, 고집증, 충동성, 언어 처리, 언어 구사의 곤란, 말의 이해 불가 (수용 실어증), 이해한 것의 말하기 곤란 (표현 실어증), 불명료 언어, 매우 빠르게 또는 매우 느리게 말하는 것, 읽기 문제, 쓰기 문제; 감각 결함, 예컨대 접촉, 온도, 움직임, 사지 위치 및 미세 식별의 이해 곤란; 지각 결함, 예컨대 감각 인상을 심리적으로 의미있는 데이터로 통합하거나 패턴화하는 것의 곤란; 시각 결함, 예컨대 부분적 또는 완전한 시력 상실, 눈의 근육 쇠약 및 이중시 (복시), 흐린 시력, 거리 판단 문제, 불수의 안구 운동 (안구진탕증), 광 불내성 (광선공포증); 청력 결함, 예컨대 청력 감소 또는 상실, 또는 귀울림 (이명), 또는 소리에 대한 감수성 증가; 후각 결함, 예컨대 후각 상실 또는 약화 (후각상실증); 미각 상실 또는 약화; 발작, 예컨대 간질과 관련이 있는 경련 (몇몇 유형이 있을 수 있으며, 인지, 감각 지각 또는 운동 움직임에서의 혼란과 관련있을 수 있음); 신체적 변화, 예컨대 신체 마비/경직; 만성 통증, 장 및 방광의 통제력 상실, 수면 장애, 스태미나 상실, 식욕 변화, 체온 조절곤란, 및 월경 곤란; 사회-정서 곤란, 예컨대 의존적 거동, 정서 능력의 결핍, 동기 결여, 과민성, 공격성, 우울증, 탈억제, 또는 거부/자각 결여에서의 검출가능한 개선을 일으키거나, 그의 중증도를 감소시키거나, 또는 그의 진행을 감소시키는데 충분한 태반 세포의 양이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 TBI를 가진 개체에게 유효 용량의 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)를 투여하는 것을 제공하며, 여기서 상기 유효 용량은 예를 들어 상기 열거된 TBI의 하나 이상의 증상에서의 검출가능한 개선, 그의 중증도의 감소, 또는 그의 진행의 감소를 일으키는데 충분한 태반 줄기 세포의 양이다. 특정 실시양태에서, TBI의 하나 이상의 증상, 상태 또는 증후군에서의 개선, 그의 중증도에서의 감소, 또는 그의 진행에서의 감소를 검출하기 위한 특정 기술(들)은 본원에 제공된 TBI의 치료 방법에서 중요하지 않다. 특정 실시양태에서, SCI의 하나 이상의 증상에서의 상기 개선 또는 그의 진행에서의 감소의 평가는 당업계의 전문인의 판단에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, TBI의 하나 이상의 증상에서의 상기 개선 또는 그의 진행에서의 감소의 평가는 대상체의 주관적인 경험과 조합되어 당업계의 전문인의 판단에 따라 결정된다.
일부 실시양태에서, 상기 TBI의 하나 이상의 증상에서의 개선, 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 글라스고우(Glasgow) 혼수상태 규모 (GCS)에 따라 검출된다. GCS는 하기와 같이 손상 48시간 이내에 TBI의 중증도를 규정한다:
개안 반응
자발적인 반응 = 4
말에 대한 반응 = 3
통증성 자극에 대한 반응 = 2
반응 없음 = 1
운동 반응
지시에 따름 = 6
통증에 대한 국부적 움직임 = 5
통증에 대한 회피성 움직임 = 4
통증에 대한 굴근 (제피) 동작 = 3
통증에 대한 신근 (제뇌) 동작 = 2
반응 없음 = 1
언어 반응
사람, 장소 및 날짜를 알고 있음 = 5
대화를 하지만, 혼란스러움 = 4
부적절한 단어로 말함 = 3
이해할 수 없는 소리로 말함 = 2
반응 없음 = 1
GCS 점수에 따른 TBI의 중증도 (48시간 이내)는 다음과 같다:
식물인간 상태의 TBI = 3점 미만 (수면 각성 주기; 흥분, 그러나 환경과의 상호작용 없음; 통증에 대한 국부적 반응 없음을 특징으로 함)
중증의 TBI = 3-8점 (혼수 상태: 무의식 상태; 의미있는 반응 없음, 자발적인 활동 없음을 특징으로 함)
중등도의 TBI = 9-12점 (30분 넘게 의식 상실; 해결하거나 해결할 수 없는 신체 또는 인지 장애; 재활이 환자에게 유용할 수 있음을 특징으로 함)
경증의 TBI = 13-15점 (정신 상태의 짧은 변화 (착란, 방향감각 상실 또는 기억 상실) 또는 30분 미만 동안 의식 상실을 특징으로 함)
따라서, 본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 환자의 GCS 점수에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12점 이상의 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 GCS에 따라 개안 반응에 대해 1, 2, 또는 3점의 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 GCS에 따라 운동 반응에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5점의 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 GCS에 따라 언어 반응에 대해 1, 2, 3 또는 4점의 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 외상성 손상의 중증도를 식물인간 상태의 TBI에 상응하는 수준에서 중증의, 중등도의 또는 경증의 TBI에 상응하는 수준으로 감소시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 외상성 손상의 중증도를 중증의 TBI에 상응하는 수준에서 중등도의 또는 경증의 TBI에 상응하는 수준으로 감소시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 외상성 손상의 중증도를 중등도의 TBI에 상응하는 수준에서 경증의 TBI에 상응하는 수준으로 감소시키는데 충분한 양이다.
일부 실시양태에서, 상기 TBI의 하나 이상의 증상에서의 개선, 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소는 란코스 로스 아미고스(Ranchos Los Amigos) 규모에 따라 검출된다. 란코스 로스 아미고스 규모는 하기 규모에 따라 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용의 수준을 측정한다:
수준 I: 반응 없음
수준 II: 전신 반응
수준 III: 국부 반응
수준 IV: 혼란스럽고 초초한 반응
수준 V: 혼란스럽고 부적절한 반응
수준 VI: 혼란스럽고 적절한 반응
수준 VII: 무의식적인 적절한 반응
수준 VIII: 의식적인 적절한 반응
따라서, 본원에 제공된 TBI의 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 란코스 로스 아미고스 규모에 따라 환자의 점수에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 수준 증가를 일으키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 반응 없음의 수준에서 전신 반응, 국부 반응, 혼란스럽고 초초한 반응, 혼란스럽고 부적절한 반응, 혼란스럽고 적절한 반응, 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 전신 반응의 수준에서 국부 반응, 혼란스럽고 초초한 반응, 혼란스럽고 부적절한 반응, 혼란스럽고 적절한 반응, 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 국부 반응의 수준에서 혼란스럽고 초초한 반응, 혼란스럽고 부적절한 반응, 혼란스럽고 적절한 반응, 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 혼란스럽고 초초한 반응의 수준에서 혼란스럽고 부적절한 반응, 혼란스럽고 적절한 반응, 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 혼란스럽고 부적절한 반응의 수준에서 혼란스럽고 적절한 반응, 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 혼란스럽고 적절한 반응의 수준에서 무의식적인 적절한 반응 또는 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)의 치료 유효량은 대상체의 자각, 인지, 거동 및 환경과의 상호작용을 무의식적인 적절한 반응의 수준에서 의식적인 적절한 반응의 수준으로 상승시키는데 충분한 양이다.
TBI를 갖거나 그의 증상을 경험하고 있는 개체를 손상이 진행되는 동안 임의의 시점에서 복수개의 태반 줄기 세포 및 임의로 1종 이상의 치료제에 의해 치료할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체를 손상 직후에, 또는 손상 1, 2, 3, 4, 5, 6일 이내에, 또는 손상 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50일 이상 이내에 치료할 수 있다. 상기 개체를 손상의 임상적 과정 동안 1회 또는 다수회 치료할 수 있다. 치료 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 21일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 14일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 7일 이내에 상기 개체에게 투여한다. 치료 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 48시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 24시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 12시간 이내에 상기 개체에게 투여한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 줄기 세포를 TBI의 하나 이상의 증상의 발생의 3시간 이내에 상기 개체에게 투여한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 비-인간 영장류이다. 특정 실시양태에서, 개체는 인간 환자이다. 개체는 남성 또는 여성 대상체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-인간 동물, 예컨대 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트 또는 마우스이다.
TBI의 치료에 유용한 태반 줄기 세포는 본원에 개시된 임의의 태반 줄기 세포일 수 있다 (섹션 5.5 참조). 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD200은 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; CD73, CD105 및 CD200을 발현하거나; CD200 및 OCT-4를 발현하거나; CD73 및 CD105는 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나; CD73 및 CD105를 발현하고, 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 OCT-4를 발현하고, (c) 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나; 또는 이들의 임의의 조합이다. 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD10+, CD105+, CD200+, CD34- 태반 줄기 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 줄기 세포는 CD117-이다.
한 실시양태에서, 개체에게 약 200×106 내지 800×106 개의 태반 줄기 세포의 용량을 투여한다. 그러나, 투여량은 개체의 신체적 특징, 예를 들어 체중에 따라 달라질 수 있으며, 1×106 내지 10×109 개의 태반 줄기 세포/용량, 바람직하게는 10×106 내지 1×109 개/용량, 또는 100×106 내지 500×106 개의 태반 줄기 세포/용량일 수 있다. 투여는 정맥내 투여가 바람직하지만, 살아있는 세포의 투여에 대해 임의의 의학적으로-허용되는 경로에 의한 투여, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 심실내, 흉골내, 두개내, 근육내, 활액낭내, 안내, 유리체내 (예를 들어, 안구가 관여된 경우), 뇌내, 뇌실내 (예를 들어, 신경 또는 뇌가 관여된 경우), 경막내, 골내 주입, 방광내, 경피, 뇌조내, 경막외 또는 피하 투여일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, TBI 부위로 직접적으로 볼루스 주사 또는 주입에 의해, 예를 들어 대조를 통해 투여된다.
태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배지는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 태반 줄기 세포가 다중 용량으로 투여되는 경우, 상기 용량은 TBI의 하나 이상의 급성 증상을 경감시키도록 디자인된 치료 처치의 일부일 수 있거나, 또는 TBI의 중증도를 줄이도록 디자인된 장기간 치료 처치의 일부일 수 있다.
본원에 제공된 TBI의 치료 방법은 추가로 치료 유효량의 태반 줄기 세포를 TBI의 치료 과정에 이용되는 하나 이상의 요법 또는 치료법과 병행하여 투여함으로써 TBI를 치료하는 것을 포함한다. 하나 이상의 추가의 요법은 태반 줄기 세포의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 수술적 치료를 포함한다. 일부 실시양태에서, 볼트 또는 ICP (두개내 압력) 모니터링 장치를 두개에 위치시켜, 뇌강에서의 압력을 모니터링할 수 있다. 일부 실시양태에서, 두개강에서 출혈이 있는 경우, 태반 줄기 세포의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에, 이를 수술적으로 제거하거나 배출시킬 수 있고, 출혈 혈관 또는 조직을 수술적으로 복구시킬 수 있다. 중증의 사례에서, 과도한 종창 및 손상된 뇌 조직이 있는 경우, 태반 줄기 세포의 투여 이전에, 동시에 또는 이후에, 소정 부분을 수술적으로 제거하여, 살아있는 뇌 조직을 위한 공간을 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 요법은 호흡을 보조하고 머리에서 압력이 낮게 유지되도록 돕는 기계적 환기의 사용을 포함한다.
또한, 본원은 TBI를 갖거나 그의 증상을 경험하고 있는 개체에게 상기 TBI의 하나 이상의 증상에서의 검출가능한 개선 또는 하나 이상의 증상의 진행에서의 감소를 일으키는데 충분한 복수개의 태반 줄기 세포, 및 1종 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 태반 줄기 세포를 대상체를 진정시키고 약물-유도 혼수상태로 두는 약제와 함께 투여하여, 초조함과 2차 손상을 최소화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발작 예방 약제는 치료 과정에서 초기에 제공될 수 있고, 개체에서 발작이 있는 경우에는 나중에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자의 기능이 회복됨에 따라 경직을 조절하는 약제가 사용될 수 있다. 또한, 주의 및 집중을 개선시키는 약제 (예를 들어, 아만타딘 및 메틸페니데이트, 브로모크립틴 및 항우울제), 또는 공격적 거동을 조절하는 약제 (예를 들어, 카르밤아마자핀 및 아미트립틸린)를 사용할 수 있다.
5.2 CNS 손상에 의해 야기되거나 그와 관련된 염증 반응을 저해하기 위한 태반 줄기 세포의 사용
또 다른 측면에서, 본원은 CNS 손상에 의해 야기되거나 그와 관련된 염증 반응을 저해하는 것을 포함하는, CNS 손상을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 면역 세포(들)을 복수개의 태반 줄기 세포와 접촉시킴으로써 면역 세포 또는 복수개의 면역 세포의 활성, 예를 들어 증식을 조정하는, 예를 들어 저해하는 방법을 제공한다.
태반 줄기 세포-매개 면역조정, 예를 들어 면역억제는 예를 들어 염증이 CNS 손상의 초기 및 만성 단계 중 하나 또는 둘 다에서 소정의 역할을 하는 CNS 손상에 유리할 것이다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 본원은 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI에 의해 야기되거나 또는 그와 관련된 면역 반응을 저해하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원은 태반 줄기 세포가 면역 반응을 검출가능하게 저해하는데 충분한 시간 동안 복수개의 면역 세포를 복수개의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기 세포가 MLR 검정 또는 회귀 검정에서 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인, CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI에 의해 야기되거나 또는 그와 관련된 면역 반응을 저해하는 방법을 제공한다.
태반 줄기 세포는 예를 들어 본원 어디에서나 기재되어 있는 태반 줄기 세포이다 (섹션 5.5 참조). 면역억제를 위해 사용되는 태반 줄기 세포는 하나의 태반 또는 여러개의 태반으로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 면역억제를 위해 사용되는 태반 줄기 세포는 또한 단일 종, 예를 들어 감소시키거나 저해하도록 기능하는 의도된 수용자의 종 또는 면역 세포의 종으로부터 유래될 수 있거나 또는 여러 종으로부터 유래될 수 있다.
이 방법과 관련하여 "면역 세포"는 면역계의 임의의 세포, 특히 T 세포 및 천연 킬러 (NK) 세포를 의미한다. 따라서, 상기 방법의 다양한 실시양태에서, 태반 줄기 세포를 복수개의 면역 세포와 접촉시키며, 복수개의 면역 세포는 복수개의 T 세포 (예를 들어, 복수개의 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포) 및/또는 천연 킬러 세포이거나 또는 이들을 포함한다. 상기 방법과 관련하여 "면역 반응"은 면역 세포에 의해 정상적으로 지각되는 자극에 대한 면역 세포에 의한 임의의 반응, 예를 들어 항원의 존재에 대한 반응일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 면역 반응은 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI에 대한 반응으로서 T 세포 (예를 들어, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포)의 증식일 수 있다. 면역 반응은 또한 천연 킬러 (NK) 세포의 임의의 활성, 수지상 세포의 성숙 등일 수 있다. 면역 반응은 또한 하나 이상의 부류의 면역 세포의 활성의 국부적, 조직- 또는 장기-특이적, 또는 전신적 효과일 수 있으며, 예를 들어 면역 반응은 염증, 염증-관련 반흔 조직의 형성 등일 수 있다.
이 문맥에서 "접촉"은 단일 용기에서 (예를 들어, 배양 디쉬, 플라스크, 바이알 등) 또는 생체내에서, 예를 들어 동일 개체 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간)에서 태반 줄기 세포와 면역 세포를 합하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 접촉은 면역 세포의 면역 기능에서의 변화가 검출가능하도록, 충분한 시간 동안 및 충분한 개수의 태반 줄기 세포 및 면역 세포를 사용하여 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 다양한 실시양태에서, 상기 접촉은 태반 줄기 세포의 부재하에서의 면역과 비교할 때 면역 기능 (예를 들어, 항원에 대한 반응으로 T 세포 증식)을 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 95％만큼 저해하는데 충분하다. 생체내에서의 이러한 저해는 시험관내 검정 (하기 참조)에 의해 결정될 수 있으며; 즉, 시험관내 검정에서의 저해 정도를 수용자 개체에서 특정 개수의 태반 줄기 세포 및 소정 개수의 면역 세포에 대해 개체에서의 저해 정도로 외삽 추정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원은 시험관내에서 면역 반응 또는 복수개의 하나 이상의 유형의 면역 세포의 활성을 조정하기 위해 태반 줄기 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 태반 줄기 세포와 복수개의 면역 세포의 접촉은, 복수개의 태반 줄기 세포의 적어도 일부가 복수개의 면역 세포의 적어도 일부와 상호작용하도록 하는 동일한 물리적 공간에서 태반 줄기 세포와 면역 세포를 합하고; 공통된 배지를 갖는 별도의 물리적 공간에서 태반 줄기 세포 및 면역 세포를 유지시키는 것을 포함할 수 있거나; 또는 태반 줄기 세포 또는 면역 세포 중 하나로부터 또는 이들의 배양물로부터의 배지를 다른 유형의 세포와 접촉시키는 것 (예를 들어, 태반 줄기 세포의 배양물로부터 배양 배지를 수득하고, 단리된 면역 세포를 상기 배지에 재현탁시킴)을 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 접촉은 MLR 검정에서 수행된다. 또 다른 구체적인 예에서, 접촉은 회귀 검정에서 수행된다. 또 다른 구체적인 예에서, 접촉은 비드 T-림프구 반응 (BTR) 검정에서 수행된다.
이러한 접촉은 예를 들어 특정 복수개의 태반 줄기 세포가 면역조절성, 예를 들어 면역억제성인 정도를 결정하도록 디자인된 실험적 설정에서 수행될 수 있다. 이러한 실험적 설정은 예를 들어 MLR 또는 회귀 검정일 수 있다. MLR 및 회귀 검정을 수행하는 절차는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Schwarz, "The Mixed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance," J. Exp . Med. 127(5):879-890 (1968)]; [Lacerda et al., "Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid / Scid Mice," J. Exp . Med. 183:1215-1228 (1996)]을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 복수개의 태반 줄기 세포를 복수개의 면역 세포 (예를 들어, 림프구, 예를 들어 CD3+, CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구)와 접촉시키는 MLR을 수행한다.
MLR을 이용하여, 복수개의 태반 줄기 세포의 면역억제 용량을 결정할 수 있다. 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 수지상 세포 (DC) 및 태반 줄기 세포를 약 10:1:2의 비율로 합하는 것을 포함하는 MLR에서 복수개의 태반 줄기 세포를 시험할 수 있으며, 여기서 T 세포를 딸 세포와 구분시키는 염료, 예컨대 CFSE로 염색하고, T 세포를 약 6일 동안 증식하도록 한다. 태반 줄기 세포의 존재하에서 6일간의 T 세포 증식이 DC의 존재 및 태반 줄기 세포의 부재하에서의 T 세포 증식에 비해 검출가능하게 감소된 경우, 복수개의 태반 줄기 세포는 면역억제성이다. 이러한 MLR에서, 태반 줄기 세포는 배양물로부터 해동된 것이거나 수확된 것이다. 약 20,000개의 태반 줄기 세포를 100 ㎕의 배지 (RPMI 1640, 1 mM HEPES 완충제, 항생제, 및 5％ 혼합 인간 혈청) 중에 재현탁시키고, 2시간 동안 웰의 바닥에 부착되도록 한다. CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 밀테니이(Miltenyi) 자석 비드에 의해 온전한 말초혈 단핵 세포로부터 단리한다. 상기 세포를 CFSE로 염색하고, 총 100,000개의 T 세포 (CD4+ T 세포 단독, CD8+ T 세포 단독, 또는 동량의 CD4+ 및 CD8+ T 세포)를 웰마다 첨가한다. 웰 중의 부피는 200 ㎕가 되게 하고, MLR이 진행되도록 한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본원은 MLR 검정 또는 회귀 검정에서 상기 태반 줄기 세포가 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는데 충분한 시간 동안 복수개의 면역 세포를 복수개의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 저해하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, MLR에 사용되는 상기 태반 줄기 세포는 태반 줄기 세포의 더 큰 집단으로부터 태반 줄기 세포의 샘플 또는 분취액을 나타낸다.
상이한 태반으로부터 또는 동일 태반 내의 상이한 조직으로부터 수득되는 태반 줄기 세포의 집단은 면역 세포의 활성을 조절하는 그들의 능력에 차이가 있을 수 있으며, 예를 들어 T 세포 활성 또는 증식 또는 NK 세포 활성을 저해하는 그들의 능력에 차이가 있을 수 있다. 따라서, 사용하기 전에, 면역억제에 대한 태반 줄기 세포의 특정 집단의 용량을 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 용량은 예를 들어 MLR 또는 회귀 검정에서 태반 줄기 세포 집단의 샘플을 시험함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 샘플을 이용하여 MLR을 수행하고, 상기 검정에서 태반 줄기 세포로부터 기인할 수 있는 면역억제의 정도를 결정한다. 이어서, 이러한 면역억제의 정도는 샘플링된 태반 줄기 세포 집단으로부터 기인할 수 있다. 따라서, MLR은 태반 줄기 세포의 특정 집단이 면역 기능을 저해하는 절대적인 및 상대적인 능력을 결정하는 방법으로 이용될 수 있다. MLR의 파라미터를 변화시켜, 더 많은 데이터를 제공하거나 또는 태반 줄기 세포의 샘플이 면역억제하는 용량을 가장 잘 결정할 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기 세포에 의한 면역억제가 검정에 존재하는 태반 줄기 세포의 개수에 대략 비례하여 증가하는 것으로 보이기 때문에, 한 실시양태에서 2개 이상의 태반 줄기 세포, 예를 들어 반응 당 1 x 103, 3 x 103, 1 x 104 및/또는 3 x 104개의 태반 줄기 세포를 사용하여 MLR을 수행할 수 있다. 검정에서 T 세포의 개수에 비한 태반 줄기 세포의 개수는 또한 달라질 수 있다. 예를 들어, 검정에서 태반 줄기 세포 및 T 세포는 임의의 비율로, 예를 들어 약 10:1 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5의 비율로 존재할 수 있지만, 비교적 더 많은 개수의 태반 줄기 세포 또는 T 세포를 사용할 수 있다.
회귀 검정 또는 BTR 검정은 유사한 방식으로 이용될 수 있다.
본원은 생체내에서 예를 들어 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI에 의해 야기되거나 또는 그와 관련된, 면역 반응 또는 복수개의 하나 이상의 유형의 면역 세포의 활성을 조정하기 위해 태반 줄기 세포를 이용하는 방법을 제공한다. 태반 줄기 세포 및 면역 세포를 예를 들어 복수개의 태반 줄기 세포의 수용자인 개체에서 접촉시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 접촉을 개체에서 수행하는 경우, 접촉은 외인성 태반 줄기 세포 (즉, 개체로부터 유래되지 않은 태반 줄기 세포)와 개체에 내인성인 복수개의 면역 세포 사이에서 수행된다. 구체적인 실시양태에서, 개체 내의 면역 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및/또는 NK 세포이다.
태반 줄기 세포를 개체에서 공지된 또는 예상된 개수의 면역 세포, 예를 들어 T 세포에 대해 약 10:1 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5의 비율로 개체에게 투여할 수 있다. 그러나, 복수개의 태반 줄기 세포를 비제한적인 예로 약 10,000:1, 약 1,000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1,000 또는 약 1:10,000의 비율로 개체에게 투여할 수 있다. 일반적으로, 약 1 x 105 내지 약 1 x 108 개의 태반 줄기 세포/수용자 kg, 바람직하게는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 개의 태반 줄기 세포/수용자 kg을 투여하여 면역억제를 유효화할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 개체 또는 대상체에게 투여되는 복수개의 태반 줄기 세포는 약 1 x 105, 3 x 105, 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107, 3 x 107, 1 x 108, 3 x 108, 1 x 109, 3 X 109 개의 태반 줄기 세포, 또는 그 이상 또는 이하를 포함한다.
또한, 태반 줄기 세포를 하나 이상의 제2 유형의 줄기 세포, 예를 들어 골수로부터의 중간엽 줄기 세포와 함께 투여할 수 있다. 이러한 제2 줄기 세포는 예를 들어 약 1:10 내지 약 10:1의 비율로 태반 줄기 세포와 함께 개체에게 투여될 수 있다.
생체내에서 태반 줄기 세포 및 면역 세포의 접촉 또는 근접을 용이하게 하기 위해, 태반 줄기 세포와 면역 세포가 서로 접촉하기에 충분한 임의의 경로에 의해 태반 줄기 세포를 개체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기 세포를 개체에게 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내, 안내, 비경구, 경막내, 또는 장기, 예를 들어 췌장에 직접 투여될 수 있다. 생체내 투여의 경우, 태반 줄기 세포를 하기 섹션 5.9.1.2에 기재된 바와 같이 제약 조성물로서 제제화할 수 있다.
특히 생체내의 관점에서 면역억제 방법은 추가로 하나 이상의 면역억제제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 복수개의 태반 줄기 세포를 개체의 생체내에서 복수개의 면역 세포와 접촉시키고, 면역억제제를 포함하는 조성물을 개체에게 투여한다. 면역억제제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 항-T 세포 수용체 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날, 또는 그의 항체 단편 또는 유도체), 항-IL-2 수용체 항체 (예를 들어, 바실릭시맙 (시물렉트(SIMULECT®)) 또는 다클리주맙 (제나팍스(ZENAPAX)®), 항-T 세포 수용체 항체 (예를 들어, 무로모납-CD3), 아자티오프린, 코르티코스테로이드, 시클로스포린, 타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 시롤리무스, 칼시뉴린 억제제 등이 포함된다. 구체적인 실시양태에서, 면역억제제는 대식세포 염증성 단백질 (MIP)-1α 또는 MIP-1β에 대한 중화 항체이다. 바람직하게는, 항-MIP-1α 또는 MIP-1β 항체를 상기 개체에서 MIP-1α 및/또는 MIP-1β의 양의 검출가능한 감소를 일으키는데 충분한 양으로 투여한다.
T 세포 증식을 저해하는 것 이외에도, 태반 줄기 세포는 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI의 치료에 유익할 수 있는 면역계의 세포에 대해 다른 항염증성 효과를 갖는다. 예를 들어, 태반 줄기 세포는, 예를 들어 시험관내 또는 생체내에서 개체에게 투여할 때와 같이, Th1 및/또는 Th17 T 세포 하위세트에 의해 매개되는 면역 반응을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 본원은 T 세포 (예를 들어, CD4+ T 림프구 또는 백혈구)를 태반 줄기 세포, 예를 들어 본원에 기재된 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 염증전 반응, 예를 들어 Th1 반응 또는 Th17 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 Th1 세포 성숙을 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 T 세포에 의한 또는 항원-생성 세포에 의한 하나 이상의의 림포톡신-1α (LT-1α), 인터류킨-1β (IL-1β), IL-12, IL-17, IL-21, IL-23, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 및/또는 인터페론 감마 (IFNγ)의 생성을 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 조절성 T 세포 (Treg) 표현형을 강화시키거나 상향조절하고/거나, Th1 및/또는 Th17 반응 (예를 들어, CD80, CD83, CD86, ICAM-1, HLA-II)을 촉진시키는 생체분자의 수지상 세포 (DC) 및/또는 대식세포에서의 발현을 감소시킨다. 구체적인 실시양태에서, 상기 T 세포를 또한 IL-10, 예를 들어 외인성 IL-10, 또는 상기 T 세포에 의해 생성되지 않는 IL-10, 예를 들어 재조합 IL-10과 접촉시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 대식세포를 유효량의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포로부터 염증전 시토카인의 생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역계 세포를 유효량의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역관용성 세포의 개수를 증가시키고, 면역 세포의 면역관용성 기능을 촉진시키고/거나, 예를 들어 대식세포로부터의 면역관용성 시토카인을 상향조절하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 활성화된 대식세포가 상기 태반 줄기 세포와 접촉하지 않은 활성화된 대식세포에 비해 더 많은 IL-10을 검출가능하게 생성하게 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 면역계 세포를 유효량의 태반 줄기 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 항염증성 T 세포를 상향조절하거나 또는 그의 개수를 증가시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원은 개체에게 유효량의 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 유효량은 개체에서 Th1 반응을 검출가능하게 감소시키는 양인, CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI를 갖거는 그의 증상을 경험하고 있는 개체에서 Th1 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 개체에게 유효량의 태반 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 유효량은 개체에서 Th17 반응을 검출가능하게 감소시키는 양인, CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI를 갖거나 그의 증상을 경험하고 있는 개체에서 Th17 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 투여는 상기 개체에서 T 세포 또는 항원 제시 세포에 의한 IL-1β, IL-12, IL-17, IL-21, IL-23, TNFα 및/또는 IFNγ 중 하나 이상의 생성을 검출가능하게 감소시킨다. 상기 방법의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 조절성 T 세포 (Treg) 표현형을 강화시키거나 상향조절하거나, 또는 상기 개체에서 수지상 세포 (DC) 및/또는 대식세포에서 Th1 또는 Th17 반응을 촉진시키는 마커의 생성을 조정한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 IL-10을 추가로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원은 1종 이상의 항염증성 시토카인을 발현하도록 유전자 조작된 본원에 기재된 바와 같은 태반 줄기 세포를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 항염증성 시토카인은 IL-10을 포함한다.
5.3 혈관신생 및 CNS 손상의 치료
또 다른 측면에서, 본원은 개체의 뇌 내에서 또는 주변에서 혈액의 흐름이 중단된 개체, 예를 들어 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI로 인해 개체의 뇌 또는 CNS 내에서 또는 주변에서 혈액의 흐름이 중단되는데 기여할 수 있는 증상 또는 신경학적 결함을 가진 개체에게 치료 유효량의 단리된 태반 줄기 세포 (예를 들어, PDAC)를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 혈액 흐름의 중단은 개체의 뇌 또는 CNS에 무산소 손상 또는 저산소 손상을 일으킨다. 특정 실시양태에서, PDAC는 혈관신생성이다. 특정 실시양태에서, PDAC는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 내피 세포 및 내피 세포 집단, 및 상피 세포 및 상피 세포 집단의 성장을 보조할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 태반 유래 부착성 세포와 관련하여 용어 "혈관신생성"은, 세포, 예를 들어 내피 세포의 또 다른 집단에서 세포가 혈관 또는 혈관-유사 발아체를 형성할 수 있거나, 또는 세포가 혈관신생 (예를 들어, 혈관 또는 혈관-유사 구조체의 형성)을 촉진시킬 수 있는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생"은 내피 세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 리모델링 및 세포 안정화를 포함하지만 이로 제한되지 않는 혈관 형성의 과정을 지칭한다.
특정 실시양태에서, PDAC 및 이러한 세포의 집단은 외상성 조직 손실을 나타내는 개체에서 혈관신생을 촉진시키거나, 또는 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI로 인한 반흔 형성을 예방하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 개체는 상기 요법으로부터, 예를 들어 희돌기교세포 및 뉴런을 비롯한 다른 세포의 성장을 보조하는 세포의 능력으로부터, 조직 내부 성장 또는 조직의 혈관증식으로부터, 및 유익한 세포 인자, 케모카인, 시토카인 등의 존재로부터의 이점을 경험하지만, 세포는 개체에서 통합되거나 증대되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 세포를 이용하는 치료학적 처치로부터 이점을 갖지만, 세포는 환자에서 장기간 동안 생존하지 않는다. 한 실시양태에서, 세포는 수, 생존율 또는 생화학적 활성이 점차적으로 쇠퇴하고, 다른 실시양태에서, 활성, 예를 들어 성장, 분열 또는 생화학적 활성의 기간 이후에 세포가 쇠퇴한다. 다른 실시양태에서, 노화된, 생존할 수 없는 또는 심지어 죽은 세포가 유익한 치료 효과를 가질 수 있다.
PDAC, 또는 이러한 세포를 포함하는 치료 조성물을 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것은 예를 들어 이식(transplantation), 이식(implantation) (예를 들어, 세포 자체, 또는 매트릭스-세포 조합물의 일부로서의 세포), 주사 (예를 들어, CNS 손상 부위로 직접), 주입, 카테터를 통한 전달, 또는 세포 요법을 제공하는 것에 대해 당업계에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 달성될 수 있다.
이를 위해, 추가로 본원은 혈관신생, 혈액관신생 또는 맥관형성 경로를 따라 줄기 또는 전구 세포 분화를 자극하는 하나 이상의 인자의 존재하에 접촉된, 예를 들어 인큐베이션된 또는 배양된 PDAC의 집단을 제공한다. 이러한 인자에는 성장 인자, 케모카인, 시토카인, 세포 생성물, 탈메틸화제와 같은 인자, 및 혈관신생, 혈액관신생 또는 맥관형성 경로 또는 계통을 따라 예를 들어 줄기 세포의 분화를 자극하는 것으로 새로 공지되거나 이후에 결정된 다른 인자가 포함되지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, PDAC는 탈메틸화제, BMP (골 형태형성 단백질), FGF (섬유모세포 성장 인자), Wnt 인자 단백질, 헷지호그 단백질 및/또는 항-Wnt 인자 중 적어도 하나를 포함하는 인자의 존재하에 세포를 배양시킴으로써 시험관내에서 혈관신생, 혈액관신생 또는 맥관형성 경로 또는 계통을 따라 분화될 수 있다.
PDAC는 세포 및 또 다른 치료제, 예컨대 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인터류킨 18 (IL-8), 항혈전형성제 (예를 들어, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, 또는 PPack (덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항-트롬빈 화합물, 혈소판 수용체 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 수용체 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제, 및/또는 혈소판 억제제), 항-세포자멸제 (예를 들어, 에리트로포이에틴 (Epo), Epo 유도체 또는 유사체, 또는 그의 염, 트롬보포이에틴 (Tpo), IGF-I, IGF-II, 간세포 성장 인자 (HGF), 또는 카스파제 억제제), 항염증제 (예를 들어, p38 MAP 키나제 억제제, 스타틴, IL-6 억제제, IL-1 억제제, 페미롤라스트, 트라닐라스트, 레미케이드, 시롤리무스, 및/또는 비스테로이드성 항염증성 화합물 (예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 테폭살린, 톨메틴, 또는 수프로펜)), 면역억제제 또는 면역조절제 (예를 들어, 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린, 타크롤리무스, mTOR 억제제, 예컨대 시롤리무스 또는 에버롤리무스; 항증식제, 예컨대 아자티오프린 및/또는 미코페놀레이트 모페틸; 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니솔론 또는 히드로코르티손; 항체, 예컨대 모노클로날 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맙, 다클리주마, 폴리클로날 항-T-세포 항체, 예컨대 항-흉선세포 글로불린 (ATG), 항-림프구 글로불린 (ALG), 및/또는 모노클로날 항-T 세포 항체 OKT3, 또는 미국 특허 제7,468,276호 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호 (각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 부착성 태반 줄기 세포), 및/또는 항산화제 (예를 들어, 프로부콜; 비타민 A, C, 및/또는 E, 조효소 Q-10, 글루타티온, L 시스테인, N-아세틸시스테인, 또는 항산화제 유도체, 임의의 상기의 유사체 또는 염)를 포함하는 치료 조성물의 형태로 개체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, PDAC를 포함하는 치료 조성물은 1종 이상의 추가의 세포 유형, 예를 들어 성인 세포 (예를 들어, 섬유모세포 또는 내배엽 세포), 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 추가로 포함한다. 이러한 치료제 및/또는 1종 이상의 추가의 유형의 세포는 개별적으로 또는 조합되어 또는 2종 이상의 이러한 화합물 또는 치료제와 함께 개체에게 투여될 수 있다.
5.4 제2 치료 조성물 및 제2 요법
임의의 상기 치료 방법에서, 상기 방법은 제2 치료 조성물 또는 제2 요법의 투여를 포함할 수 있다. 상기 구체적인 질환의 치료 방법에서 구체적인 제2 치료 화합물 또는 제2 요법의 언급은 배타적인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 논의된 임의의 질환, 장애 또는 상태는 본원에 기재된 임의의 항염증성 화합물 또는 면역억제 화합물에 의해 치료될 수 있다. 태반 줄기 세포를 제2 치료제와 함께, 또는 제2 유형의 줄기 세포와 함께 투여하는 실시양태에서, 태반 줄기 세포 및 제2 치료제 및/또는 제2 유형의 줄기 세포는 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있으며, 예를 들어 상기 투여는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 20, 30, 40, 또는 50분 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22시간 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 이내에 일어날 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 부적절한, 해로운 또는 유해한 면역 반응과 관련된 또는 그로 인해 야기된 질환, 장애 또는 상태의 치료는 제2 유형의 줄기 세포, 또는 제2 유형의 줄기 세포의 집단의 투여를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 유형의 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포, 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 제2 유형의 줄기 세포는 다능성 줄기 세포, 다분화성 줄기 세포, 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 조혈 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 배아 생식 세포이다. 제2 유형의 줄기 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포는 태반 줄기 세포와 임의의 비율로, 예를 들어 약 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100의 비율로 투여될 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 상업적으로 또는 원래의 공급원, 예를 들어 골수, 골수 흡인물, 지방 조직 등으로부터 입수할 수 있다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 요법은 면역조절 화합물을 포함하며, 여기서 상기 면역조절 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온; 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온; 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; 또는 α-(3-아미노프탈이미도) 글루타르이미드이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 면역조절 화합물은 하기 구조식을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 또는 입체이성질체의 혼합물이다.
Figure pat00001
상기 식에서, X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 다른 하나는 C=O 또는 CH2이고, R2는 수소 또는 저급 알킬이다. 또 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 면역조절 화합물은 하기 구조식을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 또는 입체이성질체의 혼합물이다.
Figure pat00002
상기 식에서,
X 및 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH2 또는 C=O이고;
R1은 H, (C1-C8)알킬, (C3-C7)시클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로시클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3', C(S)NR3R3' 또는 (C1-C8)알킬-O(CO)R5이고;
R2는 H, F, 벤질, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, 또는 (C2-C8)알키닐이고;
R3 및 R3'는 독립적으로 (C1-C8)알킬, (C3-C7)시클로알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로시클로알킬, (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, (C0-C8)알킬-N(R6)2, (C1-C8)알킬-OR5, (C1-C8)알킬-C(O)OR5, (C1-C8)알킬-O(CO)R5 또는 C(O)OR5이고;
R4는 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C1-C4)알킬-OR5, 벤질, 아릴, (C0-C4)알킬-(C1-C6)헤테로시클로알킬, 또는 (C0-C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴이고;
R5는 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, 또는 (C2-C5)헤테로아릴이고;
R6은 각각의 경우 독립적으로 H, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C2-C5)헤테로아릴, 또는 (C0-C8)알킬-C(O)O-R5이거나, 또는 R6 기들은 결합하여 헤테로시클로알킬 기를 형성할 수 있고;
n은 0 또는 1이고;
*는 키랄-탄소 중심을 나타낸다.
또 다른 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 면역조절 화합물은 하기 구조식을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 포접화합물, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체, 또는 입체이성질체의 혼합물이다.
Figure pat00003
상기 식에서,
X 및 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH2 또는 C=O이고;
R은 H 또는 CH2OCOR'이고;
(i) 각각의 R1, R2, R3 또는 R4는 서로 독립적으로 할로, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알콕시이거나, 또는 (ii) R1, R2, R3 또는 R4 중 하나는 니트로 또는 -NHR5이고, R1, R2, R3 또는 R4 중 나머지는 수소이고;
R5는 수소 또는 1 내지 8개의 탄소를 갖는 알킬이고;
R6은 수소, 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 벤조, 클로로, 또는 플루오로이고;
R'는 R7-CHR10-N(R8R9)이고;
R7은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(CnH2n)-이고, 여기서 n은 0 내지 4의 값을 갖고;
각각의 R8 및 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬이거나, 또는 R8 및 R9는 함께 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2X1CH2CH2-이고, 여기서 X1은 -O-, -S-, 또는 -NH-이고;
R10은 수소, 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 또는 페닐이고;
*는 키랄-탄소 중심을 나타낸다.
상기 치료제의 임의의 조합물이 투여될 수 있다. 이러한 치료제는 태반 줄기 세포와 임의의 조합물로서 동일한 시간에 또는 별도의 치료 과정에서 투여될 수 있다.
태반 줄기 세포는 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI로 고통받는 개체에게 제약 조성물, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사에 적합한 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 태반 줄기 세포는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 태반 줄기 세포가 다중 용량으로 투여되는 경우, 상기 용량은 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI의 하나 이상의 급성 증상을 경감시키도록 고안된 치료 처리의 일부일 수 있거나, 또는 손상의 만성 과정을 예방하거나 그의 중증도를 감소시키도록 고안된 장기간 치료 처치의 일부일 수 있다. 태반 줄기 세포를 제2 치료제와 함께 또는 제2 유형의 줄기 세포와 함께 투여하는 실시양태에서, 태반 줄기 세포 및 제2 치료제 및/또는 제2 유형의 줄기 세포는 동일한 시간에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있으며, 예를 들어 상기 투여는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 20, 30, 40, 또는 50분 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 22시간 이내에, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 이상 이내에 일어날 수 있다.
5.5 태반 줄기 세포 및 태반 줄기 세포 집단
본원에 제공된 방법은 태반 줄기 세포, 즉 (1) 조직 배양 기재에 부착되고; (2) 비-태반 세포 유형을 분화시키는 용량을 가지며; (3) 면역 기능, 예를 들어 MLR 검정 또는 회귀 검정에서 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 검출가능하게 저해하는 용량을 충분한 개수로 가진, 태반 또는 그의 일부로부터 수득가능한 줄기 세포를 사용한다. 태반 줄기 세포는 혈액, 예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈로부터 유래되지 않는다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용되는 태반 줄기 세포는 상기 용량을 가지며, 개체의 면역계를 저해하는 그들의 용량에 대해 선별된다.
태반 줄기 세포는 태아 또는 모체 기원일 수 있다 (즉, 모체 또는 태아의 유전자형을 가질 수 있다). 태반 줄기 세포의 집단, 또는 태반 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단은 태아 또는 모체 단독에서만 기원하는 태반 줄기 세포를 포함할 수 있거나, 또는 태아 및 모체 둘 다에서 기원하는 태반 줄기 세포의 혼합된 집단을 포함할 수 있다. 태반 줄기 세포, 및 태반 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단은 하기 논의되는 형태학, 마커 및 배양 특징에 의해 식별 및 선별될 수 있다.
5.5.1 물리적 및 형태학적 특징
본원에 기재된 바와 같이 사용되는 태반 줄기 세포는, 초대 배양물 또는 세포 배양물에서 배양시, 조직 배양 기재, 예를 들어 조직 배양 용기 표면 (예를 들어, 조직 배양 플라스틱)에 부착한다. 배양물 중의 태반 줄기 세포는 일반적으로 중심 세포체로부터 이어진 수많은 세포질 프로세스를 갖는 섬유모세포양 성상 외형으로 추정된다. 그러나, 태반 줄기 세포는 섬유모세포가 수행하는 것보다 훨씬 많은 이러한 프로세스를 나타내기 때문에, 태반 줄기 세포는 동일한 조건하에 배양된 섬유모세포와 형태학적으로 구별될 수 있다. 형태학적으로, 태반 줄기 세포는 또한 조혈 줄기 세포와 구별될 수 있으며, 이는 일반적으로 배양물 중에서 더욱 둥근 또는 조약돌 형태로 추정된다.
5.5.2 세포 표면, 분자 및 유전자 마커
본원에 개시된 방법, 예를 들어 CNS 손상의 치료 방법에서 유용한, 단리된 태반 줄기 세포, 예를 들어 단리된 다능성 태반 줄기 세포 또는 단리된 태반 줄기 세포, 및 이러한 단리된 태반 줄기 세포의 집단은, 다능성 세포 또는 줄기 세포의 특징을 가지며, 상기 줄기 세포를 포함하는 세포 또는 세포 집단을 식별 및/또는 단리하는데 사용될 수 있는 복수개의 마커를 발현하는 조직 배양 플라스틱-부착성 인간 태반 줄기 세포이다. 특정 실시양태에서, PDAC는 예를 들어 시험관내 또는 생체내에서의 혈관신생성이다. 본원에 기재된 단리된 태반 줄기 세포, 및 태반 세포 집단 (즉, 2 이상의 단리된 태반 줄기 세포)은 태반 또는 그의 임의의 일부분 (예를 들어, 융모막, 태반엽 등)으로부터 직접적으로 수득되는 태반 줄기 세포 및 태반 세포-함유 세포 집단을 포함한다. 단리된 태반 세포 집단은 또한 배양물 중 단리된 태반 줄기 세포의 집단 (즉, 2 이상), 및 용기, 예를 들어 백 중의 집단을 포함한다. 본원에 기재된 단리된 태반 줄기 세포는 골수-유래 중간엽 세포, 지방-유래 중간엽 줄기 세포, 또는 제대혈, 태반 혈액, 또는 말초혈로부터 수득되는 중간엽 세포가 아니다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 태반 세포, 예를 들어 태반 다능성 세포 및 태반 줄기 세포는 본원에 기재되며, 예를 들어 미국 특허 제7,311,904호; 제7,311,905호; 및 제7,468,276호; 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 줄기 세포이다. 다른 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 다능성 세포이다. 한 실시양태에서, 단리된 태반 세포, 예를 들어 PDAC는 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD34-, CD10+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 신경 표현형의 세포, 골발생성 표현형의 세포, 및/또는 연골발생성 표현형의 세포로 분화되는 잠재력을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD45- 또는 CD90+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD45- 및 CD90+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD90+ 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD90+ 및 CD45-이며, 즉, 상기 세포는 CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+, CD200+ 세포는 추가로 CD80- 및 CD86-이다.
특정 실시양태에서, 상기 태반 세포는 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD34-, CD10+, CD105+ 및 CD200+이며, CD38-, CD45-, CD80-, CD86-, CD133-, HLA-DR,DP,DQ-, SSEA3-, SSEA4-, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+ 및/또는 OCT-4+ 중 하나 이상이다. 다른 실시양태에서, 상기 기재된 임의의 CD34-, CD10+, CD105+ 세포는 추가로 CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ 또는 SH4+ 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 CD44+이다. 상기 임의의 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포는 추가로 CD117-, CD133-, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, 또는 프로그래밍된 사망-1 리간드 (PDL1)+ 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합이다.
또 다른 실시양태에서, CD34-, CD10+, CD105+ 세포는 추가로 CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-카드헤린low, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G-, 또는 프로그래밍된 사망-1 리간드 (PDL1)+ 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 실시양태에서, CD34-, CD10+, CD105+ 세포는 추가로 CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-카드헤린low, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G- 및 프로그래밍된 사망-1 리간드 (PDL1)+이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 ABC-p+, 또는 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 결정되는 바와 같이 OCT-4+ (POU5F1+)이며, 여기서 ABC-p는 태반-특이적 ABC 수송자 단백질 (유방암 내성 단백질 (BCRP) 및 미톡산트론 내성 단백질 (MXR)로도 공지됨)이고, OCT-4는 옥타머-4 단백질 (POU5F1)이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이 SSEA3- 또는 SSEA4-이며, 여기서 SSEA3은 단계 특이적 배아 항원 3이고, SSEA4는 단계 특이적 배아 항원 4이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 태반 세포는 추가로 SSEA3- 및 SSEA4-이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 태반 세포는 추가로 MHC-I+ (예를 들어, HLA-A,B,C+), MHC-II- (예를 들어, HLA-DP,DQ,DR-) 또는 HLA-G- 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 태반 세포는 추가로 MHC-I+ (예를 들어, HLA-A,B,C+), MHC-II- (예를 들어, HLA-DP,DQ,DR-) 및 HLA-G- 중 하나 이상이다.
또한, 본원은 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 유용한, 단리된 태반 세포의 집단, 또는 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이를 풍부하게 포함하는 세포의 집단, 예를 들어 태반 세포의 집단을 제공한다. 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단이 바람직하며, 여기서 세포의 집단은 예를 들어 적어도 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％의 단리된 CD10+, CD105+ 및 CD34- 태반 세포를 포함하고; 즉, 상기 집단에서 적어도 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 98％의 세포가 단리된 CD10+, CD105+ 및 CD34- 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD90+ 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 세포는 추가로 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같이 CD90+ 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 기재된 임의의 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ 또는 SH4+ 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포, 또는 단리된 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 세포는 추가로 CD44+이다. 상기 단리된 CD34-, CD10+, CD105+ 태반 세포를 포함하는 임의의 세포의 집단의 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-카드헤린low, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G-, 또는 프로그래밍된 사망-1 리간드 (PDL1)+ 중 하나 이상, 또는 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, CD34-, CD10+, CD105+ 세포는 추가로 CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-카드헤린low, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP,DQ,DR-, HLA-G- 및 프로그래밍된 사망-1 리간드 (PDL1)+이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및 ABC-p+ 중 하나 이상 또는 이들 전부이며, 여기서 상기 단리된 태반 세포는 태반 조직의 물리적 및/또는 효소적 파괴에 의해 수득된다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 ABC-p+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 CD34-이며, 여기서 상기 단리된 태반 세포는 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는다: CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3- 및 SSEA4-. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3- 및 SSEA4-이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, SSEA3- 및 SSEA4-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 CD34-이고, SH2+ 또는 SH3+ 중 하나이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, SH2+ 및 SH3+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, SSEA3- 및 SSEA4-이고, SH2+ 또는 SH3+ 중 하나이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 CD34-이고, SH2+ 또는 SH3+ 중 하나이고, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3- 또는 SSEA4- 중 하나 이상이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3- 및 SSEA4-이고, SH2+ 또는 SH3+ 중 하나이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 SH2+, SH3+, SH4+ 및 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, CD34-, CD45-, SSEA3-, 또는 SSEA4-이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- 및 SSEA4-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- 및 SSEA4-, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, OCT-4+, CD34- 또는 CD45-이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+ 및 SH4+이고; 여기서 상기 단리된 태반 세포는 추가로 OCT-4+, SSEA3- 또는 SSEA4- 중 하나 이상이다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD200+ 또는 HLA-G-이다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD200+ 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+ 또는 HLA-G- 태반 세포는 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단에서 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 줄기 또는 다능성 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 마커들의 이 조합을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 CD200+, HLA-G- 줄기 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 집단은 태반 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포가 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포 집단에서 적어도 약 70％의 세포가 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포이다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포의 적어도 약 90％, 95％, 또는 99％가 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포이다. 세포 집단의 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포는 또한 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포는 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포는 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단은 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 하나 이상의 배아양-유사체를 생성한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, HLA-G- 태반 세포는 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD73+, CD105+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34-, CD38-, CD45- 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+ 및 CD200+ 태반 세포는 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양시킬 때 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 단리된 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 CD73+, CD105+, CD200+ 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포는 단리된 CD73+, CD105+, CD200+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 70％의 상기 세포는 단리된 CD73+, CD105+, CD200+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 90％, 95％ 또는 99％의 세포는 단리된 CD73+, CD105+, CD200+ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38-, CD45- 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포의 집단은 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 하나 이상의 배아양-유사체를 생성한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포의 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포의 집단은 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
다른 특정 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, HLA-G- 또는 ABC-p+ 중 하나 이상이다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4- 및 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+ 및 SH4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ 및 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, HLA-G-, SH2+, SH3+, SH4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 ABC-p+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 SH2+, SH3+, SH4+ 및 OCT-4+이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+, CD34-, SSEA3- 및 SSEA4-이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+, CD34-, SSEA3- 및 SSEA4- 태반 세포는 추가로 CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+ 및 SH4+이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 OCT-4+ 및 CD34-이고, SH3+ 또는 SH4+ 중 하나이다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD34-이고, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ 또는 OCT-4+ 중 하나이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD200+ 및 OCT-4+이다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 단리된 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양시킬 때 상기 집단에 의한 하나 이상의 배아양-유사체의 생성을 용이하게 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 줄기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 CD200+, OCT-4+ 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포는 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 적어도 약 70％는 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 80％, 90％, 95％, 또는 99％의 세포는 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포이다. 단리된 집단의 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 추가로 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포 집단은 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 하나 이상의 배아양-유사체를 생성한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 단리된 CD200+, OCT-4+ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD73+, CD105+ 및 HLA-G-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+ 및 HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 상기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양시킬 때 상기 집단에서 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 CD73+, CD105+ 및 HLA-G- 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포는 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％의 세포는 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 90％, 95％ 또는 99％의 세포는 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 CD73+, CD105+, HLA-G- 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD73+ 및 CD105+이고, 상기 CD73+, CD105+ 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 OCT-4+, CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은, CD73+, CD105+이고, 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하는, 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포는 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％의 세포는 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 90％, 95％ 또는 99％의 세포는 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 OCT-4+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 상기 단리된 CD73+, CD105+ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 OCT-4+이고, 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 OCT-4+ 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은, OCT-4+이고, 상기 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단을 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하는, 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이다. 다양한 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 10％, 적어도 약 20％, 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 또는 적어도 약 60％의 세포는 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％의 세포는 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포의 집단에서 적어도 약 80％, 90％, 95％ 또는 99％의 세포는 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포이다. 상기 집단의 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 또는 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD73+ 및 CD105+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD200+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 OCT-4+ 태반 세포는 추가로 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- 및 CD45-이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- 및 CD34- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단이며, 여기서 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％의 세포는 단리된 HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- 및 CD34- 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- 및 CD34- 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포의 집단은 실질적으로 모체 성분이 없으며; 예를 들어 상기 단리된 태반 세포의 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 세포가 비-모체 기원이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단이며, 여기서 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％의 세포는 단리된 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133- 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 상기 단리된 태반 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- 및 CD133- 태반 세포는 비-모체 기원이며, 즉, 태아 유전자형을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포의 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 상기 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10+ CD33-, CD44+, CD45- 및 CD117- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이며, 여기서 상기 세포의 집단에서 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％의 세포는 단리된 CD10+ CD33-, CD44+, CD45- 및 CD117- 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 상기 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 단리된 CD10+ CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117- 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포 집단은 단리된 CD10+, CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117- 태반 세포를 포함하는, 예를 들어 이들이 풍부한 세포의 집단이며, 여기서 상기 집단에서 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％ 또는 적어도 약 99％의 세포는 CD10+ CD13-, CD33-, CD45- 및 CD117- 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 상기 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 이들 특징을 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 HLA A,B,C+, CD45-, CD34- 및 CD133-이며, 추가로 CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+ 및/또는 HLA-G-이고/이거나, CD117에 대해 음성이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단이며, 여기서 상기 집단에서 적어도 약 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 약 99％의 세포는 HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-이고 추가로 CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200에 대해 양성이고/이거나 CD117 및/또는 HLA-G에 대해 음성인 단리된 태반 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 상기 세포가 아닌 태반 세포로부터 단리된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 상기 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포의 집단은 이들 마커를 디스플레이하지 않는 태반 세포로부터 단리된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 항체 결합에 의해 결정되는 바와 같이 CD200+ 및 CD10+이고 항체 결합 및 RT-PCR 둘 다에 의해 결정되는 바와 같이 CD117-인 단리된 태반 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G-, MHC 클래스 I+ 및 β-2-마이크로글로불린+인 단리된 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 하나 이상의 세포 마커의 발현이 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 골수-유래 중간엽 줄기 세포)보다 2배 이상 더 높은 태반 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 비-모체 기원이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 약 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 90％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 상기 세포는 비-모체 기원이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-카드헤린low, CD184/CXCR4-, β2-마이크로글로불린low, MHC-Ilow, MHC-II-, HLA-Glow, 및/또는 PDL1low 중 하나 이상인 단리된 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 또는 태반 다능성 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29+ 및 CD54+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD44+ 및 CD106+이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포는 적어도 CD29+이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 유용한 세포 집단은 단리된 태반 세포를 포함하며, 상기 세포 집단에서 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 세포는 CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-카드헤린dim, CD184/CXCR4-, β2-마이크로글로불린dim, HLA-Idim, HLA-II-, HLA-Gdim 및/또는 PDL1dim 중 하나 이상인 단리된 태반 세포이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 세포는 CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-카드헤린dim, CD184/CXCR4-, β2-마이크로글로불린dim, MHC-Idim, MHC-II-, HLA-Gdim, 및 PDL1dim이다. 특정 실시양태에서, 태반 세포는 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 유도될 때 HLA-II 마커를 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+ 및 ABC-p+ 중 하나 이상 또는 이들 전부인 단리된 태반 세포이며, 여기서 ABC-p는 태반-특이적 ABC 수송자 단백질 (유방암 내성 단백질 (BCRP) 및 미톡산트론 내성 단백질 (MXR)로도 공지됨)이고, 여기서 상기 단리된 태반 세포는 제대혈로부터 배출되고 잔류 혈액 제거를 위해 관류된 포유동물, 예를 들어 인간의 태반을 관류시킴으로써 수득된다.
상기 임의의 특징의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포 마커 (예를 들어, 분화의 클러스터 또는 면역원성 마커)의 발현은 유동 세포계측에 의해 결정되며; 또 다른 구체적인 실시양태에서, 마커의 발현은 RT-PCR에 의해 결정된다.
유전자 프로파일링은, 단리된 태반 세포, 및 단리된 태반 세포의 집단이 다른 세포, 예를 들어 중간엽 줄기 세포, 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포와 구별될 수 있음을 확고히 한다. 본원에 기재된 단리된 태반 세포는 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포에 비해 단리된 태반 세포에서 유의하게 더 높은 하나 이상의 유전자의 발현에 근거하여 중간엽 줄기 세포와 구별될 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 치료 방법에 유용한 단리된 태반 세포는, 동등한 조건하에 세포를 성장시킬 때 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포에 비해 단리된 태반 세포에서 유의하게 더 높은 (즉, 적어도 2배 더 높은) 하나 이상의 유전자의 발현에 근거하여 중간엽 줄기 세포와 구별될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 유전자는 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, 또는 이들의 임의의 조합이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호를 참조하며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 특정한 구체적인 실시양태에서, 상기 하나 이상의 유전자의 상기 발현은 예를 들어 RT-PCR 또는 마이크로어레이 분석에 의해, 예를 들어 U133-A 마이크로어레이 (아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 결정된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는, DMEM-LG (예를 들어, 깁코(Gibco)로부터); 2％ 태아 송아지 혈청 (예를 들어, 하이클론 랩스.(Hyclone Labs.)로부터); 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 1x 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 10-9 M 덱사메타손 (예를 들어, 시그마(Sigma)로부터); 10-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (예를 들어, 시그마로부터); 표피 성장 인자 10 ng/mL (예를 들어, 알앤디 시스템즈(R＆D Systems)로부터); 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/mL (예를 들어, 알앤디 시스템즈로부터)를 포함하는 배지에서 수많은 집단 배가, 예를 들어 어느 경우이던 약 3 내지 약 35 집단 배가를 위해 배양할 때, 상기 하나 이상의 유전자를 발현한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 태반 세포-특이적 유전자는 CD200이다.
이들 유전자에 특이적인 서열은 2008년 3월 시점에서 진뱅크(GenBank)에서 관리 번호 NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 또는 BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), 및 BC005001 (ZC3H12A)로 확인할 수 있다.
특정한 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는, 동등한 조건하에 세포를 성장시킬 때 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포에 비해 검출가능하게 더 높은 수준으로 각각의 ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, 및 ZC3H12A를 발현한다.
구체적인 실시양태에서, 태반 세포는 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC)에 비해 검출가능하게 더 높은 수준으로 CD200 및 ARTS1 (유형 1 종양 괴사 인자의 아미노펩티다제 조절자); ARTS-1 및 LRAP (백혈구-유래 아르기닌 아미노펩티다제); IL6 (인터류킨-6) 및 TGFB2 (형질전환 성장 인자, 베타 2); IL6 및 KRT18 (케라틴 18); IER3 (극초기 반응 3), MEST (중배엽 특이적 전사체 상동체) 및 TGFB2; CD200 및 IER3; CD200 및 IL6; CD200 및 KRT18; CD200 및 LRAP; CD200 및 MEST; CD200 및 NFE2L3 (핵 인자 (적혈구-유래 2)-유사 3); 또는 CD200 및 TGFB2를 발현하며, 여기서 상기 골수-유래 중간엽 줄기 세포는 상기 단리된 태반 세포가 겪는 계대의 횟수와 동등하게 배양물에서 수많은 계대를 겪는다. 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 세포는 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포 BM-MSC에 비해 검출가능하게 더 높은 수준으로 ARTS-1, CD200, IL6 및 LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, KRT18 및 MEST; CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, 및 TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, 및 TGFB2; 또는 IER3, MEST 및 TGFB2를 발현하며, 여기서 상기 골수-유래 중간엽 줄기 세포는 상기 단리된 태반 세포가 겪는 계대의 횟수와 동등하게 배양물에서 수많은 계대를 겪는다
상기 언급된 유전자의 발현은 표준 기술에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 유전자(들)의 서열에 기초한 프로브를 개별적으로 선택하여 통상적인 기술에 의해 구축할 수 있다. 유전자의 발현은 예를 들어 하나 이상의 유전자에 대한 프로프를 포함하는 마이크로어레이, 예를 들어 아피메트릭스 진칩(GENECHIP®) 인간 게놈 U133A 2.0 어레이, 또는 아피메트릭스 진칩® 인간 게놈 U133 플러스 2.0 (캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 평가할 수 있다. 특정 진뱅크 관리 번호에 대한 서열이 수정된 경우에도, 수정된 서열에 대해 특이적인 프로브가 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 쉽게 생성될 수 있기 때문에, 이들 유전자의 발현을 평가할 수 있다.
이들 유전자의 발현의 수준을 이용하여, 단리된 태반 세포의 집단의 동일성을 확인하고, 세포의 집단이 적어도 복수개의 단리된 태반 세포를 포함하는 것에 대해 확인하는 것 등이 가능하다. 동일성이 확인된 단리된 태반 세포의 집단은 클로날일 수 있으며, 예를 들어 단일 단리된 태반 세포로부터 증식된 단리된 태반 세포의 집단, 또는 줄기 세포의 혼합된 집단, 예를 들어 다중의 단리된 태반 세포로부터 증식된 단리된 태반 세포를 단독으로 포함하는 세포의 집단, 또는 본원에 기재된 바와 같은 단리된 태반 세포 및 적어도 하나의 다른 유형의 세포를 포함하는 세포의 집단일 수 있다.
이들 유전자의 발현의 수준을 이용하여, 단리된 태반 세포의 집단을 선별할 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 클로날-증식된 세포의 집단은, 상기 열거된 하나 이상의 유전자의 발현이 중간엽 줄기 세포의 동등한 집단에 비해 세포의 집단으로부터의 샘플에서 유의하게 더 높은 경우에 선별될 수 있다. 이러한 선별은 복수개의 단리된 태반 세포 집단으로부터, 동일성이 공지되지 않은 복수개의 세포 집단 등으로부터의 집단일 수 있다.
단리된 태반 세포는 예를 들어 중간엽 줄기 세포 대조군에서 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준, 예를 들어 동등한 수의 골수-유래 중간엽 줄기 세포에서 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교해서 하나 이상의 이러한 유전자의 발현 수준에 기초하여 선별될 수 있다. 한 실시양태에서, 동등한 수의 중간엽 줄기 세포를 포함하는 샘플에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 대조군으로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 특정 조건하에 시험된 단리된 태반 세포의 경우 대조군은 상기 조건하에 중간엽 줄기 세포에서 상기 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 수치 값이다.
본원에 기재된 단리된 태반 세포는 초대 배양에서, 또는 예를 들어 DMEM-LG (깁코), 2％ 태아 송아지 혈청 (FCS) (하이클론 래버러토리즈(Hyclone Laboratories)), 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS), 1x 리놀레산-소-혈청-알부민 (LA-BSA), 10-9 M 덱사메타손 (시그마), 10-4 M 아스코르브산 2-포스페이트 (시그마), 표피 성장 인자 (EGF) 10 ng/ml (알앤디 시스템즈), 혈소판 유래된-성장 인자 (PDGF-BB) 10 ng/ml (알앤디 시스템즈), 및 100U 페니실린/1000U 스트렙토마이신을 포함하는 배지에서 증식하는 동안, 상기 특징 (예를 들어, 세포 표면 마커의 조합 및/또는 유전자 발현 프로파일)을 나타낸다.
본원에 개시된 임의의 태반 세포의 특정 실시양태에서, 상기 세포는 인간의 것이다. 본원에 개시된 임의의 태반 세포의 특정 실시양태에서, 세포 마커 특징 또는 유전자 발현 특징은 인간 마커 또는 인간 유전자의 것이다.
상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 또는 집단은 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 회 계대, 또는 그 이상 또는 그 이하로 증식되거나, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40 집단 배가, 또는 그 이상 또는 그 이하로 증식되었다. 상기 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포 또는 집단은 1차 단리물이다. 본원에 개시된 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포를 포함하는 세포의 집단의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 태아 기원이다 (즉, 태아 유전자형을 갖는다).
특정 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 성장 배지, 즉, 예를 들어 성장 배지에서 증식하는 동안 증식을 촉진시키도록 제제화된 배지에서 배양하는 동안 분화하지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 증식을 위해 피더 층을 필요로 하지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포는 피더 층의 부재하에서는 전적으로 피더 세포 층의 결여로 인해 배양물 중에서 분화하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 세포는 단리된 태반 세포이며, 여기서 복수개의 상기 단리된 태반 세포는 알데히드 데히드로게나제 활성 검정에 의해 평가되는 바와 같이 알데히드 데히드로게나제 (ALDH)에 대해 양성이다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Bostian and Betts, Biochem . J., 173, 787, (1978)] 참조). 구체적인 실시양태에서, 상기 ALDH 검정은 알데히드 데히드로게나제 활성의 마커로서 알데플루으로(ALDEFLUOR®, 알다젠 인크.(Aldagen, Inc.), 오레곤주 애쉬랜드)를 사용한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 복수개는 상기 세포의 집단에서 약 3％ 내지 약 25％의 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 태반 세포의 집단은 대략 동일한 개수의 세포를 가지며 동일한 조건하에 배양된 골수-유래 중간엽 줄기 세포의 집단에 비해 적어도 3배, 또는 적어도 5배 더 높은 ALDH 활성을 나타낸다.
본원에 기재된 단리된 태반 세포를 포함하는 임의의 세포 집단의 특정 실시양태에서, 상기 세포 집단에서 태반 세포는 실질적으로 모체 유전자형을 갖는 세포를 갖지 않으며; 예를 들어 상기 집단에서 적어도 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 태반 세포는 태아 유전자형을 갖는다. 본원에 기재된 단리된 태반 세포를 포함하는 임의의 세포 집단의 다른 특정 실시양태에서, 상기 태반 세포를 포함하는 세포의 집단은 실질적으로 모체 유전자형을 갖는 세포를 갖지 않으며; 예를 들어 상기 집단에서 적어도 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％의 세포는 태아 유전자형을 갖는다.
임의의 상기 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포의 세포 집단의 구체적인 실시양태에서, 세포, 예를 들어 모든 세포, 또는 상기 집단에서 적어도 약 95％ 또는 약 99％의 세포의 핵형은 정상이다. 임의의 상기 태반 세포 또는 세포 집단의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 세포, 또는 세포 집단에서의 세포는 비-모체 기원이다.
본원에 개시된 태반 세포의 임의의 실시양태의 구체적인 실시양태에서, 태반 세포는 유전적으로 안정하며, 정상적인 2배성 염색체 수 및 정상적인 핵형을 나타낸다.
임의의 상기 마커의 조합을 보유하는 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포의 집단을 임의의 비율로 조합할 수 있다. 임의의 2종 이상의 상기 단리된 태반 세포 집단을 조합하여, 단리된 태반 세포 집단을 형성할 수 있다. 예를 들어, 단리된 태반 세포의 집단은 상기 기재된 마커 조합 중 하나에 의해 규정되는 단리된 태반 세포의 제1 집단, 및 상기 기재된 또 다른 마커 조합에 의해 규정되는 단리된 태반 세포의 제2 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제1 및 제2 집단은 약 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 또는 약 99:1의 비율로 조합된다. 마찬가지 방식으로, 임의의 3, 4, 5종 이상의 상기 기재된 단리된 태반 세포 또는 단리된 태반 세포 집단을 조합할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 단리된 태반 세포는 예를 들어 효소적 소화 (섹션 5.3.3 참고) 또는 관류 (섹션 5.3.4 참고)를 이용하거나 이용하지 않고 태반 조직의 파괴에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 단리된 태반 세포의 집단은, 제대혈이 배출되고 잔류 혈액 제거를 위해 관류된 포유동물 태반을 관류시키고, 상기 태반을 관류 용액으로 관류시키고, 상기 관류 용액을 수집하고 (여기서, 관류 이후 상기 관류 용액은 단리된 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 포함함), 상기 세포 집단으로부터 복수개의 상기 단리된 태반 세포를 단리하는 것을 포함하는 방법에 따라 생성될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 관류 용액은 제대 정맥 및 제대 동맥 둘 다를 통과하고, 태반으로부터 삼출된 후에 수집된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 관류 용액은 제대 정맥을 통과하여 제대 동맥으로부터 수집되거나, 또는 제대 동맥을 통과하여 제대 정맥으로부터 수집된다.
다양한 실시양태에서, 태반의 관류로부터 수득되는 세포 집단 내에 함유되는 단리된 태반 세포는 상기 태반 세포의 집단의 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 또는 적어도 99.5％이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 관류에 의해 수집되는 단리된 태반 세포는 태아 및 모체 세포를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 관류에 의해 수집되는 단리된 태반 세포는 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 또는 적어도 99.5％ 태아 세포이다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 바와 같이 관류에 의해 수집되는 단리된 태반 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 단리된 태반 세포의 수집을 위해 사용되는 관류 용액의 적어도 일부를 포함한다.
본원에 기재된 단리된 태반 세포의 집단은 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단을 수득하기 위해 조직-파괴 효소로 태반 조직을 소화시키고, 상기 태반 세포의 나머지로부터 복수개의 태반 세포를 단리하거나 또는 실질적으로 단리함으로써 생성될 수 있다. 온전한 태반 또는 그의 임의의 일부분을 소화시켜 본원에 기재된 단리된 태반 세포를 수득할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 예를 들어 상기 태반 조직은 온전한 태반 (예를 들어, 제대를 포함함), 양모 막, 융모막, 양막과 융모막의 조합, 또는 상기 임의의 것들의 조합일 수 있다. 다른 구체적인 실시양태에서, 조직-파괴 효소는 트립신 또는 콜라게나제이다. 다양한 실시양태에서, 태반을 소화시킴으로써 수득되는 세포의 집단 내에 함유되는 단리된 태반 세포는 상기 태반 세포의 집단의 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 또는 적어도 99.5％이다.
상기 기재된 단리된 태반 세포의 집단, 및 단리된 태반 세포의 집단은 일반적으로 약 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 또는 그 이상 또는 그 이하의 단리된 태반 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법에 유용한 단리된 태반 세포의 집단은 예를 들어 트리판 블루 배제법에 의해 결정되는 바와 같이 예를 들어 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 98％, 또는 99％의 살아있는 단리된 태반 세포를 포함한다.
임의의 상기 태반 세포, 또는 태반 세포의 집단의 경우, 태반 줄기 세포의 세포 또는 집단은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20 회 이상 계대되거나, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40 집단 배가 이상으로 증식된 세포이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
임의의 상기 태반 세포 또는 세포 집단의 구체적인 실시양태에서, 세포, 또는 상기 집단에서 적어도 약 95％ 또는 약 99％의 세포의 핵형은 정상이다. 또 다른 임의의 상기 태반 세포 또는 세포 집단의 구체적인 실시양태에서, 세포, 또는 상기 세포 집단에서의 세포는 비-모체 기원이다.
임의의 상기 마커의 조합을 보유하는 단리된 태반 세포, 또는 단리된 태반 세포의 집단은 임의의 비율로 조합될 수 있다. 임의의 2종 이상의 상기 태반 세포 집단을 단리하거나 풍부화하여 태반 세포 집단을 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 마커 조합 중 하나에 의해 규정되는 태반 세포의 제1 집단을 상기 기재된 또 다른 마커 조합에 의해 규정되는 태반 세포의 제2 집단과 조합할 수 있으며, 여기서 상기 제1 및 제2 집단은 약 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 또는 약 99:1의 비율로 조합된다. 마찬가지 방식으로, 임의의 3, 4, 5종 이상의 상기 기재된 태반 세포 또는 태반 세포 집단을 조합할 수 있다.
상기 언급한 태반 세포의 구체적인 실시양태에서, 태반 세포는 IL-6, IL-8 및 단핵구 화학유인물질 단백질 (MCP-1)을 구성적으로 분비한다.
상기 기재된 복수개의 면역억제성 태반 세포는 약 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 또는 그 이상 또는 그 이하의 태반 세포를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 유용한 태반 세포 (예를 들어, PDAC)는 면역국소화에 의해 검출되는 바와 같이 4일 내지 21일 동안 1 내지 100 ng/mL VEGF에 노출된 후에 CD34를 발현하지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 부착성 세포는 조직 배양 플라스틱에 대해 부착성이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포의 집단은 내피 세포를 유도하여, 혈관신생 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재하에 배양될 때 예를 들어 기재, 예컨대 마트리겔(MATRIGEL™) 상에서 발아체 또는 관-유사 구조체를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 PDAC, 세포의 집단, 예를 들어 PDAC의 집단, 또는 상기 세포의 집단에서 적어도 약 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 98％의 세포가 PDAC인 세포의 집단은 예를 들어 세포 또는 세포들이 성장하는 배양 배지에서 VEGF, HGF, IL-8, MCP-3, FGF2, 폴리스타틴, G-CSF, EGF, ENA-78, GRO, IL-6, MCP-1, PDGF-BB, TIMP-2, uPAR, 또는 갈렉틴-1 중 하나 이상 또는 이들 전부를 분비한다. 또 다른 실시양태에서, PDAC는 정상산소 조건 (예를 들어, 약 20％ 또는 약 21％ O2)에 비해 저산소 조건 (예를 들어, 약 5％ 미마의 O2)하에 증가된 수준의 CD202b, IL-8 및/또는 VEGF를 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 임의의 PDAC 또는 본원에 기재된 PDAC를 포함하는 세포의 집단은 상기 태반 유래 부착성 세포와 접촉시 내피 세포의 집단에서 발아체 또는 관-유사 구조체의 형성을 유도한다. 구체적인 실시양태에서, PDAC를, 예를 들어 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 콜라겐 제I형 및 제IV형, 및/또는 혈관신생 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재하에 배양할 때 예를 들어 기재, 예컨대 태반 콜라겐 또는 마트리겔™에서 또는 상에서 적어도 4일 동안 발아체 또는 관-유사 구조체를 형성하거나 또는 내피 세포 발아체의 형성을 보조하는 인간 내피 세포와 공배양시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 태반 유래 부착성 세포를 포함하는 임의의 세포 집단은 혈관신생 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 또는 인터류킨-8 (IL-8)을 분비하며, 따라서 인간 내피 세포를 유도하여 세포외 매트릭스 단백질, 예컨대 콜라겐 제I형 및 제IV형의 존재하에 배양할 때 예를 들어 기재, 예컨대 태반 콜라겐 또는 마트리겔™에서 또는 상에서 발아체 또는 관-유사 구조체를 형성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 태반 유래 부착성 세포 (PDAC)를 포함하는 임의의 상기 세포 집단은 혈관신생 인자를 분비한다. 구체적인 실시양태에서, 세포의 집단은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 및/또는 인터류킨-8 (IL-8)을 분비한다. 다른 구체적인 실시양태에서, PDAC를 포함하는 세포의 집단은 하나 이상의 혈관신생 인자를 분비하며, 따라서 인간 내피 세포를 유도하여 시험관내 창상 치유 검정에서 이동할 수 있다. 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 유래 부착성 세포를 포함하는 세포의 집단은 인간 내피 세포, 내피 전구세포, 근세포 또는 근아세포의 성숙, 분화 또는 증식을 유도한다.
5.5.3 태반 세포 집단의 선별 및 생성
특정 실시양태에서, 면역억제성인 태반 세포의 집단을 선별할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 본원은 상기 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 세포이고, 상기 태반 세포가 검출가능하게 MLR 검정에서 T 세포 증식을 저해하는 것인 태반 세포의 집단을 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD45- 및 CD90+인 줄기 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD200+, HLA-G- 태반 세포이고, 상기 태반 세포가 MLR 검정에서 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포의 집단을 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+ 및 CD105+인 줄기 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 줄기 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ 및 CD105+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 하나 이상의 배아양-유사체를 형성하는 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD73+, CD105+, CD200+ 태반 세포이고, 상기 태반 세포가 MLR 검정에서 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 HLA-G-인 줄기 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45- 및 HLA-G-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양시킬 때 하나 이상의 배아양-유사체를 생성하는 태반 세포의 집단을 선별하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 또한 본원은 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD200+, OCT-4+ 태반 세포이고, 상기 태반 세포가 MLR 검정에서 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+ 및 CD105+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 HLA-G-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ 및 HLA-G-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD73+, CD105+ 및 HLA-G- 태반 세포이고, 상기 태반 세포가 MLR 검정에서 T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ 및 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 또한 본원은 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 CD73+, CD105+ 태반 세포이고, 복수개의 태반 세포가 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 하나 이상의 배아양-유사체를 형성하는 것인 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 OCT-4+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 OCT-4+, CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 단리된 태반 세포의 적어도 10％, 적어도 20％, 적어도 30％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 60％, 적어도 70％, 적어도 80％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％가 OCT4+ 줄기 세포이고, 복수개의 태반 세포가 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 하나 이상의 배아양-유사체를 형성하는 것인 복수개의 태반 세포를 선별하는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포로부터 복수개의 면역억제성 태반 세포를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+ 및 CD105+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD34-, CD38- 또는 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD200+인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 선별은 또한 CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포를 선별하는 것을 포함한다.
면역억제성 집단 또는 복수개의 태반 세포는 본원에 제공된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원은 상기 기재된 임의의 복수개의 태반 세포를 선별하고, 다른 세포, 예를 들어 다른 태반 세포로부터 복수개의 태반 세포를 단리하는 것을 포함하는, 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본원은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD200은 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나, 또는 CD73, CD105, 및 CD200을 발현하거나, 또는 CD200 및 OCT-4를 발현하거나, 또는 CD73, CD105는 발현하고 HLA-G는 발현하지 않거나, 또는 CD73 및 CD105를 발현하고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하거나, 또는 OCT-4를 발현하고, 줄기 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 형성을 용이하게 하고, (c) MLR 또는 회귀 검정에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는, 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
더욱 구체적인 실시양태에서, 면역억제성 태반 세포 집단은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD200은 발현하고 HLA-G는 발현하지 않고, (c) MLR 검정에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73, CD105 및 CD200을 발현하고, (c) MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD200 및 OCT-4를 발현하고, (c) MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는, 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73 및 CD105를 발현하고, (c) 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 배아양-유사체를 형성하고, (d) MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는, 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73 및 CD105는 발현하고 HLA-G는 발현하지 않고, (c) MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함한다. (a) 기재에 부착하고, (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아양-유사체를 형성하도록 하는 조건하에 배양할 때 배아양-유사체를 형성하고, (d) MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하는 것인 태반 세포를 선별하고, 다른 세포로부터 상기 태반 세포를 단리하여 세포 집단을 형성하는 것을 포함하는, 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
면역억제성 태반 세포 집단을 생성하는 방법의 구체적인 실시양태에서, 상기 T 세포 및 상기 태반 세포는 상기 MLR에서 약 5:1의 비율로 존재한다. 상기 방법에 사용된 태반 세포는 온전한 태반로부터, 또는 일차적으로 양막으로부터, 또는 양막 및 융모막으로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 태반 세포는, 상기 태반 세포의 부재하에 상기 MLR에서 T 세포 증식의 양과 비교할 때, 상기 MLR에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 적어도 50％, 적어도 75％, 적어도 90％, 또는 적어도 95％만큼 저해한다. 상기 방법은 추가로 면역조정, 예를 들어 다른 면역 세포의 활성, 예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포의 활성의 저해를 가능하게 하는 태반 세포 집단의 선별 및/또는 생성을 포함한다.
5.5.4 배양물에서 성장
임의의 포유동물 세포와 관련하여 본원에 기재된 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 (PDAC)의 성장은 부분적으로 성장을 위해 선택된 특정 배지에 의해 좌우된다. 최적의 조건하에, 태반 세포는 전형적으로 3-5일 이내에 수적으로 배가된다. 배양하는 동안, 본원에 제공된 태반 세포는 배양물 중에서 기재, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면 (예를 들어, 조직 배양 디쉬 플라스틱, 피브로넥틴-코팅된 플라스틱 등)에 부착하여, 단층을 형성한다.
본원에 제공된 태반 세포를 포함하는 단리된 태반 세포의 집단은 적절한 조건하에 배양할 때 배아양-유사체를 형성하며, 즉, 세포의 3차원 클러스터가 부착성 줄기 세포 층의 상단에서 성장한다. 배아양-유사체 내의 세포는 매우 초기의 줄기 세포와 관련된 마커, 예를 들어 OCT-4, Nanog, SSEA3 및 SSEA4를 발현한다. 배아양-유사체 내의 세포는 전형적으로 배양 기재에 부착하지 않지만, 본원에 기재된 태반 세포와 같이, 배양하는 동안 부착성 세포에 부착한 채로 남아있다. 배아양-유사체가 부착성 줄기 세포의 부재하에서는 형성되지 않기 때문에, 배아양-유사체 세포의 생존율은 부착성 태반 세포에 따라 좌우된다. 따라서, 부착성 태반 세포는 부착성 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단에서 하나 이상의 배아양-유사체의 성장을 용이하게 한다. 이론에 구애되는 것은 아니지만, 배아 줄기 세포가 세포의 피더 층 상에서 성장함에 따라 배아양-유사체의 세포가 부착성 태반 세포 상에서 성장하는 것으로 생각된다. 중간엽 줄기 세포, 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포는 배양물 중에서 배아양-유사체를 발생시키지 않는다.
5.5.5 분화
특정 실시양태에서 본원에 제공된 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI의 치료 방법에 유용한 태반 세포는 상이한 위탁 세포 계통으로 분화가능하다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 태반 세포는 지방생성, 연골발생성, 신경발생성 또는 골발생성 계통의 세포로 분화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 분화는 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포를 유사한 세포 계통으로 분화시키는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 또는 본원에서 달리 기재된 방법에 의해 달성될 수 있다. 태반 세포를 특정한 세포 계통으로 분화시키는 구체적인 방법은 예를 들어 미국 특허 제7,311,905호, 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0275362호에 개시되어 있으며, 상기 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 제공된 태반 세포는 시험관내, 생체내, 또는 시험관내 및 생체내에서 특정 세포 계통으로 분화할 수 있는 용량을 나타낼 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 태반 세포는 특정 세포 계통으로의 분화를 유도하거나 촉진시키는 조건하에 두었을 때 시험관내에서 분화할 수 있지만, 생체내에서, 예를 들어 NOD-SCID 마우스 모델에서는 검출가능하게 분화하지 않는다.
5.6 태반 세포의 수득 방법
5.6.1 줄기 세포 수집 조성물
태반 세포는 본원에서 제공된 방법에 따라 수집 및 단리될 수 있다. 일반적으로, 줄기 세포는 생리적으로-허용되는 용액, 예를 들어 줄기 세포 수집 조성물을 이용하여 포유동물 태반으로부터 수득한다. 줄기 세포 수집 조성물은 2005년 12월 29일자로 출원된 발명의 명칭 "태반 세포를 수집 및 보존하기 위한 개선된 조성물 및 상기 조성물의 이용 방법"인 관련 미국 가출원 제60/754,969에 상세하게 기재되어 있다.
줄기 세포 수집 조성물은 줄기 세포 수집 및/또는 배양에 적합한 임의의 생리적으로-허용되는 용액, 예를 들어 염수 용액 (예를 들어 인산염 완충 염수, 크렙 용액, 변형 크렙 용액, 이글 용액, 0.9％ NaCl 등), 배양 배지 (예를 들어 DMEM, HDMEM 등) 등을 포함할 수 있다.
줄기 세포 수집 조성물은 태반 세포를 보존하는 경향이 있는 하나 이상의 성분, 즉, 수집 시간부터 배양 시간까지 태반 세포를 죽지 않게 하거나 태반 세포의 사망을 늦추는 성분, 죽은 세포 집단에서 태반 세포의 수를 감소시키는 성분 등을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 예를 들어 세포자멸 억제제 (예를 들어 카스파제 억제제 또는 JNK 억제제); 혈관확장제 (예를 들어 황산마그네슘, 항고혈압 약물, 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 나트륨 니트로프루시드, 히드랄라진, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 포스포디에스테라제 억제제 등); 괴사 억제제 (예를 들어 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 피롤리딘 디티오카르바메이트, 또는 클로나제팜); TNF-α 억제제; 및/또는 산소-운반 퍼플루오로카본 (예를 들어 퍼플루오로옥틸 브로마이드, 퍼플루오로데실 브로마이드 등)일 수 있다.
줄기 세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-분해 효소, 예를 들어 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 중성 프로테아제, RNase, 또는 DNase 등을 포함할 수 있다. 이러한 효소는 콜라게나제 (예를 들어 콜라게나제 I, II, III 또는 IV, 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 얻은 콜라게나제 등); 디스파제, 써모리신(thermolysin), 엘라스타제, 트립신, 리버라제, 히알루로니다제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
줄기 세포 수집 조성물은 살균 또는 정균 유효량의 항생제를 포함할 수 있다. 특정 비-제한적인 실시양태에서, 항생제는 마크롤리드 (예를 들어 토브라마이신), 세팔로스포린 (예를 들어 세팔렉신, 세프라딘, 세푸록심, 세프로질, 세파클로르, 세픽심 또는 세파드록실), 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 페니실린 (예를 들어 페니실린 V) 또는 퀴놀론 (예를 들어 오플록사신, 시프로플록사신 또는 노르플록사신), 테트라시클린, 스트렙토마이신 등이다. 특정 실시양태에서, 항생제는 그람(+) 및/또는 그람(-) 박테리아, 예를 들어 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등에 활성이다.
또한, 줄기 세포 수집 조성물은 1종 이상의 하기 화합물을 포함할 수 있다: 아데노신 (약 1 mM 내지 약 50 mM); D-글루코스 (약 20 mM 내지 약 100 mM); 마그네슘 이온 (약 1 mM 내지 약 50 mM); 한 실시양태에서 내피 완전성 및 세포 생존율 유지에 충분한 양으로 존재하는 분자량이 20,000 달톤을 초과하는 거대분자 (예를 들어 약 25 g/l 내지 약 100 g/l, 또는 약 40 g/l 내지 약 60 g/l로 존재하는 합성 또는 천연 생성 콜로이드, 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜); 항산화제 (예를 들어 약 25 μM 내지 약 100 μM로 존재하는 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E); 환원제 (예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 5 mM로 존재하는 N-아세틸시스테인); 세포 내로 칼슘의 도입을 억제하는 물질 (예를 들어 약 2 μM 내지 약 25 μM로 존재하는 베라파밀); 니트로글리세린 (예를 들어 약 0.05 g/L 내지 약 0.2 g/L); 한 실시양태에서 잔류 혈액의 응고 방지를 돕기에 충분한 양으로 존재하는 항응고제 (예를 들어 약 1000 단위/l 내지 약 100,000 단위/l의 농도로 존재하는 헤파린 또는 히루딘); 또는 아밀로리드 함유 화합물 (예를 들어 약 1.0 μM 내지 약 5 μM로 존재하는 아밀로리드, 에틸 이소프로필 아밀로리드, 헥사메틸렌 아밀로리드, 디메틸 아밀로리드 또는 이소부틸 아밀로리드).
5.6.2 태반의 수집 및 취급
일반적으로, 인간 태반은 출산 후에 그의 배출 직후에 회수된다. 바람직한 실시양태에서, 태반은 사전 동의 후에 및 환자의 전체 의학적 병력을 얻고 태반과 관련시킨 후에 환자로부터 회수한다. 바람직하게는, 의학적 병력은 분만 후 계속된다. 이러한 의학적 병력은 태반 또는 그로부터 수확한 줄기 세포의 후속적인 사용을 조화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 인간 태반 세포는 의학적 병력의 면에서, 태반과 연관된 유아 또는 유아의 부모, 형제자매, 또는 다른 친척을 위한 맞춤형 의약을 위해 사용될 수 있다.
태반 세포의 회수 전에, 제대혈 및 태반 혈액을 제거한다. 특정 실시양태에서, 분만 후에, 태반 내의 제대혈을 회수한다. 태반은 통상적인 제대혈 회수 과정으로 처리할 수 있다. 전형적으로, 태반을 방혈시키기 위해 바늘 또는 캐뉼라가 중력의 도움 하에 사용된다 (예를 들어 앤더슨(Anderson)의 미국 특허 제5,372,581호; 헤슬(Hessel) 등의 미국 특허 제5,415,665호 참조). 바늘 또는 캐뉼라는 통상적으로 제대 정맥 내에 놓이고, 태반으로부터 제대혈을 배수시키는 것을 돕기 위해 태반을 부드럽게 마사지할 수 있다. 이러한 제대혈 회수는 상업적으로 수행될 수 있다 (예를 들어 라이프뱅크 인크.(LifeBank Inc.), 미국 뉴저지주 시더 놀스), 비아코드(ViaCord), 코드 블러드 레지스트리(Cord Blood Registry) 및 크리오셀(Cryocell)). 바람직하게는, 태반은 제대혈 회수 동안 조직 파괴를 최소화하기 위해 추가의 조작 없이 중력에 의해 배수된다.
전형적으로, 예를 들어 관류 또는 조직 해리에 의한 제대혈의 회수 및 줄기 세포의 수집을 위해 태반은 분만실 또는 탄생실로부터 또다른 위치, 예를 들어 실험실로 수송된다. 태반은 바람직하게는 예를 들어 태반을 클램핑한(clamped) 근위 제대와 함께 멸균 집록식(zip-lock) 플라스틱 백에 넣은 후 이를 절연 용기에 넣음으로써 멸균 단열 수송 장치 (태반 온도를 20-28℃로 유지하는) 내에서 수송한다. 또다른 실시양태에서, 태반은 2005년 9월 19일자로 출원된 계류중인 미국 특허출원 제11/230,760호에 기재된 바와 실질적으로 같은 제대혈 수집 키트 내에서 수송된다. 바람직하게는, 태반은 분만 후 4 내지 24시간에 실험실로 전달된다. 특정 실시양태에서, 근위 제대는 바람직하게는 제대혈 회수 전에 태반 디스크로 삽입부의 4-5 cm 이내에 클램핑된다. 다른 실시양태에서, 근위 제대는 제대혈 회수 후에 그러나 태반의 추가의 처리 전에 클램핑된다.
줄기 세포 수집 전에 태반은 멸균 조건하에 및 실온 또는 5 내지 25℃ (섭씨온도)의 온도에서 저장될 수 있다. 태반은 임의의 잔류하는 제대혈을 제거하기 위해 태반을 관류시키기 전에 48시간 보다 더 긴 기간 동안, 바람직하게는 4 내지 24시간 동안 저장될 수 있다. 태반은 바람직하게는 항응고제 용액 내에 5 내지 25℃(섭씨온도)의 온도에서 저장된다. 적합한 항응고제 용액은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 헤파린 또는 와파린 나트륨의 용액이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항응고제 용액은 헤파린의 용액 (예를 들어 1:1000 용액 중 1％ w/w)을 포함한다. 방혈시킨 태반은 바람직하게는 태반 세포를 수집하기 전에 36시간 이내 동안 저장된다.
포유동물 태반 또는 그의 일부는, 전반적으로 상기와 같이 수집 및 제조된 후, 줄기 세포를 수득하기 위하여 임의의 당업계에 공지된 방식으로 처리될 수 있고, 예를 들어 관류되거나 파괴될 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 조직-파괴 효소로 소화될 수 있다.
5.6.3 태반 조직의 물리적 파괴 및 효소 소화
한 실시양태에서, 줄기 세포는 기관의 물리적 파괴, 예를 들어 효소 소화에 의해, 예를 들어 상기 단락 5.3.1에 기재된 줄기 세포 수집 조성물을 이용하여 포유동물 태반으로부터 수집한다. 예를 들어 태반 또는 그의 일부는 예를 들어 완충제, 배지 또는 줄기 세포 수집 조성물과 접촉하면서, 예를 들어 파쇄되거나, 전단되거나, 잘게 썰리거나, 네모로 썰리거나, 절단되거나, 침연될 수 있고, 그 후 조직은 하나 이상의 효소로 소화될 수 있다. 태반, 또는 그의 일부는 또한 물리적으로 파괴되고 하나 이상의 효소로 소화될 수 있고, 그 후, 생성된 물질은 완충제, 배지 또는 줄기 세포 수집 조성물에 침지되거나 이들로 혼합될 수 있다. 파괴 방법이 예를 들어 트리판 블루 제외법으로 결정되는 바와 같이, 상기 살아있는 장기에서 다수의 세포, 보다 바람직하게는 대다수의 세포, 보다 바람직하게는 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 또는 99％의 세포를 남긴다면, 어떠한 물리적 파괴의 방법도 사용할 수 있다.
태반은 물리적 파괴 및/또는 효소 소화 및 줄기 세포 회수 이전에 성분으로 해부될 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 양모 막, 융모막, 태반엽, 또는 그의 임의의 조합, 또는 제대, 또는 그의 임의의 조합으로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는, 태반 세포는 양막 및 융모막, 또는 양막-융모막 및 제대를 포함하는 태반 조직으로부터 수득한다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 약 1:1 중량비인 양막-융모막 및 제대로부터 수득한다. 전형적으로, 태반 세포는 작은 블록의 태반 조직, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 약 1000 mm3 부피의 블록의 태반 조직의 파괴로 수득할 수 있다.
바람직한 줄기 세포 수집 조성물은 하나 이상의 조직-파괴 효소(들)을 포함한다. 효소 소화는 바람직하게는 효소들의 조합, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테아제 및 중성 프로테아제의 조합, 예를 들어 콜라게나제 및 디스파제의 조합을 사용한다. 한 실시양태에서, 태반 조직의 효소 소화는 매트릭스 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제, 및 하이알루론산의 소화를 위한 점액용해 효소의 조합, 예컨대 콜라게나제, 디스파제, 및 히알루로니다제의 조합 또는 리버라제 (베링거인겔하임 만하임 코퍼레이션(Boehringer Mannheim Corp.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스) 및 히알루로니다제의 조합을 사용한다. 태반 조직을 파괴하는 데 사용할 수 있는 다른 효소는 파파인, 데옥시리보뉴클레아제, 세린 프로테아제, 예컨대 트립신, 키모트립신, 또는 엘라스타제를 포함한다. 세린 프로테아제는 혈청에서 알파 2 마이크로글로불린에 의해 억제될 수 있고, 따라서 소화를 위해 사용되는 배지는 통상적으로 혈청 무함유이다. EDTA 및 DNase는 통상적으로 효소 소화 절차에 사용되어 세포 회수의 효율을 증가시킨다. 소화액(digestate)은 점성이 있는 소화물 내에 줄기 세포를 가두는 것을 피하도록 희석되는 것이 바람직하다.
조직 소화 효소의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 조직 소화 효소에 대한 전형적인 농도는 예를 들어 콜라게나제 I 및 콜라게나제 IV의 경우 50-200 U/mL, 디스파제의 경우 1-10 U/mL, 및 엘라스타제의 경우 10-100 U/mL을 포함한다. 프로테아제는 태반 세포를 해방시키기 위하여 조합하여 (즉, 동일 소화 반응에서의 2개 이상의 프로테아제) 사용될 수 있거나 순차적으로 사용될 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서, 태반 또는 그의 일부는 적절한 양의 콜라게나제 I로 2 mg/ml로 30분 동안 먼저 소화되고, 그 후, 트립신 0.25％로 10분 동안 37℃에서 소화된다. 세린 프로테아제는 바람직하게는 다른 효소의 사용 후에 연속적으로 사용된다.
또다른 실시양태에서, 조직은 줄기 세포 수집 조성물로 줄기 세포를 단리하기 전 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 수집 조성물에 또는 조직이 파괴되고(거나) 소화된 용액에 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르)-N,N,N'N'-테트라아세트산 (EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 첨가함으로써 추가로 파괴될 수 있다.
태반 전체 또는 태반의 일부가 태아 및 모체 세포 둘 다를 포함하는 경우 (예를 들어 태반의 일부가 융모막 또는 태반엽을 포함하는 경우), 수집된 태반 세포는 태아 및 모체 공급원 둘 다로부터 유도된 태반 세포의 혼합물을 포함할 것임을 알 것이다. 태반의 일부가 모체 세포 (예를 들어 양막)를 전혀 포함하지 않거나 무시할 정도의 수로 포함하는 경우, 수집된 태반 세포는 대부분 태아 태반 세포만을 포함할 것이다.
5.6.4 태반 관류
태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 (PDAC)는 또한 포유동물 태반의 관류로 수득될 수 있다. 줄기 세포를 수득하기 위한 포유동물 태반의 관류 방법은 예를 들어 해리리(Hariri)의 미국 출원 공개 제2002/0123141호 및 2005년 12월 29일자로 출원된 발명의 명칭 "태반 세포를 수집 및 보존하기 위한 개선된 조성물 및 상기 조성물의 이용 방법"인 관련 미국 가출원 제60/754,969에 기재되어 있다.
태반 세포는 예를 들어 관류 용액으로서 줄기 세포 수집 조성물을 이용하여 예를 들어 태반 혈관계를 통한 관류에 의해 수집될 수 있다. 한 실시양태에서, 포유동물 태반은 제대 동맥과 제대 정맥 중 하나 또는 둘 다를 관류 용액이 통과함으로써 관류된다. 태반을 통한 관류 용액의 유동은 예를 들어 태반으로의 중력식 유동을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 관류 용액은 펌프, 예를 들어 연동 펌프를 이용하여 태반을 통하도록 강요된다. 제대 정맥은 예를 들어 멸균 연결 기구, 예컨대 멸균 튜빙에 연결되는 캐뉼라, 예를 들어 테플론(TEFLON)® 또는 플라스틱 캐뉼라로 삽관될 수 있다. 멸균 연결 기구는 관류 매니폴드로 연결된다.
관류를 위한 제조에서, 태반은 바람직하게는 제대 동맥 및 제대 정맥이 태반의 가장 높은 지점에 위치하는 방식으로 맞춰진다 (예를 들어 매달린다). 태반은 태반 혈관계나 태반 혈관계와 주변 조직을 관류액, 예를 들어 본원에서 제공된 줄기 세포 수집 조성물이 통과함으로써 관류될 수 있다. 한 실시양태에서, 제대 동맥 및 제대 정맥은 가요성 연결기를 통해 관류 용액의 저장소로 연결된 피펫에 동시에 연결된다. 관류 용액은 제대 정맥 및 동맥으로 통과된다. 관류 용액은 혈관 벽에서 나와 이를 통해 태반의 주변 조직으로 통과하고, 임신 중 모체의 자궁에 부착된 태반의 표면으로부터 적합한 개방 혈관에 수집된다. 관류 용액은 또한 제대 입구를 통해 도입되고, 모체 자궁 벽과 접속된 태반의 벽에 있는 입구로부터 흐르거나 스며들게 될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 관류 용액은 제대 정맥을 통과하고 제대 동맥으로부터 수집되거나, 제대 동맥을 통과하고 제대 정맥으로부터 수집된다.
한 실시양태에서, 근위 제대는 관류 중에 클램핑되고, 보다 바 바람직하게는, 태반 디스크로의 코드 삽입의 4-5 cm (센티미터) 내에 클램핑된다.
방혈 과정 동안 포유동물 태반으로부터의 관류액의 제1 수집은 일반적으로 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구로 착색된다. 관류액은 관류가 진행되고 잔류 제대혈 세포가 태반으로부터 씻겨 나가면서 점점 무색으로 된다. 태반을 초기에 방혈하는 데에는 일반적으로 30 내지 100 ml (밀리리터)의 관류액이 적합하지만, 관찰되는 결과에 따라 그 이상이나 이하의 관류액을 사용할 수 있다.
태반 세포 수집에 사용되는 관류 액체의 부피는 수집될 줄기 세포의 수, 태반의 크기, 단일 태반으로부터 만들어질 수집의 수 등에 따라 달라질 수 있다. 다양한 실시양태에서, 관류 액체의 부피는 50 mL 내지 5000 mL, 50 mL 내지 4000 mL, 50 mL 내지 3000 mL, 100 mL 내지 2000 mL, 250 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 2000 mL, 또는 750 mL 내지 2000 mL일 수 있다. 전형적으로, 태반은 방혈 후 700-800 mL의 관류 액체로 관류된다.
태반은 수 시간 또는 수 일에 걸쳐 여러번 관류될 수 있다. 태반이 여러번 관류될 경우, 이는 컨테이너 또는 다른 적합한 용기에서 무균 조건하에 유지되거나 배양될 수 있고, 항응고제 (예를 들어 헤파린, 와파린 나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)를 함유하거나 함유하지 않고/거나 항균제 (예를 들어 β-메르캅토에탄올 (0.1 mM)), 항생제, 예컨대 스트렙토마이신 (예를 들어 40-100 ㎍/ml), 페니실린 (예를 들어 40U/ml), 암포테리신 B (예를 들어 0.5 ㎍/ml)를 함유하거나 함유하지 않는 표준 관류 용액 (예를 들어 정상적인 염수 용액, 예컨대 인산염 완충 염수 ("PBS") 또는 줄기 세포 수집 조성물로 관류될 수 있다. 한 실시양태에서, 관류 및 관류액 수집 전 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 2 또는 3일 또는 그 이상의 일 동안 태반이 유지되거나 배양되도록, 관류액을 수집하지 않고 단리된 태반을 일정 시간의 기간 동안 유지하거나 배양한다. 관류된 태반은 하나 이상의 추가의 시간 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 또는 그 이상의 시간 동안 유지되고, 예를 들어 700-800 mL 관류액으로 재차 관류될 수 있다. 태반은 1, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상의 횟수로, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 한번씩 관류될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 태반의 관류 및 관류 용액, 예를 들어 줄기 세포 수집 조성물의 수집은 회수된 유핵 세포의 수가 100개 세포/ml 아래로 떨어질 때까지 반복된다. 상이한 시점에서의 관류액을 추가로 개별적으로 처리하여 세포, 예를 들어 줄기 세포의 시간-의존적 집단을 회수할 수 있다. 상이한 시점으로부터 얻은 관류액을 또한 모을 수도 있다.
임의의 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 태반의 방혈 및 충분한 시간의 관류 후에, 태반 세포는 태반의 방혈 및 관류된 미세순환 (여기에서 바람직하게는 관류에 의해 수집 용기로 세척함으로써 이들이 수집됨)으로 이동한다고 여겨진다. 단리된 태반을 관류하는 것은 잔류 제대혈을 제거하는 것 뿐 아니라 태반에 산소를 비롯한 적절한 영양분을 제공하는 역할을 한다. 태반은 바람직하게는, 항응고제의 첨가 없이 잔류 제대혈 세포를 제거하기 위해 사용된 유사한 용액으로 배양 및 관류될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 관류는 상기 용액으로 관류되지 않고, 줄기 세포를 수득하기 위해 (예를 들어 조직 파괴, 예를 들어 효소 소화에 의해) 달리 처리되지 않은 포유동물 태반으로부터 수득가능한 수보다 유의하게 더 많은 태반 세포의 수집을 야기한다. 이러한 문맥에서, "유의하게 더 많은"은 적어도 10％ 더 많음을 의미한다. 관류는 예를 들어 태반 또는 그의 일부가 배양된 배양 배지로부터 수득가능한 태반 세포의 수보다 유의하게 더 많은 태반 세포를 수득한다.
줄기 세포는 하나 이상의 프로테아제 또는 다른 조직-파괴 효소를 포함하는 용액으로 관류함으로써 태반으로부터 단리될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 태반 또는 그의 일부 (예를 들어 양모 막, 양막 및 융모막, 태반소엽 또는 태반엽, 또는 상기의 임의의 조합)를 25-37℃에 이르게 하고, 배양 배지 200 mL 중에서 30분 동안 하나 이상의 조직-파괴 효소와 인큐베이션한다. 관류액으로부터 얻은 세포를 수집하고, 4℃에 이르게 하고, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨 및 2 mM 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 차가운 억제제 믹스로 세척한다. 줄기 세포를 수 분 후에 본원의 다른 곳에서 기재된 차가운 (예를 들어 4℃) 줄기 세포 수집 조성물로 세척한다.
팬 방법을 이용한 관류로 인해, 즉, 관류액이 태반의 모체 측으로부터 나온 후에 수집됨으로써, 태아 및 모체 세포의 믹스가 형성됨을 알 것이다. 그 결과, 상기 방법에 의해 수집된 세포는 태아 및 모체 모두 기원인 태반 세포의 혼합된 집단을 포함한다. 반대로, 태반 혈관계만을 통한 관류로 인해, 즉 관류액이 1 또는 2개의 태반 혈관을 통과하고 나머지 혈관(들)만을 통해 수집됨으로써, 거의 오로지 태아 기원인 태반 세포의 집단이 수집된다.
5.6.5 태반 세포의 단리, 분류, 및 특징규명
포유동물 태반으로부터의 줄기 세포는, 관류에 의해 수득되든 효소 소화에 의해 수득되든, 피콜(Ficoll) 구배 원심분리에 의해 다른 세포로부터 초기에 정제될 수 (즉, 단리될 수) 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등을 위한 임의의 표준 프로토콜 후에 이어질 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 태반으로부터 수집된 세포는 5000 x g에서 15분 동안 실온에서 원심분리에 의해 관류액으로부터 회수되며, 이는 세포를 예를 들어 오염 잔여물 및 혈소판으로부터 분리시킨다. 또다른 실시양태에서, 태반 관류액을 약 200 ml로 농축하고, 피콜 상에 부드럽게 적층하고, 약 1100 x g에서 20분 동안 22℃에서 원심분리하고, 추가의 프로세싱을 위해 세포의 저밀도 계면 층을 수집한다.
세포 펠렛은 신선한 줄기 세포 수집 조성물, 또는 줄기 세포 유지를 위해 적합한 배지, 예를 들어 2U/ml 헤파린 및 2mM EDTA를 함유하는 IMDM 혈청 무함유 배지 (깁코BRL(GibcoBRL), 미국 뉴욕주) 중에 재현탁할 수 있다. 총 단핵 세포 분획은 예를 들어 제조업체가 권장하는 절차에 따라 림포프렙(Lymphoprep) (나이코메드 파마(Nycomed Pharma), 노르웨이 오슬로)을 이용하여 단리할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 (PDAC)를 "단리함"은 줄기 세포가 무손상 포유동물 태반에서 정상적으로 연합된 세포의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％ 이상을 제거함을 의미한다. 장기로부터의 줄기 세포는 줄기 세포가 무손상 장기에서 정상적으로 연합된 세포의 50％ 미만을 포함하는 세포의 집단 내에 존재하는 경우, "단리된다".
관류 또는 소화에 의해 수득된 태반 세포는 예를 들어 추가로, 또는 초기에, 예를 들어 0.2％ EDTA 함유 0.05％ 트립신 용액 (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스)을 이용하여 차별적 트립신 처리에 의해 단리될 수 있다. 태반 세포 (PDAC)는 전형적으로 약 5분 내에 플라스틱 표면으로부터 박리되는 반면, 다른 부착 집단은 전형적으로 20-30분 초과의 인큐베이션이 요구되기 때문에 차별적 트립신 처리가 가능하다. 박리된 태반 세포는 예를 들어 트립신 중화 용액 (TNS, 캠브렉스(Cambrex))을 이용하여 트립신 처리 및 트립신 중화 후에 수확할 수 있다. 부착 세포의 단리에 대한 한 실시양태에서, 예를 들어 약 5-10 x 106개 세포의 분취액을 몇몇 T-75 플라스크, 바람직하게는 피브로넥틴-코팅된 T75 플라스크의 각각에 위치시킨다. 이러한 실시양태에서, 세포를 시판되는 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM) (캠브렉스)와 배양하고, 조직 배양 인큐베이터 (37℃, 5％ CO2)에 위치시킬 수 있다. 10 내지 15일 후, 비-부착 세포를 PBS로의 세척에 의해 플라스크에서 제거한다. 그 후, PBS를 MSCGM으로 대체한다. 플라스크를 바람직하게는 다양한 부착 세포 유형의 존재에 대해, 특히, 섬유모세포타입 세포의 클러스터 확인 및 증식에 대해 매일 조사한다.
포유동물 태반으로부터 수집된 세포의 수 및 유형은 예를 들어 표준 세포 검출 기술, 예를 들어 유동 세포계측, 세포 분류, 면역세포화학 (예를 들어 조직 특이적 또는 세포-마커 특이적 항체를 사용한 염색), 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 자성 활성화된 세포 분류 (MACS)를 이용하여 형태 및 세포 표면 마커의 변화를 측정함으로써, 광학 또는 공초점 현미경검사를 이용하는 세포의 형태의 조사에 의해, 및/또는 당업계에 공지된 기술, 예컨대 PCR 및 유전자 발현 프로파일링을 이용하여 유전자 발현의 변화를 측정함으로써 모니터링할 수 있다. 이들 기술은 1종 이상의 특정 마커에 대해 양성인 세포를 확인하기 위해 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 CD34에 대한 항체를 사용하여, 상기 기술을 이용하여 세포가 검출가능한 양의 CD34를 포함하는지 결정할 수 있고; 이러한 경우, 세포는 CD34+이다. 유사하게, 세포가 RT-PCR에 의해 검출가능할 정도로 충분한 OCT-4 RNA를 생산하거나, 또는 성인 세포보다 유의하게 더 많은 OCT-4 RNA를 생산하는 경우, 세포는 OCT-4+이다. 세포 표면 마커 (예를 들어 CD 마커, 예컨대 CD34)에 대한 항체 및 줄기 세포-특이적 유전자, 예컨대 OCT-4의 서열은 당업계에 공지되어 있다.
태반 세포, 특히 피콜 분리, 차별적인 부착, 또는 둘의 조합에 의해 단리된 세포는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)를 사용하여 분류될 수 있다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 입자의 형광 특성에 기초하여 세포를 비롯한 입자를 분리하기 위한 널리 공지된 방법이다 [Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165]. 개별 입자 내의 형광 모이어티의 레이저 여기는 혼합물로부터 양성 및 음성 입자의 전자기 분리를 허용하는 작은 전하를 생성한다. 한 실시양태에서, 세포 표면 마커-특이적 항체 또는 리간드를 구분된 형광 표지로 표지한다. 세포를 세포 분류기를 통해 처리하여, 사용된 항체에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 세포를 분리시킨다. FACS 분류된 입자는 분리 및 클로닝을 용이하게 하기 위해 96웰 또는 384웰 플레이트의 개별 웰로 직접적으로 침착될 수 있다.
한 분류 반응식에서, 태반으로부터의 줄기 세포를 마커 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G의 발현을 기초로 분류한다. 이는 배양시 그들의 부착 특성을 기초로 줄기 세포를 선택하는 절차와 함께 수행할 수 있다. 예를 들어 줄기 세포의 부착 선택은 마커 발현을 기초로 분류하기 전 또는 후에 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 세포는 CD34 중 그의 발현을 기초로 먼저 분류되고; CD34- 세포가 유지되고, CD200+HLA-G+인 세포가 모든 다른 CD34- 세포로부터 분리된다. 또다른 실시양태에서, 태반으로부터의 세포는 마커 CD200 및/또는 HLA-G 중 그의 발현을 바탕으로 하며, 예를 들어 이들 마커들 중 하나를 나타내는 세포를 추가 용도를 위해 단리한다. 구체적인 실시양태에서, 예를 들어 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포는 CD73 및/또는 CD105 중 그의 발현, 또는 항체 SH2, SH3 또는 SH4에 의해 인식된 에피토프, 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 발현 결핍을 바탕으로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서, 태반 세포는 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 및 CD45의 발현 또는 그의 결핍에 의해 분류되고, CD200+, HLA-G-, CD73+, CD105+, CD34-, CD38- 및 CD45-인 태반 세포는 추가 용도를 위해 다른 태반 세포로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 세포를 분리하기 위해 자성 비드를 사용할 수 있다. 세포는 자성 활성화된 세포 분류 (MACS) 기술 (입자를 자성 비드 (0.5-100 ㎛ 직경)에 결합하는 그들의 능력에 기초하여 분리시키는 방법)을 이용하여 분류될 수 있다. 특정 세포 표면 분자 또는 합텐을 특이적으로 인식하는 항체의 공유 첨가를 비롯한, 다양한 유용한 변형을 자성 미소구 상에서 수행할 수 있다. 이어서, 비드를 세포와 혼합하여 결합시킨다. 이어서, 세포를 자기장을 통해 통과시켜 특이적 세포 표면 마커를 가진 세포를 분리시킨다. 이어서, 한 실시양태에서, 이들 세포를 단리하고 추가의 세포 표면 마커에 대한 항체에 결합된 자성 비드와 재혼합할 수 있다. 세포를 다시 자기장을 통해 통과시켜, 두 항체 모두에 결합된 세포를 단리시킨다. 이어서, 상기 세포를 별개의 접시, 예를 들어 클로날 단리를 위한 마이크로역가 접시로 희석시킬 수 있다.
태반 세포는 또한 세포 형태 및 성장 특징을 바탕으로 특징규명 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 예를 들어 배양시의 섬유모세포타입 외양을 가지는 것으로 특징규명하고/거나 이를 바탕으로 선택할 수 있다. 태반 세포는 또한 배아양 유사체를 형성하는 그의 능력을 가지는 것으로 특징규명하고/거나 이를 바탕으로 선택할 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들어 모양상 섬유모세포타입인 태반 세포는 CD73 및 CD105를 발현하고, 배앙시 하나 이상의 배아양 유사체를 생산하고, 다른 태반 세포로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, 배앙시 하나 이상의 배아양 유사체를 생산하는 OCT-4+ 태반 세포는 다른 태반 세포로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 태반 세포는 콜로니 형성 단위 검정에 의해 확인 및 특징규명될 수 있다. 콜로니 형성 단위 검정은 예컨대 메센 컬트(Mesen Cult)™ 배지 (스템 셀 테크놀로지스, 인크(Stem Cell Technologies, Inc.), 브리티시 컬럼비아주 밴쿠버)와 같이 당업계에 통상적으로 공지되어 있다.
태반 세포는 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 트리판 블루 배제 검정, 플루오레세인 디아세테이트 흡수 검정, 아이오딘화프로피듐 흡수 검정 (생존율을 평가하기 위해); 및 티미딘 흡수 검정 또는 MTT-세포 증식 검정 (증식을 평가하기 위해)을 이용하여 생존율, 증식 잠재성 및 수명(longevity)에 대해 평가할 수 있다. 수명은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대 연장된 배양에서 집단 배가(doubling)의 최대 수를 결정함으로써 결정할 수 있다.
태반 세포는 또한 당업계에 공지된 다른 기술, 예를 들어 원하는 세포의 선택적 성장 (양성 선택), 원치않는 세포의 선택적 파괴 (음성 선택); 예를 들어 대두 응집소를 갖는 것과 같은 혼합된 집단에서의 차별적 세포 응집성을 바탕으로 하는 분리; 동결-해동 절차; 여과; 통상적 및 띠(zonal) 원심분리; 원심분리 세정 (카운터-스트리밍 원심분리); 단위 중력 분리; 역류 분포; 전기영동 등을 이용하여 다른 태반 세포로부터 분리할 수 있다.
5.7 태반 세포의 배양
5.7. 1 배양 배지
단리된 태반 세포, 또는 태반 세포 집단, 또는 태반 세포가 성장해 나간 세포 또는 태반 조직은 세포 배양물을 개시하거나 접종하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 일반적으로 세포외 매트릭스 또는 리간드, 예컨대 라미닌, 콜라겐 (예를 들어 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴, 및 세포외 막 단백질 (예를 들어 매트리겔™ (비디 디스커버리 랩웨어(BD Discovery Labware, 미국 매사추세츠주 베드포드))로 코팅되거나 코팅되지 않은 멸균 조직 배양 용기에 옮겨진다.
태반 세포는 줄기 세포의 배양을 위해 허용된다고 당업계에서 인식된 임의의 조건하에서 임의의 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지는 혈청을 포함한다. 태반 세포는 예를 들어 ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄), LA+BSA (리놀레산-소 혈청 알부민), 덱스트로스, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-1, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM-LG (둘베코 변형 필수 배지, 저 글루코스)/MCDB 201 (병아리 섬유모세포 기초 배지); 10％ 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 DMEM-HG (고 글루코스); 15％ FBS를 포함하는 DMEM-HG; 10％ FBS, 10％ 말 혈청, 및 히드로코르티손을 포함하는 IMDM (이스코브 변형 둘베코 배지); 10％ FBS, EGF, 및 헤파린을 포함하는 M199; 10％ FBS, GlutaMAX™ 및 겐타미신을 포함하는 α-MEM (최소 필수 배지); 10％ FBS, GlutaMAX™ 및 겐타미신을 포함하는 DMEM 등에서 배양될 수 있다. 바람직한 배지는 2％ FBS, ITS, LA+BSA, 덱스트로스, L-아스코르브산, PDGF, EGF, 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM-LG/MCDB-201이다.
태반 세포를 배양하기 위해 사용할 수 있는 다른 배지는 DMEM (고 또는 저 글루코스), 이글 기본 배지, 햄 F10 배지 (F10), 햄 F-12 배지 (F12), 이스코브 변형 둘베코 배지, 중간엽 줄기 세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (깁코), DMEM/MCDB201 (시그마), 및 세포-GRO 프리를 포함한다.
배양 배지는 1종 이상의 성분, 예를 들어 혈청 (예를 들어 태아 소 혈청 (FBS), 바람직하게는 약 2-15％ (v/v); 말 혈청 (ES); 인간 혈청 (HS)); 베타-메르캅토에탄올 (BME), 바람직하게는 약 0.001％ (v/v); 1종 이상의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 에리트로포이에틴 (EPO); 아미노산, 예를 들어 L-발린; 및 미생물 오염을 제어하기 위한 1종 이상의 항생제 및/또는 항진균제, 예를 들어 페니실린 G, 스트렙토마이신 술페이트, 암포테리신 B, 겐타미신, 및 니스타틴으로 단독으로 또는 조합으로 보충될 수 있다.
5.7.2 태반 세포의 증대 및 증식
단리된 태반 세포, 또는 단리된 줄기 세포 집단 (예를 들어 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단이 생체내 정상적으로 연합되어 있는 태반 세포의 50％ 이상으로부터 분리된 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단)에서, 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단은 시험관내 증식되거나 증대될 수 있다. 예를 들어 태반 세포 집단은 줄기 세포가 70-90％ 전면성장까지 증식하기에 충분한 시간 동안, 즉 줄기 세포 및 그의 자손이 조직 배양 용기의 배양 표면적의 70-90％를 차지할 때까지, 조직 배양 용기, 예를 들어 접시, 플라스크, 멀티웰 플레이트 등에서 배양될 수 있다.
태반 세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 접종할 수 있다. 예를 들어 세포는 저밀도 (예를 들어 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/cm2) 내지 고밀도 (예를 들어 약 50,000개 이상의 세포/cm2)로 접종할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기중 약 0 내지 약 5 부피％ CO2에서 배양된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 공기중 약 2 내지 약 25％ O2, 바람직하게는 공기중 약 5 내지 약 20 ％ O2에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양된다. 세포는 바람직하게는 인큐베이터에서 배양된다. 배양 배지는 정적이거나, 또는 예를 들어 생물반응기를 이용하여 교반될 수 있다. 태반 세포는 바람직하게는 저산소 스트레스 하에서 (예를 들어 글루타티온, 아스코르브산, 카탈라제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등의 첨가와 함께) 성장한다.
70％-90％ 전면성장이 얻어지면, 세포를 통과시킬 수 있다. 예를 들어 세포를 당업계에 공지된 기술을 이용하여 효소 처리, 예를 들어 트립신처리하여 조직 배양 표면으로부터 이를 분리할 수 있다. 세포를 피펫팅 및 계수함으로써 세포를 제거한 후에, 약 20,000-100,000개 줄기 세포, 바람직하게는 약 50,000개 줄기 세포를 신선한 배양 배지를 함유하는 신규 배양 용기로 통과시킨다. 전형적으로, 신규 배지는 줄기 세포가 제거된 것으로부터 동일한 유형의 배지이다. 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20회 또는 그 이상, 및 이의 조합으로 통과된 태반 세포의 집단이 본원에 제공된다.
5.7.3 태반 세포 집단
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 처리 방법은 태반 세포 집단을 이용한다. 태반 세포 집단은 하나 이상의 태반으로부터 직접적으로 단리될 수 있으며, 즉, 태반 세포 집단은 관류액으로부터 수득되거나 이에 함유된 또는 소화액으로부터 수득되거나 이에 함유된 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단 (즉, 태반 또는 그의 일부의 효소 소화에 의해 수득된 세포의 수집)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 단리된 태반 세포는 또한 배양 및 증식되어 태반 세포 집단을 생성할 수 있다. 태반 세포 (예를 들어 PDAC)를 포함하는 태반 세포 집단은 또한 배양 및 증식되어 태반 줄기 세포 집단, 예를 들어 PDAC, 또는 PDAC 집단을 포함하는 태반 세포 집단을 생성할 수 있다.
본원에 기재된 태반 세포 집단은 태반 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 태반 세포 (예를 들어 PDAC)를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 단리된 태반 세포 집단 중 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 99％ 이상의 세포가 태반 줄기 세포이다. 즉, 태반 줄기 세포 집단은 예를 들어 1％, 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％만큼 많은 비-줄기 세포를 포함할 수 있다.
예를 들어 효소 소화로부터 유도되든 관류로부터 유도되든, 특정 마커 및/또는 특정 배양 또는 형태학적 특징을 발현하는 태반 줄기 세포를 선택함으로써 단리된 태반 세포 집단을 생성하는 방법을 본원에 제공한다. 한 실시양태에서, 예를 들어 세포 집단은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD200을 발현하고 HLA-G를 발현하지 않는 태반 세포를 선택하는 단계; 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함하는 방법으로 생성될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 세포 집단 생성 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73, CD105, 및 CD200을 발현하는 태반 세포를 선택하는 단계; 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포 집단 생성 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD200 및 OCT-4를 발현하는 태반 세포를 선택하는 단계; 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포 집단 생성 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73 및 CD105를 발현하고, (c) 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포 집단이 배아양 유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양 유사체의 형성을 용이하게 하는 태반 세포를 선택하는 단계, 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포 집단 생성 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) CD73 및 CD105를 발현하고 HLA-G를 발현하지 않는 태반 세포를 선택하는 단계; 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포 집단 생성 방법은 (a) 기재에 부착하고, (b) OCT-4를 발현하고, (c) 상기 줄기 세포를 포함하는 태반 세포 집단이 배아양 유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양 유사체의 형성을 용이하게 하는 태반 세포를 선택하는 단계, 및 상기 세포를 다른 세포로부터 단리하여 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 실시양태에서, 상기 방법은 ABC-p (태반-특이적 ABC 수송자 단백질; 예를 들어 [Allikmets et al., Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)] 참조)를 발현하는 태반 세포를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 예를 들어 중간엽 줄기 세포에 특이적인 하나 이상의 특징, 예를 들어 CD29의 발현, CD44의 발현, CD90의 발현, 또는 이의 조합의 발현을 나타내는 세포를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
상기 실시양태에서, 기재는 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포의 배양 및/또는 선택을 수행할 수 있는 임의의 표면일 수 있다. 전형적으로, 기재는 플라스틱, 예를 들어 조직 배양 접시 또는 멀티웰 플레이트 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 생체분자, 예를 들어 라미닌 또는 피브로넥틴으로 코팅될 수 있다.
세포, 예를 들어 태반 줄기 세포는 세포 선택에 대한 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 태반 세포 집단에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어 세포는 예를 들어 유동 세포계측 또는 FACS에서 하나 이상의 세포 표면 마커에 대한 항체(들)을 이용하여 선택될 수 있다. 선택은 자성 비드와 함께 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 특정 줄기 세포-관련 마커에 특이적인 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 OCT-4에 대한 항체 (아브캄(Abcam), 미국 매사추세츠주 캠브리지), CD200에 대한 항체 (아브캄), HLA-G에 대한 항체 (아브캄), CD73에 대한 항체 (비디 바이오사이언시즈 파밍겐(BD Biosciences Pharmingen), 미국 캘리포니아주 샌디에고), CD105에 대한 항체 (아브캄; 바이오디자인 인터내셔널(BioDesign International), 미국 메인주 사코) 등. 다른 마커에 대한 항체도 또한 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 CD34, CD38 및 CD45에 대한 항체는 예를 들어 스템셀 테크놀로지스 또는 바이오디자인 인터내셔널에서 입수가능하다.
단리된 태반 세포 집단은 줄기 세포가 아닌 태반 세포, 또는 태반 세포가 아닌 세포를 포함할 수 있다.
단리된 태반 세포 집단은 비-줄기 세포 또는 비-태반 세포의 하나 이상의 집단과 조합될 수 있다. 예를 들어 태반 세포의 단리된 집단은 혈액 (예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈), 혈액-유래 줄기 세포 (예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈로부터 유도된 줄기 세포), 혈액-유래 유핵 세포의 집단, 골수-유래 중간엽 세포, 뼈-유래 줄기 세포 집단, 조 골수, 성인 (체세포) 줄기 세포, 조직 내에 함유된 줄기 세포의 집단, 배양된 줄기 세포, 완전히-분화된 세포 (예를 들어 연골세포, 섬유모세포, 양모 세포, 골모세포, 근육 세포, 심장 세포 등)의 집단 등과 조합될 수 있다. 단리된 태반 세포 집단 중의 세포는 각각의 집단에서 총 유핵 세포의 수를 비교할 때 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; 또는 약 1:100,000,000의 비율로 또다른 유형인 복수개의 세포와 조합될 수 있다. 단리된 태반 세포 집단에서의 세포는 또한 복수개의 세포 유형의 복수개의 세포와 조합될 수 있다.
한 경우에, 태반 세포의 단리된 집단은 복수개의 조혈 줄기 세포와 조합된다. 이러한 조혈 줄기 세포는 예를 들어 비처리된 태반, 제대혈 또는 말초혈 내에; 태반 혈액, 제대혈 또는 말초혈로부터의 총 유핵 세포에; 태반 혈액, 제대혈 또는 말초혈로부터의 CD34+ 세포의 단리된 집단에; 비처리된 골수에; 골수로부터의 총 유핵 세포에; 골수로부터의 CD34+ 세포의 단리된 집단 등에 함유될 수 있다.
5.8 태반 세포의 보존
태반 세포는 보존될 수 있고, 즉, 장기간 저장을 허용하는 조건 또는 예를 들어 세포자멸 또는 괴사에 의한 세포 사멸을 억제하는 조건 하에 놓일 수 있다.
태반 세포는, 예를 들어 2005년 12월 25일자로 출원된 관련된 미국 가출원 제60/754,969호 (발명의 명칭: "태반 세포를 수집 및 보존하기 위한 개선된 조성물 및 상기 조성물의 이용 방법")에 기재된 바와 같이 세포자멸 억제제, 괴사 억제제 및/또는 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함하는 조성물을 이용하여 보존할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 줄기 세포 집단을 세포자멸 억제제 및 산소-운반 퍼플루오로카본을 포함하는 줄기 세포 수집 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 줄기 세포 집단의 보존 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 세포자멸 억제제는 세포자멸 억제제와 접촉되지 않은 줄기 세포 집단에 비해 줄기 세포 집단 내에서 세포자멸을 감소 또는 방지하기 위해 충분한 양으로 충분한 시간 동안 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제는 카스파제 억제제이다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제는 JNK 억제제이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기 세포의 분화 또는 증식을 조정하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 상기 세포자멸 억제제 및 상기 산소-운반 퍼플루오로카본을 별개의 상 내에 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포 수집 조성물은 상기 세포자멸 억제제 및 상기 산소-운반 퍼플루오로카본을 에멀젼 내에 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 에멀젼화제, 예를 들어 레시틴을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제 및 상기 퍼플루오로카본은 줄기 세포 접촉 시간에 약 0℃ 내지 약 25℃이다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 세포자멸 억제제 및 상기 퍼플루오로카본은 줄기 세포 접촉 시간에 약 2℃ 내지 10℃ 또는 약 2℃ 내지 약 5℃이다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 수송 동안 수행된다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 접촉은 상기 세포 집단의 냉동 및 해동 동안 수행된다.
또다른 실시양태에서, 태반 세포의 집단은 상기 줄기 세포 집단을 세포자멸 억제제 및 장기-보존 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 보존될 수 있고, 여기서 상기 세포자멸 억제제는 세포자멸 억제제와 접촉되지 않은 줄기 세포 집단에 비해 줄기 세포 집단 내에서 세포자멸을 감소 또는 방지하기 위해 충분한 양으로 충분한 시간 동안 존재한다. 구체적인 실시양태에서, 장기-보존 화합물은 UW 용액 (미국 특허 제4,798,824호에 기재됨; ViaSpan이라고도 공지됨; 또한 문헌 [Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)] 참조) 또는 스턴(Stern) 등의 미국 특허 제5,552,267호에 기재된 용액이다. 또다른 실시양태에서, 상기 장기-보존 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산, 라피노스 또는 이들의 조합물이다. 또다른 실시양태에서, 세포 수집 조성물은 산소-운반 퍼플루오로카본을 2개의 상 내에 또는 에멀젼으로서 추가로 포함한다.
상기 방법의 또다른 실시양태에서, 태반 세포는 관류 동안 세포자멸 억제제 및 산소-운반 퍼플루오로카본, 장기-보존 화합물, 또는 이들의 조합물을 포함하는 세포 수집 조성물과 접촉된다. 또다른 실시양태에서, 상기 줄기 세포는 조직 파괴, 예를 들어 효소 소화의 과정 동안 접촉된다. 또다른 실시양태에서, 태반 세포는 관류에 의한 수집 후에, 또는 조직 파괴, 예를 들어 효소 소화에 의한 수집 후에 상기 줄기 세포 수집 조성물과 접촉된다.
전형적으로, 태반 세포의 수집, 풍부화 및 단리 동안, 저산소증 및 기계적 스트레스로 인한 세포 스트레스를 최소화 또는 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 방법의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포 또는 줄기 세포 집단은 상기 보존 동안 6시간 미만 동안의 수집, 풍부화 또는 단리 동안 저산소 조건에 노출되고, 여기서 저산소 조건은 예를 들어 정상적인 혈액 산소 농도 미만인 산소 농도이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포의 집단은 상기 보존 동안 2시간 미만 동안 상기 저산소 조건에 노출된다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포의 집단은 1시간 미만 또는 30분 미만 동안 상기 저산소 조건에 노출되거나, 수집, 풍부화 또는 단리 동안 저산소 조건에 노출되지 않는다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 줄기 세포 집단은 수집, 풍부화 또는 단리 동안 전단 스트레스에 노출되지 않는다.
본원에 기재된 태반 세포는 예를 들어 작은 용기, 예를 들어 앰플 내에서 냉동보존 배지 내에서 냉동보존될 수 있다. 적합한 냉동보존 배지는 배양 배지, 예를 들어 성장 배지, 또는 세포 동결 배지, 예를 들어 상업적으로 이용가능한 세포 동결 배지, 예를 들어 C2695, C2639 또는 C6039 (시그마)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 냉동보존 배지는 바람직하게는 DMSO (디메틸술폭시드)를 예를 들어 약 10％ (v/v)의 농도로 포함한다. 냉동보존 배지는 추가의 물질, 예를 들어 플라스말라이트 (Plasmalyte), 메틸셀룰로스 (글리세롤과 함께 또는 글리세롤 없이)를 포함할 수 있다. 태반 세포는 바람직하게는 냉동보존 동안 약 1℃/분으로 냉각된다. 바람직한 냉동보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 냉동보존된 세포는 사용을 위해 해동 전에 액체 질소로 이송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 앰플이 약 -90℃에 도달하면 이들은 액체 질소 저장 구역으로 이송된다. 냉동보존된 세포는 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동된다.
5.9 태반 세포의 용도
5.9.1 태반 세포를 포함하는 조성물
본원에 제공된 면역억제 방법은 태반 세포, 또는 그로부터의 생체분자를 포함하는 조성물을 사용할 수 있다. 동일 방식으로, 본원에 제공된 태반 세포의 다수 및 집단은 임의의 생리적으로-허용되는 또는 의학적으로-허용되는 화합물, 조성물 또는 예를 들어 조사 또는 치료에 사용하기 위한 장치와 조합될 수 있다.
5.9.1.1 냉동보존된 태반 세포
본원에 기재된 면역억제 태반 세포 및 세포의 집단은 이후의 사용을 위해 보존, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 세포, 예컨대 줄기 세포의 냉동보존을 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 태반 세포 집단은 개체에 용이하게 투여가능한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어 본원에 기재된 태반 세포 또는 태반 세포의 집단은 의학적 사용에 적합한 용기 내에 함유될 수 있다. 이러한 용기는, 예를 들어 멸균 플라스틱 백, 플라스크, 병, 또는 태반 세포 집단을 용이하게 투입할 수 있는 다른 용기일 수 있다. 예를 들어 용기는 혈액 백 또는 수용자로의 액체의 정맥내 투여에 적합한 다른 의학적으로-허용되는 플라스틱 백일 수 있다. 용기는 바람직하게는 조합된 줄기 세포 집단의 냉동보존을 허용하는 것이다.
냉동보존된 면역억제 태반 세포 집단은 단일 공여자 또는 다중 공여자로부터 유도된 태반 세포를 포함할 수 있다. 태반 세포 집단은 의도된 수용자에 완전히 HLA-매치되거나, 또는 부분적으로 HLA-미스매치되거나 완전히 HLA-미스매치될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 용기 내에 면역억제 태반 세포 집단을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 줄기 세포 집단은 냉동보존된다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 용기는 백, 플라스크, 또는 병이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 백은 멸균 플라스틱 백이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 백은 상기 태반 세포 집단의 정맥내 투여에 적합하거나, 이를 허용하거나 용이하게 한다. 백은 투여 전 또는 중에 태반 세포 및 1종 이상의 다른 용액, 예를 들어 약물의 혼합을 허용하도록 상호연결된 다중 내강 또는 구획을 포함할 수 있다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 조합된 줄기 세포 집단의 냉동보존을 용이하게 하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포 집단은 생리적으로-허용되는 수용액 내에 함유된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 생리적으로-허용되는 수용액은 0.9％ NaCl 용액이다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포 집단은 상기 줄기 세포 집단의 수용자에 HLA-매치된 태반 세포를 포함한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 조합된 줄기 세포 집단은 상기 줄기 세포 집단의 수용자에 적어도 부분적으로 HLA-미스매치된 태반 세포를 포함한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 태반 세포는 복수개의 공여자로부터 유도된다.
5.9.1.2 제약 조성물
태반 세포의 면역억제 집단 또는 태반 세포를 포함하는 세포의 집단은 생체내 사용을 위해 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 생체내 투여를 위하여 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 염수 용액 또는 다른 허용되는 생리적-허용 용액 내에 태반 세포의 집단 또는 태반 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함한다. 본원에 제공된 제약 조성물은 본원의 다른 곳에 기재된 임의의 태반 세포 집단 또는 태반 세포 유형을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 태아, 모체, 또는 태아 및 모체 태반 세포 둘 다를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 제약 조성물은 단일 개체 또는 태반, 또는 복수개의 개체 또는 태반으로부터 수득된 태반 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 제약 조성물은 임의의 면역억제성 수의 태반 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 태반 세포의 단일 단위 투여는 약 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 또는 그 이상의 태반 세포 또는 그 이상 또는 이하의 태반 세포를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 제약 조성물은 50％ 살아있는(viable) 세포 또는 그 이상 (즉, 집단에서 세포의 적어도 50％가 기능적이거나 생존함)을 포함하는 세포의 집단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 집단에서 세포의 적어도 60％가 살아있다. 보다 바람직하게는, 제약 조성물에서 집단에서 세포의 적어도 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 99％가 살아있다.
본원에 제공된 제약 조성물은 예를 들어 생착을 용이하게 하는 하나 이상의 화합물 (예를 들어 항-T-세포 수용체 항체, 면역억제제 등); 안정화제, 예컨대 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 히드록시에틸 전분 등을 포함할 수 있다.
5.9.1.3 태반 세포 조건화 배지
본원에 제공된 태반 세포를 사용하여 면역억제성인 조건화된 배지, 즉, 복수개의 하나 이상의 유형의 면역 세포에 대해 검출가능한 면역억제 효과를 갖는 줄기 세포에 의해 분비되거나 배설되는 하나 이상의 생체분자를 포함하는 배지를 생성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 조건화된 배지는 태반 세포가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상의 날 동안 성장한 배지를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조건화된 배지는 태반 세포가 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 전면성장, 또는 100％까지의 전면성장으로 성장한 배지를 포함한다. 이러한 조건화된 배지를 사용하여 태반 세포, 또는 또다른 종류의 줄기 세포의 별개의 집단의 배양을 뒷받침할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 조건화된 배지는 태반 세포가 성인 세포 유형으로 분화된 배지를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조건화된 배지는 태반 세포 및 비-태반 세포가 배양된 배지를 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 태반 세포는 (a) 기재에 부착하고; (b) CD200을 발현하고 HLA-G를 발현하지 않거나, CD73, CD105, 및 CD200을 발현하거나, CD200 및 OCT-4을 발현하거나, CD73 및 CD105를 발현하고 HLA-G를 발현하지 않거나, CD73 및 CD105를 발현하고, 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아양 유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양 유사체의 형성을 용이하게 하거나, OCT-4를 발현하고 태반 세포를 포함하는 태반 세포의 집단이 배아양 유사체의 형성을 허용하는 조건하에 배양되는 경우, 상기 집단에서 하나 이상의 배아양 유사체의 형성을 용이하게 하고; (c) MLR 검정에서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 증식을 검출가능하게 저해하며, 여기서 상기 태반 세포 배양은 24시간 이상 동안 상기 배지에서 배양된 것인, 태반 세포의 배양으로부터의 배양 배지를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 구체적인 실시양태에서, 조성물은 복수개의 상기 태반 세포를 추가로 포함한다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 복수개의 비-태반 세포를 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 비-태반 세포는 CD34+ 세포, 예를 들어 조혈 전구 세포, 예컨대 말초혈 조혈 전구 세포, 제대혈 조혈 전구 세포, 또는 태반 혈액 조혈 전구 세포를 포함한다. 비-태반 세포는 또한 다른 줄기 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포, 예를 들어 골수-유래 중간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다. 비-태반 세포는 또한 하나 이상의 유형의 성인 세포 또는 세포주를 포함할 수 있다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 조성물은 항증식제, 예를 들어 항-MIP-1α 또는 항-MIP-1β 항체를 포함한다.
5.9.1.4 태반 세포를 포함하는 매트릭스
추가로, 면역억제 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 (예를 들어 PDAC)의 면역억제 집단을 포함하는 매트릭스, 히드로겔, 스캐폴드 등이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 태반 세포는 천연 매트릭스, 예를 들어 태반 생체물질, 예컨대 양모 막 물질에 접종될 수 있다. 이러한 양모 막 물질은 예를 들어 포유동물 태반으로부터 직접적으로 해부된 양모막; 고정된 또는 열-처리된 양모막, 실질적으로 건조한 (즉, <20％ H2O) 양모막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양모막 및 융모막 등일 수 있다. 태반 세포가 접종될 수 있는 바람직한 태반 생체물질은 해리리(Hariri)의 미국 출원 공개 제2004/0048796호에 기재되어 있다.
본원에 제공된 태반 세포는 예를 들어 주사에 적합한 히드로겔 용액 중에 현탁될 수 있다. 이러한 조성물에 적합한 히드로겔은 자가-결집 펩티드, 예컨대 RAD16을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포를 포함하는 히드로겔 용액은 예를 들어 몰드에서 경화되게 하여 이식을 위해 거기에 분산된 세포를 갖는 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 매트릭스 내의 태반 세포는 또한 세포가 이식 전 유사분열로 증식되도록 배양될 수 있다. 히드로겔은 예를 들어 겔을 형성하기 위해 물 분자를 가두는 3차원 오픈-격자 구조를 생성하도록 공유, 이온성, 또는 수소 결합을 통해 가교된 유기 중합체 (천연 또는 합성)이다. 히드로겔-형성 물질은 폴리사카라이드 예컨대 알기네이트 및 그의 염, 펩티드, 폴리포스파진, 및 폴리아크릴레이트 (이온적으로 가교된 것), 또는 블록 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블럭 공중합체 (각각 온도 또는 pH에 의해 가교된 것)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히드로겔 또는 매트릭스는 생분해성이다.
일부 실시양태에서, 제제는 계내 중합가능한 겔을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 출원 공개 2002/0022676; [Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3):199-209 (2002)]; [Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)] 참조).
일부 실시양태에서, 중합체는 대전된 사이드 기, 또는 그의 1가 이온성 염을 갖는 수용액, 예컨대 물, 완충된 염 용액, 또는 수성 알콜 용액에 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 사이드 기를 갖는 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산 및 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 술폰화된 중합체, 예컨대 술폰화된 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산 및 비닐 에테르 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성되는 산성 사이드 기를 갖는 공중합체를 또한 사용할 수 있다. 산성 기의 예는 카르복실산 기, 술폰산 기, 할로겐화된 (바람직하게는 플루오르화된) 알콜 기, 페놀성 OH 기, 및 산성 OH 기이다.
태반 세포 또는 그의 공배양물은 3차원 프레임워크 또는 스캐폴드 상에 접종되고, 생체내 이식될 수 있다. 이러한 프레임워크는 임의의 하나 이상의 성장 인자, 세포, 약물 또는 조직 형성을 자극하거나 본원의 다른 곳에 기재된 치료 방법의 실행을 달리 증진 또는 개선시키는 다른 성분과 조합하여 이식될 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법에 사용될 수 있는 스캐폴드의 예는 부직포 매트, 다공성 폼, 또는 자가 결집 펩티드를 포함한다. 부직포 매트는 글리콜산 및 락트산의 합성 흡수성 공중합체로 이루어진 섬유 (예를 들어 PGA/PLA) (비크릴(VICRYL), 에티콘, 인크.(Ethicon, Inc.), 미국 뉴저지주 소머빌)를 이용하여 형성할 수 있다. 냉동-건조, 또는 동결건조와 같은 방법 (예를 들어 미국 특허 번호 제6,355,699호 참조)으로 형성된 예를 들어 폴리(ε-카프로락톤)/폴리(글리콜산) (PCL/PGA) 공중합체로 이루어진 폼을 또한 스캐폴드로서 사용할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 스캐폴드는 나노섬유성 스캐폴드, 예를 들어 전기방사 나노섬유성 스캐폴드이거나 또는 이를 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 나노섬유성 스캐폴드는 폴리(L-락트산) (PLLA), 제I형 콜라겐, 비닐리덴 플루오라이드 및 트리플루오로에틸렌 (PVDF-TrFE)의 공중합체, 폴리(-카프로락톤), 폴리(L-락타이드-코-ε-카프로락톤) [P(LLA-CL)] (예를 들어 75:25), 및/또는 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시발레레이트) (PHBV) 및 제I형 콜라겐의 공중합체를 포함한다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 스캐폴드는 태반 세포의 연골세포로의 분화를 촉진시킨다. 나노섬유성 스캐폴드, 예를 들어 전기방사 나노섬유성 스캐폴드의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Xu et al., Tissue Engineering 10(7):1160-1168 (2004)]; [Xu et al., Biomaterials 25:877-886 (20040; Meng et al., J. Biomaterials Sci., Polymer Edition 18(1):81-94 (2007)]을 참조한다.
본원에 기재된 태반 세포, 예를 들어 면역억제 태반 세포는 또한 모노-, 디-, 트리-, 알파-트리-, 베타-트리-, 및 테트라-칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 플루오로아파타이트, 칼슘 술페이트, 칼슘 플루오라이드, 칼슘 옥시드, 칼슘 카르보네이트, 마그네슘 칼슘 포스페이트, 생물학적으로 활성인 유리, 예컨대 바이오글라스(BIOGLASS)®, 및 이것들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 생리적으로-허용되는 세라믹 물질 상에 접종되거나 이와 접촉할 수 있다. 현재 시판되는 다공성 생체적합성 세라믹 물질은 서지본(SURGIBONE)® (캔메디카 코퍼레이션(CanMedica Corp.), 캐나다), 엔도본(ENDOBON)® (머크 바이오머티리얼 프랑스(Merck Biomaterial France), 프랑스), 세로스(CEROS)® (매티스, 아게(Mathys, AG), 스위스 베트라흐), 및 광화 콜라겐 골 이식 제품, 예컨대 힐로스(HEALOS)™ (데퍼이, 인크.(DePuy, Inc.), 미국 매사추세츠주 레인햄) 및 비토스(VITOSS)®, 라코스(RHAKOSS)™, 및 코르토스(CORTOSS)® (오르토비타(Orthovita), 미국 펜실배니아주 말번)를 포함한다. 프레임워크는 천연 및/또는 합성 물질의 혼합물, 블렌드 또는 복합체일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 태반 세포는 펠트 상에 접종되거나 펠트와 접촉될 수 있고, 상기 펠트는 예를 들어 생흡수성 물질, 예컨대 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드, 또는 하이알루론산으로부터 제조된 멀티필라멘트 실로 이루어질 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본원에 기재된 태반 세포는 복합체 구조일 수 있는 폼 스캐폴드 상에 접종될 수 있다. 이러한 폼 스캐폴드는 유용한 모양, 예컨대 바디 내 특정 구조의 일부가 복구, 대체 또는 증가된 것으로 몰딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프레임워크는 세포 부착을 증진시키기 위하여 면역억제 태반 세포의 접종 전에, 예를 들어 0.1M 아세트산, 이후 폴리리신, PBS, 및/또는 콜라겐 중의 인큐베이션으로 처리한다. 매트릭스의 외부 표면은 예컨대 매트릭스를 혈장-코팅하거나, 하나 이상의 단백질 (예를 들어 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸 (예를 들어 헤파린 술페이트, 콘드로이틴-4-술페이트, 콘드로이틴-6-술페이트, 데르마탄 술페이트, 케라틴 술페이트 등), 세포 매트릭스, 및/또는 젤라틴, 알기네이트, 한천, 아가로스, 및 식물 검 등과 같은 (이에 제한되지 않는) 다른 물질을 첨가함으로써, 세포의 부착 또는 성장 및 조직의 분화를 개선시키기 위해 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 스캐폴드를 비-혈전형성성이 되게 하는 물질을 포함하거나 이로 처리된다. 이들 처리 및 물질은 또한 내피 성장, 이동, 및 세포외 매트릭스 침착을 촉진시키고 지속시킬 수 있다. 이들 물질 및 처리의 예는 천연 물질, 예컨대 기저막 단백질, 예컨대 라미닌 및 제IV형 콜라겐, 합성 물질, 예컨대 EPTFE, 및 세그먼트 폴리우레탄우레아 실리콘, 예컨대 퍼스판(PURSPAN)™ (더 폴리머 테크놀로지 그룹, 인크.(The Polymer Technology Group, Inc.), 미국 캘리포니아주 버클리)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 스캐폴드는 또한 항-혈전제, 예컨대 헤파린을 포함할 수 있으며, 스캐폴드는 또한 태반 세포를 접종하기 전에 표면 전하를 변경하도록 처리될 수 있다 (예를 들어 혈장으로 코팅).
5.9.2 유전자 변형된 태반 세포
또다른 측면에서, 예를 들어 관심있는 핵산 또는 폴리펩티드를 생산하기 위해 유전자 변형된 태반 세포가 본원에 제공된다. 유전자 변형은 예를 들어 비-통합성 복제 벡터, 예를 들어 유두종 바이러스 벡터, SV40 벡터, 아데노바이러스 벡터; 통합성 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터; 또는 복제-결함 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스-기반 벡터를 사용하여 달성할 수 있다. DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법은 리포좀, 전기천공, 입자 총, 직접적인 DNA 주사 등의 사용을 포함한다.
줄기 세포는 1종 이상의 적절한 발현 제어 요소, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, 내부 리보솜 진입 부위에 의해 제어되거나 그와 작동적으로 연관되는 DNA로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 DNA는 선별가능한 마커를 혼입한다. 외래 DNA의 도입 후에, 조작된 줄기 세포를 예를 들어 풍부한 배지 내에서 성장시킨 후, 선별 배지로 교체할 수 있다. 한 실시양태에서, 태반 세포를 조작하기 위해 사용되는 DNA는 관심있는 폴리펩티드, 예를 들어 시토카인, 성장 인자, 분화제 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
줄기 세포를 조작하기 위해 사용되는 DNA는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것으로 당업계에 공지된 임의의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어 프로모터는 CMV 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, 유두종 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르 바이러스 프로모터, 엘라스틴 유전자 프로모터 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구체적인 실시양태에서, 프로모터는 조절가능하여, 뉴클레오티드 서열이 원하는 경우에만 발현되도록 한다. 프로모터는 유도성 (예를 들어 메탈로티오네인 및 열 쇼크 단백질과 연관된 것) 또는 구성적일 수 있다.
또다른 구체적인 실시양태에서, 프로모터는 조직-특이적이거나 조직 특이성을 보인다. 이러한 프로모터의 예는 마이엘린 기초 단백질 유전자 제어 영역 (문헌 [Readhead et al., 1987, Cell 48:703]) (올리고덴드로사이트 세포); 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (문헌 [Swit et al., 1984, Cell 38:639]; [Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399]; [MacDonald, 1987, Hepatology 7:425]) (췌장 선포 세포); 인슐린 유전자 제어 영역 (문헌 [Hanahan, 1985, Nature 315:115]) (췌장 베타 세포); 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (문헌 [Shani, 1985, Nature 314:283]) (골격근)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
태반 세포는 하나 이상의 유전자의 발현을 "넉아웃" 또는 "넉다운"시키기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어 세포에 천연적인 유전자의 발현은 예를 들어 상동성 재조합에 의해 유전자를 완전히 불활성화시킴으로써 발현의 억제에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어 한 실시양태에서, 단백질의 중요한 영역을 코딩하는 엑손, 또는 그 영역에 5'인 엑손은 표적 유전자로부터 정상적인 mRNA의 생성을 방지하여 유전자를 불활성화시키는 양성 선별가능한 마커, 예를 들어 neo에 의해 차단될 수 있다. 유전자는 또한 유전자의 일부에 결실을 일으킴으로써 또는 전체 유전자를 결실시킴으로써 불활성화될 수 있다. 게놈 내에서 멀리 떨어져 있는 표적 유전자에 대한 2개의 상동성 영역을 갖는 구축물를 사용함으로써, 2개의 영역 사이에 개재하는 서열을 결실시킬 수 있다 (문헌 [Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084]). 또한, 줄기 세포에서 표적 유전자 활성 수준을 감소시키기 위해, 표적 유전자의 발현을 억제하는 안티센스, DNA자임 (DNAzyme), 작은 간섭 RNA 및 리보자임 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어 주조직적합성 유전자 복합체 (HLA)의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 분자는 면역 반응에 관하여 가장 다재다능한 것으로 나타났다. 삼중 나선 분자는 표적 유전자 활성의 수준을 감소시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [L.G. Davis et al. (eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn.]을 참조한다.
구체적인 실시양태에서, 태반 세포는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 유전자 변형될 수 있고, 여기서 관심있는 폴리펩티드의 발현은 외인성 인자, 예를 들어 폴리펩티드, 유기 소분자 등에 의해 제어가능하다. 이러한 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 관심있는 폴리펩티드는 IL-12 또는 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1Ra)이다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 관심있는 폴리펩티드는 인터류킨-1 수용체 길항제 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 융합체이고, 외인성 인자는 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트이다. 이러한 구축물은 메토트렉세이트와 접촉 시에 IL-1Ra, 또는 IL-1Ra 및 DHFR의 융합체를 발현하는 태반 세포의 조작에서 유용하다. 이러한 구축물은 예를 들어 류마티스 관절염의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, IL-1Ra 및 DHFR의 융합체는 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트에 노출 시에 번역상 상향조절된다. 따라서, 또다른 구체적인 실시양태에서, 태반 세포를 유전자 조작하기 위해 사용되는 핵산은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 상기 제1 및 제2 폴리펩티드는 외인성 인자의 존재 하에 번역상 상향조절되는 융합 단백질로서 발현된다. 폴리펩티드는 일시적으로 또는 장기간 (예를 들어 수 주 또는 수 개월에 걸쳐) 발현될 수 있다.
이러한 핵산 분자는 조작된 줄기 세포의 양성 선별을 허용하거나 조작된 줄기 세포의 가시화를 허용하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 또다른 보다 구체적인 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 적절한 가시화 조건 하에 형광성인 폴리펩티드, 예를 들어 루시퍼라제 (Luc)를 코딩한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc를 포함할 수 있고, 여기서 IRES는 내부 리보솜 진입 부위이다.
5.9.3 불멸화된 태반 세포주
포유동물 태반 세포는 성장-촉진 유전자, 즉, 성장-촉진 단백질의 생산 및/또는 활성이 외부 인자에 의해 제어가능하도록 적절한 조건 하에 형질감염된 세포의 성장을 촉진하는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 임의의 적합한 벡터를 사용하는 형질감염에 의해 조건부 불멸화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 성장-촉진 유전자는 종양유전자, 예를 들어 비제한적으로 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 큰 T 항원, 폴리오마 큰 T 항원, E1a 아데노바이러스 또는 인간 유두종바이러스의 E7 단백질이다.
성장-촉진 단백질의 외부 조절은 성장-촉진 유전자를 외부 조절가능한 프로모터, 예를 들어 그의 활성이 예를 들어 형질감염된 세포의 온도 또는 세포와 접촉하는 배지의 조성을 변형함으로써 제어될 수 있는 프로모터의 제어 하에 놓음으로써 달성할 수 있다. 한 실시양태에서, 테트라사이클린 (tet)-제어된 유전자 발현 시스템을 사용할 수 있다 (문헌 [Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992]; [Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996] 참조). tet의 부재 하에, 상기 벡터 내에서 tet-제어된 전사활성인자 (tTA)는 phCMV *-1 (tet 오퍼레이터 서열에 융합된 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 최소 프로모터)로부터의 전사를 강하게 활성화시킨다. tTA는 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)의 트랜스포손-10-유래 tet 내성 오페론의 레프레서 (tetR) 및 단순 포진 바이러스의 VP16의 산성 도메인의 융합 단백질이다. 낮은 비-독성 농도의 tet (예를 들어 0.01-1.0 ㎍/mL)는 tTA에 의한 전사활성화를 거의 완전히 폐지한다.
한 실시양태에서, 벡터는 선별가능한 마커, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 함유한다. 박테리아 네오마이신 내성 유전자 (neoR)가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 하나의 이러한 마커이다. neoR를 보유하는 세포는 당업자에게 공지된 수단, 예컨대 성장 배지에 예를 들어 100-200 ㎍/mL G418의 첨가에 의해 선별할 수 있다.
형질감염은 레트로바이러스 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 수단에 의해 달성할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물은 벡터에 대한 생산자 세포주로부터 수집된 조건화된 배지 및 N2 보충물 함유 DMEM/F12의 혼합물과의 인큐베이션에 의해 형질감염될 수 있다. 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 제조된 태반 세포 배양물은 1 부피의 조건화된 배지 및 2 부피의 N2 보충물 함유 DMEM/F12 중에서 약 20시간 동안 인큐베이션에 의해 시험관내에서 예를 들어 5일 후에 감염될 수 있다. 이어서, 선별가능한 마커를 보유하는 형질감염된 세포를 상기 기재된 바와 같이 선별할 수 있다.
형질감염 후에, 배양액은 증식을 허용하는, 예를 들어 적어도 30％의 세포가 24시간 기간 내에 배가하도록 허용하는 표면 상에 계대배양한다. 바람직하게는, 기재는 폴리오르니틴 (10 ㎍/mL) 및/또는 라미닌 (10 ㎍/mL)으로 코팅된 조직 배양 플라스틱으로 이루어지는 폴리오르니틴/라미닌 기재, 폴리리신/라미닌 기재 또는 피브로넥틴으로 처리된 표면이다. 이어서, 배양액에 3-4일마다 1종 이상의 증식 증진 인자를 보충하거나 보충하지 않을 수 있는 성장 배지를 공급한다. 증식 증진 인자는 배양액이 50％ 전면성장 미만일 때 성장 배지에 첨가될 수 있다.
조건부-불멸화된 태반 세포주는 80-95％ 전면성장일 때 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 트립신 처리에 의해 계대배양시킬 수 있다. 대략 제20회 계대배양까지, 일부 실시양태에서 선별을 유지하는 것이 유익하다 (예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 세포에 대해 G418을 첨가함으로써). 세포는 또한 장기간 저장을 위해 액체 질소 내에 동결시킬 수 있다.
클로날 세포주는 상기 기재된 바와 같이 제조된 조건부-불멸화된 인간 태반 세포주로부터 단리될 수 있다. 일반적으로, 이러한 클로날 세포주는 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 제한 희석에 의해 또는 클로닝 링(cloning ring)을 사용하여 단리하고 증식할 수 있다. 클로날 세포주는 일반적으로 상기 설명된 바와 같이 공급되고 계대배양될 수 있다.
클로날일 수 있지만 반드시 그러할 필요는 없는 조건부-불멸화된 인간 태반 세포주는 일반적으로 분화를 용이하게 하는 배양 조건 하에 성장-촉진 단백질의 생성 및/또는 활성을 저해함으로써 분화하도록 유도될 수 있다. 예를 들어 성장-촉진 단백질을 코딩하는 유전자가 외부에서 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있으면, 성장-촉진 유전자의 전사를 억제하도록 조건, 예를 들어 배지의 온도 또는 조성을 변경시킬 수 있다. 상기 논의된 테트라사이클린-제어된 유전자 발현 시스템에 있어서, 테트라사이클린의 첨가에 의해 분화를 달성하여 성장-촉진 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 일반적으로, 분화를 개시하기 위해 4-5일 동안 1 ㎍/mL 테트라사이클린이 충분하다. 추가의 분화를 촉진하기 위해, 추가의 물질을 성장 배지 내에 포함시킬 수 있다.
5.9.4 검정
태반 세포는 줄기 세포 증식, 증대, 및/또는 분화에 대한, 배양 조건, 환경적 인자, 분자 (예를 들어 생체분자, 소 무기 분자 등) 등의 영향을 이러한 조건에 노출되지 않은 태반 세포에 대비하여 결정하기 위한 검정에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 태반 세포를 분자와 접촉시 증식, 증대 또는 분화에서의 변화에 대해 평가할 수 있다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 증식을 허용하는 조건하에 복수개의 줄기 세포를 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 복수개의 태반 세포의 증식을 조정하는 화합물을 확인하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 화합물이 상기 화합물과 접촉되지 않은 복수개의 줄기 세포에 비해 상기 복수개의 줄기 세포의 증식에서 검출가능한 변화를 유발한다면, 상기 화합물은 태반 세포의 증식을 조정하는 화합물로서 확인된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 증식의 억제제로서 확인된다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 증식의 인핸서로서 확인된다.
또다른 실시양태에서, 증대를 허용하는 조건하에 복수개의 줄기 세포를 화합물과 접촉시키는 것을 포함하여, 복수개의 태반 세포의 증대를 조정하는 화합물을 확인할 수 있으며, 여기서 상기 화합물이 상기 화합물과 접촉되지 않은 복수개의 줄기 세포에 비해 상기 복수개의 줄기 세포의 증대에서 검출가능한 변화를 유발한다면, 상기 화합물은 태반 세포의 증대를 조정하는 화합물로서 확인된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 증대의 억제제로서 확인된다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 증대의 인핸서로서 확인된다.
또다른 실시양태에서, 분화를 허용하는 조건하에 줄기 세포를 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해, 태반 세포의 분화를 조정하는 화합물을 확인할 수 있으며, 여기서 상기 화합물이 상기 화합물과 접촉되지 않은 줄기 세포에 비해 상기 줄기 세포의 분화에서 검출가능한 변화를 유발한다면, 상기 화합물은 태반 세포의 증식을 조정하는 화합물로서 확인된다. 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 분화의 억제제로서 확인된다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 분화의 인핸서로서 확인된다.
5.9.5 태반 세포 은행
산후 태반으로부터 얻은 줄기 세포는 한 세트의 로트 (예를 들어 한 세트의 개별적으로-투여가능한 용량)의 태반 세포를 생성하기 위하여 수많은 상이한 방법으로 배양될 수 있다. 이러한 로트는 예를 들어 태반 관류액 또는 효소-소화된 태반 조직으로부터의 줄기 세포로부터 수득될 수 있다. 복수개의 태반으로부터 수득된 태반 세포의 로트의 세트는 예를 들어 장기 저장을 위하여 태반 세포의 은행에 배열될 수 있다. 일반적으로, 부착성 줄기 세포는 태반 물질의 초기 배양으로부터 수득되어 접종 배양물을 형성하고, 이는 대략 동일한 수의 배가로부터 세포의 집단을 형성하는 제어된 조건 하에서 증식된다. 로트는 바람직하게는 단일 태반의 조직으로부터 유도되나, 복수개의 태반의 조직으로부터 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 줄기 세포 로트는 다음과 같이 수득된다. 태반 조직을 먼저 예를 들어 다짐으로써 파괴시키고, 적합한 효소, 예를 들어 콜라게나제 (단락 5.3.3 참조)로 소화시킨다. 태반 조직은 바람직하게는, 예를 들어 단일 태반으로부터의 전체 양막, 전체 융모막 또는 둘 다를 포함하나, 양막 또는 융모막 중 하나의 일부만을 포함할 수 있다. 소화된 조직을 예를 들어 약 1-3 주, 바람직하게는 약 2 주 동안 배양한다. 비-부착 세포의 제거 후, 형성된 고-밀도 콜로니를 예를 들어 트립신 처리로 수집한다. 이들 세포를 수집하고, 편리한 부피의 배양 배지 중에 재현탁하고, 그 후 증식 배양물을 접종하기 위해 사용한다. 증식 배양물은 별개의 세포 배양 기구, 예를 들어 NUNC™의 셀 팩토리(Cell Factory)의 임의의 배열일 수 있다. 세포는 예를 들어 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104, 또는 10 x 104개 줄기 세포/cm2로 증식 배양물을 접종하도록 임의의 정도로 세분될 수 있다. 바람직하게는, 약 1 x 103 내지 약 1 x 104개 세포/cm2를 사용하여 각각의 증식 배양물을 접종한다. 증식 배양물의 수는 줄기 세포를 수득하는 특정 태반(들)에 따라 수적으로 더 크거나 적을 수 있다.
증식 배양물은 배양 중인 세포의 밀도가 특정 값, 예를 들어 약 1 x 105개 세포/cm2에 도달할 때까지 성장한다. 세포는 이 시점에 수집 및 냉동보존되거나, 상기 기재된 바와 같이 새로운 증식 배양물로 계대배양된다. 세포는 사용 전에, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 회 계대배양될 수 있다. 집단 배가의 누적 수의 기록을 증식 배양(들) 동안 유지하는 것이 바람직하다. 배양으로부터 얻은 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 또는 40 배가, 또는 60 이하의 배가 동안 증식될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 세포의 집단을 개별 용량으로 나누기 전 집단 배가의 수는 약 15 내지 약 30이다. 세포는 증식 과정 전반에 걸쳐 연속적으로 배양될 수 있거나, 증식 동안 하나 이상의 시점에서 동결될 수 있다.
개별 용량에 사용될 세포는 이후의 사용을 위해 동결, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 개별 용량은 예를 들어 ml 당 약 1 백만 내지 약 50 백만 개의 세포를 포함할 수 있고, 총 약 106 내지 약 1010 개의 세포를 포함할 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 태반 줄기 세포 은행은 제1 복수개의 집단 배가를 위해 인간 산후 태반으로부터의 초대 배양 태반 줄기 세포를 증식시키고; 상기 태반 줄기 세포를 냉동보존하여 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank)를 형성하고; 제2 복수개의 집단 배가를 위하여 마스터 셀 뱅크로부터의 복수개의 태반 줄기 세포를 증식시키고; 상기 태반 줄기 세포를 냉동보존하여 워킹 셀 뱅크(Working Cell Bank)를 형성하고; 제3 복수개의 집단 배가를 위하여 워킹 셀 뱅크로부터의 복수개의 태반 줄기 세포를 증식시키고; 상기 태반 줄기 세포를 개별 용량으로 냉동보존하는 것을 포함하며, 여기서 상기 개별 용량은 집합적으로 태반 줄기 세포 은행을 구성하는 것인 방법으로 제조할 수 있다. 임의로, 상기 제3 복수개의 집단 배가로부터 얻은 복수개의 태반 세포는 제4 복수개의 집단 배가를 위해 증식되거나 개별 용량으로 냉동보존될 수 있다. 여기서 상기 개별 용량은 집합적으로 태반 줄기 세포 은행을 구성한다.
한 실시양태에서, 세포는 플라스말라이트(Plasmalyte) 중의 10％ DMSO, 10％ 인간 혈청 알부민 (HSA) 중에 약 2 백만개/ml로 희석된다.
바람직한 실시양태에서, 태반이 얻어지는 공여자 (예를 들어 모체)를 적어도 하나의 병원체에 대해 시험한다. 모체가 시험된 병원체에 대해 양성으로 시험된 경우, 태반으로부터의 전체 로트를 폐기한다. 이러한 시험은 계대배양 0 세포의 확립 전 또는 후를 비롯하여 태반 세포 로트의 생성 동안 또는 증식 배양 동안의 임의의 시점에 수행할 수 있다. 존재를 시험하는 병원체는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (I형 및 II형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스바이러스 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
6. 실시예
6.1 실시예 1: 태반 세포를 이용한 면역조절
태반 세포, 예를 들어 태반 줄기 세포 (PDAC)는 T 세포 및 천연 킬러 세포의 증식 저해를 비롯하여 면역조절 효과를 갖는다. 하기 실험은 태반 세포 (CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포)가 자극에 대한 T 세포의 반응을 조정하는 능력을 가짐을 입증한다.
6.1. 1 IFN -γ 유도성 가용성 메카니즘을 통해 매개되는 T 세포 증식의 PDAC 저해
PDAC가 T 세포 증식을 저해하는 지, 그리고 이러한 저해가 세포 접촉 또는 가용성 인자 매개 메카니즘에 대해 세포에 의해 매개되는지의 여부를 다루기 위하여, BTR (항-CD3, 항-CD28-코팅된 다이나비드(Dynabead)에 의해 자극된 T 세포) 및 PDAC 또는 24시간 동안 500 또는 100 유닛/mL의 IFN-γ로 예비-처리된 PDAC의 공배양물을 세포를 세포 접촉시키게 하는 공동배양 또는 T 세포:PDAC 비율이 10:1인 트랜스웰 시스템에 세팅하였다.
비드 T-림프구 반응 (BTR)은 20,000개 PDAC의 존재 또는 부재하에 96웰 플레이트의 웰에서 1:3의 비드:T-림프구 비율로 100,000개 T-림프구를 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 다이나비즈(DynaBeads) (인비트로겐)와 혼합함으로써 수행하였다. 혼합된 세포 배양물을 37℃, 5％ CO2, 및 90％ 상대 습도에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 6일째에, 모든 세포를 회수하고, 항-CD4-PE 및 항-CD8 APC (R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스)로 염색하였다.
PDAC에 의한 BTR의 저해는 세포-세포 접촉 및 트랜스웰 조건 둘 다 하에서 관찰되었고, 이는 저해가 가용성 인자에 의해 적어도 부분적으로 매개됨을 시사하였다. PDAC를 IFN-γ로 예비-처리한 것은 BTR의 PDAC-매개 저해를 강하게 증진시켰다. IFN-γ 유도성 메카니즘을 통한 PDAC에 의한 T 세포 증식의 저해를 추가로 확인하기 위하여, 항-IFN-γ 중화 항체를 2, 8, 16 또는 32 ㎍/ml로 PDAC 및 AbTR (가용성 항-CD3 및 항-CD28에 의해 자극된 PBMC)의 공배양물에 도입하였다. 항-IFN-γ 항체는 약 2 ㎍/ml의 ED50으로 용량 의존적 방식으로 PDAC-매개 저해로부터 T 세포 증식을 구제하였다. 따라서, 활성화된 T 세포 증식의 PDAC 면역억제는 IFN-γ에 의해 매개된다.
6.1.2 PDAC는 T REG 세포를 유도한다.
실시예는 태반 세포 (PDAC)가 T 세포의 Treg 세포 (저해자 T 세포로도 공지됨)로의 분화를 유도하는 능력을 가지며, 이는 다른 T 세포의 활성을 하향조절할 수 있음을 입증한다.
미접촉(naive) CD4+ T 세포는 국부 시토카인 환경에 따라 Th1, Th2, Th17 및 조절성 (Treg) 표현형으로 분화하도록 유도될 수 있다. Treg 세포는 자가-항원에 대한 면역 허용성을 조절한다. Th17 또는 Th1 표현형을 향한, 및 Treg 표현형으로부터 멀어지는 반응의 스큐잉(skewing)은 특정 자가면역 질환 및/또는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)의 발전 및/또는 진행에 책임이 있을 수 있다.
유도된 Treg 세포는 표현형 FoxP3+ (포크헤드 박스 P3+)을 갖는다. 따라서, Treg 세포에서 FoxP3의 발현에 대한 PDAC의 효과를 조사하였다. 인터류킨-2 (IL-2; 300 IU/mL) 및 IL-15 (125 IU/mL)의 존재하에, 말초혈 세포 (PBMC) 단독으로, PBMC + PDAC를 1:1000의 비율로, 또는 PBMC를 4일 동안 배양하였다. 이어서, PBMC의 샘플을 CD25 및 FoxP3에 대해 면역염색하였다. 각각의 조건에서 PBMC로부터의 CD4+ T 세포를 항-CD4 항체로 코팅된 마이크로비드를 이용하여 단리하였다. 단리된 T 세포를 10 ㎍/mL 미토마이신 C로 2시간 동안 37℃에서 처리하고, 1:1, 1:10 및 1:100의 비율로 신선하게-단리된 T 세포의 증식에 대한 그의 효과에 대해 시험하였다. PDAC와 공배양된 PBMC는 FoxP3+ 표현형을 나타내는 CD4+ 세포의 백분율이 더 높음을 입증하였고, 이는 Treg 세포의 수가 더 높음을 암시한다.
결론: PBMC와 공배양된 PDAC는 T 세포가 Treg 표현형을 갖는 세포로 분화하도록 유도하였고, 이러한 세포는 T 세포 증식을 저해하하는 능력을 갖는다.
6.1. 3 T 세포 증식의 PDAC 매개 저해는 인돌아민 2,3- 디옥시게나제 (IDO)를 통한다
본 실시예는 PDAC T 세포 면역억제가 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 활성을 통해 매개됨을 입증한다.
상기 확립된 바와 같이, PDAC는 T 세포와 공배양될 때, T 세포 증식을 저해한다. T 세포 증식의 PDAC-매개 저해의 작용 메카니즘을 조사하기 위하여, 약리 억제제 또는 중화 항체를 사용하여, 시험관내 T 세포 증식 검정 (BTR)에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 유도성 산화질소 신타제 (iNOS), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터류킨-10 (IL-10) 및 IDO의 활성을 차단하였다. PGE2, iNOS, TGF-베타 및 IL-10 활성을 차단함으로써 T 세포 증식의 복구 없음이 발견되었다. 그러나, T 세포 증식 검정에 IDO 억제제 1 MT (1-메틸 트립토판)을 16, 64, 128 및 256 μM로 첨가함으로써 용량-의존적 방식으로 T 세포 증식의 복구가 얻어졌다.
T 세포 증식에는 트립토판이 요구된다. 시험관내 T 세포 증식의 PDAC-매개 저해가 IDO에 의해 매개됨을 확인하기 위하여, 16, 64, 128 및 256 μM의 1 MT 및 과량의 L-트립토판 (L-Trp)을 T 세포 증식 검정에 도입하였다. 256 μM 1 MT 및 256 μM L-Trp은 실질적으로 용량 의존적 방식으로 PDAC-매개 저해로부터 T 세포 증식을 구제하였다.
또다른 실험에서, IDO 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 대조군 siRNA를 PDAC로 형질감염시켜 IDO의 발현을 감소시켰다. 대조군 siRNA가 아니라 IDO siRNA로 형질감염된 PDAC가 BTR 검정에서 T 세포 증식의 저해를 실질적으로 폐지시켰다. 이러한 결과는 T 세포 증식의 PDAC 저해가 IDO에 의해 매개됨을 확인하였다.
6.1.4 L-시스템은 PDAC 매개된 면역억제에 요구된다.
L-시스템 수송자는 중성 분지 (발린, 류신, 이소류신) 및 방향족 (트립토판, 티로신) 아미노산을 우선적으로 수송하는 이종이량체 막 수송 단백질이다. L-시스템 수송자가 원형질막을 가로질러 IDO 기재 트립토판을 수송하기 때문에, L-시스템이 PDAC-매개 면역억제에 요구된다는 가설이 있었다. L-시스템 (LAT1)의 경쇄에 특이적인 SiRNA를 PDAC로 형질감염시키고, PDAC를 증식 검정에서 T 세포와 공배양하였다. 대조군 siRNA가 아닌 LAT1 특이적 siRNA가 PDAC의 존재하에 T 세포 증식을 복원시켰다. 이 결과는 L-시스템이 PDAC 매개된 면역억제에 요구됨을 시사한다.
6.1.5 T 세포 분화 및 시토카인 분비에 대한 PDAC의 효과
본 실시예는 태반 줄기 세포 (PDAC)가 Th1 및 Th17 하위세트로부터 멀어져서 Treg 하위세트로 향하는 T 세포 분화를 스큐잉함을 입증한다.
T 세포 구획에서의 스큐잉에 영향을 주는 PDAC의 능력을 PDAC를 비롯한 PMLR에서 시토카인 분비를 측정함으로써 조사하였다. Th1 하위세트의 마커인 IFN-γ의 생성은 MLR 단독에서의 T 세포 또는 단독 배양된 T 세포에 비해, MLR 중 PDAC와 공동배양된 T 세포에서 감소되었다 (약 50％). 이 결과는 PMLR에서의 T 세포 증식의 저해와 일치하였다. 별도의 실험에서, PMLR 중 PDAC의 존재는 또한 Th17 세포 (IL-17-발현 세포)의 백분율을 T 세포의 10.44％에서 4.68％로 감소시켰고, Treg 세포의 백분율을 8.34％에서 12.65％로 증가시켰다.
Th1 스큐잉의 PDAC-매개 저해의 작용에 대한 분자 메카니즘을 조사하기 위하여, IDO siRNA를 표준 기술에 의해 PDAC로 일시적으로 형질감염시켰다. Th1 스큐잉은 BTR 반응 (상기 참조)에 대한 것과 같이 수행하였으나, IL-2 (200 IU/mL), IL-12 (2 ng/mL) 및 항-IL-4 (0.4 ㎍/ml)를 함유하는 추가의 Th1 스큐잉 시토카인 칵테일로 보충하였다. IDO siRNA 형질감염은 Th1 스큐잉의 PDAC-매개 저해를 완전히 구제하였다. 확인차, IDO 억제제 1MT, 및 트립토판 과량도 또한 PDAC에 의해 저해된 Th1 스큐잉을 완전히 구제하였다.
PDAC에 의한 Th17 스큐잉의 저해가 가용성 인자를 통해 매개되는 지를 결정하기 위하여, PDAC 및 IL-1β로 처리된 PDAC로부터의 조건화 배지를 PDAC 배양의 1, 2 및 3일 째에 수집하고, T 세포가 Th17 하위세트로 정상적으로 분화되는 조건하에 T 세포의 배양에 첨가하였다. Th17 극성화 (스큐잉)를 위하여, 5 x 105개 총 T-림프구를 50,000개 PDAC의 존재 또는 부재 하에 6일 동안 5 x 105개의 분류된 CD14+ 단핵구, 50 ng/mL 항-CD3 항체 (비디 바이오사이언시즈), 및 100 ng/mL LPS (시그마 알드리치)로 자극하였다. Th17 세포 집단을 CD4 양성 집단에서 IL-17의 ICCS 염색으로 분석하였다.
PDAC 조건화 배지는 Th17 스큐잉을 저해하였고, IL-1β 처리의 첨가는 상기 저해 효과를 증진시켰다. 따라서, Th17 스큐잉의 PDAC-매개 저해는 가용성 인자에 의해 매개되고, IL-1β 처리는 이러한 효과를 증진시킨다.
IL-10 생산 T 세포 표현형의 PDAC-매개 유도는 미접촉 T 세포 Th1/Th2 계통 구속(commitment)의 스큐잉과는 관련되지 않는다. PDAC 공배양에 대한 반응에서 T 세포 시토카인 분비에 대한 관찰된 효과에 대한 조절 모드를 정의하기 위하여, IL-10 및 TNF mRNA의 정량적 PCR (qPCR) 분석을 PDAC/BTR 공배양물로부터 분류된 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 FACS에 의해 수행하였다. PDAC와 공배양된 T 세포에서 IL-10 mRNA의 강한 재현가능한 전사 유도가 관찰되었다.
IL-10의 관찰된 전사 조절은 T 세포와의 PDAC 공배양에 대해 반응하는 변경된 이펙터 T 세포 분화 패턴을 나타내며, 미접촉 T 세포의 Th1 계통 분화의 특이적 저해, 및/또는 Th2 계통 분화의 유도에 의해 설명될 수 있다. 상기 가능성을 다루기 위하여, Th1- 또는 Th2-극성화 조건에서 뿐만 아니라 비-극성화 조건에서 배양된 선택된 미접촉 CD4 T 세포에서의 Th1/Th2 분화 패턴에 대한 PDAC 효과를 모니터링하였다. 각각 Th1 및 Th2 계통 구속의 특이적 전사 마커인 T-bet (전사 인자) 및 GATA-3 mRNA의 상대적 발현 수준을 이용하여 PDAC와 함께 또는 PDAC 없이 BTR 배양으로부터 단리된 T 세포의 분화를 정량화하였다. 임의의 중성 또는 계통 특이적 배양 조건 하에서 Th1 또는 Th2 전사 인자에 대한 PDAC 공배양의 효과 없음이 관찰되었다. 따라서, PDAC에 의한 IL-10 생산 표현형의 전사 유도는 Th1/Th2 구속의 스큐잉에 의해 매개되지 않으며, 조절성 T 세포 개발의 별개의 분자 경로에 대한 PDAC의 효과와 일치하였다.
6.1.6 대식세포/단핵구 시토카인 프로파일에 대한 PDAC 효과
대략 50％ CD14+ 세포를 함유하는 PBMC로부터 수득된 세포의 부착성 집단을 단리하였다. 제2 CD14+ 세포 집단을 항-CD14 코팅된 MACS 비드를 이용한 양성 선택으로 수득하였다. 대식세포 및 단핵구 시토카인 분비 프로파일에 대한 PDAC 효과를 조사하기 위하여, 대식세포/단핵구를 LPS로 12시간 동안 처리한 후, 추가의 48시간 동안 PDAC와 공배양하였다. 상등액을 수집하고, 시토카인 및 성장 인자에 대하여 25-플렉스 루미넥스(Luminex) 검정으로 분석하였다. PDAC는 PBMC 부착성 집단과 공배양시, IL-1β, IL-8, RANTES 및 TNF-α의 생성을 저해하고, 리포폴리사카라이드 (LPS)-처리된 PBMC 부착성 세포에 의해 인터류킨-1 수용체 효능제 (IL-1Ra)의 생성을 증진시켰다. 대식세포 및 PDAC의 공배양은 IL-10의 유도 뿐 아니라 TNF-α의 저해에서 PDAC 세포 용량-의존적 반응을 생성하는 것으로 관찰되었다. IL-10 반응의 규모는 대식세포 공여자에 따라 더욱 변화하였다.
6.1.7 수지상 세포 성숙 및 기능에 대한 태반 줄기 세포의 효과
수지상 세포 (DC) 성숙 및 기능의 PDAC-매개 조정을 탐구하기 위하여, 단핵구 유도된 미성숙 DC를 LPS 단독으로 또는 LPS와 IFN-γ의 조합으로 처리하여 PDAC의 부재 또는 존재하에 DC 성숙 과정을 유도하였다. DC 성숙 마커 CD83, CD86 및 HLA-DR의 FACS 염색에 의해 DC 성숙을 분석하였다. IL-12의 세포내 염색 및 사이토메트릭 비드 어세이 (비디 파밍겐)에 의한 가용성 시토카인 생성의 측정으로 DC 기능적 평가를 결정하였다. DC에 대한 CD86, HLA DR 및 CD83 발현의 하향-조정에 의해 제시되는 바와 같이, PDAC는 LPS- 및 LPS+IFN-γ-유도 DC 성숙을 강하게 저해하는 것으로 밝혀졌다.
추가로, PDAC는 LPS+IFN-γ-자극된 IL-12-생산 DC 집단의 형성을 대략 50％까지 유의하게 저해하였다. 유사하게, PDAC는 TNF-α 생성을 저해하였다. PDAC가 T 세포로부터의 IL-10 생성을 증가시킨 이전의 결과와는 달리, PDAC는 수지상 세포로부터의 IL-10 생성을 상승시키지 않았다.
6.1. 8 PDAC는 단핵구에 의한 LPS 유도된 IL-23 생성을 저해하며, 가용성 인자에 의해 매개된다.
PDAC가 IL-23 생성을 조정하는 지를 조사하기 위하여, 1 백만 인간 PBMC를 200 내지 100,000개 세포/웰의 PDAC의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml의 LPS로 24시간 동안 자극하였다. IL-23을 ELISA로 결정하였다. PDAC는 용량-의존적 방식으로 PBMC에 의해 IL-23 생성을 강하게 저해하였다. 20,000개 초과의 PDAC 세포수에서 실질적으로 완전한 저해 (>90％)가 관찰되었다. 최저 PDAC 세포 용량인 200개 세포/웰에서 대략 50％의 IL-23 생성의 저해가 달성되었다.
반대로, PDAC는 LPS-활성화된 단핵구 유도된 수지상 세포에 의한 IL-23 생성을 저해하지 않았다. PBMC 세포 유형 IL-23 생성이 조절되는 지 결정하기 위하여, CD14 단핵구 및 CD11c DC 분획을 인간 PBMC로부터 단리하였다. 각각의 분획을 배양액 중 PDAC의 존재 또는 부재 하에 10 ng/ml의 LPS로 24시간 동안 처리하였다. PDAC는 단핵구에 의한 (DC에 의한 것은 아님) LPS-활성화된 IL-23 생성을 특이적으로 하향조절하는 것으로 관찰되었다.
PBMC IL-23 생성의 PDAC-매개 하향-조정의 작용 메카니즘을 이해하기 위하여, 조건화된 배지를 PDAC, PDAC+IFN-γ (100U/ml), 및 PDAC+IL-1β (10ng/ml)의 배양물로부터 수집하였다. 조건화 배지를 밤새 상이한 농도로 LPS-처리된 PBMC의 배양액에 첨가하였다. PDAC-조건화된 배지는 용량 의존적 방식으로 LPS-활성화된 PBMC에 의한 IL-23 생성을 강하게 저해하는 것으로 관찰되었다. 추가로, IL-1β-처리된 PDAC로부터의 조건화된 배지는 PDAC 단독에 의해 조건화된 배지에 비하여, 용량 의존적 방식으로 보다 강력한 저해를 나타내었다. 반대로, IFN-γ 처리된 PDAC는 LPS-활성화된 PBMC에 의한 IL-23 생성을 저해하지 않았다. 상기 결과는 LPS 활성화된 PBMC에 의한 IL-23 생성의 PDAC-매개 저해가 미확인된 가용성 인자에 의해 매개됨을 시사한다.
6.1.9 PDAC는 Th17 스큐잉 배양에서 IL-21 생성을 저해한다.
IL-21은 Th17 집단의 유지에 요구되는 중요한 시토카인이다. PDAC가 IL-21 생성을 조정할 수 있는 지를 조사하기 위하여, PDAC를 Th17 스큐잉 배양액에 도입하였다. 가용성 IL-21을 제조업체 프로토콜에 따라 이바이오사이언스(eBioscience)로부터의 ELISA 키트 (#88-7216)를 이용하여 Th-17 스큐잉 배양으로부터 수득된 상등액에서 측정하였다. PDAC는 PDAC가 없는 Th17 스큐잉 배양과 비교할 때, PDAC-Th17 공배양에서 IL-21 생성을 강하게 저해하는 것으로 관찰되었다. 상기 결과는 PDAC가 IL-21 생성을 저해할 수 있음을 나타낸다.
6.2 실시예 2: 태반 유래 부착 세포를 이용한 혈관신생
6.2.1 PDAC에 의한 혈관신생 인자의 분비
본 실시예는 태반 세포 (CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포, 소위 PDAC)에 의한 혈관신생 인자의 분비를 입증한다.
6.2. 1.1 태반 유래 부착 세포의 혈관신생 효력의 평가에 대한 세크리톰 프로파일링
멀티플렉스비드 검정: 계대배양 6의 태반 유래 부착 세포를 성장 배지에 동일한 세포 수로 플레이팅하고, 조건화 배지를 48시간 후에 수집하였다. 혈청, 혈장, 및 세포/조직 배양 상등액을 비롯한 다양한 매트릭스에서 혈관신생 바이오마커의 측정을 허용하는 자성 비드-기초의 멀티플렉스 검정 (바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro)TM, 바이오-라드, 캘리포니아주)을 이용하여, 세포-조건화 배지에서 다중 혈관신생 시토카인/성장 인자의 동시 정성적 분석을 수행하였다. 이들 96웰 플레이트-포맷된, 비드-기초의 검정의 원리는 포획 샌드위치 면역검정과 유사하였다. 원하는 혈관신생 표적에 대해 지시된 항체는 내부적으로 염색된 비드와 공유 결합한다. 커플링된 비드는 혈관신생 표적을 함유한 샘플과 반응하도록 허용된다. 미결합 단백질을 제거하기 위한 일련의 세척 후에, 상이한 에피토프에 특이적인 비오티닐화된 검출 항체를 반응물에 첨가하였다. 결과는 혈관신생 표적 주위에 항체의 샌드위치의 형성이다. 이어서, 스트렙타비딘-PE를 비드 표면 상의 비오티닐화된 검출 항체에 결합하도록 첨가하였다. 요약하면, 제조업체의 설명에 따라 멀티플렉스 검정을 수행하고, 조건화 배지에서 각각의 혈관신생 성장 인자의 양을 평가하였다.
ELISA: R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스)의 시판 키트를 이용하여 세포-조건화 배지에서 단일 혈관신생 시토카인/성장 인자의 정량적 분석을 수행하였다. 요약하면, 제조업체의 설명에 따라 ELISA 검정을 수행하고, 조건화 배지에서 각각의 혈관신생 성장 인자의 양을 평가하였다.
PDAC에 의한 다양한 혈관신생 단백질의 분비 수준은 도 1에 나타낸다.
혈관신생 마커에 대한 멀티플렉스 및 ELISA 결과
PDAC 마커 양성 음성 세크리톰
분석 ELISA,
멀티플렉스
ANG X X
EGF X X
ENA-78 X X
FGF2 X X
폴리스타틴 X X
G-CSF X X
GRO X X
HGF X X
IL-6 X X
IL-8 X X
렙틴 X X
MCP-1 X X
MCP-3 X X
PDGFB X X
PLGF X X
Rantes X X
TGFB1 X X
트롬보포이에틴 X X
TIMP1 X X
TIMP2 X X
uPAR X X
VEGF X X
VEGFD X X
별도의 실험에서, PDAC는 안지오포이에틴-1, 안지오포이에틴-2, PECAM-1 (CD31; 혈소판 내피 세포 부착 분자), 라미닌, 피브로넥틴, MMP1, MMP7, MMP9, 및 MMP10을 또한 분비하는 것으로 확인되었다.
6.2. 2 PDAC의 기능적 특징규명
본 실시예는 혈관신생 및 분화 능력과 관련된 태반 세포 (CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포, PDAC로도 불림)의 상이한 특징을 입증한다.
6.2.2.1 PDAC의 혈관신생 효력의 평가를 위한 HUVEC 튜브 형성
인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 EGM-2 배지 (캠브렉스(Cambrex), 미국 뉴저지주 이스트 루터포드)에서 3일 동안 계대배양 3 이하에서 계대배양하고, 대략 70％-80％의 전면성장에서 수확하였다. HUVEC를 기본 배지/항생제 (DMEM/F12 (깁코))로 1회 세척하고, 원하는 농도로 동일 배지에 재현탁하였다. HUVEC를 제조 1시간 이내에 사용하였다. 인간 태반 콜라겐 (HPC)을 10 mM HCl (pH 2.25) 중 1.5 mg/mL의 농도로 하고, 완충제로 pH 7.2로 중화시키고, 사용할 때까지 얼음에 유지하였다. HPC를 4000개 세포/㎕의 최종 세포 농도로 HUVEC 현탁액과 합하였다. 생성된 HUVEC/HPC 현탁액을 웰 1개 당 3 ㎕로 96웰 플레이트로 즉시 피펫팅하였다 (플레이트 주위는 증발을 막기 위해 멸균 PBS로 미리 채워야 함, 조건 당 n = 5). HUVEC 소적을 배지 첨가 없이 37℃ 및 5％ CO2에서 75-90분 동안 인큐베이션하여 콜라겐 중합을 허용하였다. "건조" 인큐베이션의 완료 후, 각각의 웰을 조건화된 PDAC 배지 (n = 2 세포주) 또는 대조군 배지 (예를 들어 음성 대조군으로서 DMEM/F12 및 양성 대조군으로서 EGM-2) 200 ㎕로 온화하게 충전하고, 37℃ 및 5％ CO2에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 조건화된 배지는 PDAC를 성장 배지에서 계대배양 6에서 4 내지 6시간 동안 인큐베이션함으로써 제조하고, 부착 및 확산 후, 배지를 DMEM/F12로 24시간 동안 변화시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 HUVEC 소적을 교란시키지 않으면서 웰로부터 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, HUVEC 소적을 10초 동안 고정시키고, 디프-퀵(Diff-Quik) 세포 염색 키트를 이용하여 1분 동안 염색한 후, 멸균수로 3회 헹구었다. 염색된 소적을 공기 건조시키고, 각각의 웰의 영상을 자이스 스테레오 디스커버리(Zeiss SteReo Discovery) V8 현미경을 이용하여 획득하였다. 이어서, 영상을 컴퓨터 소프트웨어 패키지 ImageJ 및/또는 MatLab을 이용하여 분석하였다. 영상을 컬러에서 8-비트 그레이스케일 영상으로 전환시키고, 흑색 및 백색 영상으로 전환하도록 임계치화(threshold)하였다. 이어서, 영상을 입자 분석 특성을 이용하여 분석하였고, 이는 카운트 (개별 입자의 수), 총 면적, (개별 입자의) 평균 크기, 및 구역 분획 (이는 검정에서 내피 튜브 형성의 양과 동일함)을 포함하여 픽셀 밀도 데이타를 제공하였다.
조건화된 배지는 튜브 형성의 유도로 입증되는 바와 같이, 내피 세포 상에 혈관신생 효과를 발휘하였다 (도 2 참조).
6.2.2.2 HUVEC 이동 검정
본 실험은 태반 유래 부착 세포의 혈관신생 능력을 입증하였다. HUVEC를 피브로넥틴 (FN)-코팅된 12-웰 플레이트에서 단층 전면성장으로 성장시키고, 단층을 1 mL 플라스틱 피펫 팁으로 "손상시켜(wounded)" 웰을 가로질러 무세포 선을 생성하였다. "손상된" 세포를 성장 3일 후 PDAC로부터 수득된 혈청 무함유 조건화 배지 (EBM2; 캠브렉스)와 인큐베이션함으로써 HUVEC 이동을 시험하였다. 세포 없는 EBM2 배지를 대조군으로서 사용하였다. 15시간 후, 도립 현미경을 이용하여 무세포 구역으로의 세포 이동을 기록하였다 (n = 3). 이어서, 컴퓨터 소프트웨어 패키지 ImageJ 및/또는 MatLab를 이용하여 사진을 분석하였다. 영상을 컬러에서 8-비트 그레이스케일 영상으로 전환시키고, 흑색 및 백색 영상으로 전환하도록 임계치화하였다. 이어서, 영상을 입자 분석 특성을 이용하여 분석하였고, 이는 카운트 (개별 입자의 수), 총 면적, (개별 입자의) 평균 크기, 및 구역 분획 (이는 검정에서 내피 튜브 형성의 양과 동일함)을 포함하여 픽셀 밀도 데이타를 제공하였다. 세포 이동의 정도를 초기 기록된 손상된 선의 크기에 대하여 계측하고, 결과를 1x106개 세포로 표준화하였다.
태반 유래 부착 세포에 의해 분비된 영양 인자는 세포 이동의 유도로 입증되는 바와 같이, 내피 세포에 대한 혈관신생 효과를 발휘하였다 (도 3).
별도의 실험에서, HUVEC를 EGM2에서의 밤샘 확립을 위해 24웰-플레이트의 최하부에서 배양한 후, EBM에서 반일 기아처리(starvation) 하였다. 공동으로, 배지-배양된 PDAC를 해동시키고, 트랜스웰 (8 μM)에서 밤새 배양하였다. EC 기아처리 후, 트랜스웰과 함께 조건화된 혈청 무함유 DMEM을 밤샘 증식을 위해 EC로 이동시켰다. 4개의 복제물이 각각의 실험에 포함되었고, 24시간 후 증식을 프로메가의 셀 타이터 글로 어세이(Cell Titer Glo Assay)로 평가하였다. EBM-2 배지를 음성 대조군으로 사용하고, EGM-2를 양성 대조군으로 사용하였다. 오차 막대는 분석용 복제물의 표준 편차를 나타낸다 (n=3).
PDAC에 의해 분비된 영양 인자는 HUVEC 세포 수에서의 증가를 야기하였고, 이는 HUVEC 증식의 지표이다. 도 4를 참조한다.
6.2.2.3 태반 유래 부착 세포의 혈관신생 효력의 평가를 위한 튜브 형성
세포의 분화 잠재성에 대한 VEGF의 효과 뿐만 아니라 일반적으로 세포의 혈관신생 효력을 평가하기 위하여, PDAC를 VEGF 또는 EGM2-MV를 함유하지 않고 VEGF를 함유한 성장 배지에서 성장시켰다. 튜브 형성을 위한 대조군 세포로서 HUVEC를 EGM2-MV에서 성장시켰다. 세포가 70-80％ 전면성장에 도달할 때까지 4 내지 7일 동안 세포를 각 배지에서 배양하였다. 차가운 (4℃) 매트리겔™ 용액 (50 ㎕; 비디 바이오사이언시즈)을 12-웰 플레이트의 웰로 투입하고, 플레이트를 60분 동안 37℃에서 인큐베이션하여 용액을 겔로 허용하였다. PDAC 및 HUVEC 세포를 트립신처리하고, 적절한 배지 (VEGF 함유 및 비함유) 중에 재현탁하고, 희석된 세포 (1 x 104 내지 3 x 104개 세포) 100 ㎕를 매트리겔™-함유 웰 각각에 첨가하였다. 0.5 내지 100 ng VEGF의 존재 또는 부재하에, 중합된 매트리겔™ 상의 세포를 4 내지 24시간 동안 37℃의 5％ CO2 인큐베이터에 두었다. 인큐베이션 후, 세포를 표준 광 현미경검사를 이용하여 튜브 형성의 징후에 대해 평가하였다.
PDAC는 VEGF의 부재 하에 최소 튜브 형성을 나타내었으나, VEGF로의 자극을 통해 튜브-유사 구조를 형성하도록 유도/분화되었다. 도 5를 참조한다.
6.2. 2.4 태반 유래 부착 세포의 혈관신생 효력의 평가를 위한 저산소증 반응성
내피 세포 및/또는 내피 전구 세포의 혈관신생 관능가를 평가하기 위하여, 세포를 저산소 및 정상산소 조건 하에 혈관신생 성장 인자를 분비하는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 저산소 조건 하의 배양은 통상적으로 내피 세포 또는 내피 전구 세포에 의한 혈관신생 성장 인자의 분비 증가를 유도하며, 이는 조건화 배지에서 측정될 수 있다. 태반 유래 부착 세포를 그의 표준 성장 배지에 동일한 세포 수로 플레이팅하고, 대략 70-80％ 전면성장으로 성장시켰다. 그 후, 세포를 혈청 무함유 배지 (EBM-2)로 전환하고, 정상산소 (21％ O2) 또는 저산소 (1％ O2) 조건 하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 조건화 배지를 수집하고, 혈관신생 성장 인자의 분비를 R&D 시스템즈의 시판되는 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. ELISA 검정을 제조업체의 설명에 따라 수행하고, 조건화 배지에서의 각각의 혈관신생 성장 인자 (VEGF 및 IL-8)의 수를 1 x 106개 세포로 표준화하였다.
태반 유래 부착 세포는 저산소 조건 하에서 다양한 혈관신생 성장 인자의 분비 증가를 나타내었다. 도 6을 참조한다.
6.2.2.5 PDAC-조건화된 배지에 대한 HUVEC 반응
PDAC를 60％ DMEM-LG (깁코); 40％ MCBD-201 (시그마); 2％ FBS (하이클론 랩스), 1 x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS); 10 ng/mL 리놀레산-소 혈청 알부민 (LA-BSA); 1 n-덱사메타손 (시그마); 100 μM 아스코르브산 2-포스페이트 (시그마); 10 ng/mL 표피 성장 인자 (R & D 시스템즈); 및 10 ng/mL 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-BB) (R & D 시스템즈)를 함유하는 성장 배지에서 48시간 동안 배양한 후, 혈청 무함유 배지에서 추가의 48시간 동안 배양하였다. PDAC 배양으로부터의 조건화된 배지를 수집하고, 5, 15 및 30분 동안 혈청-기아된 HUVEC를 자극하기 위해 사용하였다. 그 후, HUVEC를 용해시키고, 혈관신생 경로 신호전달에서 역할을 한다고 알려진 인단백질에 대하여 BD™ CBA (사이토메트릭 비드 검정) 셀 시그널링 플렉스 키트 (비디 바이오사이언시즈)로 염색하였다. PDAC는 HUVEC에서 AKT-1 (세포자멸 과정을 억제함), AKT-2 (인슐린 신호전달 경로에서 중요한 신호전달 단백질임) 및 ERK 1/2 세포 증식 경로의 강력한 활성자인 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 PDAC의 혈관신생 능력을 추가로 입증한다.
6.2.3 PDAC에 의한 혈관신생의 유도
본 실시예는 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 PDAC가 병아리 융모요막 (CAM)을 이용한 생체내 검정에서 혈관신생을 촉진시킨다는 것을 입증한다.
2개의 별개의 CAM 검정을 수행하였다. 제1 CAM 검정에서는, PDAC의 상이한 제조로부터 얻어진 무손상 세포 펠렛을 평가하였다. 제2 CAM 검정에서는, 상이한 PDAC 제조물의 상등액을 평가하였다. 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)를 양성 대조군으로 사용하고, MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 참조로서 사용하고, 비히클 및 배지 대조군을 음성 대조군으로 사용하였다. 연구의 종점은 모든 처리군 및 대조군의 혈관 밀도를 결정하는 것이었다.
6.2.3.1 PDAC를 이용한 CAM 검정
상기 기재된 바와 같이 제조되어 냉동보존된 PDAC를 사용하였다. PDAC를 투여를 위해 해동하고, CAM에서 투여된 세포의 수를 결정하였다.
연구 디자인: 연구는 각각의 그룹에 10개의 배아를 가지는 5개 그룹을 포함한다. 연구의 디자인은 표 2에 기재한다.
연구 그룹, 병아리 융모요막 혈관신생 검정.
그룹 번호 배아의 수 처리 종점
1 10 비히클 대조군 (PBS/매트리겔TM 혼합물 (1:1 부피) 40㎕) 혈관 밀도 스코어
2 10 양성 대조군, bFGF (DMEM/매트리겔TM 혼합물 (1:1) 40㎕ 중 100 ng/CAM)로 처리됨 그룹 1과 동일함
3 10 배지 대조군 (DMEM 40 ㎕) 그룹 1과 동일함
4 10 PDAC 그룹 1과 동일함
5 10 MDA-MB-231 세포 P34, 로트 번호 092608 그룹 1과 동일함
CAM 검정 절차: 신선한 수정란을 3일 동안 37℃의 표준 란(egg) 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 3일째에, 란을 멸균 조건하에 깨고, 배아를 20개의 100 mm 플라스틱 플레이트에 놓고, 최하부 선반에 물 저장소가 있는 배아 인큐베이터에서 37℃에서 길렀다. 인큐베이터 내의 습도가 일정하게 유지되도록 작은 펌프를 이용하여 공기를 물 저장소로 연속적으로 버블링하였다. 6일째에, 멸균 실리콘 "O" 링를 각각의 CAM에 놓은 후, 배지/매트리겔™ 혼합물 (1:1) 40 ㎕ 당 7.69 ×105개 세포의 밀도인 PDAC를 멸균 후드 중의 각각의 "O" 링으로 전달하였다. 표 2A 및 2B는 사용된 세포의 수 및 투여를 위해 각각의 세포 제조물에 첨가된 배지의 양을 나타낸다. 비히클 대조군 배아는 비히클 (PBS/매트리겔™, 1:1) 40 ㎕를 수용하였고, 양성 대조군은 DMEM 배지/매트리겔™ 혼합물 (1:1) 40 ㎕ 중 100 ng/ml bFGF를 수용하였고, 배지 대조군은 DMEM 배지 40 ㎕를 단독으로 수용하였다. 각각의 투여가 완료된 후, 배아를 인큐베이터에 되돌렸다. 8일째에, 배아를 인큐베이터로부터 제거하고, 실온에서 유지하면서 100 X의 배율로 영상 캡쳐 시스템을 이용하여 각각의 "O" 링 하에서 혈관 밀도를 결정하였다.
혈관 밀도는 산수 0 내지 5, 또는 지수 1 내지 32를 사용하는 혈관신생 채점 시스템으로 측정하여, CAM 상에서 처리 부위에 존재하는 혈관의 수를 나타내었다. 보다 높은 채점 수는 보다 높은 용기 밀도를 나타내며, 0은 혈관신생 없음을 나타낸다. 각각의 투여 부위에서의 억제율(％)은 그 부위에 대해 기록된 스코어를 각각의 개별 실험에 대한 대조군 샘플에서 얻어진 평균 스코어로 나누어 계산하였다. 주어진 화합물의 각각의 용량에 대한 억제율(％)은 8-10개 배아로부터 그 용량에 대해 수득된 모든 결과를 모아서 계산하였다.
투여를 위한 최종 세포 현탁액의 표준화를 위해 각각의 세포 제조물에 첨가된 배지의 양
세포주 펠렛 크기 DMEM 및 매트리겔™을 이용한 표준화 세포 현탁액의 최종 부피
PDAC 260 ㎕ 0 ㎕ + 260 ㎕ 매트리겔™ 520 ㎕
MDA-MB-231 40 ㎕ 220 ㎕ + 260 ㎕ 매트리겔™ 520 ㎕
PDAC는 계대배양 6에 사용되었다.
결과
혈관 밀도 스코어의 결과를 도 7에 나타낸다. 결과는, PDAC 세포 현탁액, 또는 bFGF 100 ng/mL, 또는 MDAMB231 유방암 세포 현탁액으로 처리된 병아리 융모요막의 혈관 밀도 스코어가 비히클 대조군 CAM의 것에 비해 통계적으로 유의하게 더 높았음을 분명히 나타낸다 (P < 0.001, 스튜던트의 "t" 시험). PDAC (음성 대조군)를 배양하기 위해 사용된 배지는 혈관 밀도에 대한 어떠한 효과도 갖지 않았다. 추가로, PDAC 제조물의 혈관 밀도의 유도는 일부 변동을 나타내었으나, 상기 변동은 통계적으로 유의하지 않았다.
6.2.3.2 PDAC 상등액을 이용한 CAM 검정
MDA-MB-231 세포 및 PDAC로부터의 상등액 샘플을 상기 기재된 바와 같이 제2 CAM 검정에 사용하였다. bFGF 및 MDA-MB-231 상등액을 양성 대조군으로 사용하고, 배지 및 비히클을 음성 대조군으로 사용하였다.
연구 디자인: 연구는 각각의 그룹에 10개의 배아를 가지는 5개 그룹을 포함하였다. 연구의 디자인은 표 4에 기재한다.
연구 디자인 - 세포 상등액을 이용한 CAM 검정
그룹 번호 배아의 수 처리 종점
1 10 비히클 대조군 (PBS/매트리겔TM 혼합물 (1:1 부피) 40㎕) 혈관 밀도 스코어
2 10 양성 대조군, bFGF (DMEM/매트리겔TM 혼합물 (1:1) 40㎕ 중 100 ng/CAM)로 처리됨 그룹 1과 동일함
3 10 배지 대조군 (DMEM 40 ㎕) 그룹 1과 동일함
4 10 PDAC의 상등액 그룹 1과 동일함
5 10 MDAMB231 세포 (P34)의 상등액 그룹 1과 동일함
PDAC 상등액은 계대배양 6에서의 세포로부터 수득되었다.
CAM 검정 절차: 검정 절차는 상기 단락 6.3.1에 기재된 것과 동일하였다. 유일한 차이는 각각의 줄기 세포 제조물 또는 MDA-MB-231 세포로부터의 상등액이 시험 물질로서 사용되었다는 것이었다. 투여를 위하여, 각각의 상등액을 매트리겔™ (1:1 부피)과 혼합하고, 혼합물 40 ㎕를 각각의 배아로 투여하였다.
결과: 혈관 밀도 스코어 (도 8 참조)는 각각의 줄기 세포 제조물의 상등액에 의한 혈관 형성의 유도가 상이하였음을 나타낸다. PDAC로부터의 상등액 샘플은 혈관 유도에 대한 유의한 효과를 나타내었으며, 각각 P < 0.01, P < 0.001, 및 P < 0.02 (스튜던트의 "t" 시험)를 가졌다. 예상한 바와 같이, 양성 대조군 bFGF 또한 상기 CAM 검정 1번에서 보는 바와 같이 혈관 형성의 강력한 유도를 나타내었다 (P < 0.001, 스튜던트의 "t" 시험). 그러나, MDA-MB-231 인간 유방암 세포로부터의 상등액은 비히클 대조군에 비해 혈관 형성의 유의한 유도를 나타내지 않았다. 이전에 나타난 바와 같이, 배양 배지 단독으로는 어떠한 효과도 갖지 않았다.
6.3 실시예 3: PDAC는 신경보호 효과를 나타낸다.
본 실시예는 PDAC가 산소-글루코스 고갈 (OGD) 손상 검정 및 반응성 산소 종 검정을 이용하여 저-산소 및 저-글루코스 조건에서 신경보호 효과를 가짐을 입증한다. 또한, PDAC는 신경영양 인자 BDNF, GDNF, NT-3, NT-4/5, 및 항산화 효소 헤미옥시게나제-1, 카탈라제, 수퍼옥시드 디스뮤타제-1 및 알데히드 옥시다제-1을 비롯한 신경보호 잔기를 발현하며, 이들 잔기의 일부의 발현 및 분비는 저산소 손상 이후 상승된다. 따라서, 이러한 결과는 PDAC가 전형적으로 괴사, 세포자멸, 탈수초, 및 다른 형태의 기능 손상에 의한 뉴런 기능 손상 또는 퇴화로 특징지어 지는 CNS 손상, 예를 들어 SCI 또는 TBI를 치료하는 데에 유용할 수 있음을 나타낸다.
인간 뉴런 (사이언셀(ScienCell), 카탈로그 # 1520)을 제조업체의 권장에 따라 배양하였다. 간략하게 설명하면, 배양 용기를 멸균 증류수에서 1시간 동안 37℃에서 폴리-L-리신 (2 ㎍/mL)으로 코팅하였다. 용기를 이중 증류된 H2O로 3회 세척하였다. 뉴런 배지 (사이언셀)를 용기에 첨가하고, 인큐베이터에서 37℃로 평형화하였다. 뉴런을 해동시키고, 원심분리 없이 용기로 직접 첨가하였다. 그 후의 배양 동안, 배양 개시 다음 날 및 그 후 모든 다른 날에 배지를 변경하였다. 뉴런은 전형적으로 4일째까지 손상에 대해 준비되어 있었다.
부분적으로는 액체 배지 중 산소의 용해도를 감소시키기 위하여, 먼저 수조 내 배지를 가온함으로써 OGD 배지 (둘베코 변형 이글 배지-글루코스 미함유)를 제조하였다. 0.5μm 확산 스톤을 이용하여 100％ 질소를 30분 동안 배지를 통해 버블링하여 용존 산소를 제거하였다. HEPES 완충제를 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 살포 마지막에 배지를 직접적으로 뉴런에 첨가하였다. 배지의 작은 샘플을 침지형 산소 센서를 이용하여 산소 수준의 확인을 위해 분주하였다. 산소 수준을 전형적으로 0.9％ 내지 약 5.0％ 산소로 감소시켰다.
가스처리 전에 챔버를 적어도 4시간 동안 (바람직하게는 밤새) 37℃의 인큐베이터에 둠으로써 저산소증 챔버를 제조하였다. 배양 용기 중의 배지를 제거하고, 탈기된 배지로 대체하고, 배양 용기를 저산소증 챔버에 놓았다. 이어서, 저산소증 챔버를 적어도 5분 동안 20-25 Lpm의 속도로 시스템을 통해 95％ N2/5％ CO2 기체로 플러싱하였다. 1시간 후 한번 더 챔버를 탈기하면서 시스템을 37℃의 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
손상 절차의 마무리에, OGD 배지를 흡인하고, 가온된 배지를 뉴런에 첨가하였다. 24-28시간 후, PDAC 및 뉴런을 뉴런 배지 중에 현탁된 6웰 플레이트의 각각의 웰 1개 당 100,000개 세포로 동일한 수로 플레이팅하고, 뉴런에 첨가하고, 6일 동안 공배양하였다.
각각의 조건에 대해 6웰 플레이트에서 무작위 구격의 현미경사진을 찍었다. 전형적인 뉴런 형태를 갖는 세포를 확인하고, 신경돌기 길이를 기록하였다. 신경돌기의 평균 길이는 뉴런 건강과 양의 상관관계가 있었고, 뉴런 및 PDAC의 공배양에서 더 길었는데, 이는 PDAC가 손상으로부터 세포를 보호하고 있음을 나타낸다.
반응성 산소 종 검정
반응성 산소 종을 청소하고(scavenge) 이러한 종으로부터 세포를 보호하는 PDAC의 능력을 반응성 산소 종 발생기로서 과산화수소를 이용하는 검정에서 결정하다.
검정 설명: 표적 세포 (성상세포, 사이언셀 리서치 래버러토리즈)를 폴리-L-리신으로 6000/cm2로 미리-코팅된 96웰 블랙 웰 플레이트에 접종하였다. 성상세포를 5％ 이산화탄소를 보유한 37℃의 성장 배지에서 밤새 부착하도록 허용하였다. 다음 날에, 배양 배지를 제거하고, 세포를 형광원성 프로브인 세포 투과성 염료 DCFH-DA (디클로로플루오레신 디아세테이트)와 인큐베이션하였다. 잉여 염료를 둘베코 인산염 완충 염수 또는 행크 완충 염 용액으로 세척함으로써 제거하였다. 이어서, 1000 μM 과산화수소를 30-60분 동안 첨가함으로써 세포를 반응성 산소 종으로 손상시켰다. 이어서, 과산화수소-함유 배지를 제거하고, 혈청 무함유, 글루코스-무함유 성장 배지로 대체하였다. PDAC를 6000/cm2로 첨가하고, 세포를 또다른 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 표준 형광 플레이트 판독기에서 480Ex 및 530Em에서 판독하였다. 배지 중 반응성 산소 종 함량은 세포 시토졸에서의 DCFH-DA의 수준과 직접적으로 비례하였다. 반응성 산소 종 함량을 비교로 측정하여 DCF 표준 곡선을 미리-결정하였다. 모든 실험은 N=24로 행하였다.
검정을 위하여, 1X DCFH-DA를 20 X DCFH-DA 원액을 태아 소 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지 중의 1X로 희석하고 균질할 때까지 교반함으로써 사용 직전에 제조하였다. 과산화수소 (H202) 희석물을 필요에 따라 DMEM 또는 DPBS 중에서 제조하였다. 표준 곡선은 1 mM DCF 표준물을 세포 배양 배지에서 희석하고, DCF 표준물 100 ㎕를 형광 측정에 적합한 96웰 플레이트로 옮기고, 세포 용균 완충제 100 ㎕를 첨가함으로써, 농도 범위 0 μM 내지 10 μM인 1:10 희석 시리즈로서 제조하였다. 형광을 480Ex 및 530Em에서 판독하였다.
결과: PDAC는 성상세포 공배양에서 반응성 산소 종의 농도를 유의하게 감소시켰다. 도 9를 참조한다.
신경보호 잔기의 발현 및 분비
정상적인 (정상산소) 및 손상/질환-관련 (저산소) 조건 하에서 신경보호 잔기의 유전자 발현을 평가하기 위하여, PDAC를 6-웰 조직 배양 접시에서 6000개 세포/cm2로 접종하고, 24시간 동안 배지에서 성장시켰다. 그 후, 성장 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 이어서, 혈청 무함유 DMEM 배지를 세포에 첨가하고, 배양물을 3시간 동안 37℃, 5％ CO2, 21％ O2, 90％ 습도에서 인큐베이션하였다. 저산소 조건하에서 PDAC 유전자 발현의 평가를 위하여, 1％ O2로 평형화된 혈청 무함유 배지를 세포에 첨가하고, 배양물을 37℃, 5％ CO2, 1％ O2, 90％ 습도의 저산소증 챔버에 3시간 동안 두었다. 상기 조건에서 인큐베이션 후, 전체 RNA를 제조업체의 지시에 따라 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 이용하여 세포로부터 추출하였다. 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR) 기술을 이용하여 유전자 전사체의 정량화를 수행하였다. BDNF, GDNF, NT-3, NT-4/5의 상등액으로의 분비를 제조업체의 지시에 따라 고체 상 샌드위치 ELISA 면역검정 시스템 (R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스)을 이용하여 결정하였다. 단백질 농도는 450 nM에서의 흡광도 또는 리포터 크로마겐 (테트라메틸벤지딘)과 공지된 각각의 표준의 상관관계에 의해 비색적으로 결정하였다.
신경보호 잔기의 분비를 평가하기 위하여, PDAC를 6-웰 조직 배양 접시에서 6000개 세포/cm2로 접종하고, 24시간 동안 PDAC 배지에서 성장시켰다. 그 후, 성장 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 이어서, 혈청 무함유 DMEM 배지를 세포에 첨가하고, 배양물을 정상산소 조건하에서 영양 인자의 PDAC 분비의 평가를 위한 표준 조직 배양 인큐베이터에서 37℃, 5％ CO2, 21％ O2, 90％ 습도에서 추가의 3시간 동안 인큐베이션하였다. 저산소 조건하에서 PDAC 분비의 평가를 위하여, 1％ O2로 평형화된 혈청 무함유 배지를 세포에 첨가하고, 배양물을 37℃, 5％ CO2, 1％ O2, 90％ 습도의 저산소증 챔버에 3시간 동안 두었다.
인큐베이션 기간의 종료 후, 세포-조건화된 배지를 조직 배양 용기로부터 수집하고, -80℃에서 동결하고, 그 후, 하기 기재된 바와 같이 분석하였다.
결과: 정상산소 조건하에서 PDAC에 의해 발현된 항산화 효소 전사체의 발현 수준을 인간 성상세포의 것과 비교하였다. 측정된 Ct 값은 PDAC에 의한 항산화 효소 카탈라제 (CAT), 헤미옥시게나제-1 (HMOX-1), 알데히드 옥시다제-1 (AOX-1) 및 수퍼옥시드 디스뮤타제-1 (SOD-1)의 더 높은 발현을 나타내었고, 이는 배양된 성상세포에 비해 ROS의 보다 우수한 중화를 시사한다. 또한, 정상산소 조건하에서 PDAC에 의해 발현된 신경영양 인자의 발현 수준을 인간 성상세포 대조군과 비교하였다. 측정된 Ct 값은 PDAC에 의한 공지된 신경영양 인자 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경교-유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4/5 (NT-4/5)의 발현을 나타내며, 이는 PDAC가 수많은 인자를 통해 신경보호 관능가를 나타낼 수 있음을 시사한다. 손상/질환-관련 조건하에서 이들 관심 유전자의 유도성을 평가하기 위하여, PDAC를 유전자 발현의 평가 전 저산소 조건하에서 3시간 동안 배양하였다. PDAC에 의한 BDNF, GDNF, NT-3 및 NT-4/5의 발현은 저산소 배양 후 각각 2.5배, 5배, 30배, 및 15배 상승되었다. 이러한 결과는 PDAC가 신경보호 인자의 조절을 통해 질환-관련 환경에서 적절히 반응할 수 있음을 시사하며, 추가로 PDAC가 신경보호 관능가를 갖는다는 가설을 시사한다.
상승된 전사체가 증가된 단백질 발현을 야기하였는 지를 결정하기 위하여, 조건화된 상등액을 신경영양 인자의 존재에 대해 평가하였다. BDNF, GDNF, NT-3 및 NT-4 신경영양 인자의 존재는 조건화 배지에서 3시간 배양 후 실질적인 수준 및 3시간 저산소 손상 후 BDNF 및 NT-3 분비의 각각 78％ 및 100％ 증가로 확인되었고, 이는 유전자 발현 수준에 대한 관찰된 조절을 입증하였다. 이러한 결과는 PDAC가 항산화 효소 및 신경영양 인자의 발현을 통한 급성 CNS 손상과 관련된 다양한 병리적 과정, 예를 들어 저산소증으로 구동되는 ROS의 과도한 축적 및 뉴런 세포의 손상을 치료학적으로 조정할 것이라는 개념을 뒷받침한다.
6.4 실시예 4: 래트 SCI 모델에서 PDAC를 이용한 SCI의 치료
본 실시예는 PDAC로도 불리우는 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포의 SCI에 대한 효과를 평가하기 위한, 특히 래트의 손상되지 않은 척수 및 손상된 척수에 이식된 PDAC의 면역 거부, 이동 및 분화를 평가하기 위한 예시적인 모델 및 방법을 제공한다. 상기 모델은 단독 또는 2차 치료 옵션과 조합된 (예를 들어 메틸프레드니솔론, 리튬 및/또는 시클로스포린 A과의 공동투여) PDAC 투여의 효과의 평가를 위해 제공한다. 일반운동 활성 (BBB 스코어)의 회복, 피질척수로 및 세로토닌성 축삭돌기의 재생 및 척수의 백질 구역을 포함하는 기능에 대한 PDAC의 효과를 세포 이식 없는 대조군 래트와 비교하여 손상후 12주에 시클로스포린으로 및 시클로스포린 없이 평가하였다. SCI의 급성, 아급성 및 만성 상태로의 세포의 이식을 모의하기 위해 세포를 척수에 손상후 바로, 2주 및 6주에 이식하였다. 손상후 0, 1, 2, 3, 4 및 6주에 투여된 PDAC의 생존, 이동 및 분화를 평가하였다. 또한, 유전자 칩, RT-PCR 및 ELISA 방법을 이용하여, PDAC의 투여후 신경발생성 성장 인자, 예를 들어 뉴로트로핀의 발현을 평가할 수 있다.
실험적 디자인
PDAC의 생체내 지속성. 25 mm 체중 강하가 있는 SCI의 부과가 있는 또는 없는 0, 1, 2, 3, 4 및 6주에 래트 척수의 T9의 상부단 및 T10 척추 분절의 하부단에서의 중심 회색 영역으로 PDAC를 주사하였다 (n=4/군). 6주 후, 래트를 60 mg/kg 펜토바르비탈로 마취시키고, 포름알데히드로 관류하고, 척수를 수평으로 섹션화하고, 주변형광 해부 현미경으로 조사하였다. 주사 부위로부터 다양한 거리의 PDAC의 분포를 형광을 통해 측정하고, 섹션을 베타-3-튜불린 (뉴런), GFAP (성상세포), 네스틴 (전구체) 마커에 대해 면역조직학적으로 염색하였다
처리. PDAC가 투여된 래트를 메틸프레드니솔론 (MP, 이식시 30 mg/kg 볼루스), 리튬 (Li, 6주 동안 100 mg/kg/일) 및 시클로스포린 (CsA, 10 mg/kg/일)으로 처리하고, 손상 및 이식 후 6주에 이식된 PDAC의 수, 분포 및 특징을 평가하였다. PDAC 단독, MP 단독, Li 단독, CsA 단독 또는 MP+Li의 효과를 평가하였다. 세포를 정량화하기 위해, 척수에서의 인간 DNA 및 녹색 형광 단백질 (GFP)의 양을 측정하였다. 구성적 GFP 발현 카세트를 코딩하는 플라스미드 벡터의 아막사(Amaxa)-기반 전기천공법에 의해 PDAC에서의 단기간-중간기간 GFP 발현을 달성하였다. 구성적 GFP 발현을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 더 긴 장기간 발현을 달성하였다.
유전자 / 단백질 발현. PDAC 단독, PDAC + MP, PDAC + MP 및 Li, 및 PDAC + MP, Li 및 CsA로 처리하거나 처리하지 않은 동물에서 LIF, BDNF, GDNF, NT3, NGFA 및 GFP의 mRNA 및 단백질 수준을 측정하기 위해 RT/PCR 및 ELISA를 이용하였다.
회수 / 재생. CsA와 함께 또는 CsA 없이 손상후 2주 및 6주에 PDAC를 이식하고, 동물을 12주 동안 유지하였다. 전위 복구 (BBB)를 평가하고, 조직학적 연구를 수행하였다.
프로토콜
마취. 77±1 일령의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 척추후궁절제술로 처리하였다. 래트를 복강내 펜토바르비탈 (45 mg/kg 암컷, 65 mg/kg 수컷)로 마취시켰다. 5분 내에 깊이 마취되지 않은 래트를 실험에서 제외시켰다. 손상후 1주 및 4주에 세포의 척수로의 지연된 이식을 위해, 헤드콘(head-cone)을 통한 이소플루란의 자발적인 호흡에 의해 (5분 동안 5％ 유도 및 이어서 1％ 유지) 래트를 마취시켰다.
척수 손상. 래트를 면도하고 베타딘으로 수술 부위를 준비한 후, T8-11 척주 및 T9-10을 노출시키기 위해 중간선 배측 절개를 수행하고, 하부 T13 척수를 노출시키기 위해 척추후궁절제술을 수행하였다. 래트를 TS 및 T11 배측 프로세스 상에 위치된 클램프로 매달았다. 마취 유도후 1시간에, 10-그람 막대를 T13 척수로 25 mm 강하시켰다. 부착을 방지하기 위해 경막 상에 폴리락트산 및 폴리카프리락톤의 얇은 (100μ) 시트를 위치시키고, 흉터 형성을 지연시키기 위해 자가 피하 지방 조각을 척추후궁절제술 부위 상에 위치시켰다. 척추후궁절제술 위 및 아래에 실크로 중간선에서 근육을 봉합하였다. 스테인레스 스틸 클립으로 피부를 폐쇄하였다. 1주후 클립을 제거하였다.
세포 이식. 경막을 26-게이지 투베르쿨린 시린지로 절개하고, 200,000개 세포의 1-마이크로리터 현탁액을 척수에 주사하였다. 지연된 이식을 위해, 이소플루란에 의한 마취후 척추후궁절제술 부위를 재개방하고, 작은 경막 절개부를 만들고, 마이크로피펫을 사용하여 200,000개 세포의 2개의 1-마이크로리터 현탁액을 문측 및 미측 척수로 충격 부위에 주사하였다.
수술후 간호. 래트가 깨어날 때까지 래트를 발열 패드 상에서 유지하였다. 청색증 (발 색깔부터)을 나타내는 래트는 분비물을 치우고 호흡을 자극하기 위해 경구강 기관 흡인을 받았다. 기도 폐쇄의 더 많은 발병이 있다면 수술내 분비 축적을 감소시키기 위해 아트로핀 (0.04 mg/kg IM) 또는 글리코피롤레이트 (0.5 mg/kg IM)를 임의로 투여하였다. 탈수 징후를 나타내는 래트 (예를 들어 등 피부가 초췌하고 금세 정착하지 않음)는 5-10 ml 피하 염수 주사 (5 ml 암컷, 10 ml 수컷)를 받았다. 모든 래트는 요로 및 창상 감염을 감소시키기 위해 50 mg/kg의 세파졸린을 피하로 7일 동안 매일 받았다.
수술후 무통증. 손상은 손상 부위에서 및 손상 부위 아래에서 마취를 야기하기 때문에, 척수 손상된 래트는 일반적으로 통증의 증거를 나타내지 않는다. 그러나, 척추후궁절제술만을 받은 동물, 즉, 척수 손상 없고 수술후 통증을 나타내는 동물에 대해, 국부 마취제인 부피바카인 (마르카인)을 수술 부위에 2 mg/kg 체중의 최대 용량으로 투여하였다. 각각의 동물을 통증의 증거에 대해 모니터링하고, 필요하다면 추가의 통증 경감제를 제공하였다.
장기간 간호. 래트를 매일 검사하고, 전위 스코어 (BBB)에 대해 매주 평가하였다. 첫째, 동물을 매일 2회 검사하고, 촉진이 방광 중 >1 ml 소변을 나타내는 경우에 손으로 표시하였다. 초기 7일 기간 후에 방광 감염의 지표인 소변이 탁하고 혈색인 래트는 7-10일 동안 2.5 mg/kg/일의 바이트릴 (플루오로퀴놀론 항생제)을 받았다. 감염이 없어지지 않으면, 래트를 안락사시켰다. 둘째, 래트를 멸균 백색 종이 쓰레기통 (알파 드라이(Alpha Dry)) 상에서 유지시켰으며, 이는 래트를 건조한 상태로 유지시키고, 혈뇨의 존재를 나타낸다. 혈뇨를 갖는 래트를 한쪽으로 분리하고, 다른 래트로부터 단리하여 간호하여, 감염 전달을 방지하였다. 셋째, 래트가 통증의 증거 (발성, 접촉에 대해 감수성) 또는 자교증의 증거 (모발 손실 또는 피부 침투로 표시되는 손상 부위 아래 피부분절을 씹는 것)를 나타내는 경우에, 래트에게 피부 병변이 완전히 치유될 때까지 매일 경구 아세트아미노펜 (64 mg/kg/일 "베이비 타이레놀" 경구)을 제공하였다. 정정가능한 통증 발병이 발견되지 않으면, 래트를 안락사시켰다. 동물의 체중을 처음 1주일 동안 매일 및 그후에는 매주 측정하였다.
안락사. 모든 동물을 펜토바르비탈 (100 mg/kg 암컷-수컷 용량)로 깊이 마취시키고, 분자 연구를 위해 참수하거나, 또는 고정 및 조직학 연구를 위해 4％ 파라포름알데히드 용액으로 관류시켰다.
6.5 실시예 5: 래트 TBI 모델에서 PDAC를 사용한 TBI의 치료
본 실시예는 PDAC로도 불리우는 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포의 TBI에 대한 효과를 평가하기 위한 예시적인 모델 및 방법을 제공한다. 어떠한 특정 이론 또는 작용 메카니즘에도 얽매이도록 의도되지 않고, TBI는 순환 면역 세포의 증가와 상관관계가 있는 비장 덩어리의 감소를 초래하여 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 방법은 면역학적 반응을 조정하고; 비장세포 증식 및 항-염증성 시토카인, 예컨대 IL-4 및 IL-10의 분비를 촉진시키기 위해 비장세포로 공동국부화하고; 비장 덩어리를 보존하고; 유도된 TBI 후 혈액 뇌 장벽의 완전성을 유지하는 PDAC의 능력의 평가를 위해 제공된다.
생체내 방법
제어된 피질 충격 손상. 문헌 [Lighthall J., Neurotrauma 5, 1-15 (1988)]에 기재된 바와 같이 편측 뇌 손상을 적용하기 위해, 제어된 피질 충격 (CCI) 장치, 예를 들어 eCCI 모델 6.3 (VCU, 미국 버지니아주 리치몬드)을 사용하였으며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 체중 225-250 g의 수컷 래트를 4％ 이소플루란 및 O2로 마취시키고, 각각의 래트의 머리를 정위 기구(stereotactic frame)에 탑재하였다. 머리를 수평면으로 유지하였다. 노출을 위해 중간선 절개를 사용하였으며, 우측 두개관 상에서 7-8 mm 두개절제술을 수행하였다. 두개절제술의 중심을 측후두엽 피질 위에 가로놓인 중간선에 대해 측면 약 3 mm인 브레그마와 람다 사이의 중간점에 위치시켰다. 동물은 충격이 피질 표면에 대해 직각이 되도록, 6 mm 직경 임팩터 팁을 사용하여 수직면으로부터 10°의 각도에서 5.8 m/s의 충격 속도 및 150 ms의 체류시간에 의한 3.1 mm 깊이의 변형의 단일 충격을 받았다 (중등도-중증 손상). 두정 연합 피질에 대해 충격을 주었다. 동물을 마취시키고, 중간선 절개을 수행하고, 두개골로부터 피부, 결합 조직 및 건막을 분리함으로써 가장(Sham) 손상을 수행하였다. 이어서, 절개부를 폐쇄하였다.
PDAC의 제조 및 정맥내 주사. 주사 전에, PDAC를 해동시키고, 세척하고, 인산염 완충 염수 (PBS) 비히클 중에 2×106개 세포/mL의 농도로 현탁시켰다. 세포를 계수하고, 트리판 블루 배제를 통해 생존율에 대해 체크하였다. 정맥내 주사 직전에, PDAC를 부드럽게 8-10회 적정하여, 세포의 균질한 혼합물을 보장하였다. PDAC를 CCI 손상 후 2시간 및 24시간에 2개의 상이한 투여량 (CCI + 2×106개 PDAC/kg 및 CCI + 10×106개 PDAC/kg)으로 주사하였다. 따라서, 각각의 처리 동물은 그들의 할당된 PDAC 농도의 2개의 별개의 용량을 받았다. CCI 손상 대조군 동물은 세포 처리된 동물과 동일 지정된 시점에 PBS 비히클 주사 단독을 받았다.
래트 비장절제술. 비장절제술 후 래트로 완료되는 모든 실험에서, 수컷 스프라그-돌리 래트를 상기 기재된 바와 같이 마취시키고, 바로누운 자세로 위치시켰다. 작은 3 cm 절개부를 복부의 좌측 위 사분역에 만든 후, 비장을 수축시키고, 비장문을 결찰하였다. 비장의 제거 후, 절개부를 연속 봉합으로 폐쇄하였다. 동물을 회복시키고, 비장절제술 후 72시간 동안 순화시켰다. 이어서, 원래의 비장절제술 후 72시간에 모든 실험을 완료하였다.
에반 블루 혈액 뇌 장벽 (BBB) 투과성 분석. CCI 손상 후 72시간에, 래트를 상기 기재된 바와 같이 마취시키고, 우측 내부 경정맥의 직접 삽관을 통해 PBS 중 3％ 에반 블루 염료 1 mL (4 cm3/kg)를 주사하였다. 염료를 관류시켜 60분 동안 동물을 회복시켰다. 이 시간 후, 우심방 천공을 통해 동물을 희생시키고, 4％ 파라포름알데히드로 관류시켰다. 다음, 동물을 참수한 후, 뇌 추출하였다. 피질 조직의 나머지로부터 소뇌를 박리시켰다. 뇌를 중간선을 통해 나누고, 표준화를 위해 각각의 반구 (손상에 대해 동측성 및 손상에 대해 대측성)의 질량을 측정하였다. 후속적으로, 염료를 추출하기 위해 각각의 반구를 50℃에서 포름아미드 5 mL 중에서 밤새 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 각각의 샘플로부터의 100 ㎕의 상등액을 96웰 플레이트로 옮기고 (3벌), 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반구 중량에 대해 모든 값을 표준화하였다.
피질 면역조직화학. 밀착연접 단백질 폐색 및 형광 현미경검사를 이용한 가시화 (핵을 위한 DAPI 블루 및 오클루딘을 위한 FITC 그린)를 위한 면역염색에 의해 BBB 완전성을 추가로 조사하였다. CCI 손상 후 72시간에, 무손상 비장을 갖는 래트 및 비장절제술 후 래트 둘 모두의 4개의 군 (손상되지 않은, CCI 손상 단독, CCI 손상 + 2×106개 PDAC/kg, 및 CCI 손상 + 10×106개 PDAC/kg)을 희생시킨 후, 신속하게 참수하였다. 뇌를 추출하고, 두 반구 (손상에 대해 동측성 및 대측성) 모두를 단리하였다. 이어서, 플래쉬 냉동을 위해 조직 샘플을 예비-냉각된 2-메틸부탄으로 신속하게 위치시켰다. 샘플을 드라이아이스로 이동시키고, 조직을 섹션화할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 이어서, 조직 샘플을 최적의 절단 온도(Optimal Cutting Temperature) 화합물, 예를 들어 사쿠라 파인텍(Sakura Finetek, 미국 캘리포니아주 토런스)에 위치시키고, 직접 손상 구역을 통해 20 ㎛ 냉동 섹션을 만들었다. 밀착연접 단백질 오클루딘 (예를 들어 1:150 희석, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 및 적절한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 접합된 2차 항체 (예를 들어 1:200 희석, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 위한 항체로의 염색을 통해 혈관 구조에 대한 직접 손상을 평가하였다. 모든 항체 염색 후, 핵 염색을 위해 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (예를 들어 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 조직 섹션을 대조염색하고, 형광 현미경검사로 가시화하였다.
비장 면역조직화학. PDAC를 생체내에서 추적하기 위해, 예를 들어 투여된 PDAC가 폐 마이크로혈관계를 통과하여 비장에 도달하는가를 결정하기 위해, 4개의 군의 래트 (손상되지 않은, CCI 손상 단독, CCI 손상 + 2×106개 PDAC/kg, 및 CCI 손상 + 10×106개 PDAC/kg)를 가장 손상 또는 CCI 손상으로 처리하였다. 다음, 2개의 처리군은 CCI 손상 후 2시간 및 24시간에 양자점 (예를 들어 QDOT, 큐트래커(Qtracker) 세포 표지 키트 525 및 800, 인비트로젠, 인크., 미국 캘리포니아주 칼스바드) 표지된 (제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라) PDAC의 주사를 받았다. 제2 QDOT 표지된 PDAC 주입 후 6시간에, 동물을 희생시키고, 비장을 제거하였다. 비장을 후속적으로 형광 스캐너 (예를 들어 오디세이(Odyssey) 영상화 시스템, 리코르 인크.(Licor Inc.), 미국 네브라스카주 링컨) 상에 위치시켜, QDOT 표지된 PDAC를 국부화하였다. 스캐닝을 완료한 후, 이어서 플래쉬 냉동을 위해 조직 샘플을 예비-냉각된 2-메틸부탄으로 신속하게 위치시켰다. 샘플을 드라이아이스로 이동시키고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다. 다음, 조직 샘플을 최적의 절단 온도 화합물, 예를 들어 사쿠라 파인텍, 미국 캘리포니아주 토런스)에 위치시키고, 비장에 걸쳐 10 ㎛ 냉동 섹션을 만들었다. 핵 염색을 위해 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (예를 들어 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로 조직 섹션을 염색하고, QDOT 표지된 PDAC 및 비장세포 둘 모두는 형광 현미경검사로 가시화하였다. 추가로, 비장 구조를 평가하기 위해 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하였다.
비장 덩어리의 비장세포 단리/ 측정. 손상 후 72시간에, 비장 덩어리를 측정하면서 동물을 비장절제술로 처리하였다. 이때에 동물을 안락사시켰다. 다음, 면도기를 이용하여 비장을 잘게 부수고, 기본 배지 (RPMI 중 10％ FBS 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신)로 세척하고, 파쇄하고, 100 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 필터로부터의 배출물 샘플을 부드럽게 8-10회 적정하고, 후속적으로 40 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 임의의 남은 결합 조직을 제거하였다. 샘플을 1000 g에서 3분 동안 원심분리하였다. 다음, 상등액 용액을 제거하고, 샘플을 3 mL의 적혈구 용해 완충제 (퀴아겐 사이언시스, 미국 캘리포니아주 발렌시아) 중에 현탁시키고, 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 샘플을 기본 배지로 2회 세척하고, 상기 언급된 세팅을 이용하여 원심분리하였다. 비장세포를 계수하고, 트리판 블루 배제를 통해 생존율에 대해 체크하였다.
생체내 비장세포 증식 검정. 희생시킬 때 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 예를 들어 클릭-잇(Click-iT)™ EdU 유동 세포계측 검정 키트 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 이용하여 활성적으로 증식하는 비장세포 (S기)의 백분율을 측정하였다. 간략하게 설명하면, 비장세포를 72시간에 수확하고, 20 mM의 EdU를 세포에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 세척하고, 4％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. 트리톤-X100을 사용하여 세포를 투과시킨 후, 제조업체에 의해 제공된 항-EdU 항체 "칵테일"을 첨가하였다. 마지막으로, 세포를 세척한 다음, 리보뉴클레아제 및 셀사이클488-레드 염색약을 첨가하여, DNA 함량을 분석하였다.
생체내 비장세포 세포자멸 검정. 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 예를 들어 안넥신 V 염색 (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세)을 이용하여, 희생시 세포자멸 비장세포의 백분율을 측정하였다. 간략하게 설명하면, 단리 후, 비장세포를 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 다음, 1×106개 세포를 5 ㎕의 안넥신 V 및 7-아미노-악티노마이신 (7-AAD)과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 유동 세포계측을 이용하여 세포자멸 세포의 백분율을 측정하였다. 제조업체의 설명서에 따라 예를 들어 RNEasy 컬럼 (퀴아겐, 미국 캘리포니아주 발렌시아)을 이용하여 정량적 PCR RNA를 비장세포로부터 단리하였다. 래트 참고 RNA (스트라타젠(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야)를 양성 대조군으로서 사용하였다. M-MLV 역전사효소 및 무작위 헥사머 (프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)로 cDNA의 합성을 수행하였다. 게놈 DNA 오염에 대한 제어를 위해 역전사효소 없이 대조군 반응을 수행하였다. 예를 들어 9600 에뮬레이션이 있는 ABI 7500을 이용하여 qPCR을 수행하였다.
시험관내 방법
비장세포 배양. 2 ㎍ 콘카나발린 A로 자극된 7.5×105개 세포/mL의 밀도로 배양된 비장세포를 성장 배지 (RPMI 중 10％ FBS, 비타민을 함유하는 1％ RPMI, 1％ 피루브산나트륨, 0.09％ 2-메르캅토에탄올 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신) 중에서 72시간 동안 증식시켰다.
비장세포 특징규명. 단핵구, 호중구 및 T-세포 집단을 결정하기 위해 유동 세포계측으로 단리된 비장세포를 분석하였다. CD200 및 CD11b/CD18에 대한 항체 각각을 사용하여 단핵구 및 호중구를 측정하였다. CD3, CD4 및 CD8 항체를 사용하여 비장세포 T-세포 집단을 표지하였다. 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 모든 염색을 완료하였다.
시험관내 증식 검정. 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라 예를 들어 클릭-잇™ EdU 유동 세포계측 검정 키트 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 이용하여, 자극된 성장 배지 중에서의 배양 후 활성적으로 증식하는 (S기) CD4+ 비장세포의 백분율을 측정하였다. 간략하게 설명하면, 2 ㎍ 콘카나발린 A로 자극된 성장 배지 중에서 상기 기재된 바와 같이 72시간 동안 7.5×105개 세포/mL의 밀도로 비장세포를 배양하였다. 20 mM의 EdU를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 세포를 DMEM (4％ FBS) 중 4％ 소 혈청으로 세척하고, CD4-PE를 첨가하여, 관심있는 T-세포 집단을 게이팅하였다. 인큐베이션 30분 후, 세포를 세척하고, 4％ 파라포름알데히드로 고정시켰다. 트리톤-X100을 사용하여 세포를 투과시킨 후, 제조업체에 의해 제공된 항-EdU 항체 "칵테일"을 첨가하였다. 마지막으로, 세포를 세척한 다음, 리보뉴클레아제 및 셀사이클488-레드 염색약을 첨가하여, DNA 함량을 분석하였다.
시험관내 비장세포 시토카인 생성. 자극된 성장 배지에서의 배양 후, 제조업체가 권장하는 프로토콜에 따라, 예를 들어 BD 사이토메트릭 비드 어레이 플렉스 세트 (비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여, 유동 세포계측에 의해 항-염증성 시토카인 IL-4 및 IL-10의 생성을 정량화하였다.
6.6 실시예 6: 조직 리모델링을 위한 PDAC의 사용
본 실시예는 PDAC가 어떻게 섬유증 및 리모델 조직을 조정하기 위해 사용될 수 있는가를 입증한다.
ELISA 및 멀티플렉스 검정을 이용하여, 2종의 세포 유형의 분비 프로파일을 평가하기 위해, 정상적인 인간 피부 섬유모세포 (NHDF)로 조건화된 배지와 PDAC-조건화된 배지를 비교하였다. PDAC는 NHDF에 의해 분비된 폴리스타틴의 양보다 60％ 내지 65％ 더 많은 폴리스타틴을 분비하는 것으로 결정되었다. PDAC는 또한 NHDF에 의해 분비된 간세포 성장 인자 (HGF)의 양보다 75％ 내지 95％ 더 많은 HGF를 분비하는 것으로 결정되었다. 추가로, PDAC는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)1, MMP2, MMP7 및 MMP10을 분비하는 것으로 결정되었다.
PDAC가 NHDF에 비해 높은 수준의 폴리스타틴 및 HGF를 분비하고, PDAC가 또한 MMP1, MMP2, MMP7 및 MMP10을 분비하는 것으로 결정된 것은 PDAC가 생체내에서 조직을 리모델링하는, 예를 들어 섬유증을 조정하는 능력을 보유할 수 있고, 따라서 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.
6.7 실시예 7: PDAC를 이용하는 치료 방법
6.7.1 PDAC를 사용하는 SCI의 치료
개체는 척수 손상 (SCI)을 나타내고, 감각 및/또는 운동 기능의 손실을 겪고 있었다. 개체에게 0.9％ NaCl 용액 중 2.5 x 108 내지 1 x 1010개의 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포 (PDAC)를 정맥내 투여하였다. 하나 이상의 증상의 감소를 평가하기 위해 다음 2주 내지 한 달에 걸쳐 개체를 모니터링하였다. 다음 일 년의 기간에 걸쳐 개체를 추가로 모니터링하고, 필요에 따라, 예를 들어 증상이 되살아나거나 또는 중증도가 증가하면 동일 용량의 PDAC를 투여하였다.
6.7.2 PDAC를 사용하는 SCI의 치료
개체는 척수 손상 (SCI)을 나타내고, 감각 및/또는 운동 기능의 손실을 겪고 있었다. 개체에게 0.9％ NaCl 용액 중 1 x 106 내지 1 x 107개의 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포 (PDAC)를 정맥내 투여하였다. 하나 이상의 증상의 감소를 평가하기 위해 다음 2주 내지 한 달에 걸쳐 개체를 모니터링하였다. 다음 일 년의 기간에 걸쳐 개체를 추가로 모니터링하고, 필요에 따라, 예를 들어 증상이 되살아나거나 또는 중증도가 증가하면 동일 용량의 PDAC를 투여하였다.
6.7.3 PDAC를 사용하는 TBI의 치료
개체는 외상성 뇌 손상 (TBI)을 나타내고, 기억 상실, 주의력/집중력 부족 및/또는 어지럼증/균형 상실을 겪고 있었다. 개체에게 0.9％ NaCl 용액 중 2.5 x 108 내지 1 x 1010개의 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포 (PDAC)를 정맥내 투여하였다. 하나 이상의 증상의 감소를 평가하기 위해 다음 2주 내지 한 달에 걸쳐 개체를 모니터링하였다. 다음 일 년의 기간에 걸쳐 개체를 추가로 모니터링하고, 필요에 따라, 예를 들어 증상이 되살아나거나 또는 중증도가 증가하면 동일 용량의 PDAC를 투여하였다.
6.7.4 PDAC를 사용하는 TBI의 치료
개체는 외상성 뇌 손상 (TBI)을 나타내고, 기억 상실, 주의력/집중력 부족 및/또는 어지럼증/균형 상실을 겪고 있었다. 개체에게 0.9％ NaCl 용액 중 1 x 106 내지 1 x 107개의 CD10+, CD34-, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포 (PDAC)를 정맥내 투여하였다. 하나 이상의 증상의 감소를 평가하기 위해 다음 2주 내지 한 달에 걸쳐 개체를 모니터링하였다. 다음 일 년의 기간에 걸쳐 개체를 추가로 모니터링하고, 필요에 따라, 예를 들어 증상이 되살아나거나 또는 중증도가 증가하면 동일 용량의 PDAC를 투여하였다.
균등물:
본원에 개시된 조성물 및 방법은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 기재된 것에 추가하여 조성물 및 방법의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 그 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (1)

  1. 치료 유효량의 태반 줄기 세포, 또는 태반 줄기 세포에 의해 조건화된 배양 배지를 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖거나 발병할 위험이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 치료 유효량은 상기 질환, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상에서 검출가능한 개선을 일으키는데 충분한 양인, 척수 손상 또는 외상성 뇌 손상과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖거나 발병할 위험이 있는 개체를 치료하는 방법.
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